CN111944104A - 一种检测登革热ns1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球及其应用 - Google Patents
一种检测登革热ns1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测登革热NS1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球，其包括PS微球以及覆盖在其表面的分子印迹聚合物层，所述分子印迹聚合物层具有由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽片段形成的空穴。本发明的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球能够准确、方便、高效、快速、灵敏、低成本地实现对登革热NS1蛋白的检测。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种用于检测登革热NS1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球及其应用。
背景技术
登革热(dengue fever)是主要由伊蚊叮咬感染登革病毒引起，伴有头痛、肌肉骨关节痛、发热、淋巴结肿大、疲乏等临床特征的一种急性传染病，广泛流行于热带和亚热带，可能出现多种临床表现，从轻度发热病到严重和致命疾病不等。随着疾病的发展，在发热阶段，症状与其它虫媒病毒感染以及麻疹、风疹、肠病毒感染、腺病毒感染和流感相似，需要根据临床表现和当地疾病流行情况结合诊断。
登革热由感染登革热病毒引起，根据患者血清中抗体的类型不同，可以将登革热病毒分为DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4等四个血清型。四个不同亚型的登革热病毒RNA序列基本一致。RNA翻译的蛋白分子主要分为两类，其中前端的结构基因片段翻译出C、prM、E等结构蛋白，之后的非结构基因片段翻译出NS1与其他六个非结构蛋白。首先翻译出的C蛋白又名衣壳蛋白，是登革热等黄热病科病毒的共通结构，起到保护病毒RNA的作用。prM蛋白是M蛋白的前驱体，经过糖基化的结构蛋白M会和结构蛋白E以一定的方式结合在登革热病毒表面。结构蛋白一般是同属病毒共同含有的蛋白分子，常用于鉴定病毒的种类，有些结构蛋白还起识别细胞的作用。非结构蛋白不和RNA组合成病毒，但在病毒识别、复制的过程中起到一定的作用。作为第一个翻译的非结构蛋白，登革热NS1蛋白是登革热病毒翻译的多种蛋白中三个糖蛋白之一，是登革病毒的翻译的最重要非结构蛋白。1985年GREG W.SMITH，NS1蛋白可以与登革热患者血清中的抗体结合，说明登革热NS1蛋白在登革热病毒复制和感染过程中起着关键作用，是诊断登革热的重要指标。登革热NS1蛋白主要以二聚体形式存在，其分子量约42～50KDa，分子量主要由NS1蛋白上连接的糖基侧链的大小决定。
深入研究登革热NS1蛋白的抗原性发现，尽管登革病毒存在四种血清亚型，但是DEN-NS1序列翻译出的NS1蛋白的特异性抗体能与其他型NS1蛋白发生交叉反应。这说明四型登革热的NS1蛋白存在共同性，登革热NS1蛋白与其对应抗体可以用来诊断登革热。Jyh-Hsiung Huang等发现登革热NS1蛋白的部分氨基酸序列肽段可以引起登革热抗体血清发生免疫结合反应，对应的lgM和lgG抗体在患者发热后2天和9天可被检测出，患者康复后仍然能检测出较高的登革热NS1蛋白抗体滴度。相关研究表明，NS1蛋白与登革热患者病情发展有着重大关系，原发性登革热感染者在出现发热症状后不久即可检测出NS1蛋白与NS1蛋白抗体，但继发性登革热感染者(包括重症登革热患者)的血清抗原抗体检测含量较低。
登革热若只通过症状表现诊断往往会被其他病症类似的疾病误导、耽误救治。早期病毒感染确诊需要分离出样品中的病毒毒株，此方法费时费力，操作失误还会产生假阴性结果。现阶段确诊登革热感染主要依靠检测登革热标志性生物分子。登革热病毒核酸与登革热NS1蛋白在登革热病毒感染不久后的病毒快速复制过程中即有大量表达。为了尽早确诊登革热，核酸检测和蛋白质检测是最常使用的检测方法。对于登革热RNA的检测，基本是使用聚合酶链式反应(PCR)原理。登革热核酸检测因为核酸序列的特异性确诊登革热准确率最高的方法，但是核酸检测法受到核酸提取困难的限制，而且相对应的仪器，如RT-PCR仪和荧光光谱仪，价格都比较昂贵，不是每个实验室都有条件使用检测。登革热NS1蛋白也是登革热病毒感染后表达出的重要蛋白，NS1蛋白及其lgM和lgG抗体蛋白常来确诊登革热。一般利用NS1蛋白和NS1蛋白抗体之间的酶联免疫反应，设计相应的识别反应产生信号，以此检测NS1蛋白及其抗体。酶联免疫法鉴定登革热蛋白往往需要登革热NS1蛋白的不同抗体(包括一抗二抗、抗一抗二等)，虽然检测速度快，但纯度高的抗体价格昂贵，且不论酶联免疫法设计如何精巧，利用登革热NS1蛋白酶联免疫作用的检测方法仍然受到蛋白质稳定性差的影响。据已有报道抗体依赖感染增强效应(ADE)，继发性感染登革热患者体内会出现NS1蛋白与lgG抗体结合的情况，患者体内的NS1蛋白免疫检测准确度明显降低。因此，急需一种准确、方便、高效、快速、低成本的检测方法，实现对登革热NS1蛋白的检测。
分子印迹聚合物材料是一种用抗体抗原结合的原料，通过人工化学合成的方法制备的特殊功能材料，被广泛利用于化学、生物、环境等领域。分子印迹聚合物(Molecularimprinting polemers，MIPs)具有特异性、选择性和环境耐久性。但针对蛋白质的分子印迹聚合物制备仍存在一些挑战。首先，制备MIPs需要的模板分子一般是待分离物质的纯品，通常蛋白质都难以获得且价格昂贵，导致生物大分子印迹材料的研究和应用受到极大限制；温度和环境变化很容易影响蛋白质的柔性结构和构象，从热力学的角度来看，制备这些分子的印迹聚合物的难度很大；第二，蛋白质结构复杂，表面存在的多种类型的结合位点都可能与MIPs作用，导致其专一性识别性能很低；第三，蛋白质分子体积庞大，严重影响高度交联的MIPs的吸附动力学性能。第四，蛋白质在血液或组织中基体复杂，浓度非常低，快速检测难度很大。
对于蛋白质分子的检测，倘若使用生物法检测，目标分子的生物差异性不明显。但是化学检测方法强调目标物质的专一性，而蛋白质分子在实际表达中存在变异可能，并且变异的蛋白经过蛋白酶酶解后产生的多肽片段会存在某些序列不一致，在化学检测中会造成结果偏差。
在实际样品的UPLC-MS/MS检测结果中，某个离子对在登革热NS1蛋白和几个阳性血清样品中的信号强度不一致，如果只使用这一个离子对进行检测，会造成样品假阴性。就算使用同一个多肽的多肽多个离子对信息检测，也不能完全确保生物差异性引起的假阳性。因此，十分有必要建立多通道的检测信息，消除生物差异性。
分子印迹聚合物在制备的过程中不加入表面活性剂等致孔剂，一般是不具备大孔结构的。而这种均相聚合物材料，在复杂体系下无法萃取出浓度较低的目标物质，因此需要改进原本的聚合方法。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种灵敏度高、选择性强、可以快速检测登革热NS1蛋白的技术方案。
为了实现以上目的，本发明提供了一种检测登革热NS1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球，其包括PS微球以及覆盖在其表面的分子印迹聚合物层，所述分子印迹聚合物层具有由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽片段形成的空穴。
另一方面，本发明还提供了所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球用于检测登革热NS1蛋白的用途。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测登革热NS1蛋白的方法，其使用根据本发明所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球，利用固相萃取和超高效液相色谱质谱，通过检测所述多肽片段来检测登革热NS1蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括根据本发明所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球。
另一方面，本发明还提供了所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球的制备方法，其包括以下步骤：
1)将PS微球与十二烷基磺酸钠溶液一起超声处理，脱去所述PS微球吸附的空气，加入正己醇、聚乙烯醇和十二烷基磺酸钠溶液，充分搅拌形成微乳液环境；
2)各取NS1-1多肽模板溶液、NS1-2多肽模板溶液混合，加入甲基丙烯酸和4-乙烯基咪唑作为功能单体，进行预作用；
3)取苯乙烯和对二乙烯苯用氢氧化钠溶液淋洗并分液萃取，保留上层油相，并重复用氢氧化钠水溶液淋洗多次，保证充分去除稳定剂，边搅拌边滴加对二乙烯苯和苯乙烯，搅拌使混合溶液形成稳定的微乳液囊泡结构；
4)加入已预作用的功能单体和模板分子，搅拌，确保整个乳液环境稳定，整个反应体系升温至70℃，体系稳定后加入AIBN(偶氮二异丁腈)引发聚合反应；反应12h后终止加热，离心，沉淀加入三氟乙酸甲醇溶液超声，离心，沉淀加入无水乙醇，超声，离心分离保留沉淀；交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止，沉淀进行干燥。
优选地，该方法的具体步骤如下：
配置2.5％的十二烷基磺酸钠水溶液作为整个聚合反应的溶剂；称取0.2g PS微球，加入到20mL十二烷基磺酸钠溶液中，超声处理30min，充分脱去PS微球吸附的空气，使其完全润湿，超声结束后加入1mL正己醇并在搅拌的状态下加入5mL 1％的聚乙烯醇和5mL十二烷基磺酸钠溶液，充分搅拌形成微乳液环境，各取5mL浓度为1mg/L的NS1-1多肽模板溶液、NS1-2多肽模板溶液混合，加入甲基丙烯酸和4-乙烯基咪唑作为功能单体，预作用3h；取苯乙烯和对二乙烯苯用5％的氢氧化钠溶液淋洗并分液萃取，保留上层油相，并重复用5％氢氧化钠水溶液淋洗多次，保证充分去除稳定剂，边搅拌边滴加3mL对二乙烯苯和3mL苯乙烯，搅拌使混合溶液形成稳定的微乳液囊泡结构，此时加入已预作用的功能单体和模板分子，继续搅拌1h，确保整个乳液环境稳定；整个反应体系升温至70℃，体系稳定后加入40mgAIBN引发聚合反应；反应12h后终止加热，以5000r/in转速离心，沉淀加入1％v三氟乙酸甲醇溶液超声10min，以5000r/min的转速离心分离，沉淀加入无水乙醇，超声10min，并离心分离保留沉淀；交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止，沉淀进行50℃真空干燥。
本发明采用多孔隙双模板分子印迹微球固相萃取UPLC-MS/MS双通道检测登革热NS1蛋白。利用表面活性剂形成的微乳液体系，让苯乙烯疏水型单体和其他亲水型单体形成多界面体系，并以双登革热NS1特征多肽为模板制备了一种多孔型分子印迹材料。该材料含有丰富的孔隙结构，并且材料的孔隙结构是贯穿整个微球的，相较于表面印迹，空间利用率较高，有利于生物大分子的传输性能。以双多肽模板分子建立的双通道UPLC-MS/MS检测方法，减少了生物差异性带来的结果误差，增加了检测结果的准确性。该方法线性范围为1～100μg/L，检测限分别为LODNS1-1＝0.1168μg/L、LODNS1-2＝0.1820μg/L。此方法弥补了之前遇到的生物差异性带来的阳性样品产生假阴性信号，增加了方法的可靠性。
附图说明
图1是根据本发明的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球的合成过程示意图。
图2示出了双多肽模板NS1-1和NS1-2的分子结构。
图3示出了分子印迹聚合物红外光谱；其中，PS：PS微球，NIP：非印迹聚合物；MIP1：印迹聚合物洗脱模板后；MIP2：印迹聚合物洗脱模板前。
图4是分子印迹聚合物(MIP)与PS微球(PS)的热重表征数据。
图5是PS微球与MIP的氮气吸脱附表征数据。
图6是分子印迹聚合物扫描电镜表征结果。
图7是分子印迹聚合物能谱分析与元素分布图。
图8双多肽模板的离子对信息和液相图。
图9示出了双多肽模板分子标准曲线。
图10示出了登革热血清样品与登革热NS1蛋白样品检测结果。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。值得注意的是，出于简要清楚的目的，以下实施例中对一些常规的技术操作步骤、试剂、仪器并未进行细致的描述，但应理解，如未特别说明，这些常规技术操作步骤、试剂、仪器对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
实施例1：双多肽模板的UPLC检测方法建立
利用NS1-1、NS1-2多肽(结构如图2所示)建立双通道检测方法。首先用仪器自带的分子碎片优化系统，优化电离和碰撞电压，确定主离子信息和子碎片信息，以此质谱信息为检测信号，用C18超高效液相色谱柱对双多肽模板分子的混合标样进行流动相条件优化，确保能区分两个多肽碎片。
多肽片段NS1-1的氨基酸序列如下：RTTTASGKLITE(SEQ ID NO.1)。
多肽片段NS1-2的氨基酸序列如下：WNSGVLESEMVIPK(SEQ ID NO.2)。
双多肽液相梯度洗脱表如表1所示。
表1：双多肽液相梯度洗脱表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 0.2％甲酸水溶液(％) | 色谱纯甲醇(％) |
| 0.01 | 0.300 | 95 | 5 |
| 1 | 0.300 | 95 | 5 |
| 2 | 0.300 | 95 | 5 |
| 3 | 0.300 | 10 | 90 |
| 4 | 0.300 | 10 | 90 |
| 4.5 | 0.300 | 95 | 5 |
| 5 | 0.300 | 95 | 5 |
| 6 | 0.300 | 95 | 5 |
| 7 | 0.300 | 95 | 5 |
将1mg/L的多肽标准溶液稀释为1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L和1000μg/L系列浓度，以上述确定的液相条件和离子信息进行多肽标准系列溶液检测，以所得数据绘制双多肽标准曲线。
图8示出了双多肽模板的离子对信息和液相图。根据优化后的液相条件，进行双多肽混标检测，以模拟蛋白样品和血清样品的中双通道检测的性能。图8的双多肽液相质谱图中可以看到，NS1-1多肽的出峰时间为2.7min，NS1-2的出峰时间为3.5min，因此可以将两个多肽模板分子进行区分。
根据上述多肽标准溶液的浓度进行UPLC-MS/MS进样检测，并以此绘制双多肽模板分子的标准曲线，计算相关系数。配置九组空白样品，进行UPLC-MS/MS进样检测，计算其空白样品标准偏差，计算得出检测限LOD分别为：LODNS1-1＝0.1168μg/L、LODNS1-2＝0.1820μg/L。图9为双多肽模板分子标准曲线。
实施例2：多孔隙双模板分子印迹聚合物微球合成
本发明的多孔隙双模板分子印迹聚合物合成过程示意图如图1所示。
配置2.5％(质量浓度)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液作为整个聚合反应的溶剂。称取0.2g PS(聚苯乙烯)微球，加入到含有20mL十二烷基磺酸钠溶液的圆底烧瓶中，整个反应容器转移到超声震荡仪中超声30min，充分脱去PS球吸附的空气，使其完全润湿。超声结束后圆底烧瓶中加入1mL正己醇并转移到磁力搅拌器上，在搅拌的状态下加入5mL 1％(质量浓度)的聚乙烯醇(PVA)和5mL十二烷基磺酸钠溶液，充分搅拌形成微乳液环境。各取5mL浓度为1mg/L的NS1-1、NS1-2多肽模板溶液混合，加入甲基丙烯酸和4-乙烯基咪唑作为功能单体，预作用3h。
取苯乙烯和对二乙烯苯用5％(质量浓度)的氢氧化钠溶液淋洗并分液萃取，保留上层油相，并重复用5％(质量浓度)氢氧化钠水溶液淋洗三次，保证充分去除稳定剂。向搅拌中的圆底烧瓶加滴加3mL对二乙烯苯和3mL苯乙烯，快速搅拌使混合溶液形成稳定的微乳液囊泡结构，此时加入已预作用的功能单体和模板分子，继续搅拌1h，确保整个乳液环境稳定。整个反应体系转移到油浴锅中升温至70℃，体系稳定后加入40mg AIBN引发聚合反应。反应12h后终止加热，以5000r/in转速离心，沉淀加入1％v/v三氟乙酸甲醇溶液超声10min，以5000r/min的转速离心分离，沉淀加入无水乙醇，超声10min，并离心分离保留沉淀。交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止。沉淀置于50℃真空干燥箱内干燥12h。
非印迹微球也用上述方法合成，只是不需要加入模板多肽。
实施例3：分子印迹聚合物材料表征
1、分子印迹材料红外表征
用压片法制备固体红外测试薄片，对分子印迹聚合物材料、印迹聚合物含模板分子材料、非印迹聚合物材料与PS微球进行红外光谱表征。在红外灯下，分别称取0.002g分子印迹聚合物材料与0.002g PS微球，分别加入0.2g光谱纯溴化钾，样品占总成分1％。充分研磨均匀后用压片机以10MPa的压力进行压制5min，确保压片均匀透明后用于红外检测，扫描波长为4000-400cm-1。
结果如图3所示，从整体上看，变化最明显的峰有3024cm-1的苯骨架C-H的伸缩吸收峰，1499、1450cm-1处的苯骨架C-C震动频率吸收，以及760、700cm-1苯环单取代物的特征吸收。这些峰说明聚合物主体以聚苯乙烯形式存在，印迹反应后，主要的聚苯乙烯结构没有被破坏，但是因为交联剂对二乙烯苯、功能单体甲基丙烯酸和4-乙烯基咪唑的加入，聚苯乙烯的特征峰强度下降比较明显。1000、800cm-1两处小峰是苯对位取代的特征吸收，属于交联剂对二乙烯苯的特征吸收，强度较低说明聚合后交联剂参与反应量较少。1700cm-1归属于羰基C＝O伸缩吸收，属于功能单体甲基丙烯酸和模板多肽上的羰基，3435cm-1的宽峰为NH氨基峰，属于4-乙烯基咪唑和模板多肽上的氨基，这两处的峰强度都较小，这是因为原本反应体系中的加入量也少。前者在模板洗脱前后强度变化不明显，后者在模板洗脱后强度下降，说明多肽模板在经过酸洗后脱离印迹聚合物。
2、分子印迹材料热重表征
分别称取0.02g左右分子印迹聚合物材料、PS微球，进行热重分析。设置检测温度为40-800℃，升温速率为10℃/min。以失重百分比、失重速率为Y轴，温度变化为X轴作图。
结果如图4所示，首先，不论是分子印迹聚合物还是PS微球，都是由C、H、O、N等元素组成，在空气氛围下燃烧可以完全烧去，因此分子印迹聚合物与PS微球的失重百分比都在最后到达了零。对于PS微球，在300℃作用开始以较大速度失重，在380℃达到最大失重速率，整个失重过程只有一个平台，说明PS微球的成分单一。印迹聚合物在整个失重过程中出现了两个较为明显的失重平台，他们的最大失重速率分别在350℃和540℃处，特别是300℃起始的失重反应，明显是和PS微球的失重反应是一致的，说明300℃开始是PS微球被烧去的反应，之后的第二个失重平台是属于印迹聚合物层的失重反应。
3、分子印迹材料氮气吸脱附表征
分别称取0.1g左右分子印迹聚合物材料、非印迹聚合物材料与PS微球，置于氮气吸脱附表征样品管中先进行恒温脱气步骤。脱气温度为100℃，脱气时间3h。脱气后的样品管快速安装在氮气吸脱附仪器上，等样品管冷却后进行氮气吸脱附表征，测试期间确保液氮瓶内液氮液面高于样品管内样品。
结果如图5所示，经过聚合反应后，多孔隙分子印迹聚合物材料的氮气吸附量明显大于PS微球的，但总体吸附量明显过低。有可能是样品检测前脱气不完整，或材料本身对氮气吸附效果差，吸附量少。
4、分子印迹材扫描电镜和能谱表征
分子印迹聚合物材料与非印迹聚合物材料用乙醇分散，并超声30min。将超声后印迹聚合物材料与非印迹聚合物材料的分散液滴到粘有导电胶的扫描电镜样品台上，50℃真空干燥12h后进行扫描电镜观察，分散液滴到粘有铜箔的扫描电镜样品台上，50℃真空干燥12h后进行能谱表征。
结果如图6、图7所示，从分子印迹聚合物和非印迹聚合物的扫描电镜表征图片显示，不论是印迹聚合物还是非印迹聚合物，两者颗粒大小基本一致，在微观结构上也基本一致。分子印迹聚合从形貌上看具有非常丰富的孔隙结构，就算加入模板分子，并且经过酸洗处理后，微观结构没有消失，仍然保持着丰富的空穴结构。图7中可以发现，分子印迹微球的主要元素是C元素，并集中分布在球体之上，含量在82％左右。根据之前的经验，N元素的含量会因为被C元素的峰覆盖，较难作为分析目标，O元素在整个样品体系中含量较少，也较难作为分析目标。因此较难以此能谱信息区分模板是否在存在分子印迹聚合物内。
实施例4：实际样品检测
选取三组登革热阳性患者血清样品和登革热NS1蛋白溶液，向其中加入1mL50mmol/L的碳酸氢铵水溶液作为溶剂和缓冲剂，加入100μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液，震荡均匀后于37℃恒温培养箱内孵育1h。反应停止后加入100μL 0.3mol/L碘乙酸溶液，置于37℃恒温培养箱内暗室孵育1h后取出，加入200μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液和200μL100ng/L的牛胰蛋白酶，置于37℃恒温培养箱内孵育6h，取出后加入0.1％的甲酸水溶液终止酶解反应并定容至5.0mL，放置于4℃冰箱内密封保存。
取1mL酶解完的待测样品加入到固相萃取柱中进行固相萃取，分批加入5mL 1％的三氟乙酸甲醇溶液冲洗。收集洗脱液，将洗脱液用干式氮吹仪于50℃氮吹近干，以0.1％v/v的甲酸水溶液重新定容至1mL。用0.22μm的滤膜过滤，转移到2mL样品瓶内，用UPLC-MS/MS检测方法进行超高效液相质谱检测。
反应后的蛋白酶解液，经过双多肽模板分子印迹聚合物固相萃取柱萃取后，进行UPLC-MS/MS进样液质检测，结果如图10所示，对比双多肽模板的检测信号，其差异性较小，说明双通道检测方法有效。
以上实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种检测登革热NS1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Asn Ser Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Val Ile Pro Lys
1 5 10
Claims (5)
1.一种检测登革热NS1蛋白的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球，其特征在于：包括PS微球以及覆盖在其表面的分子印迹聚合物层，所述分子印迹聚合物层具有由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽片段形成的空穴。
2.根据权利要求1所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球用于检测登革热NS1蛋白的用途。
3.一种用于检测登革热NS1蛋白的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球，利用固相萃取和超高效液相色谱质谱，通过检测所述多肽片段来检测登革热NS1蛋白。
4.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物微球的制备方法，其包括以下步骤：
1)将PS微球与十二烷基磺酸钠溶液一起超声处理，脱去所述PS微球吸附的空气，加入正己醇、聚乙烯醇和十二烷基磺酸钠溶液，充分搅拌形成微乳液环境；
2)各取NS1-1多肽模板溶液、NS1-2多肽模板溶液混合，加入甲基丙烯酸和4-乙烯基咪唑作为功能单体，进行预作用；
3)取苯乙烯和对二乙烯苯用氢氧化钠溶液淋洗并分液萃取，保留上层油相，并重复用氢氧化钠水溶液淋洗多次，保证充分去除稳定剂，边搅拌边滴加对二乙烯苯和苯乙烯，搅拌使混合溶液形成稳定的微乳液囊泡结构；
4)加入已预作用的功能单体和模板分子，搅拌，确保整个乳液环境稳定，整个反应体系升温至70℃，体系稳定后加入AIBN(偶氮二异丁腈)引发聚合反应；反应12h后终止加热，离心，沉淀加入三氟乙酸甲醇溶液超声，离心，沉淀加入无水乙醇，超声，离心分离保留沉淀；交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止，沉淀进行干燥。
5.一种试剂盒，其特征在于包括根据权利要求1所述的多孔隙双模板分子印迹聚合物微球。
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