CN104991013B - 一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法，该多功能净化柱包含以下部件：反相色谱填料、阳离子交换色谱填料。本发明提供的多功能净化柱可以适用于各种水果、蔬菜、粮食、饲料和食品样品。

Description

一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种多功能净化柱的制作和使用方法，尤其涉及一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌产生的次级代谢产物。它们在农作物产品、食品及饲料中的污染情况日趋严重，对人和动物的健康造成了极大的危害。其中，由链格孢菌(Alternaria spp)产生的链格孢毒素是全球范围内发生率较高的一类真菌毒素。它广泛污染果蔬、小麦、油料种籽等农产品及其初级加工品，其中在果蔬及其制品中检出率较高。这可能是由于果蔬贮藏过程中链格孢菌能在低温下生长繁殖且产生毒素，此外链格孢菌还可使有些果实内部腐烂而表皮无明显变化。而在果蔬汁等加工制品生产过程中，主要是通过剔除表面可见的腐烂部分降低毒素及病菌污染的风险，但这并不能完全消除风险隐患。

链格孢毒素主要包括5种：交链孢酚(AOH)，交链孢酚单甲醚(AME)，细交链格孢酮酸(TeA)，交链孢烯(AOH)，腾毒素(TEN)。

最近欧洲食品安全局(EFSA)对食品中链格孢毒素的潜在风险进行评估，研究结果表明，随膳食摄入的链格孢毒素对公众健康存在潜在风险，目前已开始着手制定链格孢毒素的最大残留限量标准。尽管我国较早的研究表明，进食受链格孢毒素污染的小麦与该地区食管癌高发病率密切相关。然而，由于链格孢毒素检测技术较落后及对实验动物的急性毒性较弱，长期以来未引起科学界的重视。

目前报道的农产品及食品中链格孢毒素的检测方法主要采用液相色谱法(HPLC)、液相色谱法-质谱法(HPLC-MS/MS)等。此类方法前处理操作繁琐，难以满足现场的、大批量样品的快速检测；而且检测成本高，同时AOH和AME回收率偏低。

而有关多功能净化柱的描述：

在CN201410001661.6(公开号为CN103954714A，黄曲霉毒素)和CN201410835645.7(公开号为CN104502481A，呕吐霉素和玉米赤霉烯酮)提到了mycosep^TM228多功能净化柱。但Mycosep^TM228主要应用于农产品中黄曲霉毒素、展青霉素的多功能净化柱，目前未见针对链格孢毒素开发的多功能净化柱。

另外，CAPCELL PAK CR Strong Cation Exchange&Reversed Phase强阳离子交换与反向粒子混合柱CAPCELL PAK CR是2007年最新推出的产品之一，是将阳离子交换填料SCX与C18包被型填料按一定比例混合(SCX：C18＝1：50，1：20和1：4三种)制成的。可实现离子和亲水性化合物在LC/MS上的同时分离。但经验证，C18填料对于链格孢毒素有较强的吸附能力，按照多功能净化柱适用的方法使用时，回收率低(低于20％)，因此该产品不适用于链格孢毒素的净化。

因此，有必要建立高效且可靠的分析方法来监控链格孢毒素的发生及污染情况。

发明内容

本发明的旨在解决现有固相萃取柱技术对链格孢毒素检测净化效果差，回收率低，并且试剂较为复杂，不能对各种水果、蔬菜、粮食和食品样品进行准确的检测的问题，进而提出一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法。

本发明提供了一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱，该净化柱包含以下部件：反相色谱填料、阳离子交换色谱填料。

具体的，所述多功能净化柱中：反相色谱填料与阳离子交换色谱填料的体积比为1：1-5：1。

优选地，所述多功能净化柱中：反相色谱填料与阳离子交换色谱填料的体积比为1：1-3：1。

本发明所述的多功能净化柱中，还含有筛板，筛板至少有一层，将反向色谱填料与阳离子交换色谱填料用筛板隔开。

优选地，所述筛板有三层，在两个填料中间、两边均有一层。

上述多功能净化柱中：

所述反相色谱填料为HLB，其主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，其粒径优选为40-60μm。

所述阳离子交换色谱填料为MCX，其粒径优选为40-60μm。

所述筛板为10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板。

本发明还提供了上述多功能净化柱的制备方法，具体为：在筛板上加入阳离子交换色谱填料，再加入一层筛板，在此筛板上加入反向色谱填料，其上再加一层筛板，压紧，即得多功能净化柱。

本发明还提供了上述多功能净化柱在净化链格孢毒素方面的应用。

所述净化包括链格孢毒素穿漏法和链格孢毒素吸附法。其中：

所述链格孢毒素穿漏法：将含链格孢毒素的提取液直接加入多功能柱，收集过柱后的提取液，提取液中的杂质被多功能柱保留；或

所述链格孢毒素吸附法：将含链格孢毒素的提取液转换成水相溶液，加入多功能柱，链格孢毒素保留在多功能柱上，最后通过甲醇等有机溶剂洗脱。

净化时，多功能净化柱与样本溶液的体积比为1：10-1：30。

本发明还提供了上述多功能净化柱净化样品在净化其他中性或酸性的毒素方面或在检测链格孢毒素方面的应用。

所述其他中性或酸性毒素为赭曲霉毒素、桔青霉素、黄曲霉毒素，对其他中性或酸性毒素的净化方法优选为穿漏法。

所述检测是利用液相色谱串联质谱仪进行分析，通过多反应监测(MRM)方式进行准确定量。

需要说明的是，本发明提供的多功能净化柱在使用时，反相色谱填料和阳离子交换色谱填料均可以调换位置，或者反向色谱填料在上，或者阳离子交换色谱填料在上。

本发明提供的多功能净化柱具有以下有益效果：

(1)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，适用于各种水果、蔬菜、粮食、饲料和食品样品，样品乙腈/水提取后，可直接过柱，净化，也可溶剂转换后以吸附再洗脱的方式净化，一柱双用。

(2)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，包括两种净化机理：反相分离和离子交换。

(3)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，与通用的固相萃取方法相比，此方法更加简便快捷、节省了样品处理的时间及成本、减少了有机溶剂的消耗量，使毒素检测的前处理更为方便、高效、标准。

(4)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，除适用于链格孢毒素的净化外，也适用于其他中性或酸性的毒素；

(5)本发明提供的多功能净化柱较单独使用阳离子交换色谱填料、反向色谱填料相比，能显著降低基质效应。阳离子交换色谱填料可用于去除碱性和两性化合物杂质，HLB是亲水-亲脂平衡的吸附剂，其保留机理为反相，可有效去除非极性杂质。而链格孢毒素为中等极性的物质，因此，两者填料复配可有效去除样本中的杂质，经处理后的样本十分干净，连续进样后灵敏度不会有明显变化，三重四级杆质谱仪的离子源仍保持干净。此外，若单独使用阳离子交换色谱填料，只能适用于穿漏法；若单独使用反相色谱填料，净化效果较差，基质效应较严重，进而降低仪器的灵敏度。

附图说明

图1为多功能净化柱，其中1为柱管，2为筛板，3为反向色谱填料，4为筛板，5为阳离子交换色谱填料，6为筛板；

图2为多功能净化柱与Waters Oasis HLB固相萃取小柱净化效果比较，上面为净化前，下面的为净化后，右面的三个试管中的液体为Waters Oasis HLB固相萃取小柱净化效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

聚乙烯或聚四氟乙烯筛板的孔径在市场上购买时只能是范围值的孔径，如10-30μm，其平均孔径为22μm，生产厂家为北京茨维特科技有限公司。

同样，反相色谱填料的粒径为40-60μm，其平均粒径为50μm,生产厂家为北京茨维特科技有限公司。

实施例1：多功能净化柱的原料及制备

1、原料：

(1)柱管：6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12.7mm；

(2)筛板：10-30μm孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；

(3)反相色谱填料：200μL粒径为40-60μm反相色谱填料HLB；

(4)阳离子交换色谱填料：200μL粒径为40-60μm阳离子交换色谱填料MCX。

2、组装方法(具体见附图1)

向聚丙烯或玻璃柱管(附图1中的1)中先填入一片筛板(附图1中的6)，加入200μL阳离子交换色谱填料(附图1中的5)，再填入第二块筛板(附图1中的4)，加入200μL反相色谱填料(附图1中的3)，再填入第三块筛板(附图1中的2)，压紧。

实施例2：多功能净化柱的原料及制备

1、原料

(1)柱管：6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12.7mm；

(2)筛板：10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；

(3)反相色谱填料：600μL粒径为40-60μm反相色谱填料HLB；

(4)阳离子交换色谱填料：200μL粒径为40-60μm阳离子交换色谱填料MCX。

2、组装方法

向聚丙烯或玻璃柱管中先填入一片筛板，加入200μL阳离子交换色谱填料，再填入第二块筛板，加入600μL反相色谱填料，再填入第三块筛板，压紧。

实施例3：多功能净化柱的原料及制备

1、原料

(1)柱管：6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12.7mm；

(2)筛板：10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；

(3)反相色谱填料：600μL粒径为40-60μm反相色谱填料；

(4)阳离子交换色谱填料：600μL粒径为40-60μm阳离子交换色谱填料；

2、组装方法

向聚丙烯或玻璃柱管中先填入一片筛板，加入600μL阳离子交换色谱填料，再填入第二块筛板，加入600μL反相色谱填料，再填入第三块筛板，压紧。

实施例4：链格孢毒素的穿漏法

(1)准确称取5.0g(精确至0.01g)均质好的樱桃样品在带盖的离心管中，加入20mL酸化乙腈溶液(乙腈含量85％，含5％甲酸)，涡旋振荡2min后，150r/min常温振荡提取0.5h。然后在10000×g下离心5min，收集上清液待净化。

(2)取5mL上清液，自然通过多功能净化柱(0.4mL)，收集过柱后的上清液，60℃下氮吹近干。

(3)残渣用乙腈/5mM的醋酸铵水溶液(50/50，v/v)溶解，过0.22μm的滤膜后，过滤液(即净化液)待进样分析。

实施例5：链格孢毒素的吸附法

(1)准确称取5.0g(精确至0.01g)均质好的樱桃样品在带盖的离心管中，加入20mL酸化乙腈溶液(乙腈含量85％，含5％甲酸)，涡旋振荡2min后，150r/min常温振荡提取0.5h。然后在10000×g下离心5min，收集上清液待净化。

(2)将5mL上清液转移至10mL刻度试管中，60℃下氮吹至1mL，用水定容至5mL。

(3)将多功能净化柱(0.8mL)依次用5mL甲醇、5mL水活化，将步骤(2)得到的上样液通过多功能净化柱，用约1mL水洗涤刻度试管，洗涤液并入上样液中。再用10％甲醇溶液淋洗，用甲醇-酸化乙腈(1％甲酸)溶液洗脱，60℃下氮吹近干。

(4)残渣用乙腈/5mM的醋酸铵水溶液(50/50，v/v)溶解，过0.22μm的滤膜后，过滤液(即净化液)待进样分析。

实施例6：对实施例4、5的样品进行检测分析

1、检测分析条件如下：

(1)液相分离的条件为：色谱柱为Waters UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)或与其性质类似的反相色谱柱，流动相为(A)5mM醋酸铵水溶液和(B)乙腈。流速为0.3mL/min进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下表1所示：

表1流动相梯度洗脱程序(体积)

时间(min)	B(％)	A(％)
			0	5	95
1.0	5	95
			3.0	95	5
3.5	95	5
			3.6	5	95
5.0	5	95

(2)质谱条件：离子源模式：正负离子模式(ESI⁺和ESI^-)；喷雾电压：3.5kv(ESI⁺)和-1.5kv(ESI^-)；气化温度：400℃；干燥气流速：12mL/min；进样体积为5μL；5种链格孢毒素的质谱参数见表2。

表2链格孢毒素的质谱参数

注：*，定量离子

(3)链格孢毒素多功能净化柱的重复性和变异系数：

称取经测定空白试样5.0g，加入200μL的上述5种链格孢毒素混合标准溶液(500ng/mL^-1的AOH、AME、TeA、ALT、TEN)，充分混匀，并于室温下静置1h，按照实施例4和实施例5的方法分别进行前处理并测定含量，每个处理方法平行测定6份。

2、所有链格孢毒素的添加回收率和变异系数见表3。

表3：5种链格孢毒素的回收率及精密度

已发表的链格孢毒素检测方法利用Waters Oasis HLB固相萃取小柱(200mg)及吸附法方式进行样品前处理(Zhao K,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015)，与实施例5中所述方案相同。

表3结果显示：本发明但改进其洗脱方式，进而提高毒素的回收率。

此外，如图2所示，多功能净化柱的净化效果要好于Waters Oasis HLB固相萃取小柱。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (12)

1.多功能净化柱在净化链格孢毒素方面的应用，所述多功能净化柱与样本溶液的体积比为1：10-1：30；所述多功能净化柱包含体积比为1：1-3：1的反相色谱填料和阳离子交换色谱填料，所述反相色谱填料和阳离子交换色谱填料分别为HLB和MCX。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多功能净化柱还含有筛板，所述筛板至少有一层，筛板在反向色谱填料和阳离子交换色谱填料中间，将两种填料隔开。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述HLB的主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，其粒径为40-60μm。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述MCX的粒径为40-60μm。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述筛板为10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述筛板为三层，分别在反向色谱填料、阳离子交换色谱填料两边和中间。

7.多功能净化柱在检测链格孢毒素方面的应用；所述多功能净化柱包含体积比为1：1-3：1的反相色谱填料和阳离子交换色谱填料，所述反相色谱填料和阳离子交换色谱填料分别为HLB和MCX。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多功能净化柱还含有筛板，所述筛板至少有一层，筛板在反向色谱填料和阳离子交换色谱填料中间，将两种填料隔开。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述HLB的主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，其粒径为40-60μm。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述MCX的粒径为40-60μm。

11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述筛板为10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述筛板为三层，分别在反向色谱填料、阳离子交换色谱填料两边和中间。