CN104280495A

CN104280495A - 检测水和水稻植株中的井冈霉素a的方法

Info

Publication number: CN104280495A
Application number: CN201410169872.0A
Authority: CN
Inventors: 张昌朋; 赵华; 吴珉; 平立凤; 朱亚红; 张春荣; 何红梅; 汤涛
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: CN104280495B

Abstract

本发明提供一种检测田水中井冈霉素A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）量取田水样品10mL到刻度管中，加入甲酸水，调节田水的pH值为2-3，混匀，待净化；2）净化的步骤包括：提供MCX小柱，3cc/60mg,；用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MCX小柱，2mL的经0.2%甲酸水酸化后的田水样品全部上样，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液体；3mL的5%氨水甲醇溶液洗脱MCX小柱，洗脱液在50℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测。通过本发明的方法，可以提高检测的最低阀值，提高了检测的灵敏度。

Description

检测水和水稻植株中的井冈霉素A的方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，特别的，属于井冈霉素A在水和水稻植株中的分析检测方法。背景技术

井冈霉素(validamycin)是由水链霉菌井冈变种产生的水溶性抗生素，共有A、B、C、D、E、F6种组分，主要活性物质为井冈霉素A，一般产品中均以A组分的含量来标示产品的规格及产品的质量。井冈霉素为我国独立开发研制的生物源杀菌剂，至今未见有关抗药性上升的报道，也无变异菌种的报道，主要用于防治水稻纹枯病菌，对丝核菌亦有良好生物活性，具有强内吸性，兼具保护和治疗作用，是我国南方稻区防治水稻纹枯病的主要药剂品种，使用量大。

井冈霉素A(Validamycin A)的化学名称为N-[(1S)-(1,4,6/5)-3-羟甲基-4,5,6-三羟基-2-环己烯]-(O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-(1S)-(1,2,4/3,5)-2,3,4-三羟基-5-羟甲基环己胺(A组分)；化学结构式为

分子式C₂₀H₃₅NO₁₃，分子量497.23。井冈霉素无一定熔点，95-100℃软化，约135℃分解。易溶于水，可溶于甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，微溶于乙醇和丙酮，不溶于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、苯和石油醚。

井冈霉素A是氨基糖苷类化合物，分子中含多个极性基团，难于气化，不能直接进行气相色谱分析。对井冈霉素A原药和制剂的分析多采用高效液相色谱法、毛细管电泳法、离子交换色谱法、薄层荧光法及填充柱气相色谱衍生化方法等。许鹏军等采用柱前衍生化毛细管气相色谱法测定了土壤中井冈霉素A的残留。余晓江等研究并建立了井冈霉素A在大米和稻壳中的残留分析方法。样品经溶剂提取，C₁₈固相萃取小柱净化后，用液相色谱检测。但是这些方法需要前期的复杂的提取步骤，提取净化过程较复杂，且净化效果不理想。有待对这些方法进行改进。

发明内容

为了改进现有的方法，本发明一方面，本发明提供一种田水中井冈霉素A的提取和净化的方法，该方法包括以下步骤：

1)、量取田水样品10mL到刻度管中，加入甲酸水，调节田水的pH值为2-3，混匀，待净化；

2)、净化的步骤包括：提供MCX小柱，3cc/60mg,；用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MCX小柱，2mL的经0.2％甲酸水酸化后的田水样品全部上样，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液体；3mL的5％氨水甲醇溶液洗脱MCX小柱，洗脱液在50℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测。

在一些优选的方式中,10mL田水样品中加入10mL0.2％甲酸水，让混合后的液体pH值为2.7。我们惊讶的发现，如果甲酸水太少或让经过甲酸水处理的田水样本的pH值大于3，井冈霉素A不能被完全离子化，从而使井冈霉素A不能完全保留到MCX小柱上，最终不能达到净化的目的。

相反，如果甲酸水太多，或让处理的样本pH值小于2，井冈霉素A将保留在MCX小柱上后，洗脱液(例如，5％氨水甲醇溶液)不能把井冈霉素A完全洗脱下来，这样降低了在后续测试的井冈霉素A的浓度。

只有当这个pH值为2～3的条件下，样品过MCX小柱，能够保证既把样品保留在MCX小柱上，达到净化的目的，用洗脱液(5％氨水甲醇溶液)又能够把井冈霉素A完全洗脱下来。

我们也试图寻找其他试剂来代替甲酸水，但是经过多次试验后，发现甲酸水的效果是最好的，例如使用盐酸、醋酸等试剂，都不能获得理想的净化效果，而且在后续的进行上样检测的时候，不能获得更精确的检测值，最低检测浓度都很高。

在一些优选的方式中，田水是指从田间直接采集的样本，而不需要对样本进行任何前期的预处理，比如通过过滤、离心等方式除去田水中的颗粒杂质、沉淀等。本发明的方法中，可以直接采集田间的水样本(例如稻田里的水)进行处理，并经过后期的纯化处理，直接进行上样测试。

在一些方式中，田水样品10mL可以被任何样品替代，例如，为了检测植物中的井冈霉素A，一般先从植物中进行井冈霉素A的提取，然后再经过处理后，最终进行井冈霉素A的测定。

从植物组织，例如水稻组织中提取井冈霉素A的方法如下：

1)、称取成熟期干燥的水稻茎秆2g(精确至0.01g)，加入60mL甲醇/水溶液(8/2，V/V)振荡1小时后，布氏漏斗抽滤到分液漏斗中，获得的滤液用石油醚(100mL×2)萃取两次，弃去石油醚相，甲醇/水混合相在60℃浓缩干，加入4mL纯净水溶解，再在4mL纯净水溶解的溶液中加入甲酸水，让溶液的PH为2-3，混匀，待净化；

2)、净化的步骤包括：提供MCX小柱，3cc/60mg；用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MCX小柱，2mL的经0.2％甲酸水酸化后的田水样品全部上样，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液体；3mL的5％氨水甲醇溶液洗脱MCX小柱，洗脱液在50℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，进行检测。

在一些优选的方式中，测定采用超高效液相色谱进行测定，测定的条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC Hilic(1.7μm，2.1×100mm，Waters公司)。流动相：乙腈/10M Mol醋酸铵溶液＝70/30；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL。

在一些优选的方式中，质谱条件：毛细管电压：3.0KV；离子源温度：150℃；去溶剂温度：400℃；去溶剂气流量800L/hr；锥孔反吹气流量：30L/hr；碰撞气流量：0.15mL/min；定量模式：MRM模式；电离方式：ESI+；母离子：498.2；锥孔电压28；定量离子：178.2，(碰撞能量：28eV)；定性离子：336.19(碰撞能量24eV)。

附图说明

图1为井冈霉素A标准曲线。

图2为井冈霉素A0.1mg/L标准溶液色谱图

有益效果

国内外关于井冈霉素A在各种基质中的前处理方法是采用衍生化的方法，或者是采用C₁₈固相萃取小柱净化，提取净化过程较复杂，且净化效果不理想。本方法的前处理过程简单，省去了大量有机溶剂的使用，回收率高，重复性好，净化分离效果好，而且最低检测浓度比较低，适合于井冈霉素A在水和水稻植株中的分析检测；井冈霉素A在水中的最低检测浓度为0.02mg/kg，在水稻植株中的最低检出浓度为0.05mg/kg。

具体实施方式

1材料与方法

1.1主要仪器设备和化学试剂

超高效液相色谱串联质谱仪(超高效液相色谱仪型号为Waters ACQUITY UPLC，质谱仪型号为Waters Xevo TQ MS，Waters公司)、

THZ-82A型气浴恒温振荡器(金坛医疗仪器厂)、

R-201型旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)、

乙腈(色谱纯Honeywell4L，Burdick&Jackson公司)、

甲醇(色谱纯Honeywell4L，Burdick&Jackson公司)、

甲醇(分析纯500mL，上海凌峰化学试剂有限公司)、

醋酸铵(HPLC500g，TEDIA COMPANY，INC公司)、

甲酸(99％，HPLC1L，Anaqua company)、

MCX小柱(3cc/60mg,Waters公司)、

HLB小柱(3cc/60mg,Waters公司)、

滤膜(0.22μm，型号为TQP-61322,Pall公司)

1.2方法

1.2.1仪器条件

超高效液相色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC Hilic(1.7μm，2.1×100mm，Waters公司)。流动相：乙腈/10MMol醋酸铵溶液＝70/30；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL。

质谱条件：毛细管电压：3.0KV；离子源温度：150℃；去溶剂温度：400℃；去溶剂气流量800L/hr；锥孔反吹气流量：30L/hr；碰撞气流量：0.15mL/min；定量模式：MRM模式；电离方式：ESI+；母离子：498.2；锥孔电压28；定量离子：178.2，(碰撞能量：28eV)；定性离子：336.19(碰撞能量24eV)。

1.2.2提取和净化

田水中井冈霉素A的提取和净化：

量取田水样品10mL到刻度管中，加入10mL0.2％甲酸水。

实验过程必须添加甲酸水。添加甲酸水后，井冈霉素A带上H⁺，从而被离子化。离子化后的井冈霉素A才能被MCX小柱吸附。样品上样后，使井冈霉素A富集在小柱上，用甲醇淋洗掉一些杂质，再用洗脱液(5％氨水甲醇溶液)洗脱井冈霉素A，从而达到净化井冈霉素A的目的。

净化(MCX小柱，3cc/60mg,Waters公司)：3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MCX小柱，2mL经0.2％甲酸水酸化后的田水样品全部上样，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液体。3mL5％氨水甲醇溶液洗脱MCX小柱，洗脱液50℃条件下浓缩干，甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜，待进样。

植株中井冈霉素A的提取和净化：

称取植株样品(成熟期干燥的水稻茎秆，不包括叶片)2g(精确至0.01g)，加入60mL甲醇/水溶液(8/2，V/V)振荡1小时后，布氏漏斗抽滤到分液漏斗中，获得的滤液用石油醚(100mL×2)萃取两次，弃去石油醚相，甲醇/水混合相在60℃浓缩干，加入4mL纯净水溶解，待净化。

净化(HLB小柱)：3mL甲醇、3mL水分别按照顺序添加进行活化HLB小柱，取2mL溶解液全部上样，3mL纯净水洗脱，用吸耳球吹干HLB小柱中的液体。洗脱液收集经过HLB小柱的溶解液和洗脱液到平底烧瓶中，50℃条件下浓缩干，甲醇定容到2.0mL，过0.22μm滤膜过滤，待测定。

MCX小柱是混合型阳离子交换固相萃取小柱，提供了离子交换和反相双重保留模式，而且保留作用发生在一种洁净、稳定、高表面积、在pH0-14范围内稳定的有机共聚物上。

HLB固相萃取小柱用的是亲水亲脂平衡聚合物。吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留机理为反相，通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留提供很好的水浸润性。HLB小柱用于酸性，中性和碱性化合物的通用型吸附剂；具有高吸附容量、高而稳定的回收率；即使柱床干涸，回收率也不受影响。

C18是反相萃取小柱，填料是疏水性的，用来萃取非极性分析物。C₁₈小柱柱床不能干涸，否则影响回收率。

2结果

2.1分析方法线性关系的测定

用纯水配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L的井冈霉素A标准溶液，分别进样1μL，获得UPLC-MS/MS的响应值(见表1)，以浓度-峰面积绘制井冈霉素A标准溶液曲线(见图1)，其回归方程为y＝48495x+24.76(R²＝0.9992)。

表1井冈霉素A标准曲线

2.2方法的回收率和检出限

根据井冈霉素A在超高效液相色谱串联质谱仪的响应情况，在0.02/0.05～2.0mg/kg范围内分别设定了3种添加浓度，每种添加浓度设5个重复。

根据井冈霉素A在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，井冈霉素A在水样品中设定了3档添加浓度(0.02、0.2和2.0mg/L)，井冈霉素A在水稻植株样品中设定了3档添加浓度(0.05、0.2和2.0mg/L)，每档添加浓度设5个重复。

按上述提取、净化及测定步骤，进行添加回收率试验。得到水和水稻植株样品中井冈霉素A的添加回收率和相对标准偏差(RSD)，见表2。由表2可知，井冈霉素A在田水中添加浓度为0.02、0.2和2.0mg/kg时，平均回收率分别为90％、102％和99％，相对标准偏差分别为5.3％、1.7％和6.7％。井冈霉素A在水稻植株中添加浓度为0.05、0.2和2.0mg/kg时，平均回收率分别为74％、78％和89％，相对标准偏差分别为3.7％、4.8％和2.4％。

超高效液相色谱串联质谱仪对井冈霉素A的最小检出量为5×10^-12g。

根据井冈霉素A在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，以及田水中井冈霉素A最低添加浓度0.02mg/L的样品、和水稻植株中井冈霉素A最低添加浓度0.05mg/L的样品在仪器上响应值均大于仪器的3倍信号噪音比，得出：井冈霉素A在水中的最低检测浓度为0.02mg/kg，在水稻植株中的最低检出浓度为0.05mg/kg。

因此该方法完全满足农药残留分析中对准确度、精密度和灵敏度的要求。

表2井冈霉素A的添加回收率

3结论

本发明建立了水和水稻植株中井冈霉素A的分析检测方法。该方法井冈霉素A在0.005～0.2mg/L浓度范围内呈良好的线性关系；井冈霉素A在田水中的平均回收率为90％～102％，相对标准偏差为1.7％～6.7％，最低检测浓度为0.02mg/kg；井冈霉素A在植株中添加浓度为0.05～2.0mg/kg时，平均回收率为74％～89％，相对标准偏差为2.4％～4.8％，最低检测浓度为0.05mg/kg。该方法操作简便，准确可靠、可满足农药残留分析的要求，并可用于大量样品的快速检测。

Claims

1.一种检测田水中井冈霉素A的方法，其特征在于，该方法由以下顺序的步骤组成：1）、量取田水样品10 mL到刻度管中，加入甲酸水，调节田水的pH值为2-3，混匀，待净化；2）、净化的步骤包括：提供MCX小柱，3cc/60mg,；用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MCX小柱，2 mL的经0.2%甲酸水酸化后的田水样品全部上样，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液体；3mL的5%氨水甲醇溶液洗脱MCX小柱，洗脱液在50℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0 mL，过0.22μm滤膜，进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在10 mL田水样品中加入10 mL0.2%甲酸水，让混合后的液体pH值为2.7。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，甲酸水的浓度为0.2%。

4.一种检测水稻中井冈霉素A的方法，其特征在于，该方法由以下顺序的步骤组成：1)、从水稻中提取井冈霉素A，其中提取的方法包括：称取成熟期干燥的水稻茎秆2g（精确至0.01g），加入60 mL甲醇/水溶液（8/2，V/V）振荡1小时后，布氏漏斗抽滤到分液漏斗中，获得的滤液用石油醚（100mL×2）萃取两次，弃去石油醚相，甲醇/水混合相在60℃浓缩干，加入4mL纯净水溶解；2）、再在4mL纯净水溶解的溶液中加入甲酸水，让溶液的PH为2-3，混匀，待净化；3）、净化的步骤包括：提供MCX小柱，3cc/60mg；用3mL甲醇和3mL水分别按照顺序添加进行活化MCX小柱，2 mL的经0.2%甲酸水酸化后的田水样品全部上样，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液体；3mL的5%氨水甲醇溶液洗脱MCX小柱，洗脱液在50℃条件下浓缩干，用甲醇定容到2.0 mL，过0.22μm滤膜，进行检测。

5.根据权利1或4所述的方法，检测的方法包括采用超高效液相色谱进行测定，测定的条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC Hilic（1.7μm，2.1×100mm，Waters公司）；流动相：乙腈/10M Mol 醋酸铵溶液= 70/30；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；质谱条件：毛细管电压：3.0KV；离子源温度：150℃；去溶剂温度：400℃；去溶剂气流量800L/hr；锥孔反吹气流量：30L/hr；碰撞气流量：0.15 mL/min；定量模式：MRM模式；电离方式：ESI+；母离子：498.2；锥孔电压28；碰撞能量为28eV的定量离子：178.2；碰撞能量为24eV的定性离子：336.19。

6.一种检测水稻中井冈霉素A的方法，其特征在于，该方法由以下顺序的步骤组成：1)、从水稻中提取井冈霉素A，其中提取的方法包括：称取成熟期干燥的水稻茎秆2g，加入60 mL甲醇/水溶液（8/2，V/V）振荡1小时后，布氏漏斗抽滤到分液漏斗中，获得的滤液用石油醚（100mL×2）萃取两次，弃去石油醚相，甲醇/水混合相在60℃浓缩干，加入4mL纯净水溶解；2)、净化：3mL甲醇、3mL水分别按照顺序添加进行活化HLB小柱，取2mL溶解液全部上样，3mL纯净水洗脱，用吸耳球吹干HLB小柱中的液体；洗脱液收集经过HLB小柱的溶解液和洗脱液到平底烧瓶中，50℃条件下浓缩干，甲醇定容到2.0 mL，过0.22μm滤膜过滤，待测定。