CN111398494A - 一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法 - Google Patents

一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111398494A
CN111398494A CN202010194212.3A CN202010194212A CN111398494A CN 111398494 A CN111398494 A CN 111398494A CN 202010194212 A CN202010194212 A CN 202010194212A CN 111398494 A CN111398494 A CN 111398494A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nicotine
sample
dimensional
liquid chromatography
tobacco
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010194212.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111398494B (zh
Inventor
朱瑞芝
司晓喜
王凯
蒋薇
刘志华
张凤梅
何沛
杨继
李振杰
向能军
刘春波
唐石云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Original Assignee
China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd filed Critical China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority to CN202010194212.3A priority Critical patent/CN111398494B/zh
Publication of CN111398494A publication Critical patent/CN111398494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111398494B publication Critical patent/CN111398494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns
    • G01N30/463—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns for multidimensional chromatography

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法，包括以下步骤：①样品前处理；②样品检测；③S‑(‑)‑烟碱和R‑(+)‑烟碱的定量测定。本发明的分离测定方法首次采用了反相二维液相色谱体系，稳定性大大提高；本发明还提供了一种含烟碱的样品或纯烟碱样品中烟碱来源的辅助识别方法。

Description

一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光 异构体分离测定方法。
背景技术
烟碱是烟草和烟气中含量最丰富的生物碱，是烟草最重要的生理性活性成 分。烟碱分子含有一个手性中心，有两个旋光体：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱，两者 在烟草中含量、代谢机理和生理特性完全不同。已报道的烟碱手性分离方法主要 有毛细管电泳法、核磁共振法(NMR)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱 (GC)及其联用法等。
烟碱旋光异构体的构成比例是烟草特征性成分之一。2018年发布了烟草行 业标准YC/T 561—2018《烟草特征性成分烟碱旋光异构体比例的测定高效 液相色谱法和超高效合相色谱—串联质谱法》，推荐了两种烟碱旋光异构体比例 的测定方法，即正相手性柱分离的高效液相色谱法和超高效合相色谱—串联质谱 法。这两种测定方法的色谱体系受试剂和环境中水分影响较大，保留时间不稳定； 同时由于液相色谱方法反相色谱和正相色谱之间溶剂体系切换所需时间长，而且 对仪器稳定性影响较大，不利于实验室多种方法的开展和仪器维护。另外，由于 烟碱两个对映体含量差别较大，对测定方法的灵敏度要求较高，对于较为复杂的 基质，有效排除杂质干扰是方法准确度的保证；标准所推荐的两种测定方法难以 达到要求。
为解决上述问题提出本发明。
发明内容
本发明首次提出了基于反相二维液相色谱分离烟草及烟草制品中烟碱的旋 光异构体的测定方法。通过在一维柱中对烟碱的富集、净化和精准切割，再在二 维液相中进行手性分离，有效解决了烟草复杂基质的干扰，方法稳定性好，灵敏 度高，适用于富杂基质中烟碱的旋光异构体的分离和测定。
本发明的技术方案如下：
本发明第一方面公开了一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定 方法，包括以下步骤：
①样品前处理：将样品加入适量甲醇中萃取，取上层清液得待测液；
②样品检测：将步骤①得到的待测液进行反向二维液相色谱检测，采用峰面 积归一化法测定待测液中的碱旋光异构体即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的相对含量；
③S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定量测定：配制标准工作溶液，建立S-(-)-烟碱 和R-(+)-烟碱建立线性回归方程，对待测液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱进行准确的 定量分析。
优选地，所述的样品包括烟叶、烟丝、传统卷烟、加热卷烟、电子烟烟油 或烟草提取物中的一种。
优选地，步骤①中的烟草样品与甲醇的固液比为1:10～1:200(g:mL)， 萃取方式为振荡萃取、超声萃取中的一种，萃取时间为10～180min。
优选地，步骤②中液相色谱条件如下：
一维色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18，(4.6*50mm，2.7μm)； 流速1mL/min；流动相A：50mmol/L的醋酸铵溶液；流动相B：甲醇；梯度洗 脱，洗脱顺序见下表：
梯度洗脱顺序
Figure BDA0002416990160000021
定量环，40～500μL；
二维液相色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T，(4.6*150mm，2.7um)；流动相包括：甲醇＝45v/v％，乙腈＝55v/v％；流速1mL/min。
优选地，所述二维液相色谱柱的流动相还含有0.25v/v％的醋酸及0.05v/v％ 三乙胺。
优选地，步骤②中所用仪器为光电二极管阵列检测器，其参考检测波长为 255～265nm，柱温箱：25～35℃，进样量：2～5μL。
优选地，步骤②中检测步骤包括：一维色谱柱对进样样品进行初步分离富集 净化，目标物在一维色谱柱出峰的时间段内通过切换阀进行精准切割，切割后的 目标物进入定量环保留；然后二维流动相将目标物从定量环转移至二维液相色谱 柱，实现对烟碱同分异构体的分离。二维液相色谱柱为二维手性色谱柱。
优选地，步骤③中的标准工作溶液的配制使用的溶剂为甲醇、异丙醇中的一 种。
本发明第二方面公开了所述的方法用于含烟碱的样品中烟碱来源的辅助识 别方法的用途。
相对于现有技术，本发明具有以下显著优点：
1、本发明的分离测定方法，采用了反相二维液相色谱体系，克服了基于正 向液相色谱的烟碱的旋光异构体分析体系中试剂和环境中水分对体系的影响较 大的缺点，稳定性大大提高。
2、本发明的分离测定方法，在一维柱中对烟碱进行富集、净化和精准分离 切割，再在二维柱中进行手性分离，有效解决了烟草复杂基质的干扰；操作简单、 稳定性好、灵敏度高、准确度好、分析时间短，适用于复杂基质中烟碱旋光异构 体的分离及定量测定。
3、本发明的方法提供了一种用于含烟碱的样品或纯烟碱样品中烟碱来源的 辅助识别方法的用途；2％的R-(+)-烟碱旋光异构体比例大致可以作为样品中烟 碱可能来源于烟草提取的识别指标。
附图说明
图1为本发明的在线中心切割的二维液相系统切换流路示意图。
图2为实施例3晒黄烟的烟叶中烟碱旋光异构体的二维液相色谱图。
图3为不同来源的烟草中R-(+)-烟碱旋光异构体比例。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步地说明，但本发明的保护范围 并不限于此。
(1)仪器与试剂
Agilent1260-Agilent1290二维液相色谱仪(美国Agilent公司)； Milli-Q-Intergral5超纯水仪(美国Millipore公司)；SHZ-88水浴恒温振荡器(金坛 市医疗仪器厂)；BT125D电子天平(感量0.0001g，德国赛多利斯科学仪器有限 公司)；KQ-700DB数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；具塞离心 管，50mL；一次性无菌注射器；5mL；有机相滤膜，0.22μm(上海楚定分析 仪器有限公司)。
甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，乙腈(色谱纯，德国Merck公司)， 三乙胺(分析纯，南京化学试剂有限公司)，乙酸(分析纯，国药集团化学试剂 有限公司)、乙酸铵，二乙胺(分析纯，廊坊鹏彩精细化工有限公司)、甲酸铵 (分析纯，南京化学试剂股份有限公司)、外消旋体烟碱标准品(纯度＞90％, 加拿大TRC公司)，左旋烟碱(S-(-)-烟碱)和右旋烟碱(R-(+)-烟碱)标准品 (纯度＞99％，加拿大TRC公司)；烟草样品均由云南中烟工业有限责任公司 技术中心提供；卷烟样品为市售卷烟。
(2)系列标准工作溶液配制
根据需要配制合适浓度的系列标准工作溶液，配制0.025、0.05、0.1、0.25、0.500mg/mL的左旋烟碱(S-(-)-烟碱)标准工作溶液。配置得到浓度为0.0002、 0.0005、0.01、0.02、0.05mg/mL的右旋烟碱(R-(+)-烟碱)系列标准溶液，各级 标准工作溶液即配即用。
(3)样品制备
取烟草样品磨粉后获得烟末样品，准确称取0.2g烟末样品，精确至0.0001g， 放入50mL离心管中，加入30mL萃取剂甲醇密闭，放入超声波水浴中，于常 温下超声萃取40min，过0.22μm有机相滤膜后进样分析。
空白试验：离心管中不加烟草样品加入30mL甲醇溶液，与上述烟草样品 处理方式相同，进二维液相色谱仪分析。
(4)仪器条件
一维色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18，(4.6*50mm，2.7μm)； 流速1mL/min；流动相A：50mmol/L的醋酸铵溶液；流动相B：甲醇，梯度洗 脱，见表2：
表2 梯度洗脱顺序
Figure BDA0002416990160000051
定量环；
二维液相色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T，(4.6*150mm，2.7μm)；流动相：甲醇＝45％(加0.25％的醋酸及0.05％三乙胺)，乙腈＝55％； 流速1mL/min。
检测波长为259nm，柱温箱：25℃，进样量：3μL。
(5)方法评价
Figure BDA0002416990160000052
实施例1-17：样品中烟碱旋光异构体的分析结果
Figure BDA0002416990160000053
Figure BDA0002416990160000061
由上表可以看出，本方法可消除基质干扰，测试结果稳定，适合复杂基质中 烟碱旋光异构体的测定；同时烟草及烟草制品中R-(+)-烟碱比例和其它作物之间 存在显著差异性。
图2为实施例3晒黄烟的烟叶中烟碱旋光异构体的二维液相色谱图。由图2 可以看出，一维色谱图中1min-10min为样品中的杂质峰，3.8min-4.0min时， 目标烟碱被精准切割，进入二维液相色谱，并在12min-15min出峰，S-(-)-烟碱 和R-(+)-烟碱得到了很好的基线分离，并且含量低的R-(+)-烟碱不受基质干扰。 表明样品中目标物在一维色谱图中得到很好的富集、净化分离，消除了基质干扰； 在二维色谱图中，S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱得到很好的基线分离。其他实施例的情 况类似。
(6)样品普查及数据分析
根据本方法，对700多个样品进行R-(+)-烟碱比例分析，样品包括烟叶、卷 烟、无烟气烟草、电子烟、草本卷烟、其它含烟碱作物以及合成烟碱，数据分析 如图3所示，由图3可知：a)电子烟和烟草提取烟碱中的R-(+)-烟碱旋光异构体 比例高于烟叶、卷烟、无烟气烟草、草本卷烟中R-(+)-烟碱旋光异构体的比例， 基本都处于1％以下。b)其他作物中R-(+)-烟碱旋光异构体比例最高，达到 2％～4％。c)市售合成烟碱主要有两种，分别是外消旋烟碱和R-(+)-烟碱，其中 R-(+)-烟碱所占比例分别为50％以上。
由此可见，R-(+)-烟碱旋光异构体比例2％可以作为样品中烟碱可能来源于 烟草提取的识别指标。
图3为不同来源的烟草中R-(+)-烟碱旋光异构体比例。由图3可以看出，2％ 的R-(+)-烟碱旋光异构体比例大致可以作为样品中烟碱可能来源于烟草提取的 识别指标。

Claims (9)

1.一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
①样品前处理：将样品加入适量甲醇中萃取，取上层清液得待测液；
②样品检测：将步骤①得到的待测液进行反向二维液相色谱检测，采用峰面积归一化法测定待测液中的碱旋光异构体即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的相对含量；
③S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定量测定：配制标准工作溶液，建立S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱建立线性回归方程，对待测液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱进行准确的定量分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品包括烟叶、烟丝、传统卷烟、加热卷烟、电子烟烟油或烟草提取物中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中的烟草样品与甲醇的固液比为1:10～1:200(g:mL)，萃取方式为振荡萃取、超声萃取中的一种，萃取时间为10～180min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中液相色谱条件如下：
一维色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18，(4.6*50mm，2.7μm)；流速1mL/min；流动相A：50mmol/L的醋酸铵溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱，洗脱顺序见下表：
梯度洗脱顺序
Figure FDA0002416990150000011
定量环，40～500μL；
二维液相色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T，(4.6*150mm，2.7um)；流动相包括：甲醇＝45v/v％，乙腈＝55v/v％；流速1mL/min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述二维液相色谱柱的流动相还含有0.25v/v％的醋酸及0.05v/v％三乙胺。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中所用仪器为光电二极管阵列检测器，其参考检测波长为255～265nm，柱温箱：25～35℃，进样量：2～5μL。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤②中检测步骤包括：一维色谱柱对进样样品进行初步分离富集净化，目标物在一维色谱柱出峰的时间段内通过切换阀进行精准切割，切割后的目标物进入定量环保留；然后二维流动相将目标物从定量环转移至二维液相色谱柱，实现对烟碱同分异构体的分离。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤③中的标准工作溶液的配制使用的溶剂为甲醇、异丙醇中的一种。
9.根据权利要求1所述的方法用于含烟碱的样品中烟碱来源的辅助识别方法的用途。
CN202010194212.3A 2020-03-19 2020-03-19 一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法 Active CN111398494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010194212.3A CN111398494B (zh) 2020-03-19 2020-03-19 一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010194212.3A CN111398494B (zh) 2020-03-19 2020-03-19 一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111398494A true CN111398494A (zh) 2020-07-10
CN111398494B CN111398494B (zh) 2022-07-12

Family

ID=71432618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010194212.3A Active CN111398494B (zh) 2020-03-19 2020-03-19 一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111398494B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113376303A (zh) * 2021-05-14 2021-09-10 河北中烟工业有限责任公司 一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104062385A (zh) * 2014-07-18 2014-09-24 云南中烟工业有限责任公司 一种检测电子烟烟气中烟碱含量的方法
CN106770809A (zh) * 2017-03-15 2017-05-31 上海烟草集团有限责任公司 一种电子烟烟液中烟碱手性异构体的分析方法
CN106770808A (zh) * 2017-03-10 2017-05-31 国家烟草质量监督检验中心 一种电子烟液中烟碱的手性分析高效液相色谱法
CN106885857A (zh) * 2017-03-15 2017-06-23 上海烟草集团有限责任公司 一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法
CN106950322A (zh) * 2017-05-15 2017-07-14 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种烟草及烟草制品中烟碱旋光异构体的正相液相色谱‑串联质谱检测方法
CN110646536A (zh) * 2019-09-26 2020-01-03 上海烟草集团有限责任公司 一种卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺的在线二维色谱串联质谱的测定方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104062385A (zh) * 2014-07-18 2014-09-24 云南中烟工业有限责任公司 一种检测电子烟烟气中烟碱含量的方法
CN106770808A (zh) * 2017-03-10 2017-05-31 国家烟草质量监督检验中心 一种电子烟液中烟碱的手性分析高效液相色谱法
CN106770809A (zh) * 2017-03-15 2017-05-31 上海烟草集团有限责任公司 一种电子烟烟液中烟碱手性异构体的分析方法
CN106885857A (zh) * 2017-03-15 2017-06-23 上海烟草集团有限责任公司 一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法
CN106950322A (zh) * 2017-05-15 2017-07-14 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种烟草及烟草制品中烟碱旋光异构体的正相液相色谱‑串联质谱检测方法
CN110646536A (zh) * 2019-09-26 2020-01-03 上海烟草集团有限责任公司 一种卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺的在线二维色谱串联质谱的测定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NORBERTO M. GONZALEZ: "METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION FOR THE DETERMINATION OF NICOTINE ENANTIOMERS IN ELECTRONIC CIGARETTE LIQUIDS USING REVERSED-PHASE AND CHIRAL PHASE HIGH PREFORMANCE LIQUID CHROMOTOGROPHY", 《WWW.SEARCH.PROQUEST.COM》 *
余晶晶 等: "电子烟烟液中烟碱旋光异构体的手性液相色谱分离及测定", 《化学研究与应用》 *
张杰 等: "在线二维固相萃取-HPLC-MS/MS法测定卷烟侧流烟气中的TSNAs", 《烟草科技》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113376303A (zh) * 2021-05-14 2021-09-10 河北中烟工业有限责任公司 一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111398494B (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106290682B (zh) 一种茶叶中烟碱的手性分析方法
CN105675757B (zh) 一种同时测定卷烟主流烟气中烟草特有n‑亚硝胺和多环芳烃的方法
CN109884207B (zh) 一种快速准确分析菜籽油中多酚含量的方法
CN107024552B (zh) 一种测定玉兰亚属植物中植物激素的方法
CN112730696A (zh) 一种利用hplc法检测火麻油中5种大麻酚化合物的方法
CN103323543A (zh) 一种检测卷烟烟气中17种多环芳烃的方法
CN105527356B (zh) 一种基于吸头‑微萃取的卷烟主流烟气中烟草特有n‑亚硝胺和多环芳烃的同时测定方法
CN103293245A (zh) 同时分析卷烟主流烟气中四种烟草特有亚硝胺（TSNAs）的GC-MS/MS方法
CN115184497B (zh) 一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法
CN106198796B (zh) 一种超临界流体色谱-气相色谱-质谱测定卷烟主流烟气中苯并[a]芘的方法
CN111398494B (zh) 一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法
CN109470789B (zh) 一种烟草及烟草制品中降烟碱、假木贼碱与新烟草碱的手性分析方法
CN107315058A (zh) 一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法
CN108152425B (zh) 一种高效液相色谱检测芝麻油木脂素的方法
CN111505178B (zh) 一种卷烟中烟碱旋光异构体迁移率的分离测定方法
CN103713058B (zh) 一种化风丹药母中双酯型生物碱的检测方法
CN106338559A (zh) 一种氯消毒副产物二氯乙酰胺的气相色谱检测方法
CN112710743B (zh) 碳酸酯溶剂中杂质的分离与检测方法及其应用
CN104569253B (zh) 一种卷烟主流烟气中苯并[a]芘的测定方法
Xu et al. Sensitive determination of cyanide in cigarette smoke by capillary GC with a microECD
CN108982684B (zh) 一种检测和鉴别石格菜的方法
CN114740105B (zh) 一种脯氨酸和n-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法及其应用
CN112557534B (zh) 一种空气环境内分泌干扰物检测方法
CN113640401B (zh) 一种土壤中马兜铃酸的检测方法
CN110579547B (zh) 一种威灵仙药材hplc指纹图谱的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant