WO2013144394A1 - Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de alternaria (alternariol y alternariol monometíl éter) - Google Patents

Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de alternaria (alternariol y alternariol monometíl éter) Download PDF

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WO2013144394A1
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alternariol
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mycotoxins
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Guillermo Orellana Moraleda
María Cruz MORENO BONDI
Ana Belén DELCALZO LÓPEZ
Javier Lucas Urraca Ruiz
Rahma AHMED GEBRIL ABOU HANY
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Universidad Complutense De Madrid
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Definitions

  • the invention relates to materials capable of selectively recognizing and binding mycotoxins and their method of preparation. More specifically, the invention relates to molecular imprint polymers for selectively recognizing alternariol and alternariol monomethyl ether toxins as well as their method of preparation using analogous molecules as templates.
  • the polymers object of the present invention are useful for the determination of alternariol and alternariol monomethyl ether in water, vegetables, fruits, foods, derivatives and other matrices where said toxins can be present. State of the art
  • Alternar ⁇ a family produces a high number of secondary metabolites.
  • Seven major toxins, which belong to three different structural classes, are known as possible food contaminants with a potential toxicological risk. These are: alternariol, alternariol monomethyl ether, alternativeuene, alterotoxins I, II and III and acid Tenuazonic Alternariol (AOH) and alternariol monomethyl ether (AME) are the most relevant mycotoxins produced by Alternaria fungi.
  • Alternar ⁇ a mushrooms in turn, are the most commonly found in foods such as cereal grains, fruits and vegetables.
  • Tomatoes are one of the products most affected by contamination with AOH and AME, with levels of AOH of 25 ⁇ g / kg and AME of 5 ⁇ g / kg being found in concentrated tomato pastes (S. Asam, K Konitzer, M. Rychlik, Mycotox. Res. 2011, 27, 23-28).
  • AOH and AME extraction procedures in analytical methods include, for example, solid phase extraction (SPE).
  • SPE solid phase extraction
  • the methods for determining these most commonly used species are thin layer chromatography (TLC), gas chromatography (GC) and, above all, liquid chromatography (LC) with UV, fluorescent or electrochemical detection (V. Fernández Pinto, en Mycotoxins in Fruits and Vegetables, R. Barkai-Golan, N. Paster, Academic Press, 2008, chapter 13, p. 271-278)
  • WO 2011/031562 describes the preparation of molecular imprint polymers to sequester or adsorb mycotoxins as target compounds. More specifically, the synthesis of template molecules analogous to ocratoxin A and sporidesmin is described.
  • Molecular imprint polymers are materials that mimic to some extent the properties of biological molecules such as antibodies or enzymes in that they have cavities that are capable of selectively recognizing and binding a certain compound or family of compounds of similar structure. For this reason they are also known as "plasticibodies", with the advantage that these materials can be obtained more easily and, in addition, are cheaper and more robust, since they have much greater physical-chemical stability than biological receptors.
  • the MIPs are prepared in the presence of the molecule to be recognized, in this case, AOH or AME, so that during the polymerization stage, the starting monomers are organized around said molecule by reversible interactions.
  • the material is thoroughly washed with the appropriate solvent for the extraction of the template molecule, leaving cavities in the material that are complementary in size, shape and chemical properties to the analyte. This material with selective cavities can then be used for the extraction (or preconcentration) of the molecule of interest present in a complex sample.
  • the polymeric support can also be used for its application in sensors.
  • substitute molecules has an additional advantage. Sometimes the template used during the synthesis of the MIPs cannot be extracted or washed from the material completely, and the residue that remains bound to the polymer can gradually be released during its subsequent analytical use or application. This implies serious interference in the analytical measures. By using molecules other than AME or AOH, the problem can be avoided, since they will have different retention times in chromatography, or differentiated optical properties.
  • template molecules analogous to AOH and AME are prepared and used that do not have a rigid structure (S2-AME and S2-AOH in Figure 2 or their salts resulting from the treatment of the template molecule with one or more equivalents base capable of reacting with phenolic hydroxyl groups such as, for example, a quaternary ammonium salt) and, therefore, are not fluorescent, thereby eliminating residual fluorescence in the case of a polymer in which it had not been extracted Quantitatively mycotoxin after preparation.
  • the present invention describes the preparation of selective molecular imprint polymers for the recognition or extraction of AOH and AME using substitute molecules for imprinting the polymers instead of AOH or AME.
  • non-rigid AOH and AME substitute template molecules are also described and employed.
  • the S2-AME and S2-AOH structures shown in Figure 3 are proposed as non-fluorescent templates to minimize residual background fluorescence that would provide unwashed substitute molecules of the MIP at the stage of thorough removal of the template used for its preparation.
  • These artificial AOH and AME receptors can be used in the determination of said compounds in water, vegetables, fruits and derivatives (juices, musts, wines ...) and other complex matrices where these toxins can be present.
  • As functional acid monomers for the recognition of basic groups for example, methacrylic acid (MAA), acrylic acid (AA), trifluoromethacrylic acid (TFM) or p-vinylbenzoic acid (PVB), among others, or basic functional monomers for the recognition of acidic groups such as, for example, 2-vinylpyridine (2-VP), 4-vinylpyridine (4-VPY), A /, A / -diethyl-2-aminoethyl methacrylate (DAEM), 2-aminoethyl methacrylate (AEM), 2-aminoethyl methacrylamide (EAMA), etc.
  • MAA methacrylic acid
  • AA acrylic acid
  • TFM trifluoromethacrylic acid
  • PVB p-vinylbenzoic acid
  • basic functional monomers for the recognition of acidic groups such as, for example, 2-vinylpyridine (2-VP), 4-vinylpyridine (4-VPY), A /, A / -diethy
  • the crosslinking monomers preferably include ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), divinylbenzene (DVB), diisopropenylbenzene (DIB), thmethylolpropanotrimethacrylate (TRIM), pentaerythritoltriacrylate (PETRA), ethylene bisacrybisacrylamide (MB) methacrylamide (MB) ).
  • azo ⁇ /, ⁇ / '- substituted compounds such as azo-A /, A / -bisisobutyronitrile (AIBN), azo-A /, A /'-bisdimetlvaleronyl (ABDV) are preferably used as initiators ), 2,2'-azobis- (2,4-dimethyl-4- methoxivaleronitrile) (V70) or any other initiating azo whose decomposition takes place at the desired polymerization temperature (commercialized, for example, by Wako Pure Chemical Ind.
  • solvents used in the polymerization reaction are water, methanol, ethanol, tetrahydrofuran (THF) acetone, dimethylformamide (DMF), acetonitrile (MeCN), 1, 1, 1- trichloroethane, chloroform, dichloromethane, toluene, dimethisulfoxide (DMSO), isopropanol and any mixture of these or other solvents .
  • MIPs can be prepared in different formats such as particles porous, nanofibers, nanotubes, monoliths, nanoparticles and their derivatives such as core-shelf nanoparticles with possible optical or magnetic properties, with luminescent nuclei or incorporating specialized molecules on them that allow easy detection (eg luminescent molecular probes )
  • These polymers can also be modulated to offer better physical or chemical properties such as adsorption or porosity.
  • the polymers can also be synthesized as particles by techniques that include liquid-liquid polymerizations, or two-phase systems as suspension polymerization, emulsion or variants thereof (eg mini-emulsion polymerization), or of a single liquid as dispersion or precipitation polymerization.
  • CRP controlled root polymerization
  • the particles can be produced by grafting technique to obtain a film on a support. Grafting can be carried out under the techniques of "anchored to"("graftingto") or “grown from”("graftingfrom”) normally improving the latter molecular recognition and kinetic properties of materials (US Patent No 6,759,488). Under another consideration, the synthesis of nanoparticles can be carried out in the normal range of 10 nm - 500 nm. The process of obtaining these can be carried out via precipitation polymerization or mini-emulsion (V. Mittal, Miniemulsion Polymerization Technology, WNey, Hoboken, New Jersey, 2010), where uniform particles are obtained by high dilution with a solvent in a single step.
  • Aqueous or non-aqueous systems can be used for both methods.
  • spherical particles in the range 500 nm - 75 ⁇ can be obtained by precipitation, emulsion or by carrying out polymerization inside or outside of particles serving as a mold, eg use of spherical particles of silica gel of defined size which is fill with the MIP polymer.
  • the MIP particles can also be post-functionalized in order to make them more biocompatible. In this way they can be modified to provide maximum compatibility in aqueous biological systems, by coating the particle with a hydrophilic membrane.
  • the MIP particles can be used in methods similar to those already well established as immunoassays, where the antibody can be replaced by a MIP.
  • MIPs can be synthesized with "probes” or “markers” that facilitate detection. These probes are like those that can be used in immunoassays, for example enzymes, radioactive isotopes or luminescent ruthenium complexes or other fluorescent molecules.
  • Figure 2 shows the synthesis of the analogous molecules S1-AMEa-d and S1-AOHa-d.
  • Figure 3 shows the synthesis of the analogous molecules S2-AME and S2-AOH.
  • Figure 4 shows the structures of the functional and crosslinking monomers.
  • Figure 5 shows the chromatograms of apple juice extracts at a concentration level of 0.05 mg / mL before (solid line) and after (broken line) of the solid phase extraction process using a molecular imprint polymer (MIP ) for the recognition of alternariol.
  • MIP molecular imprint polymer
  • the alternariol peak (AOH) is indicated in the figure.
  • Example 1 The embodiment of the present invention is illustrated by the following examples that are not limiting of its scope.
  • Example 1 The embodiment of the present invention is illustrated by the following examples that are not limiting of its scope.
  • AICI 3 (0.700 g, 5.2 mmol) is weighed in a two-neck round bottom flask and suspended in a solution of dodecanothiol (0.5 mL) in chlorobenzene (8.5 mL) in a low ice bath argon. The suspension is stirred and the compound S1-AMEb (0.300 g, 1.2 mmol) is added. After half an hour the ice bath is removed, kept at room temperature for another half hour and then heated to 100 ° C. The reaction is followed by thin layer chromatography (silica, CH 2 Cl 2 -MeOH 20: 1 v / v).
  • the synthesis of the polymer is carried out as described below: the template molecule S1-AOH-a (28 mg, 0.125 mmmol), commercial 2-aminoethyl methacrylamide hydrochloride (EAMA) (670 mg, 4 mmol / mg), commercial tetrabutylammonium hydroxide (1038 mg, 4 mmol), commercial EDMA (3.8 mL, 20 mmol) and commercial ABDV root initiator (44 mg) are dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) (5.6 mL) . After dissolution, the mixture is transferred to a sealed glass tube, the temperature is lowered to 0 ° C and purged under a stream of nitrogen for 10 min.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the glass tube is sealed and polymerization is started thermally in an oven at 60 ° C.
  • the polymerization process lasts 48 h.
  • the tube is broken and the polymer obtained in the form of a monolith is washed sequentially to thoroughly remove the template molecule according to the following steps: methanol (100 mL), methanol / trifluoroacetic acid (99: 1 v / v) and finally methanol (100 mL).
  • the polymer is crushed and sieved until particles of between 25 and 50 ⁇ are obtained, free of fine particles, and these are used in the solid phase extraction process.
  • a control polymer (often referred to as "NIP", from the English term "non-imprinted polymef) is prepared following the same procedure, but in the absence of the template molecule.
  • Example 6 Synthesis of a molecular imprint polymer using S1-AME-a as a template molecule.
  • the synthesis of the polymer is carried out as described below: the template molecule S1-AME-a (33 mg, 0.125 mmol), the commercial 2-aminoethyl methacrylamide hydrochloride (EAMA) (670 mg, 4 mmol ), commercial tetrabutylammonium hydroxide (1038 mg, 4 mmol), commercial EDMA (3.8 mL, 20 mmol) and the commercial ABDV root initiator (44 mg) are dissolved in dimethisulfoxide (DMSO) (5.6 mL). After dissolution, the mixture is transferred to a sealed glass tube at 0 ° C and purged under a stream of nitrogen for 10 min.
  • DMSO dimethisulfoxide
  • the glass tube is sealed and polymerization is started thermally in an oven at 60 ° C.
  • the polymerization process lasts 48 h.
  • the tube is broken and the polymer obtained in the form of a monolith is washed sequentially to remove the template molecule according to the following steps: methanol (100 mL), methanol / trifluoroacetic acid (99: 1 v / v) and finally methanol ( 100 mL)
  • the polymer is crushed and screened to achieve particles of size between 25-50 ⁇ , free of fine particles, and these are used in the solid phase extraction process.
  • a control polymer (NIP) is prepared following the same procedure but in the absence of the template molecule.
  • the alternariol separation is carried out using an AQUA TM C18 HPLC column (polar coating) (250 * 4.6 mm, 5 ⁇ ) protected with a RP18 pre-column (4.0 ⁇ 3.0 mm, 5 ⁇ ), both of Phenomenex (Torrance, AC).
  • the functionality and applicability of the IPM is excellent, both for the pre-concentration of alternariol, and for the cleaning process of the apple juice sample.

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Abstract

El alternariol y el aternariol monometil éter son dos de las toxinas producidas en mayor grado por hongos de la familia Alternaría. Se encuentran con frecuencia en alimentos y su consumo continuado puede tener efectos negativos en la salud humana por lo que es importante el desarrollo de métodos de detección eficaz que evite su introducción en la cadena alimentaria. En esta invención se describe un método para la preparación de materiales poliméricos orgánicos que actúan como adsorbentes selectivos de alternariol y alternariol monometil éter. Los polímeros emplean como plantillas moléculas de estructura análoga a las micotoxinas, sencillas de preparar, robustas y baratas. Se pueden utilizar en la determinación de micotoxinas de Alternariol presentes en aguas, alimentos, hortalizas, frutos y derivados (zumos, mostos, vinos...) y otras matrices donde se puedan encontrar presentes.

Description

TITULO
Materiales para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría (alternariol y alternariol monometil éter)
Objeto y campo de la invención
La invención se refiere a materiales capaces de reconocer y unir selectivamente micotoxinas y su método de preparación. De manera más concreta, la invención se refiere a polímeros de impronta molecular para reconocer de forma selectiva las toxinas alternariol y alternariol monometil éter así como su método de preparación empleando moléculas análogas como plantillas. Los polímeros objeto de la presente invención son útiles para la determinación de alternariol y alternariol monometil éter en aguas, hortalizas, frutas, alimentos, derivados y otras matrices donde se puedan encontrar presentes dichas toxinas. Estado de la técnica
La existencia de hongos en alimentos mal almacenados (frutas, cereales, etc.) puede dar lugar a la presencia de toxinas que pasan inadvertidas en muchos alimentos. El consumo continuado de estos alimentos implica un riesgo para la salud humana, por lo que es importante el desarrollo de métodos de detección y cuantificación de las mismas.
Las especies de hongos de la familia Alternaría producen un elevado número de metabolitos secundarios. Siete toxinas principales, que pertenecen a tres clases estructurales diferentes, son conocidas como posibles contaminantes de alimentos con un riesgo toxicológico potencial. Éstas son: alternariol, alternariol monometil éter, altenueno, alterotoxinas I, II y III y ácido tenuazónico. El alternariol (AOH) y el alternariol monometil éter (AME) son las micotoxinas más relevantes producidas por hongos Alternaría. Los hongos Alternaría a su vez, son los que más comúnmente se pueden encontrar en alimentos como granos de cereales, frutas y vegetales. Los tomates, por ejemplo, son uno de los productos más afectados por la contaminación con AOH y AME, pudiéndose encontrar niveles de AOH de 25 μg/kg y de AME de 5 μg/kg en pastas de tomate concentradas (S. Asam, K. Konitzer, M. Rychlik, Mycotox. Res. 2011 , 27, 23-28). Los procedimientos de extracción de AOH y AME en métodos analíticos incluyen, por ejemplo, la extracción en fase sólida (SPE). Los métodos de determinación de dichas especies más empleados son la cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de gases (GC) y, sobre todo, la cromatografía líquida (LC) con detección UV, fluorescente o electroquímica (V. Fernández Pinto, en Mycotoxins in Fruits and Vegetables, R. Barkai-Golan, N. Paster, Academic Press, 2008, capítulo 13, p. 271-278)
Actualmente, en la mayoría de casos, la determinación de AOH y AME se realiza mediante métodos cromatográfícos que requieren de instrumentación compleja y cara y personal especializado para su manejo.
Un método alternativo para su determinación es el empleo de inmunoensayos, recientemente descrito en la literatura (A. A. Burkin y G. P. Kononenko, Appl. Biochem. Micro+, 2011 , 47, 72-76; Y. Ackermann, V. Curtui, R. Dietrich, M. Gross, H. Latif, E. Mártlbauer, E. Usleber, J. Agrie. Food Chem. 2011 , 59, 6360-6368), si bien requiere el empleo de sistemas biológicos de reconocimiento que son más difíciles y más caros de producir, menos estables y menos robustos que los polímeros sintéticos. En la presente invención se describen soportes sólidos y materiales poliméricos en distintos formatos para la coordinación selectiva de AOH y AME como moléculas diana empleando polímeros de impronta molecular (también denominados MIPs, del término en inglés molecularly imprinted polymers) como elementos de reconocimiento sintéticos.
En el documento WO 2011/031562 se describe la preparación de polímeros de impronta molecular para secuestrar o adsorber micotoxinas como compuestos diana. De forma más concreta, se describe la síntesis de moléculas plantilla análogas a ocratoxina A y esporidesmina.
Descripción de la invención
Los polímeros de impronta molecular son materiales que mimetizan en un cierto grado las propiedades de moléculas biológicas como los anticuerpos o las enzimas en cuanto a que poseen cavidades que son capaces de reconocer y enlazar selectivamente un cierto compuesto o familia de compuestos de estructura similar. Por esta razón se les conoce también como "plasticuerpos", con la ventaja de que estos materiales se pueden obtener de forma más sencilla y, además, son más económicos y robustos, ya que poseen mucha mayor estabilidad físico-química que los receptores biológicos.
Los MIPs se preparan en presencia de la molécula que se quiere reconocer, en este caso, AOH o AME, de manera que durante la etapa de polimerización, los monómeros de partida se organizan alrededor de dicha molécula mediante interacciones reversibles. Una vez ha transcurrido la polimerización, el material se lava minuciosamente con el disolvente apropiado para la extracción de la molécula plantilla, quedando cavidades en el material que son complementarias en tamaño, forma y propiedades químicas al analito. Este material con cavidades selectivas se puede utilizar entonces para la extracción (o preconcentración) de la molécula de interés presente en una muestra compleja. Desarrollando el procedimiento adecuado, el soporte polimérico puede utilizarse también para su aplicación en sensores. Hay ocasiones en las que no es conveniente utilizar el propio analito a determinar como molécula plantilla en la síntesis de MIPs, ya que puede tratarse de una sustancia tóxica, peligrosa o muy cara (normalmente se requieren cantidades del orden de 10 mg a 1 g para preparar una serie completa de polímeros de ensayo y muchísimo más si se trata de una producción industrial). En estos casos, se recurre al empleo de moléculas análogas o sucedáneas, que imitan en el mayor grado posible las propiedades estructurales y químicas de la molécula diana, pero que son menos peligrosas o más sencillas de preparar.
En este caso, tanto el AOH como AME son compuestos tóxicos y de un elevado precio. Por otro lado, la síntesis completa del AOH no es un procedimiento conveniente, ya que se trata de una compleja síntesis en 7 pasos (K. Koch, J. Podlech, E. Pfeiffer, M. Metzler, J. Org. Chem. 2005, 70, 3275-3276).
El empleo de moléculas sucedáneas tiene una ventaja adicional. En ocasiones la plantilla utilizada durante la síntesis de los MIPs no puede ser extraída o lavada del material completamente, y el residuo que permanece unido al polímero puede ir liberándose gradualmente durante su uso o aplicación analítica posterior. Esto supone una grave interferencia en las medidas analíticas. Al utilizar moléculas distintas a AME ó AOH, se puede evitar el problema, ya que presentarán distintos tiempos de retención en cromatografía, o propiedades ópticas diferenciadas. Por ejemplo, en esta invención se preparan y utilizan moléculas plantilla análogas a AOH y AME que no tienen una estructura rígida (S2-AME y S2-AOH en la Figura 2 o sus sales resultantes del tratamiento de la molécula plantilla con uno o más equivalentes de base capaz de reaccionar con grupos hidroxilo fenólicos como, por ejemplo, una sal de amonio cuaternario) y, por tanto, no son fluorescentes, con lo que se elimina la fluorescencia residual en el caso de un polímero en el que no se hubiese extraído cuantitativamente la micotoxina tras la preparación del mismo. En la presente invención se describe la preparación de polímeros de impronta molecular selectivos para el reconocimiento o extracción de AOH y AME empleando moléculas sucedáneas para la impronta de los polímeros en lugar de AOH o AME. Estas moléculas sucedáneas son muy sencillas de preparar a escala cuantitativa de gramos (Figura 2). Las plantillas se preparan siguiendo procedimientos similares a los descritos en la bibliografía (H. Ito, A. Iguchi, T. Hatano, J. Agrie. Food Chem. 2008, 56, 393-400) con algún tipo de mejora. Por ejemplo, en la preparación de los compuestos S1 -AOHa-d se procede a la desmetilación de los sustituyentes -OCH3 mediante el empleo de un tiol y AICI3. Se ha descrito en la bibliografía que la mezcla etanotiol- AICI3 es un agente desmetilante muy activo (M. Node, K. Nishide, K. Fuji, E. Fujita, J. Org. Chem. 1980, 45, 4275-4277). Sin embargo, en lugar de etanotiol (altamente volátil y de olor muy intenso y desagradable), en este caso se emplea dodecanotiol, de olor apenas perceptible y que sigue ofreciendo buenos rendimientos de desmetilación (M. Node, K. Kumar, K. Nishide, S. Ohsugi, T. Miyamoto, Tetrahedron Lett. 2001 , 42, 9207-9210).
En esta invención, se describen y emplean también moléculas plantilla sucedáneas de AOH y AME no rígidas. Las estructuras S2-AME y S2-AOH mostradas en la Figura 3, se proponen como plantillas no fluorescentes para minimizar la fluorescencia residual de fondo que proporcionarían moléculas sucedáneas no lavadas del MIP en la etapa de remoción minuciosa de la plantilla utilizada para su preparación. Estos receptores artificiales de AOH y AME se pueden usar en la determinación de dichos compuestos en aguas, hortalizas, frutas y derivados (zumos, mostos, vinos... ) y otras matrices complejas donde se puedan encontrar presentes dichas toxinas. Como monómeros funcionales de carácter ácido para el reconocimiento de grupos básicos (ver figura 4) se pueden emplear, por ejemplo, ácido metacrílico (MAA), ácido acrílico (AA), ácido trifluorometacrílico (TFM) o el ácido p-vinilbenzoico (PVB), entre otros, o monómeros funcionales de carácter básico para el reconocimiento de grupos ácidos como, por ejemplo, la 2-vinilpiridina (2-VP), 4-vinilpiridina (4-VPY), A/,A/-dietil-2-aminoetil metacrilato (DAEM), 2-aminoetil metacrilato (AEM), 2-aminoetil metacrilamida (EAMA), etc. También es posible utilizar monómeros de carácter neutro para el reconocimiento molecular tales como el 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), la acrilamida (AM), metacrilamida (MAM) y monómeros basados en ureas 1 ,3- disustituidas (ver figura 4), entre otros. En la presente invención los monómeros entrecruzantes incluyen, preferentemente, etilenglicol dimetacrilato (EDMA), divinilbenceno (DVB), diisopropenilbenceno (DIB), thmetilolpropanotrimetacrilato (TRIM), pentaeritritoltriacrilato (PETRA), etilenbisacrilamida (EBA), piperazinilbisacrilamida (PBA) y metilenbisacrilamida (MBA).
En la presente invención se utilizan preferentemente como iniciadores compuestos azo Λ/,Λ/'-disustituidos tales como azo-A/,A/-bisisobutironitrilo (AIBN), azo-A/,A/'-bisdimet¡lvaleron¡trilo (ABDV), 2,2'-azobis-(2,4-dimetil-4- methoxivaleronitrilo) (V70) o cualquier otro azo iniciador cuya descomposición tenga lugar a la temperatura de polimerización deseada (comercializados, por ejemplo, por Wako Puré Chemical Ind. Ltd., Japón; o iniciadores redox como por ejemplo el persulfato amónico, con o sin aceleradores añadidos (como por ejemplo la tetrametiletilendiamina o TEMED). Ejemplos de disolventes utilizados en la reacción de polimerización (también denominados porógenos frecuentemente en la bibliografía) son el agua, metanol, etanol, tetrahidrofurano (THF) acetona, dimetilformamida (DMF), acetonitrilo (MeCN), 1 ,1 ,1- tricloroetano, cloroformo, diclorometano, tolueno, dimetiisulfóxido (DMSO), isopropanol y cualquier mezcla de estos u otros disolventes.
Los MIPs pueden prepararse en distintos formatos tales como partículas porosas, nanofibras, nanotubos, monolitos, nanopartículas y sus derivados tales como nanopartículas núcleo-recubrimiento ("core-shelf) con posibles propiedades ópticas o magnéticas, con núcleos luminiscentes o incorporando sobre ellas moléculas especializadas que permitan una fácil detección (e.g. sondas moleculares luminiscentes). Estos polímeros además pueden ser modulados para ofrecer mejores propiedades físicas o químicas como pueden ser la adsorción o la porosidad. Además, los polímeros también pueden ser sintetizados en forma de partículas mediante técnicas que incluyan polimerizaciones líquido-líquido, o sistemas de dos fases como polimerización por suspensión, emulsión o variantes de estas (e.g. polimerización por miniemulsión), o de un solo líquido como polimerización por dispersión o precipitación.
Otra forma de polimerización utilizada preferentemente es la polimerización radicálica controlada (CRP). Esta bien conocida técnica se distingue en sí misma de la polimerización convencional por el tiempo de vida de la propagación de los radicales. Según este método, la polimerización puede llevarse a cabo durante varias horas permitiendo la generación de polímeros de pesos moleculares bien definidos, con baja polidispersidad y composición y funcionalidad controladas. Esto permite a los MIPs poseer mayor afinidad, capacidad y mayor asociación/disociación con el AOH y AME.
Bajo otra consideración las partículas se pueden producir mediante la técnica de injerto obteniendo una película sobre un soporte. El injerto puede ser llevado a cabo bajo las técnicas de "anclado a" ("grafting to") o "crecido desde" ("grafting from") mejorando normalmente ésta última el reconocimiento molecular y las propiedades cinéticas de los materiales (US Patent No. 6,759,488). Bajo otra consideración, la síntesis de nanopartículas puede llevarse a cabo en el intervalo normal de 10 nm - 500 nm. El proceso de obtención de éstas puede realizarse vía polimerización por precipitación o mini-emulsión (V. Mittal, Miniemulsion Polymerization Technology, WNey, Hoboken, New Jersey, 2010), donde se obtienen partículas uniformes por alta dilución con un disolvente en un solo paso. Sistemas acuosos o no acuosos pueden ser utilizados para ambos métodos. Además, pueden obtenerse partículas esféricas en el intervalo 500 nm - 75 μητι por precipitación, emulsión o llevando a cabo la polimerización en el interior o exterior de partículas que sirvan como molde, e.g. uso de partículas esféricas de gel de sílice de tamaño definido que se rellenan de con el polímero MIP.
Finalmente las partículas de MIP también pueden ser post-funcionalizadas con el propósito de hacerlas más biocompatibles. De este modo pueden ser modificadas para proporcionar una máxima compatibilidad en sistemas biológicos acuosos, recubriendo la partícula con una membrana hidrofílica.
Alternativamente las partículas de MIPs pueden ser utilizadas en métodos similares a los ya bien establecidos como inmunoensayos, donde el anticuerpo puede ser sustituido por un MIP. Aparte de sobre partículas magnéticas, los MIPs pueden ser sintetizados con "sondas" o "marcadores" que faciliten la detección. Estas sondas son como las que pueden utilizarse en inmunoensayos, por ejemplo enzimas, isótopos radioactivos o complejos de rutenio luminiscentes u otras moléculas fluorescentes.
Descripción de las figuras
En la figura 1 se representan las estructuras químicas del alternariol (AOH) y alternariol monometil éter (AME).
La figura 2 muestra la síntesis de las moléculas análogas S1-AMEa-d y S1- AOHa-d.
La figura 3 muestra la síntesis de las moléculas análogas S2-AME y S2-AOH. En la figura 4 se representan las estructuras de los monómeros funcionales y entrecruzantes.
La figura 5 muestra los cromatogramas de extractos de zumo de manzana a un nivel de concentración de 0,05 mg/mL antes (línea continua) y después (línea discontinua) del proceso de extracción en fase sólida utilizando un polímero de impronta molecular (MIP) para el reconocimiento de alternariol. El pico de alternariol (AOH) está indicado en la figura. Modo de realización de la invención
La realización de la presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no son limitativos de su alcance. Ejemplo 1
Síntesis de 3-hidroxi-8,9-dimetoxi-6H-d¡benzo[b,d]p¡ran-6-ona (S1 -AMEa).
En un matraz de fondo redondo de dos bocas se disuelve ácido 2-bromo-4,5- dimetoxibenzoico comercial (0,95 g, 3,6 mmol) y resorcinol comercial (0,93 g, 8,4 mmol) en 4,25 mL de hidróxido sódico acuoso (0,339 g, 8,4 mmol) y se calienta a 80 °C durante 30 min. Se añade una disolución de CuS04 al 5% (m V) (1 ,45 mL). Después de 10 min se forma un precipitado. La mezcla de reacción se neutraliza añadiendo 0,9 mL de ácido clorhídrico concentrado y el sólido formado se filtra a vacío. Después de lavar con 5 mL de agua y 3 mL de metanol, el sólido se suspende en 10 mL de metanol y se calienta a 50 °C durante 10 min. Se deja enfriar a temperatura ambiente y el sólido se recupera por filtración y lavado con éter dietílico. Rendimiento: 71 %. H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.92 (s, 3H, -OCH3), 4.05 (s, 3H, -OCH3), 6.77 (d, J = 2.81 Hz, 1 H, Ar-H), 6.88 (dd, Ji = 8.69 Hz , J2 = 2.33 Hz, 1 H, Ar- H), 7.57 (s, 1 H, Ar-H), 7.72 (s, 1 H, Ar-H), 8.24 (d, J = 8.24Hz, 1 H, Ar-H), 10.58 (s, 1 H, -OH) ppm; FT-IR (MeOH): 3265 (γ OH), 2979, 2834, 1691 , 1626, 1520, 1464, 1371 , 1 130, 1085, 81 1 , 682 crrf1; MS-ESI (negativo), m/z; calculado para C 5HnO5, [M-H]~: 271.1 ; encontrado: 270.7. Ejemplo 2
Síntesis de 3,8,9-trihdroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona (S1 -AOH-a).
Se pesa AlC comercial (0,786 g, 5,8 mmol) en un matraz de fondo redondo de dos bocas y se suspende en una disolución de dodecanotiol (0,5 mL) y clorobenceno (8,5 mL) mantenidos en un baño de hielo bajo argón. La suspensión se agita y se añade el compuesto S1 -AMEa (0,337 g, 1 ,2 mmol). Después de media hora se retira el baño de hielo y la mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante otra media hora, tras lo que se calienta a 100 °C. La reacción se sigue por cromatografía en capa fina (sílica, CH2Cl2-MeOH 20:1 vV). Después de 5 h, la mezcla se vierte sobre 15 mL de ácido clorhídrico acuoso al 3% (plv) en un baño de hielo y el precipitado que se forma se filtra con un embudo Büchner y se lava con agua y unos pocos mL de metanol. Rendimiento: 72%.
1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6) δ: 6.72 (d, J = 2.34 Hz,1 H, Ar-H), 6.82 (dd, J-, = 8.64 Hz, J2 = 2.37 Hz, 1 H, Ar-H), 7.47 (s, 1 H, Ar-H), 7.53 (s, 1 H, Ar-H), 7.88 (d, J = 8.82 Hz, 1 H, Ar-H), 10.13 (s, 3H, -OH) ppm; FT-IR (MeOH): 3363 (γ OH), 2924, 1762, 1618, 1459, 1 120, 1015, 81 1 , 729 cnrT1 ; MS-ESI (negativo), m/z; calculado para C13H7O5, [M-H]": 243.0; encontrado: 242.7.
Ejemplo 3
Síntesis de 3-hidroxi-9-metoxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona (S1 -AME-b).
En un matraz de fondo redondo de dos bocas se disuelve ácido 2-bromo-4,5- dimetoxibenzoico comercial (2,00 g, 8,6 mmol) y resorcinol comercial (2,00 g, 18 mmol) en 9,1 mL de una disolución acuosa de hidróxido sódico (0,727 g, 18,1 mmol) y la disolución se calienta a 80 °C durante 30 min, tras lo cuál se añade una disolución de CuSO4 al 5% (m/v) (3.6 mL). Después de 10 min se forma un precipitado. La mezcla de reacción se neutraliza añadiendo 1.9 mL de ácido clorhídrico concentrado y el sólido formado se filtra a vacío. Después de lavar con 5 mL de agua y 3 mL de metanol, el sólido se suspende en 10 mL de metanol y se calienta a 50 °C durante 10 min. Se deja enfriar a temperatura ambiente y el sólido se recupera por filtración y lavado con éter dietílico. Rendimiento: 59%.
1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.93 (s, 3H,-OCH3), 6.79 (d, J = 2.25 Hz,1 H, Ar-H), 6.87 (dd, J, = 8.66 Hz, J2 = 2.33Hz ,1 H, Ar-H) ,7.54 (dd, Ji = 8.87 Hz, J2 = 2.78 Hz,1 H, Ar-H), 7.64 (d, J = 2.73 Hz, 1 H, Ar-H), 8.14 (d, J = 8.73 Hz, 1 H, Ar-H), 8.26 (d, J = 8.91 Hz, 1 H, Ar-H), 10.27 (s, 1 H, -OH) ppm; FT-IR (MeOH): 3635 (y OH), 2839, 1767, 1625, 1246, 1 126, 81 1 , 729 ατϊ1; MS-IE (negativo), m/z; calculado para C14H9O4, [M-H]~: 241.1 ; encontrado: 240.7.
Ejemplo 4 Síntesis de 3,9-dihdroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona (S1 -AOH-b).
Se pesa AICI3 (0,700 g, 5,2 mmol) en un matraz de fondo redondo de dos bocas y se suspende en una disolución de dodecanotiol (0,5 mL) en clorobenceno (8,5 mL) en un baño de hielo bajo argón. La suspensión se agita y se añade el compuesto S1-AMEb (0,300 g, 1 ,2 mmol). Después de media hora se retira el baño de hielo, se mantiene a temperatura ambiente durante otra media hora y después se calienta a 100 °C. La reacción se sigue por cromatografía en capa fina (sílica, CH2Cl2-MeOH 20:1 v/v). Después de 5 h, la mezcla se vierte sobre 15 mL de ácido clorhídrico acuoso al 3% (p/v) en un baño de hielo y el precipitado que se forma se filtra con un embudo Büchner y se lava con agua y unos pocos mL de metanol. Rendimiento: 70%. 1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6) δ: 6.75 (d, J = 2.37 Hz, 1 H, Ar-H), 6.83 (dd, = 8.67 Hz, J2 = 2.37 Hz, 1 H, Ar-H), 7.34 (dd, Jf = 8.7 Hz, J2 = 2.69 Hz, 1 H, Ar- H) , 7.53 (d, J = 2.64, 1 H, Ar-H), 8.05 (d, J = 8.76 Hz, 1 H, Ar-H), 8.14 (d, J = 8.85 Hz, 1 H, Ar-H), 10.21 (s, 2H, -OH) ppm; FT-IR (MeOH): 3743 (γ OH), 3320, 3292, 2854, 1773, 1272, 1126, 1080, 729 crrf1; MS-ESI (negativo), m/z; calculado para C13H7O4, [M-H]": 227.0; encontrado: 226.7.
Los sucedáneos no fluorescentes de la Serie 2 se preparan siguiendo un procedimiento similar al descrito en la bibliografía mediante condensación del correspondiente fenol y ácido benzoico en presencia de anhídrido trifluroacético (S. Kumar, K. Muller, Eur. J. Med. Chem. 2000, 35, 405-411 ; b) S. Kumar, K. Muller, Eur. J. Med. Chem. 1999, 34, 1035-1042)
Ejemplo 5
Síntesis de un polímero de impronta molecular usando S1-AOH-a como molécula plantilla.
La síntesis del polímero, se lleva a cabo tal y como se describe a continuación: la molécula plantilla S1-AOH-a (28 mg, 0,125 mmmol), el clorhidrato de 2-aminoetil metacrilamida comercial (EAMA) (670 mg, 4 mmol/mg), hidróxido de tetrabutilamonio comercial (1038 mg, 4 mmol), EDMA comercial (3,8 mL, 20 mmol) y el iniciador radicálico ABDV comercial (44 mg) se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) (5,6 mL). Después de la disolución, la mezcla se traspasa a un tubo de vidrio sellado, se disminuye la temperatura a 0°C y se purga bajo una corriente de nitrógeno durante 10 min. Después del proceso de purga, se sella el tubo de vidrio y se inicia la polimerización térmicamente en un una estufa a 60°C. El procedimiento de polimerización dura 48 h. Tras este proceso, el tubo se rompe y el polímero obtenido en forma de monolito se lava secuencialmente para eliminar minuciosamente la molécula molde según los siguientes pasos: metanol (100 mL), metanol/ácido trifluoroacético (99:1 v/v) y finalmente metanol (100 mL). El polímero se tritura y tamiza hasta conseguir unas partículas de tamaño comprendido entre 25 y 50 μηη, libres de partículas finas, y éstas son utilizadas en el procedimiento de extracción en fase sólida. Un polímero control (denominado frecuentemente "NIP", del término inglés "non-imprinted polymef) se prepara siguiendo el mismo procedimiento, pero en ausencia de la molécula molde.
Ejemplo 6 Síntesis de un polímero de impronta molecular usando S1-AME-a como molécula plantilla.
La síntesis del polímero, se lleva a cabo tal y como se describe a continuación: la molécula plantilla S1-AME-a (33 mg, 0,125 mmol), el clorhidrato de 2-aminoetil metacrilamida (EAMA) comercial (670 mg, 4 mmol), hidróxido de tetrabutilamonio comercial (1038 mg, 4 mmol), EDMA comercial (3,8 mL, 20 mmol) y el iniciador radicálico ABDV comercial (44 mg) se disuelven en dimetiisulfóxido (DMSO) (5,6 mL). Después de la disolución, la mezcla se traspasa a un tubo de vidrio sellado a 0°C y se purga bajo una corriente de nitrógeno durante 10 min. Después del proceso de purga, se sella el tubo de vidrio y la se inicia la polimerización térmicamente en un una estufa a 60°C. El procedimiento de polimerización dura 48 h. Tras este proceso el tubo se rompe y el polímero obtenido en forma de monolito se lava secuencialmente para eliminar la molécula molde según los siguientes pasos: metanol (100 mL), metanol/ácido trifluoroacético (99:1 v/v) y finalmente metanol (100 mL). El polímero se tritura y tamiza hasta conseguir unas partículas de tamaño comprendido entre 25-50 μηι, libres de partículas finas, y éstas son utilizadas en procedimiento de extracción en fase sólida. Un polímero control (NIP) se prepara siguiendo el mismo procedimiento pero en ausencia de la molécula molde. Ejemplo 7
Uso de polímeros de impronta molecular para la determinación de alternariol en zumos.
Uno de los usos de la presente invención se ilustra mediante este ejemplo siendo no limitativo su alcance. Su uso como sorbentes o fases estacionarias en la extracción en fase sólida de los analitos diana es una de las aplicaciones más características de los polímeros de impronta molecular. En el presente ejemplo se utiliza el polímero descrito en el ejemplo 5 y se empaquetan 25 mg de polímero de impronta molecular (partículas de 25-50 μιη) en cartuchos de extracción en fase sólida de 1 ml_. Tras un acondicionamiento con metanol (10 mL), y utilizando 10 mL de una disolución acuosa tamponada de ácido (4-(2-h¡droxietil)-1-piperazinetanosulfónico comercial de concentración 0,1 M y pH 7.5), se cargan los cartuchos con 10 mL de la muestra objeto de análisis previamente preparada de la siguiente manera:
Se toman 80 mL de zumo de manzana previamente contaminados con un nivel de concentración de 0,05 mg L"1, se mezclan con 20 mL de acetonitrilo y se filtran a través de un filtro de nylon de 0,45 μηπ de diámetro de poro (el cual se ha comprobado previamente que es inerte a la retención de alternariol). A continuación, se disuelven en ellos 2,5 g de ácido (4-(2-hidroxietil)-1- piperazinetanosulfónico y se ajusta el pH hasta obtener un valor de 7,5.
Una vez percolada la muestra sobre los cartuchos, se procede al lavado de los mismos pasando a través de ellos 1 mL de una mezcla acetonitrilo/agua 30:70 wV, para eluir todos aquellos compuestos que se hayan quedado retenidos en el polímero de una forma no selectiva. Finalmente se realiza la elución selectiva del alternariol percolando 1 mL de una mezcla de metanol/ácido trifluoroacético 95:5 (νλή. Este extracto se analiza utilizando un cromatógrafo de líquidos (HPLC) HP- 1 100 de Agilent Technologies (Palo Alto, CA, USA) equipado con una bomba cuaternaria, un desgasificador en flujo, automuestreador, inyector automático y un termostatizador para columna. La detección se realiza con un detector de fluorescencia. La separación del alternariol se lleva a cabo mediante una columna de HPLC AQUA™ C18 (recubrimiento polar) (250 * 4.6 mm, 5 μιτι) protegida con una precolumna RP18 (4.0 χ 3.0 mm, 5 μιη), ambos de Phenomenex (Torrance, CA). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: volumen de inyección 8 ί, caudal 1 mL min"1 , fase móvil 65:35 (v/v) metanol/agua y se usaron las longitudes de onda Aexc = 258 nm y Aem = 440 nm para llevar a cabo la detección.
Como puede apreciarse en la figura 5, la funcionalidad y la aplicabilidad del MIP es excelente, tanto para la preconcentración de alternariol, como para el proceso de limpieza de la muestra de zumo de manzana.

Claims

Reivindicaciones
1. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría preparados en presencia de una plantilla molecular donde dicha plantilla es una molécula de estructura análoga a la micotoxina de Alternaría.
2. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Atlernaría preparados en presencia de una plantilla molecular, según la reivindicación 1 , donde la micotoxina de Alternaría es alternariol (AOH) y/o alternariol monometil éter (AME).
3. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Atlernaría preparados en presencia de una plantilla molecular, según reivindicaciones 1 y 2, donde la molécula plantilla se selecciona del grupo:
3-hidroxi-8,9-dimetoxi-6 -/-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEa)
3-hidroxi-8-metoxi-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEb)
3-hidroxi-8,9-dimetoxi-1-metil-6 -/-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEc) 3-hidroxi-8-metoxi-1-metil-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AMEd)
3,8,9-trihdroxi-6H-d¡benzo[b,d]p¡ran-6-ona (S1-AOHa)
3,9-dihdroxi-6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona (S1-AOHb)
3,8,9-trihidroxi-1-metil-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AOHc)
3,8-dihidroxi-1-metil-6H-benzo[c]cromen-6-ona (S1-AOHd)
2,3,4-trimetoxibenzoato de 3-metoxifenilo (S2-AMEa)
2,3,4-trimetoxibenzoato de 3-metoxi-5-metilfenilo (S2-AMEb)
benzoato de 3-metoxifenilo (S2-AMEc)
benzoato de 3-metoxi-5-met¡lfenilo (S2-AMEd)
2,3,4-trihidroxibenzoato de 3-hidroxifenilo (S2-AOHa)
2,3,4-trihidroxibenzoato de 3-hidroxi-5-metilfenilo (S2-AOHb)
benzoato de 3-hidroxifenilo (S2-AOHc)
benzoato de 3-hidroxi-5-metilfenilo (S2-AOHd) o cualquiera de sus sales resultantes del tratamiento de la molécula plantilla con uno o más equivalentes de base capaz de reaccionar con grupos hidroxilo fenólicos.
4. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría preparados en presencia de una plantilla molecular, según reivindicación 3, donde la sal es una sal de amonio cuaternario.
5. Polímeros de impronta molecular para el reconocimiento selectivo de micotoxinas de Alternaría preparados en presencia de una plantilla molecular, según reivindicaciones anteriores, preparados con monómeros acrílicos sencillos, monómeros acrílicos di- o tri- funcionales entrecruzantes y/o monómeros acrílicos mono- o poli-funcionales portadores de grupos funcionales químicos que muestren afinidad por las moléculas plantilla.
6. Polímeros de impronta molecular, según reivindicación 5, cuyo entrecruzante es etilenglicoldimetacrilato (EDMA).
7. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicación 5 y 6, cuyo(s) monómero(s) funcional(es) contiene(n) uno o más grupos amino.
8. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicaciones 5 y 6, cuyo(s) monómero(s) funcional(es) contiene(n) uno o más grupos ácido carboxílico.
9. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicaciones 5 y 6, cuyo(s) monómero(s) funcional(es) contiene(n) uno o más grupos derivados 1 ,3- disustituidos de la urea.
10. Polímeros de impronta molecular, según las reivindicaciones anteriores, preparados en forma de monolito o de bloque.
1 1 . Polímeros de impronta molecular según las reivindicaciones 2-9 que se hayan obtenido a través de cualquier técnica de injerto, recubrimiento de partículas esféricas o nanopartículas.
12. Uso de los polímeros de impronta molecular reivindicados para la preconcentración de AOH, AME o cualquiera de sus derivados en cualquier matriz natural (e.g. carne, pescado, frutas, hortalizas, vegetales o aguas) o en cualquiera de sus derivados (e.g. zumos, vinos).
13. Uso de de los polímeros de impronta molecular reivindicados para la limpieza de una muestra de AOH, AME o cualquiera de sus derivados en cualquier matriz natural (e.g. carne, pescado, frutas, hortalizas, vegetales o aguas) o en cualquiera de sus derivados (e.g. zumos, vinos).
14. Uso de de los polímeros de impronta molecular reivindicados como sensor.
15. Uso de de los polímeros de impronta molecular reivindicados como elemento de captura o material de detección en cualquier tipo de ensayo.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104991013A (zh) * 2015-06-18 2015-10-21 北京市农林科学院 一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法
CN108675981A (zh) * 2018-05-04 2018-10-19 四川国际旅行卫生保健中心 链格孢霉毒素的虚拟模板分子化合物及采用该化合物制备的分子印迹聚合物
CN109627381A (zh) * 2018-12-20 2019-04-16 成都医学院 一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法
WO2020206828A1 (zh) * 2019-04-09 2020-10-15 北京农业质量标准与检测技术研究中心 链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003101580A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung Solid mycoctoxin carriers
WO2011031562A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-17 Alltech, Inc. Synthetic mycotoxin adsorbents and methods of making and utilizing the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101308066B (zh) * 2008-06-12 2010-07-28 济南大学 痕量真菌毒素分子印迹柱制备方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003101580A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung Solid mycoctoxin carriers
WO2011031562A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-17 Alltech, Inc. Synthetic mycotoxin adsorbents and methods of making and utilizing the same

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104991013A (zh) * 2015-06-18 2015-10-21 北京市农林科学院 一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法
CN104991013B (zh) * 2015-06-18 2017-03-01 北京市农林科学院 一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法
CN108675981A (zh) * 2018-05-04 2018-10-19 四川国际旅行卫生保健中心 链格孢霉毒素的虚拟模板分子化合物及采用该化合物制备的分子印迹聚合物
CN109627381A (zh) * 2018-12-20 2019-04-16 成都医学院 一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法
CN109627381B (zh) * 2018-12-20 2020-09-25 成都医学院 一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法
WO2020206828A1 (zh) * 2019-04-09 2020-10-15 北京农业质量标准与检测技术研究中心 链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用

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