CN103175906A - 一种井冈霉素各组分的定性与定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种井冈霉素各组分的定性与定量检测方法，步骤：A、鉴别试验：B、井冈霉素各组分质量分数的测定：1）、试剂和溶液准备:2）、仪器准备；3）、样品处理；4）、色谱操作条件：5）、编制进样程序表；6）、测定：仪器基线稳定后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液于定量环中定量，定量后的标样溶液被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井冈霉素各组分依次进入检测器流通池；7）、数据分析：绘制标准曲线，记录各组分峰面积，接合标准曲线对井冈霉素各组分进行定量。本方法灵敏度高、选择性好，井冈霉素A及相关组分均能达到基线分离，能够对井冈霉素相关产品中各组分准确定性与定量。

Description

一种井冈霉素各组分的定性与定量检测方法

技术领域

本发明涉及到一种井冈霉素(Validamycin)相关产品中井冈霉素定量检测的技术领域，更具体涉及一种井冈霉素产品中井冈霉素A及相关组分的定性与定量检测方法.可用于井冈霉素相关产品各组分定性与定量检测及为生产高品质井冈霉素产品提供依据。

背景技术

井冈霉素(Validamycin)是由吸水链球菌井冈变种产生的水溶性抗生素葡萄糖苷类化合物，分子式C₂₀H₃₅O₁₃N，分子量497.51，毒性低，纯品为白色无定型粉末，溶于水、二甲基甲酰胺，微溶于乙醇，不溶于丙酮、苯、乙酸乙酯、等有机溶剂，吸湿性强，在室温PH3-9水溶液中稳定。井冈霉素主要由井冈霉素A（Validamycin A,VA）、井冈霉素B（Validamycin B,VM-B）、井冈霉素C（Validamycin C,VM-C）、井冈霉素D（Validamycin D,VM-D）、井冈霉素E（Validamycin E,VM-E）、井冈霉素F（ValidamycinF,VM-F）、井冈霉亚基胺A（ValidoxylamineA，VxA-A）等组分组成。主要用于防治各类纹枯病，对稻曲病也有效，也可用于防治棉花、瓜类立枯病，其有效成分为井冈霉素A（ISWA T,KAMEDAY,ASAIM,studies on validamycins,new antibiotics IV[J].Antibiotics.1971,24(2):119-123）；VxA-A是昆虫的海藻糖酶抑制剂，可开发为生物杀虫剂；井冈胺和井冈霉亚基胺是重要的糖苷霉抑制剂，是合成其他新酶抑制剂类降糖药的重要医药中间体和原药（金利群，井冈霉亚基胺A的制备及其对海澡糖酶的抑制作用[D]。杭州：浙江工业大学，2003.）。井冈霉素在我国已经形成了一个经济效益较高的生物技术产业，以井冈霉素为原料开发附加值更高的医药品和安全性能更高的生物杀虫剂是十分必要的，具有社会和经济双重效益（上海农药研究所农抗组，《井冈霉素》[M]，上海人民出版社，1977）。而获得这些高品质的井冈霉素需要分离或纯化井冈霉素各种组分，因此，采用有效的手段对井冈霉素各组分进行定性和定量分析具有重要意义。目前，国内对井冈霉素的定量分析方法有离子交换比色法、薄层荧光法（徐辉，薄层-荧光法测定井冈霉素水剂，上海农学院报1998，16（2）：148-151.）、液相色谱法（GB/T9553-93），前两者只能测定井冈霉素总含量，不能将各组分分离并定量；GB/T9553-93所用的液相色谱法也只能将井冈霉素A分离并定量。日本在检测井冈霉素产品中的VA、VM-B、VM-C、VM-D、VM-E、VM-F、VxA-A方面也有相关报道，其检验方法采用100%的20mmol/L磷酸缓冲盐作为流动相，该方法虽然基本能分离井冈霉素产品中的不同组分，但是各组分分离效果不够理想。其不足之处表现为：1、系统压力高达200bar以上，随着检测量的增加，压力会不断升高，高浓度高比例的缓冲盐很容易破坏色谱柱结构，导致色谱柱寿命极短；2、分析时间长达1小时，用于大量生产检验不够现实；3、由于时间长，峰形变差，而且随着时间的延长，很容易产生基线飘移，因此会造成定量不准确；4、响应值小，同样的进样浓度与进样量，其峰高与峰面积响应基本是本发明的三分之一。本发明灵敏度高、选择性好，井冈霉素产品中VA、VM-B、VM-C、VM-D、VM-E、VM-F、VxA-A均能达到基线分离；由于流动相中加入了1%（体积比）甲醇作为流动相改性剂，缓冲盐浓度低，因此对系统压力、分析时间、基线飘移、色谱柱的寿命及准确度方面都有很大改善。所以此方法可以用于井冈霉素产品的井冈霉素A及相关组分的定性与定量检测，也可用于井冈霉素A及相关组分的分离、纯化与研究。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种井冈霉素产品中VA及VM-B、VM-C、VM-D、VM-E、VM-F、VxA-A等相关组分的定性与定量检测方法。本发明灵敏度高、选择性好，井冈霉素产品中VA、VM-B、VM-C、VM-D、VM-E、VM-F、VxA-A均能达到基线分离；由于流动相中加入了1%(体积百分数)甲醇作为流动相改性剂，缓冲盐浓度低，因此在系统压力、分析时间、基线飘移、色谱柱的寿命及准确度方面相对日本相关检测方法都有很大的改善。

一种井冈霉素A及六种相关组分的定性与定量检测方法，其步骤是：

A、鉴别试验——定性：

本鉴别试验可与井冈霉素质量分数的测定同时进行。在相同的色谱操作条件下，井冈霉素试样溶液中各组分色谱峰的保留时间与井冈霉素标样溶液中井冈霉素各组分色谱峰的保留时间，其相对差值应在1.5%以内。图6为运用本方法检测井冈霉素标样的典型色图谱，各组分保留时间分别为：VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902min VM-F23.545min、VxA-A7.553min。因色谱柱的批次，流动相所用试剂批次、流动相pH值及仪器状态等细微差别，不同时间分析各组分的保留时间会略有差别。所述的井冈霉素试样溶液与井冈霉素标样溶液为B步骤中定量测定所配井冈霉素试样溶液Ⅰ、Ⅱ与井冈霉素标样溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

B、井冈霉素各组分质量分数的测定——定量：

1、试剂和溶液准备:

试剂：新蒸二次蒸馏水,甲醇(色谱纯),磷酸（分析纯）,无水磷酸氢二钾（分析纯），浓硫酸（分析纯）。2.5mmol/L磷酸缓冲溶液：称取435.0mg无水K₂HPO₄于1000mL容量瓶中，加二次蒸馏水溶解，定容至1000mL，摇匀，用磷酸调至pH=7.0备用，使用前须用0.45μm的微孔滤膜过滤。0.05mol/L H₂SO₄溶液：取一支100mL容量瓶，加入约90mL二次蒸馏水，用移液管移取浓硫酸0.28mL缓慢加入其中后用二次蒸馏水定容。

井冈霉素标样（日本三井公司）：已知井冈霉素A93.8%。

2、仪器：

高效液相色谱仪（Agilent-1100色谱系统）：具可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、四元泵、真空脱气机。

色谱数据处理工作站（Agilent）。

色谱柱（日本YMC公司）：250mm×4.6mm(id)不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ，粒径5μm

溶剂过滤器（津腾公司）：滤膜孔径0.45μm。

针头过滤器（津腾公司）：滤膜孔径0.22μm。

3、样品处理：

井冈霉素标样溶液：称取井冈霉素标样（购于日本三井公司,VALIDAMYCIN STANDARD,Purity93.8%,LOT.NO.04①）110.0mg（精确至0.1mg）至50mL容量瓶，加入2mL0.05mol/L H₂SO4，二次蒸馏水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，二次蒸馏水定容，配成具一定浓度梯度的标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ。

标样溶液Ⅰ：井冈霉素A浓度约160.0μg/ml；

标样溶液Ⅱ：井冈霉素A浓度约200.0μg/ml；

标样溶液Ⅲ：井冈霉素A浓度约240.0μg/ml。

试样溶液：分别称取适量（根据试样中井霉素A的含量选择合适的称样量，使稀释后的试样溶液中井冈霉素A最终浓度与标样溶液Ⅱ中井冈霉素A浓度相当，准确至0.1mg）井冈霉素试样2次于2支50mL容量瓶中，二次蒸馏水定容。量取2mL此溶液于100mL容量瓶，二次蒸馏水定容，0.22μm过滤器过滤后备用，这样配得试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ。（试样溶液Ⅰ与试样溶液Ⅱ为同一试样分别取两次不同的称样量，配成井冈霉素A浓度相当的平行试样溶液。做平行试样的目的是提高检测结果准确度，减小检测误差。）

所述的井冈霉素(英文名称：Validamycin)

分子式/结构式：C₂₀H₃₅O₁₃N

井冈霉素结构式

其中：HO、OH为羟基，二者没有区别；O为连接两个六元环的氧元素，-NH为连接两个六元环的氨基。分子量：497.51毒性：属低毒杀菌剂。纯品大小鼠急性经口LD50均大于2000毫克/公斤，皮下注射LD50均大于1500毫克/公斤。5000毫克/公斤涂抹大鼠皮肤无中毒反应。对鱼类低毒，鲤鱼TLM(96h)LD50>40毫克/升。

理化性质：纯品为白色无定型粉末，溶于水、二甲基甲酰胺，微溶于乙醇，不溶于丙酮、苯、乙酸乙酯、等有机溶剂，吸湿性强，在室温（20－25℃）pH3-9水溶液中稳定。

剂型：2.4%、4%、8%（质量体积比）、24%、30%（质量百分数）井冈霉素A水剂，5%、10%、16%、20%、25%、40%、50%、60%可溶性粉剂，井冈霉素原药。

所述的可溶性粉剂是指可溶于水的粉剂和农药。农药的一种加工剂型。由水溶性较大的农药原药，或水溶性较差的原药附加了亲水基，与水溶性无机盐和吸附剂等混合磨细后制成。粉粒细度要求98%通过80目筛。其有效成分可溶于水，其填料能极细地均匀分散到水中。本剂型防治效果比可湿性粉剂高，使用方便，便于包装运输。但湿润展布性能比乳剂差。可溶性粉剂及可湿性粉剂均易被雨水冲刷而污染土壤和水体。故应选择雨后有几个晴天时对农田施药，以减少污染。

井冈霉素是一种放线菌产生的抗生素，具有较强的内吸性，易被菌体细胞吸收并在其内迅速传导，干扰和抑制菌体细胞生长和发育。

适用范围主要用于水稻纹枯病，也可用于水稻稻曲病、玉米大小斑病以及蔬菜和棉花、豆类等作物病害的防治。多年大规模的田间使用结果充分显示其“防效高、无药害、无污染”的环保型农药的特点，深受国内外用户欢迎。

4、色谱操作条件：

流动相：2.5mmol/L磷酸缓冲液+甲醇=99+1（体积比）

流速：1.2mL/min，柱温：30℃，检测波长：210nm，进样体积：10μL

色谱柱：250mm×4.6mm(id)不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ，粒径5μm

5、色谱仪器准备：

装上YMC-PACK ODS-AQ色谱柱，先用HPLC级甲醇、1.0ml/min的流速平衡色谱柱约40分钟，待仪器基线平稳后换上甲醇：二次蒸馏水=3：97（体积比）、1.0ml/min的流速冲洗色谱柱约40分钟，待仪器基线平稳后换上甲醇：2.5mmol/L磷酸缓冲溶液=1：99（体积比）的流动相、1.2ml/min流速平衡色谱柱。选择仪器操作条件：流速1.2mL/min，柱温：30℃，检测波长210nm，进样体积10μL。

6、编制进样分析程序表:

编制进样程序表：进样顺序为标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ，填写相关检测方法与样品信息。

7、进样分析：

在上述色谱条件下，待仪器基线稳定后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液Ⅰ10μl于定量环中定量，定量后的标样溶液Ⅰ被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井冈霉素各组分依次进入检测器流通池，检测器对井冈霉素各组分采集数据并将色谱图及相关数据保存于电脑中，分析完毕的试样与流动相一起排入废液瓶中，这样完成标样溶液Ⅰ进样分析。如此接着按标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ的顺序依次进样分析。

8、数据分析：

从色谱工作站中调出标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ的图谱，进行较准、绘制标准曲线。

标准曲线回归方程Area=k×Amt+b，R²须大于或等于0.999。调出试样溶液溶液Ⅰ、试样溶液溶液Ⅱ的图谱，将试样溶液VA的峰面积代入标准曲线回归方程计算出试样进样时井冈霉素A浓度C_A,则试样中井冈霉素A的质量分数X_A(%)的计算式为:

X_A=C_A×50×100×100/2/m1

式中：m₁——试样的质量，单位为毫克（mg）

X_A——井冈霉素A的质量分数，数值以%表示

C_A——样时井冈霉素A浓度（pg/mL）

试样中井冈霉素A的质量分数为两次平行结果取平均值。

从试样图谱中查出试样中井冈霉素A相关组分的峰面积A_X。用加热减量法测出试样（液体）的固形物百分含量S，粉剂样品其干物质含量即为其固形物百分含量S，则试样的纯度P为：

P=X_A×100/S

式中:

X_A为井冈霉素A的质量百分含量。

S为样品固形物质量百分含量。

井冈霉素相关组分的质量分数X(%)的计算式为：

X=A_X×P/A_A

式中:

A_A为井冈霉素A峰面积,

A_X为其它相关组分峰面积,

P为试样纯度。

井冈霉素各相关组分质量百分数为两次平行结果取平均值。

结论：本方法可以对井冈霉素产品中VA、VM-B、VM-C、V-MD、VM-E、VM-F、VxA-A七种组分进行定性并准确定量。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、运用本方法，井冈霉素产品中VA、VM-B、VM-C、V-MD、VM-E、VM-F、VxA-A均能达到基线分离；

2、根据井冈霉素标样能够对井冈霉素相关产品中各组分准确定性与定量；

3、由于流动相中加入了1%（体积比）甲醇作为流动相改性剂，缓冲盐浓度低，仅为日本相关方法中缓冲盐浓度的八分之一，为我国国标相关方法中缓冲盐浓度的1/2，因此对系统压力、分析时间、基线飘移、色谱柱的寿命及准确度方面都有很大改善；

4、选择210nm作为分析波长，井冈霉素有最大吸收，杂质吸收较小，排除了杂质干扰，因此井冈霉素响应值适当，同样的进样浓度与进样量，运用日本相关方法，其峰高与峰面积响应值基本是本发明的三分之一。

附图说明

图1为一种GB/T9553-93色谱方法典型的井冈霉素高效液相色谱图。

井冈霉素A保留时间约6min，其它井冈霉素A相关组分不能达到完全基线分离，只能作为井冈霉素A的定性与定量依据。

图2为一种日本相关方法典型的井冈霉素液相色谱图。

分析时间长达60分钟，VM-B、VxA-A、VM-D分离度与峰形不够理想，VA峰高只有图3中VA峰高的三分之一。

图3为一种实施例1的井冈霉素试样溶液Ⅰ液相色谱图。

总分析时间25分钟，各组分均达到基线分离，峰形良好，可以作为井冈霉素各组分定性与定量分析。

图4为一种实施例1标准曲线Area=2.6351×Amt-0.2097，R²=0.99999.

图5为一种实施例2的井冈霉素试样溶液Ⅰ液相色谱图。

图6为一种运用本方法检测井冈霉素标样的典型图谱，各组分保留时间为分别：VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902min VM-F23.545min、VxA-A7.553min。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，按发明内容中的操作条件和方法。

实施例1：

一种井冈霉素A及相关组分的定性与定量检测方法，其步骤如下：

第一步流动相准备：称取435.0mg无水K₂HPO₄于1000mL容量瓶中，加二次蒸馏水溶解，并用二次蒸馏稀释至刻度，摇匀。用磷酸调至pH=7.0备用，使用前用0.45μm的微孔滤膜过滤。二次蒸馏水用0.45μm的微孔滤膜过滤。

第二步色谱仪器准备：装上YMC-PACK ODS-AQ色谱柱，先用HPLC级甲醇、1.0ml/min的流速平衡色谱柱约40分钟，待仪器基线平稳后换上甲醇：二次蒸馏水=3：97（体积比）、1.0ml/min的流速冲洗色谱柱约40分钟，待仪器基线平稳后换上甲醇：2.5mmol/L磷酸缓冲溶液=1：99（体积比）的流动相、1.2ml/min流速平衡色谱柱。选择仪器操作条件：流速1.2mL/min，柱温：30℃，检测波长210nm，进样体积10μL。

第三步编制进样程序表：进样顺序为标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ，填写检测方法及样品信息。

第四步井冈霉素标样与试溶液准备：称取井冈霉素标样（购于日本三井公司,VALIDAMYCIN STANDARD,Purity93.8%,LOT.NO.04①）107.80mg至50mL容量瓶，加入2mL0.05mol/L H₂SO₄溶液，双蒸水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，二次蒸馏水定容，由此制得标样溶液Ⅰ井冈霉素A浓度为161.7862μg/ml、标样溶液Ⅱ井冈霉素A浓度为202.2328μg/ml、标样溶液Ⅲ井冈霉素A浓度为242.6796μgml。试样溶液：分别称取30%（质量百分数）井冈霉素A水剂产品HH11001批1700.22mg、1694.28mg于2支50mL容量瓶中，二次蒸馏水定容。量取2mL此溶液于100mL容量瓶，二次蒸馏水定容，0.22μm针头过滤器过滤后备用，由此制得试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ。（试样溶液Ⅰ与试样溶液Ⅱ为本批次试样取不同称样量而配成的井冈霉素A浓度相当的平行试样溶液）。

第五步按照进样程序表进样分析。在上述色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液Ⅰ10μl于定量环中定量，定量后的标样溶液Ⅰ被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井冈霉素各组分依次进入检测器流通池，检测器对井冈霉素各组分采集数据并将色谱图及相关数据保存于电脑中，分析完毕的试样与流动相一起排入废液瓶中，这样完成标样溶液Ⅰ进样分析。如此接着按标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ的顺序依次进样分析。

第六步分析完毕，从工作站调出标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ的图谱进行较准、绘制标准曲线如图4，标准曲线为Area=2.6351×Amt-0.2097，R²=0.99999.

第七步，调出试样溶液Ⅰ图谱，如图3，对照标样图谱对样品各组分进行定性并进行积分，记录各组分峰面积，调出试样溶液Ⅱ图谱并积分，记录各组分峰面积。将井冈霉素A峰面积代入标准曲线Area=2.6351×Amt-0.2097计算出试样进样时井冈霉素A浓度C_A，由公式X_A=C_A×50×100×100/2/m₁计算出试样中井冈霉素A质量百分数为30.23%。通过加热减量法测出本批次30%（质量百分数）井冈霉素A水剂固形物含量为47.06%。则试样纯度P=30.23%×100/47.07%=64.24%。其它组分面积代入公式X=A_X×P/A_A即可计算相关组分质量百分含量。各组分质量百分含量取两次平行结果的平均值。具体结果见表1。

表1

实施例2：

同实施例1准备流动相、仪器参数设置、色谱柱平衡、编制进样程序表。

井冈霉素标准溶液准备：称取井冈霉素标样（购于日本三井公司,VALIDAMYCIN STANDARD,Purity 93.8%,LOT.NO.04①）107.88mg至50mL容量瓶，加入2mL0.05mol/L H₂SO₄，二次蒸馏水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，二次蒸馏水定容，标样溶液Ⅰ井冈霉素A浓度为161.9063μg/ml、标样溶液Ⅱ井冈霉素A浓度为202.3829μg/ml、标样溶液Ⅲ井冈霉素A浓度为242.8595μgml。

井冈霉素试样溶液准备：分别称取批号为JX12052501高纯度井冈霉素解析液（生产高纯度井冈原药的前处理样品）1385.93mg、1415.25mg于2支50mL容量瓶中，二次蒸馏水定容。量取2mL此溶液于100mL容量瓶，二次蒸馏水定容，0.22μm针头过滤器过滤后备用。由此制得试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ。（试样溶液Ⅰ与试样溶液Ⅱ为本批次试样取不同称样量而配成的井冈霉素A浓度相当的平行试样溶液）。

在上述色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液Ⅰ10μl于定量环中定量，定量后的标样溶液Ⅰ被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井冈霉素各组分依次进入检测器流通池，检测器对井冈霉素各组分采集数据并将色谱图及相关数据保存于电脑中，分析完毕的试样与流动相一起排入废液瓶中，这样完成标样溶液Ⅰ进样分析。如此接着按标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ的顺序依次进样分析。

进样完毕后调出标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ色谱图并进行较准，绘制标准曲线，标准曲线为Area=2.6396×Amt+0.6165，R²=0.99998。调出试样溶液Ⅰ图谱如图5，对各组分定性并记录各组分峰面积，同样调出试样溶液Ⅱ图谱，记录各组分峰面积。将VA峰面积代入标准曲线Area=2.6396×Amt+0.6165，计算本批次井冈解析液中井冈霉素A的进样浓度C_A，并由公式X_A=C_A×50×100×100/2/m₁计算井冈霉素A的质量百分数为39.63%。通过加热减量法测出本批次井冈解析液固形物含量为52.71%。则试样纯度P=39.63%×100/52.71%=75.18%。将其它组分峰面积代入公式X=A_X×P/A_A即可计算相关组分质量百分含量。具体结果见表2。

表2

结论：经本方法检测井冈霉素含量不同的井冈霉素相关产品，井冈霉素各组分都能达到基线分离，两次平行相对偏差小，能够进行准确定量。同一批号HH11001批30%井冈霉素水剂，经GB/T9553-93色谱方法测定其组分A含量为30.29%，与本方法测定结果相对偏差为0.2%。因此，此方法可以作为井冈霉素各组分的定性和定量分析。

Claims (1)

1.一种井冈霉素各组分的定性与定量检测方法，其步骤是：

 A、鉴别试验——定性：

本鉴别试验与井冈霉素质量分数的测定同时进行，在相同的色谱操作条件下，井冈霉素试样溶液中各组分色谱峰的保留时间与井冈霉素标样溶液中井冈霉素各组分色谱峰的保留时间，其相对差值在1.5%以内，运用本方法检测井冈霉素标样，各组分保留时间分别为：VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902min VM-F23.545min、VxA-A7.553min;

B、井冈霉素各组分质量分数的测定——定量：

1）、试剂和溶液准备:

试剂：新蒸二次蒸馏水, 甲醇,磷酸,无水磷酸氢二钾，浓硫酸；

溶液：2.5mmol/L磷酸缓冲溶液:称取435.0mg 无水K₂HPO₄于1 000mL容量瓶中，加二次蒸馏水溶解，定容至1 000mL，摇匀，用磷酸调至pH=7.0备用，使用前用0.45μm的微孔滤膜过滤；0.05mol/L H₂SO₄溶液:取一支100 mL容量瓶，加入90mL二次蒸馏水，用移液管移取浓硫酸0.28mL缓慢加入其中，并用二次蒸馏水定容;

 2）、仪器：

高效液相色谱仪：具可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、四元泵、真空脱气机；

色谱数据处理工作站；

色谱柱：250mm×4.6mm不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ，粒径5μm；

溶剂过滤器：滤膜孔径0.45μm；

针头过滤器：滤膜孔径0.22μm;

3）、样品处理：

井冈霉素标样溶液：称取井冈霉素标样110.0 mg至50mL容量瓶，二次蒸馏水溶解，加入2mL0.05mol/L H₂SO4，二次蒸馏水定容，再分别移4、5、6mL至3个50mL容量瓶，二次蒸馏水定容，配成浓度梯度的标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ;

标样溶液Ⅰ：井冈霉素A浓度约160.0μg/ml；

标样溶液Ⅱ：井冈霉素A浓度约200.0μg/m l；

标样溶液Ⅲ：井冈霉素A浓度约240.0μg/m l；

试样溶液：分别称取适量井冈霉素试样2次于2支50mL容量瓶中，二次蒸馏水定容，量取2mL此溶液于100mL容量瓶，二次蒸馏水定容，0.22μm过滤器过滤后备用，配得试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ，其井冈霉素A浓度约200.0μg/m l;

4）、色谱操作条件：

流动相：2.5mmol/L磷酸缓冲液+甲醇=99+1；       

流速：1.2mL/min；     柱温：30℃；

检测波长：210nm；     进样体积：10μL；

色谱柱：250mm×4.6mm不锈钢柱，YMC-PACK ODS-AQ，粒径5μm;

5）、编制进样分析程序表:

编制进样程序表：进样顺序为标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ，填写检测方法与样品信息;

6）、测定：

在上述色谱条件下，待仪器基线平稳后，点击化学工作站中的开始按扭，色谱仪自动进样器自动抽取标样溶液Ⅰ1 0μl于定量环中定量，定量后的标样溶液Ⅰ被流动相带入色谱柱进行分离，分离后的井冈霉素各组分依次进入检测器流通池，检测器对井冈霉素各组分采集数据并将色谱图及相关数据保存于电脑中，分析完毕的试样与流动相一起排入废液瓶中，这样完成标样溶液Ⅰ进样分析，接着按标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ、试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ的顺序依次进样分析;

7）、数据分析：

从色谱工作站中调出标样溶液Ⅰ、标样溶液Ⅱ、标样溶液Ⅲ的图谱，进行较准、绘制标准曲线；

      标准曲线回归方程Area=k×Amt +b， R²须大于或等于0.999，调出试样溶液Ⅰ、试样溶液Ⅱ的图谱，将试样溶液中井冈霉素A的峰面积代入标准曲线回归方程计算出试样进样时井冈霉素A浓度C_A ,则试样中井冈霉素A的质量分数X_A(%)的计算式为:

            X_A = C_A ×50×100×100/2/m₁

式中：m₁——试样的质量，单位为毫克；

X_A——井冈霉素A的质量分数，数值以%表示；

C_A——试样进样时井冈霉素A浓度，单位为微克/毫升；

试样中井冈霉素A的质量分数为两次平行结果取平均值；

从试样图谱中查出试样中井冈霉素A相关组分的峰面积A_X，用加热减量法测出试样的固形物百分含量S，粉剂试样其干物质含量即为其固形物百分含量S，则试样的纯度P为：

P= X_A  ×100/ S

式中:

X_A为井冈霉素A的质量百分含量；

S 为样品固形物质量百分含量；

井冈霉素A相关组分的质量分数X(%)的计算式为：

X=A_X ×P /A _A

式中: 

 A _A为组分A峰面积,

A_X 为其它相关组分峰面积,

         P为试样纯度；

各组分质量百分数为两次平行结果取平均值;

8）、对井冈霉素产品中VA、VM-B、VM-C、V-MD、VM-E、VM-F、VxA-A七种组分进行定性并定量。

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