CN110824029A - 基于uplc及一测多评法的白芷药材中香豆素类成分含量检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种白芷药材中香豆素类成分的UPLC检测方法。本发明的白芷药材中香豆素类成分的UPLC检测方法,基于“一测多评法”能同时检测白芷药材中香豆素类成分中的4种成分,且本法相较于常用的HPLC检测方法稳定性更好,准确度更高,检测时间更短,效率更高,降低了检测成本。克服了在缺乏异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素对照品的情况下,通过相对校正因子f及色谱峰定位计算其含量,实现白芷中主要香豆素成分异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素的含量测定,为白芷质量控制提供了新方法。
Description
技术领域
本发明具体涉及基于UPLC及一测多评法的白芷药材中香豆素类成分含量检测。
背景技术
白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,使用历史悠久,临床上用于感冒头痛,眉棱骨痛,鼻塞流涕,鼻鼽,鼻渊,牙痛,带下,疮疡肿痛等证。研究表明白芷主要活性成分为香豆素类,主要有欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归素、白当归脑、佛手柑内酯等。
目前,对白芷香豆素类化合物的研究也比较成熟,由最初简单的定性分析,逐步发展为采用精密仪器与方法进行定量的分析与研究,如TLC、UV、 HPLC等。目前关于白芷药材中香豆素类成分含量测定已有许多报道,但是都是基于HPLC及外标法测定的,如王梦月.白芷的古今药用概况及香豆素成分研究[D].成都:成都中医药大学,2003.33‐39.,用HPLC外标法测定了川白芷中主要香豆素类成分欧前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素,但是其检测时间长、效率不高。
发明内容
为解决上述问题,本发明建立了一种新的白芷药材香豆素类成分的检测方法,具体是基于UPLC及白芷药材中香豆素类成分含量检测方法。
本发明基于UPLC的白芷药材中香豆素类成分含量检测方法,它包括如下操作步骤:
1)对照品溶液的制备:取香豆素类成分,用甲醇配制成对照品溶液;
2)供试品溶液的制备:取待测样品,甲醇提取,得供试品溶液;
3)检测:采用UPLC色谱法检测,色谱条件如下:色谱柱:C18色谱柱;流动相:流动相包括A相和B相,A相为乙腈,B相为纯水,梯度洗脱,梯度洗脱的程序如下:0~2min,35%A;2~3min,35%~40%A;3~6min, 40%~50%A;6~9min,50%~57%A;9~11min,57%~58%A;11~12min, 58%~70%A;12~15min,70%~90%A;15~16min,90%~100%A;检测波长:305nm。
步骤1)中,所述香豆素类成分为欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素和/或水合氧化前胡素。优选地,所述对照品溶液为每1mL含11.9μg欧前胡素、14.7μg氧化前胡素、10.4μg异欧前胡素和/或5.5μg水合氧化前胡素的溶液。
步骤2)中,甲醇提取的方法为:取待检样品,加入70~110倍v/w的甲醇,超声提取0.5~2h,滤过,取续滤液。优选地,所述甲醇的用量为待检样品90倍;超声提取的时间为1h。
步骤3)中,所述C18色谱柱为Agilent Poroshell 120EC‐C18,,Kinetex XB C18、CORTECSTM C18,优选Agilent Poroshell 120EC‐C18。
步骤3)中,所述的色谱条件的柱温为26~34℃,优选30℃;所述的色谱条件的流速为0.95mL·min‐1~1.05mL·min‐1,优选1.00mL·min‐1。
优选地,所述检测方法是采用一测多评的方法进行检测,以欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素和水合氧化前胡素中的任意一种为内参物,先检测内参物的含量,使用相对校正因子计算待测样品中其余香豆素类成分的含量。
所述相对校正因子按照下述方法得到:
取欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素对照品,根据权利要求1、3~7任意一项所述方法检测,根据如下公式计算:
式中A为对照品色谱峰面积、W为对照品的质量浓度,下标n代表待测成分对照品,下标s代表内参物对照品。
优选地,以欧前胡素为内参物,欧前胡素与氧化前胡素的相对校正因子为0.928,欧前胡素与异欧前胡素的相对校正因子为0.853,欧前胡素与水合氧化前胡素的相对正校因子为1.069。
本发明的基于UPLC及一测多评法的白芷药材中香豆素类成分含量检测,能同时定量检测白芷药材中的4种成分,且本法操作简单,稳定性好,准确度高,检测时间短,效率高,检测成本低,通过相对校正因子f计算其含量,实现白芷中主要香豆素成分欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素的含量测定,且检测准确度高,为白芷质量控制提供了新方法。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1对照品HPLC图,1.水合氧化前胡素2.氧化前胡素3.欧前胡素 4.异欧前胡素
图2供试品HPLC图,1.水合氧化前胡素2.氧化前胡素3.欧前胡素 4.异欧前胡素
具体实施方式
实施例1本发明检测方法
1、检测方法
(1)混合对照品的制备
分别取欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素对照品,精密称定,置于10mL量瓶内,加甲醇溶解并稀释制成每1mL含11.9,14.7,10.4,5.5μg的混合对照品溶液液。分别精密吸取混合对照品溶液0.1,0.2, 0.4,0.8,1,2,4mL置于10mL的量瓶内,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得系列混合对照品溶液,备用。
(2)供试品溶液的制备
取白芷药材粉末(过三号筛)0.5g,精密称定,置50mL量瓶中,加甲醇45mL,超声处理l h,取出,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。进样前用0.22μm微孔滤膜滤过。
(3)UPLC色谱检测
色谱柱Agilent Poroshell 120EC‐C18(150mm×4.6mm,2.7μm);以乙腈 (A):水(B)为流动相,流速1.0mL·min‐1;柱温30℃;检测波长为305nm;梯度洗脱见下表:
梯度洗脱流动相比例与时间关系
实施例2本发明检测方法(一测多评)
1、检测方法
(1)混合对照品的制备
取欧前胡素对照品,精密称定,置于10mL量瓶内,加甲醇溶解并稀释制成每1mL含11.9μg的对照品溶液液。分别精密吸取对照品溶液0.1,0.2, 0.4,0.8,1,2,4mL置于10mL的量瓶内,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液,备用。
(2)供试品溶液的制备
取白芷药材粉末(过三号筛)0.5g,精密称定,置50mL量瓶中,加甲醇45mL,超声处理l h,取出,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。进样前用0.22μm微孔滤膜滤过。
(3)UPLC色谱检测
色谱柱Agilent Poroshell 120EC‐C18(150mm×4.6mm,2.7μm);以乙腈 (A):水(B)为流动相,流速1.0mL·min‐1;柱温30℃;检测波长为305nm;梯度洗脱见下表:
下表梯度洗脱流动相比例与时间关系
(4)根据样品中欧前胡素的含量,使用相对校正因子计算待测样品中氧化前胡素、异欧前胡素和水合氧化前胡素的含量;
相对校正因子为:
相对校正因子测定结果
实施例3本发明检测方法
仪器与试药
1仪器
Agilengt 1290Infinity LC超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),SQP万分之一分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司),BT125D十万分之一分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司),KQ‐300超声波清洗机(昆山市超声设备有限公司)。
2试药
欧前胡素(批号20170528,质量分数为99.65%),氧化前胡素(批号 20170216,质量分数为99.89%),异欧前胡素(批号20170620,质量分数为99.07%),水合氧化前胡素(批号20170426,质量分数为99.97%),均够自成都昂赛思生物科技有限公司;乙腈(美国Fisher公司,色谱纯);甲醇(分析纯);屈臣氏蒸馏水。
白芷药材从四川遂宁、资阳,河南禹州,河北安国,安徽亳州收集,经成都中医药大学中药鉴定教研室马逾英教授鉴定为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根,样品见表1。
表1白芷药材样品表
3UPLC色谱条件
色谱柱Agilent Poroshell 120EC‐C18(150mm×4.6mm,2.7μm);以乙腈 (A):水(B)为流动相,流速1.0mL·min‐1;柱温30℃;检测波长为305nm;梯度洗脱见表2:
表2梯度洗脱流动相比例与时间关系
4一测多评法建立
4.1混合对照品的制备
分别取欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素对照品,精密称定,置于10mL量瓶内,加甲醇溶解并稀释制成每1mL含11.9,14.7, 10.4,5.5μg的混合对照品溶液液。分别精密吸取混合对照品溶液0.1,0.2, 0.4,0.8,1,2,4mL置于10mL的量瓶内,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得系列混合对照品溶液,备用。
4.2供试品溶液的制备
取白芷药材粉末(过三号筛)0.5g,精密称定,置50mL量瓶中,加甲醇45mL,超声处理lh,取出,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。进样前用0.22μm微孔滤膜滤过。
4.3线性观察的考察
分别精密吸取“4.1”项的混合对照品溶液各1μL,注入超高效液相色谱仪,测定并记录各色谱峰峰面积。色谱谱图见图1。以对照品质量浓度为横坐标(X),色谱峰峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程。见表3。
表3 4种香豆素的线性关系和范围
结果表明欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素分别在 1.19~47.60μg,1.47~58.80μg,1.04~41.60μg,0.55~22.00μg内线性关系良好。
4.4精密度实验
精密吸取“4.1”项的混合对照品溶液1μL,按照色谱条件,连续进样 6次,记录欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素的峰面积,其RSD分别为0.06%,0.08%,0.04%,0.26%,表明仪器的精密度良好。
4.5稳定性试验
取同一供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、18、24h进样1μL分析,色谱谱图见图2,记录欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素的峰面积,其RSD分别为0.72%,1.10%,1.32%,1.47%,表明供试品溶液在24h内稳定。
4.6重复性试验
取同一批样品(SNZJ1)6份,按照项下方法制备供试品溶液,精密吸取 1μL进样分析,记录峰面积欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素的峰面积,计算。其质量分数RSD分别为0.99%,0.85%,2.53%, 2.64%,表明该方法重复性良好。
4.7加样回收率试验
精密称取已测定的样品(SNZJ1)0.25g,平行6份,分别加入一定量的混合对照品溶液,按“4.2”项下方法制备供试品溶液,测定峰面积,计算回收率。结果表明,欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素的平均加样回收率分别为102.20%、102.66%、99.50%、98.45%,RSD分别为1.83%、 2.81%、2.37%、1.81%。结果说明该方法的加样回收率良好。
4.8相对校正因子测定及耐用性考察
4.8.1相对校正因子测定
取“4.1”项下各混合对照品溶液进样1μL,测定各待测成分的峰面积。以欧前胡素为参照物,按计算公式:
式中A为对照品色谱峰面积、W为对照品的质量浓度,下标n代表待测成分对照品,下标s代表内参物对照品。
分别计算氧化前胡素、异欧前胡素和水合氧化前胡素的相对校正因子,结果见表4。
表4相对校正因子测定结果
4.8.2不同色谱柱对相对校正因子影响
考察了Poroshell 120EC‐C18(150×4.6mm,2.7μm)、Kinetex XB C18 (150×4.6mm,2.6μm)、CORTECSTM C18(150×4.6mm,2.7μm)3 种不同型号的色谱柱对各待测成分fs/i的影响,结果RSD分别为0.66%,0.75%, 0.79%,说明不同型号色谱柱对各待测成分fs/i无显著影响。
4.8.3不同仪器对相对校正因子影响
考察了两台安捷伦超高效液相色谱仪对各待测成分fs/i的影响,结果RSD 分别为0.76%,1.00%,2.20%,说明不同仪器对各待测成分fs/i无显著影响。
4.8.4不同波长对相对校正因子影响
在同一色谱条件下,考察波长304、305、306nm对相对校正因子的影响,结果RSD分别为2.22%,2.41%,3.19%,表明微调检测波长对各待测成分fs/i无显著影响。
4.8.5不同流速对相对校正因子影响
在同一色谱条件下,考察流速0.95、0.98、1.00、1.02、1.05mL·min‐1对相对校正因子的影响,结果RSD分别为0.24%,0.22%,0.79%,表明微调流速对各待测成分fs/i无显著影响。
4.8.6不同柱温对相对校正因子影响
在同一色谱条件下,考察柱温26、28、30、32、34℃对相对校正因子的影响,结果RSD分别为0.28%,0.46%,1.21%,表明微调柱温对各待测成分 fs/i无显著影响。
4.8.7各耐用性因素对相对校正因子的综合影响
综合以上各种影响因素,氧化前胡素、异欧前胡素和水合氧化前胡素的相对校正因子的RSD分别为1.09%,1.28%,1.70%。
表5各种因素对相对校正因子的综合影响
5一测多评法与外标法测定结果比较
取不同等级的白芷药材样品,按“4.2”项制备供试品溶液,精密吸取 1μL注入超高效液相色谱仪,分别采用外标法和一测多评法计算白芷中的欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素的量,以验证一测多评法对用于测定白芷药材中香豆素类评价的准确性。结果见表6。
表6不同等级白芷药材测定结果(mg/g,n=2)
注:a为外标法;b为QAMS一测多评法
结果表明,2种方法测得的白芷中4种香豆素成分的量无显著性差异, RSD均小于5%,说明建立的一测多评方法可用于白芷药材多成分分析和质量控制。
6结果与讨论
本发明采用UPLC法,并建立了白芷药材一测多评法测定欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、水合氧化前胡素的量,进行了方法学考察,方法耐用性以及系统适应性试验,结果表明,本实验条件下相对校正因子重现性良好,且该方法测定结果与外标法测定的含量无显著性差异,可用于白芷药材质量控制,具有简便准确、节约检测成本等优点。
综上,本发明的基于UPLC及一测多评法的白芷药材中香豆素类成分含量检测,能同时定量检测白芷药材中的4种成分,且本法操作简单,稳定性好,准确度高,检测时间短,效率高,检测成本低,通过相对校正因子f计算其含量,实现白芷中主要香豆素成分欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素的含量测定,且检测准确度高,为白芷质量控制提供了新方法。
Claims (10)
1.一种基于UPLC的白芷药材中香豆素类成分含量检测方法,其特征在于:它包括如下操作步骤:
1)对照品溶液的制备:取香豆素类成分,用甲醇配制成对照品溶液;
2)供试品溶液的制备:取待测样品,甲醇提取,得供试品溶液;
3)检测:采用UPLC色谱法检测,色谱条件如下:色谱柱:C18色谱柱;流动相:流动相包括A相和B相,A相为乙腈,B相为纯水,梯度洗脱,梯度洗脱的程序如下:0~2min,35%A;2~3min,35%~40%A;3~6min,40%~50%A;6~9min,50%~57%A;9~11min,57%~58%A;11~12min,58%~70%A;12~15min,70%~90%A;15~16min,90%~100%A;检测波长:305nm。
2.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于:步骤1)中,所述香豆素类成分为欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素和/或水合氧化前胡素。
3.根据权利要求2所述的含量检测方法,其特征在于:所述对照品溶液为每1mL含11.9μg欧前胡素、14.7μg氧化前胡素、10.4μg异欧前胡素和/或5.5μg水合氧化前胡素的溶液。
4.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于:步骤2)中,甲醇提取的方法为:取待检样品,加入70~110倍v/w的甲醇,超声提取0.5~2h,滤过,取续滤液。
5.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于:所述甲醇的用量为待检样品90倍;超声提取的时间为1h。
6.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于:步骤3)中,所述C18色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18,,Kinetex XB C18、CORTECSTM C18,优选AgilentPoroshell 120EC-C18。
7.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于:步骤3)中,所述的色谱条件的柱温为26~34℃,优选30℃;所述的色谱条件的流速为0.95mL·min-1~1.05mL·min-1,优选1.00mL·min-1。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的含量检测方法,其特征在于:它是采用一测多评的方法进行检测,以欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素和水合氧化前胡素中的任意一种为内参物,先检测内参物的含量,使用相对校正因子计算待测样品中其余香豆素类成分的含量。
10.根据权利要求8或9所述的含量检测方法,其特征在于:以欧前胡素为内参物,欧前胡素与氧化前胡素的相对校正因子为0.928,欧前胡素与异欧前胡素的相对校正因子为0.853,欧前胡素与水合氧化前胡素的相对校正因子为1.069。
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