CN109627381A - 一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，该虚拟模板为通过免费商业数据库搜索得到的腾毒素分子结构类似物，且市场可售，可替代腾毒素模板分子制备出腾毒素分子印迹聚合物，填补了腾毒素分子印迹聚合物的市场空白，并且，该腾毒素分子印迹聚合物的印迹因子高，对腾毒素展现出优异的结合特性，为解决目前腾毒素检测前处理过程中分离富集困难的问题提供了一个新思路，此外，本发明不需要设计合成替代模板，大大缩短腾毒素分子印迹聚合物的制备周期，降低人工和实验药品的耗费，对于提高分子印迹聚合物的研发效率与拓宽分子印迹技术的应用范围具有指导作用。
Description
技术领域
本发明属于分子印迹聚合物的制备技术领域，具体涉及一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法。
背景技术
目前真菌毒素的检测方法发展很快，已经从传统的薄层色谱法(TLC)，发展到以现代色谱、色质联用法和免疫质谱联用技术，如气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)，以及基于免疫化学基础上的免疫分析方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)等。通过比较上述检测方法我们发现，色谱检测法耗时较长且需昂贵的免疫亲和柱进行样品前处理，难以大规模使用，免疫学检测方法简单、快速、成本低且可进行大规模筛选，然而该类方法均建立在抗原和抗体特异性结合的基础之上，真菌毒素全抗原及抗体均为蛋白质分子，在高温、强酸、强碱等极端检测环境下极易失活变性。分子印迹技术的出现为真菌毒素的快速提取和检测提供了一条新途径，该技术主要通过制备与真菌毒素特异性结合的分子印迹聚合物 (MIP)来进行检测和提取，不仅成本低廉、耐高温、耐酸碱，并可重复使用。
目前针对真菌毒素的MIP制备和使用已经有了一定的发展，并得到了广泛的关注。然而, 目前真正实现产业化的种类很少,大部分真菌毒素MIP的研究仍处于实验阶段，其原因主要在于：(1)由于作为模板分子的真菌毒素多具有极强的毒性，小剂量的摄入即会对人体产生很大的危害，并且与其他物质的MIP制备有很大不同的是，真菌毒素纯品的价格非常昂贵，即使是按照通常制备MIP的一次用量，其花费也是惊人的；(2)部分真菌毒素在紫外光或者热作用下易发生性状改变或分解，因而难以作为模板分子；(3)多数真菌毒素的分子量较大，相对来说分子体积较大，常规方法进行分子印迹时，易造成印迹轮廓不明晰，导致非特异性吸附能力提高。
针对真菌毒素本身不适合做模板分子的局限，目前多采用替代模板法解决此问题，即选择与真菌毒素空间拓补结构和印迹识别位点相似的化合物作为模板来制备真菌毒素MIP，同时该法还可避免直接使用真菌毒素作为模板出现的模板渗漏问题。然而针对具体某个真菌毒素MIP的制备，替代模板分子及功能单体等的寻找也是往往依赖半经验法则,缺乏理论指导。
食品及饲料中，营养物质丰富,在适宜的条件下,易于被链格孢霉侵染,从而受到链格孢霉毒素的污染，而腾毒素(TEN)是链格孢霉毒素中毒性最强的毒素，因此，如何提高食品和饲料中腾毒素的检测效率也成为重要的研究课题。腾毒素分子的结构式为：
目前，腾毒素分子印迹聚合物尚属空白领域，并且，腾毒素标准品昂贵、毒性大，不利于作为分子印迹模板，目前也尚未有可替代腾毒素模板分子的虚拟模板，因此，若能找到一种虚拟模板，将其用于制备腾毒素分子印迹聚合物，则可从食品或饲料中快速分离富集腾毒素，从而大大降低食品或饲料中腾毒素的检测难度，提高检测效率，并大大缩短腾毒素分子印迹聚合物的制备周期，降低人工和实验药品的耗费，对于提高分子印迹聚合物的研发效率与拓宽分子印迹技术的应用范围具有指导作用。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前尚未有腾毒素分子印迹聚合物，也未有可替代腾毒素模板分子并用于制备腾毒素分子印迹聚合物的虚拟模板，导致腾毒素分离困难的问题，本发明提供一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用及腾毒素分子印迹聚合物的制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用，其中，虚拟模板的结构式如下：
一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述的虚拟模板，溶于乙腈和DMSO的混合溶剂中，加入功能单体、交联剂、引发剂，然后超声脱气，置于0-4℃冰水浴上通氮气鼓泡除氧，密封后搅拌反应，得到带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物；
(2)将步骤(1)得到的带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物进行离心分离，收集聚合物颗粒；
(3)将聚合物颗粒加入甲醇和乙酸的混合溶剂中超声、离心，重复进行，直至离心上清液检测不到虚拟模板分子，然后用甲醇洗至中性，抽滤、真空干燥，即得腾毒素分子印迹聚合物。
进一步地，步骤(1)中，虚拟模板、功能单体、交联剂、引发剂的质量比为1：(1-10):(11-20):(0.3-0.5)，虚拟模板与混合溶剂的配比为(3-5)mg：1ml。
进一步地，步骤(1)中，乙腈和DMSO的体积比为6:1。
进一步地，步骤(1)中，超声脱气的时间为10min。
进一步地，步骤(1)中，鼓泡除氧的时间为10min。
进一步地，步骤(1)中，搅拌反应时间为24h，反应温度为60℃。
进一步地，步骤(1)中，功能单体为甲基丙烯酰胺。
进一步地，步骤(1)中，交联剂为二甲基丙烯酸乙二酸酯。
进一步地，步骤(1)中，引发剂为偶氮二异丁腈。
进一步地，步骤(3)中，甲醇和乙酸的体积比为9：1。
进一步地，步骤(3)中，超声温度为25℃，时间为30min。
进一步地，步骤(3)中，真空干燥时间为24小时，干燥温度为50℃。
进一步地，离心转速为10000rpm,时间为15min。
本发明利用https://www.chemicalbook.com/StructuredSearch.htm免费商业数据库的结构相似性搜索模块，搜索市场可售的腾毒素分子结构类似物，找到相似性最佳的化合物，作为腾毒素分子的虚拟模板，用于制备腾毒素分子印迹聚合物。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明利用免费商业数据库搜索出市场可售的腾毒素分子结构类似物，作为虚拟模板，以替代腾毒素模板分子，并采用该虚拟模板成功制备出腾毒素分子印迹聚合物，填补了腾毒素分子印迹聚合物的市场空白，并且，该腾毒素分子印迹聚合物的印迹因子高，对腾毒素展现出优异的结合特性，解决了目前腾毒素分离富集困难的问题，从而可从食品或饲料中快速分离富集腾毒素，大大降低食品或饲料中腾毒素的检测难度，提高检测效率和准确率；
2、本发明通过免费商业数据库搜索并购买获得虚拟模板，不需要设计合成替代模板，大大缩短腾毒素分子印迹聚合物的制备周期，降低人工和实验药品的耗费，对于提高分子印迹聚合物的研发效率与拓宽分子印迹技术的应用范围具有指导作用。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明虚拟模板购买于MATRIX公司。
实施例1
一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将164mg虚拟模板加入装有50ml乙腈和DMSO混合溶剂的150ml圆底烧瓶中，其中，乙腈和DMSO的体积比为6:1，加入171mg甲基丙烯酰胺,室温搅拌1h，加入1.98g二甲基丙烯酸乙二酸酯、72mg偶氮二异丁腈，然后超声脱气10min，置于0-4℃冰水浴上通氮气鼓泡除氧10min，密封后搅拌反应24h，反应温度为60℃，得到带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物；
(2)将步骤(1)得到的带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物以10000rpm的转速离心 15min，收集聚合物颗粒；
(3)将聚合物颗粒加入甲醇和乙酸的混合溶剂中，甲醇和乙酸的体积比为9：1，然后于25℃下超声30min，再以10000rpm的转速离心15min，重复进行，直至离心上清液检测不到虚拟模板分子，然后用甲醇洗至中性，抽滤后于50℃下真空干燥24h，即得腾毒素分子印迹聚合物。
实施例2
一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将202mg虚拟模板加入装有50ml乙腈和DMSO混合溶剂的150ml圆底烧瓶中，其中，乙腈和DMSO的体积比为6:1，加入606mg甲基丙烯酰胺,室温搅拌1h，加入3.02g二甲基丙烯酸乙二酸酯、100mg偶氮二异丁腈，然后超声脱气10min，置于0-4℃冰水浴上通氮气鼓泡除氧10min，密封后搅拌反应24h，反应温度为60℃，得到带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物；
(2)将步骤(1)得到的带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物以10000rpm的转速离心 15min，收集聚合物颗粒；
(3)将聚合物颗粒加入甲醇和乙酸的混合溶剂中，甲醇和乙酸的体积比为9：1，然后于25℃下超声30min，再以10000rpm的转速离心15min，重复进行，直至离心上清液检测不到虚拟模板分子，然后用甲醇洗至中性，抽滤后于50℃下真空干燥24h，即得腾毒素分子印迹聚合物。
实施例3
一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将250mg虚拟模板加入装有55ml乙腈和DMSO混合溶剂的150ml圆底烧瓶中，其中，乙腈和DMSO的体积比为6:1，加入1.75g甲基丙烯酰胺,室温搅拌1h，加入4.45g二甲基丙烯酸乙二酸酯、80mg偶氮二异丁腈，然后超声脱气10min，置于0-4℃冰水浴上通氮气鼓泡除氧10min，密封后搅拌反应24h，反应温度为60℃，得到带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物；
(2)将步骤(1)得到的带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物以10000rpm的转速离心 15min，收集聚合物颗粒；
(3)将聚合物颗粒加入甲醇和乙酸的混合溶剂中，甲醇和乙酸的体积比为9：1，然后于25℃下超声30min，再以10000rpm的转速离心15min，重复进行，直至离心上清液检测不到虚拟模板分子，然后用甲醇洗至中性，抽滤后于50℃下真空干燥24h，即得腾毒素分子印迹聚合物。
对比例
本对比例与实施例1的区别仅在于：未添加有虚拟模板，最终得到非印迹聚合物。
实验例
对实施例1制备的腾毒素分子印迹聚合物(以下简称为ZMIP1)进行结合实验，具体为：将1mL浓度为25μg/mL的腾毒素(TEN)溶于乙腈和DMSO的混合溶剂中，乙腈和DMSO的体积比为3：1，加入25mg ZMIP1，其浓度25mg/mL，然后于20℃下，以100rpm的转速振荡孵育16小时，离心，取上清液测定上清液中残留TEN浓度水平，计算ZMIP1与TEN的结合性能。对比例制备的非印迹聚合物(ZNIP1)进行结合实验，作为空白对照，将上述结合实验中的ZMIP1替换为ZNIP1，其余步骤相同。
结果见表1，ZMIP1表现了较好的与目标物TEN的结合特性，展现了聚合物ZMIP1具有从食品或饲料等复杂基质中分离富集腾毒素(TEN)的应用价值。
表1结合实验结果
| 聚合物 | 结合百分比(％) | 分配系数K(mL/g) | 印迹因子(IF) |
| ZNIP1 | 9.2 | 4.05 | -- |
| ZMIP1 | 34.2 | 20.8 | 5.14 |
上表中结合百分比、分配系数以及印迹因子的计算过程为：
Bound％＝(Ctotal-Cfree)/Ctotal×100％，其中，Bound％为结合百分比，Ctotal为TEN的总添加浓度，Cfree为上清液中TEN的残留浓度；
Q＝(Ctotal-Cfree)×V/M，K＝Q/Cfree，其中，K为分配系数，V为溶液体积，M为聚合物的质量；
IF＝KMIP/KNIP，其中，IF为印迹因子，KMIP为腾毒素分子印迹聚合物的分配系数，KNIP为非印迹聚合物的分配系数。
如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种虚拟模板在制备腾毒素分子印迹聚合物中的应用，其中，虚拟模板的结构式如下：
。
2.一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1中所述的虚拟模板，溶于乙腈和DMSO的混合溶剂中，加入功能单体、交联剂、引发剂，然后超声脱气，置于0-4℃冰水浴上通氮气鼓泡除氧，密封后搅拌反应，得到带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物；
(2)将步骤(1)得到的带有虚拟模板分子的分子印迹聚合物进行离心分离，收集聚合物颗粒；
(3)将聚合物颗粒加入甲醇和乙酸的混合溶剂中超声、离心，重复进行，直至离心上清液检测不到虚拟模板分子，然后用甲醇洗至中性，抽滤、真空干燥，即得腾毒素分子印迹聚合物。
3.根据权利要求2所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，虚拟模板、功能单体、交联剂、引发剂的质量比为1：(1-10):(11-20):(0.3-0.5)，虚拟模板与混合溶剂的配比为(3-5)mg：1ml。
4.根据权利要求2或3所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，功能单体为甲基丙烯酰胺。
5.根据权利要求2或3所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，交联剂为二甲基丙烯酸乙二酸酯。
6.根据权利要求2或3所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，引发剂为偶氮二异丁腈。
7.根据权利要求2所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，甲醇和乙酸的体积比为9：1。
8.根据权利要求2所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，超声温度为25℃，时间为30min。
9.根据权利要求2所述的一种腾毒素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，真空干燥时间为24小时，干燥温度为50℃。
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