NO319296B1 - Fremgangsmate og reagens-kit for pavisning av en analytt i en provevaeske. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for påvisning av en analytt i en prøve-væske under agglutinering hvorved prøve-væsken bringes i kontakt med en agglutineringsreagens og en inert matriks, reaksjonsblandingen utsettes for innvirkning av gravitasjon og reaksjonen mellom analytten og agglutineringsreagensen bestemmes. I tillegg beskrives et reagens-kit for gjennomføring av oppfinnelsens fremgangsmåte.

Fremgangsmåter for påvisning av analytter ved hemagglutinerings- samt ved partikkel-agglutineirngsprøver er kjent. Disse prøver finner anvendelse ved diagnose av infektiøse sykdommer for antigen- henholdsvis anti-stoff-detektering. Alle disse metoder har dog den felles mangel at de er tids- og personalkrevende og at resultatene ofte kun er vanskelige å tolke.

For hemagglutineringsprøver der ikke-fikserte retrocytter anvendes som agglutineringsreagenser kjenner man gel immuoanalysemetoder der hemagglutinater separeres fra enkelte ikke agglutinerte erytrocytter ved et sentrifugeirngsskritt gjennom en inert matriks (se for eksempel EP-A-0.194.212, EP-A-0.305.337, EP-A-0.557.546, EP-A-0.634.216, EP-A-0.485.228 og W095/31731). I henhold til disse metoder blir agglutinerte erytrocytter holdt fast på eller i den inerte matriks og kan derved tydelig separeres fra ikke-reagerende, enkelte erytrocytter som kan trenge gjennom matriksen og sedimentere på bunnen av reaksjonsbeholderen.

I EP-A-0.305.337 som går tilbake til en prioritetssøknad fra året 1987, finner man et utsagn om at det som agglutineringsreagenser også kan anvendes syntetiske partikler som latex eller polymerisert agarose. Nærmere opplysninger om egenskapene for slike syntetiske partikler finnes dog ikke. I tillegg er dette forslag ikke tatt opp i den etter-følgende tid, hverken i patenter eller i andre publikasjoner. Tvert imot har man i nyere publikasjoner som EP-A-0.557.546 tatt sikte på ikke-fikserte erytrocytter som agglutineringsreagenser.

US 5592064 angir anvendelse av syntetiske latekspartikler i en immunserologisk test ved bruk av mikrotitrering.

En mangel ved ikke-fikserte erytrocytter ligger dog i mangelen på stabilitet som under spesielle reaksjonsbetingelser fører til en hemolyse. Denne mangel på stabilitet resul-terer ofte i uønsket korte nedbrytningsdata for produkter på basis av ikke-fikserte erytrocytter. Videre er en standardisert og reproduserbar fremstilling av erytrocytt-preparater, særlig av antistoff og antigen-koblede erytrocytt-preparater, kun vanskelig mulig. Således er en tilstrekkelig uniformitet for de fysikalske egenskaper praktisk talt utelukkende ved erytrocytt-preparater.

En oppgave som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse ligger derved i i det minste delvis å overvinne de ovenfor nevnte mangler som gir seg ved anvendelse av erytrocytter som agglutineringsreagenser. Særlig skal det ved hjelp av oppfinnelsen stilles til disposisjon en fremgangsmåte omfattende bruk av syntetiske partikler som kan anvendes som agglutineringsreagens og i kjente gel-immunoanalyser kan simulere oppførselen til erytrocytter. Videre skal de syntetiske partikler tillate en enkel kobling av biologiske stoffer og derved være slik av beskaffenhet at de som agglutineringsreagenser i det minste er likeverdige med de til nu anvendte erytrocytter med henblikk på sensitivitet og spesifisitet. Disse agglutineringsmetoder skal være enklere å gjennomføre og å bedømme enn de til nu anvendte metoder.

Denne oppgave løses ved en fremgangsmåte for påvisning av en analytt i en prøvevæske under agglutinering hvorved prøve-væsker bringes i kontakt med en agglutineirngsreagens og en inert matriks, reaksjonsblandingen utsettes for gravitasjon og reaksjonen mellom analytt og agglutineringsreagensen bestemmes, kjennetegnet ved at man som agglutineirngsreagens anvender syntetiske partikler som overfor matriksen i det vesentlige oppfører seg som erytrocytter og som oppviser en midlere diameter < 5 um og en spesifikk densitet > 1,1 g/cm<3>.

Overraskende er det nu fastslått at det når samtidig densitet og diameter innstilles optimalt, virkelig kan fremstilles syntetiske partikler som uten problemer kan passere en inert matriks i en gel immunoanalyse og derved perfekt simulere friske erytrocytter.

Innenfor rammen av de forsøk som førte til foreliggende oppfinnelse viste det seg at passasjen av stive polymerpartikler ble sterkere forsinket sammenlignet med erytrocyttene (diameter 6 til 8 nm). Under gitte standardbetingelser betyr dette konkret at kommersielt tilgjengelige standardpartikler med en diameter på 3 til 7,5 um kun ufullstendig sedimenteres i gelmatriksen mens større (11,9 um) henholdsvis mindre syntetiske partikler (< 1 um) kun svakt trenger inn i gelen. En økning av parameteren sentrifugeringsvarighet (fra 10 minutter til opp til 50 minutter) henholdsvis sentri-fugeringshastigheten (fra 1030 til 1300 omdr./min.) ga riktignok en bedre men fremdeles ikke fullstendig sedimentering. Selv når en optimal sedimentering hadde kunnet oppnås ved begge disse forholdsregler er dog en forandring/forhøyelse av sentrifugeringsvarigheten og -hastigheten svært ugunstig og det av følgende grunner:

1. Oppfinnelsens system skal tillate en særlig rask metode sammenlignet med sammenlignbare metoder. Ved en mulig sentrifugeringsvarighet på 50 minutter vil den tilstrebede testvarighet på 20 minutter inkludert inkubering være 3 ganger for lang. 2. Som fagmannen vet reduseres sensitiviteten i gelsentrifugeringsmetoder med stigende sentrifugeringshastighet. 3. Ved overholdelse av gitte parametre har man en kommersielt tilgjengelig sentrifuge til disposisjon for oppfinnelsens system.

Overraskende har man nu funnet at det med syntetiske partikler med mindre diameter enn de til erytrocyttene og høyere densitet enn vanlig, kan oppnås en med erytrocyttene sammenlignbar oppførsel ved passasje av den inerte matriks. Derved kan man benytte både sfæriske og assymetriske, syntetiske partikler.

Som foretrukket for oppfinnelsens fremgangsmåte har vist seg syntetiske partikler med en midlere diameter lik mindre enn 5 um og særlig 1 til 5 um. Særlig foretrukket ligger den midlere diameter mellom 2 og 4 um. Den spesifikke densitet for partiklene er fortrinnsvis > 1,1 g/cm<3> og ligger helst i området 1,1 til 1,8 g/cm<3>. Fortrinnsvis ligger den spesifikke densitet i området 1,1 til 1,6 g/cm3 og aller helst i området 1,15 til 1,4 g/cm<3>, særlig når påvisningsmetoden gjennomføres ved standardbetingelser slik de er gitt for kjente, kommersielle erytrocytt-gel-immunoanalyser (for eksempel DiaMed).

Fortrinnsvis er de i oppfinnelsens fremgangsmåte, som agglutineringsreagenser anvendte, syntetiske partikler, organiske polymer- eller kopolymerpartikler. Særlig foretrukne materialer er styren og styren-derivater som for eksempel brom-styrener og særlig kopolymerer derav. Fremstillingen av uniforme polymerpartikler i størrelses-området slik de kommer i betraktning ved oppfinnelsens agglutineringsreagenser, er kjent for fagmannen (Arshady (1992): "Suspension, emulsion and dispersion polymerization: A methodological Survey". "Colloid & Polymer Science" 270,717-732; "Okubo und Shiozaki (1992): "Production of micron-size monodispense polymer particles by seeded polymerization utilizing dynamic swelling method with cooling process". "Polymer International" 30,469-474). Slike metoder anvender vanligvis en kombina-sjon av emulsjons- og dispersjonspolymerisering for å fremstille partikler med eksakt definerte, fysikalske egenskaper.

For den visuelle detektering av agglutineringsreaksjonene i oppfinnelsens fremgangsmåte kan man anvende farvestoffer og særlig vannuoppløselige farvestoffer som inkorporeres i partiklene. Således har blå-, gul-, grønn-, svart- eller rødfarvede, syntetiske partikler vist seg meget godt egnet for visuell bedømmelse. I en særlig foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen arbeider man med røde partikler på grunn av den særlig gode detekterbarheten.

Robustheten for de syntetiske partikler muliggjør immobiliseringen av et stort antall forskjellige ligander i henhold til kjente, industrielle standardmetoder, på deres overflate. Hensiktsmessig immobiliserer man derved ligandmolekyler som er bindedyktige med analytten som skal bestemmes. Ligandmolekylene kan immobiliseres via adsorbtive, kovalente eller høyaffine vekselvirkninger. Den kovalente kobling kan for eksempel skje over kjemisk reaktive grupper som er eksponert på overflatene. Eksempler på slike grupper er karboksyl-, amino-, aldehyd- og epoksygrupper. Immobiliseringen over høyaffine vekselvirkninger formidles via to partnere i et høyaffint bindepar som for eksempel streptavidin henholdsvis avidin/biotin, hapten/anti-stoff, sakkarid/lectin og så videre. Ved hjelp av disse kovalente og høyaffine vekselvirkninger kan man immobilisere ligandmolekyler som for eksempel peptider som syntetisk fremstilte peptider, proteiner som glycoproteiner, lipoproteiner, rekombinante polypeptider, immunoglobuliner, nukleinsyrer som DNA eller RNA, nukleinsyreanaloger, sakkarider som mono-, di-, oligo- og polysakkarider, lipider, hormoner, metabolitter og andre biologiske stoffer. Immobiliseringen kan derved skje direkte eller ved hjelp av anvendelse av linkere for på kontrollert måte å få en foretrukket optimal orientering av de bundne ligandmolekyler.

Likeledes er imidlertid også en immobilisering av ligandmolekyler mulig via rent adsorbtive prosesser. Dette er mulig for eksempel for cellemembraner som membraner av erytrocytter, trombocytter eller leukocytter, fragmenter av cellemembraner eller lysater av celler eller patogener som viruser, bakterier eller parasitter. Ved anvendelsen av farvede, syntetiske partikler er en ytterligere innfarving av membranene overflødig.

Oppfinnelsens fremgangsmåte gjelder påvisning av en analytt i en prøvevæske. Som prøvevaesken tjener fortrinnsvis kroppsvæsker som eventuelt kan være fortynnet, eksempler er blod, serum, plasma, spytt eller urin. Volumet av prøvevæsken for oppfinnelsens fremgangsmåte kan variere innen vide områder, fortrinnsvis anvendes det 1 til 200 ul for mikrotestvolumer.

Som agglutineringsreagenser anvendes det i opprinnelsens fremgangsmåte de beskrevne, syntetiske partikler. Disse partikler inneholder på sin overflate fortrinnsvis et spesifikt ligandmolekyl som med høy affinitet er bindedyktig med analytten. Agglutineringsreagensen inneholder vanligvis flere bindingsseter for analytten hvorved dannelsen av fornettede agglutineringskomplekser av analytt og agglutineringsreagens er mulig.

De ved oppfinnelsens fremgangsmåte påvisbare analytter er stoffer som kan inngå en spesifikk og høyaffin vekselvirkning med agglutineringsreagensen, for eksempel antigener henholdsvis antistoffer som kan bestemmes ved en immunreaksjon, eller også nukleinsyrer som kan bestemmes ved en hybrideringsreaksjon. En første, foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen angår påvisningen av antistoffer som analytter ved prøvevassker, for eksempel antistoffer mot patogener som vimser (HIV, heptatitt-viruser), bakterier eller protozoer, antistoffer mot auto-antigener, antistoffer mot tumorer eller antistoffer mot allergener.

Videre kan man ved oppfinnelsens fremgangsmåte også gjennomføre en klassespesifikk påvisning av antistoffer, for eksempel en separering mellom IgG- og IgM-antistoffer, noe som er av betydelig betydning ved diagnoser for eksempel av infektiøse sykdommer eller autoimmunsykdommer.

På den annen side kan man ved oppfinnelsens fremgangsmåte også bestemme antigener, for eksempel frie antigener som serum-proteiner, metabolitter, hormoner, mediatorer og så videre, eller bærerbundne antigener som for eksempel cellulære blodgruppe-antigener og så videre.

Ved oppfinnelsens metode anvendes det en reaksjonsbeholder med en matriks slik at det efter innvirkning av gravitasjonskrefter er mulig med en kvalitativ eller semi-kvantitativ bestemmelse av agglutineringsreaksjonen mellom analytten som skal bestemmes og agglutineringsreagensen. Selv om innvirkningen av gravitasjonskreftene også kan oppnås ved lengre sedimentasjon anvender man fortrinnsvis en sentrifugering da man da allerede efter kort tid kan bevirke den ønskede sedimentering. De optimale betingelser med henblikk på sentrifugeringsvarighet og g-tall kan fagmannen bestemme uten vanskeligheter for hvert enkelt analysesystem. Betingelsene bestemmes særlig av beskaffenheten for agglutineringskomplekset mellom agglutineirngsreagens og analytt, komponentene i reaksjonsblandingen i ikke-bundet tilstand samt den i hvert tilfelle anvendte matriks.

Fortrinnsvis anvendes det ved oppfinnelsens fremgangsmåte en inert, partikkelforrnig matriks. På den annen side kan man også for eksempel anvende den i EP 96 10 428.3 beskrevne, kompakte matriks.

Fortrinnsvis er matriksen en inert, partikkelforrnig matriks. Med betegnelsen "inert" menes at matriksen ikke kan inngå ikke-spesifikke reaksjoner med analytten henholdsvis agglutineringsreagensen. Fortrinnsvis anvendes det som matriks partikler som er kommersielt tilgjengelige for væskekromatografi (for eksempel fra Merck, Pharmacia, Bio-Rad, Tosohaas). Spesifikke eksempler er "Sephadex", "Sepharose", "Sephacryl",

"Bio-Gel" eller "Topopearl". Det dreier seg derved om produkter på basis av fornettede polymerer eller kopolymerer som agarose, polyakrylamid, polydekstran, styren/divinyl-benzen eller polymetakrylat. Likeledes kan man benytte glasskuler. Komstørrelsen for partiklene i matriksen utgjør fortrinnsvis 10 um til 200 mm til 200 um. Likeledes kan det anvendes matrikser til hvilke det allerede er koblet påvisningsreagenser som for eksempel antistoffer slik de kan oppnås fra firma Pierce eller Pharmacia. Fagmannen kan ved hjelp av enkle forforsøk bestemme om partiklene er brukbare i en spesiell påvisningsmetode.

Interpreteringen av resultatene fra oppfinnelsens fremgangsmåte er slik at, efter innvirkning av gravitasjonskrefter på reaksjonsblandingen,

a) ved en sterk agglutinering, reaksjonsproduktet av analytten som skal bestemmes og agglutineringsreagensen ikke eller kun i liten grad trenger inn i matriksen, b) ved en svak agglutinering, reaksjonsproduktet trenger inn i matriksen men ikke kan trenge fullstendig gjennom denne, og c) ved manglende agglutinering, de i reaksjonsbeholderen foreliggende komponenter kan trenge gjennom matriksen så og si fullstendig.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsens fremgangsmåte arbeider man med to eller flere forskjellige arter av syntetiske partikler som agglutineringsreagenser. Det finnes nemlig forskjellige, med hverandre assosierte sykdommer ved hvilke man med vanlige testmetoder først må gjennomføre en såkalt screening der man søker å fastslå om personen som undersøkes bærer antistoffer mot en sykdom som tilhører denne gruppe. Er den testede kroppsvæske fra den undersøkte person positiv i screeningtesten må den ved hjelp av konvensjonelle metoder underkastes en såkalt differensieringstest i et andre trinn, der man fastslår mot hvilken av sykdommene i gruppen antistoffet er rettet. Et typisk eksempel på denne type prosess er HIV-diagnostikken. Ved screeningen fastslår man hvorvidt det foreligger HIV-spesifikke antistoffer. I differensieringen fastslår man om disse er rettet mot HIV-I, mot HTV-U eller mot HIV-I og HIV-II.

Ved oppfinnelsens fremgangsmåte kan man nu arbeide med to forskjellige typer syntetiske partikler som ikke skiller seg fra hverandre når det gjelder størrelse, form, densitet og fleksibilitet men som oppviser en forskjellig farving, for eksempel rød og blå, og en forskjellig utrustning når det gjelder overflateligander. Da det fra disse forskjellige spesier av syntetiske partikler dannes en homogen suspensjon med like andeler av hver spesie kan suspensjonen benyttes for en enkelt test. De resulterende resultater kan så interpreteres som følger: Foreligger begge analyttene som skal bestemmes i prøvevæsken har man efter sentrifugering et rødt og et blått bånd på matriksen eller i dennes øvre område. Når kun en analytt er tilstede kan man i det øvre området av matriksen detektere et bånd med den tilsvarende farve mens den syntetiske partikkel med den andre farve har trengt gjennom matriksen og er anordnet under denne. Hvis hverken den første eller den andre analytt inneholdes i prøvevæsken danner det seg under matriksen et sjikt av de to syntetiske partikler. Tilsvarende kan det naturligvis også benyttes tre eller flere forskjellige syntetiske partikler med forskjellige farver for å differensiere de forskjellige antall av parametre fra hverandre samtidig.

For gjennomføring av fremgangsmåten kan man anvende i og for seg hvilke som helst reaksjonsbeholdere som er egnet for anvendelse i en gel-agglutineringstest. Volumet av reaksjonsbeholderen er fortrinnsvis 50 ul til 2 ml. Reaksjonsbeholderne er fortrinnsvis utstyrt med en trakt for opptak av reagensen. I en foretrukken utføfelsesform anvender man en anordning av flere reaksjonsbeholdere som sammen er anordnet på et kart eller en skive. De på et kart eller en skive anordnede reaksjonsbeholdere kan være ment for påvisning av den samme analytt eller for påvisning av forskjellige analytter.

For eksempel kan man for gjennomføring av oppfinnelsens fremgangsmåte anvende de kart som markedsføres av firma DiaMed for blodgruppeanalyse og der det er anordnet 6 mikroreaksjonsbeholdere. Likeledes kan man anvende produkter fra firma Ortho eller firma Diagast.

Innvirkningen av gravitasjonen på reaksjonsblandingen skjer fortrinnsvis ved sentrifugering av reaksjonsbeholderen i en for dette egnet sentrifuge. Således kan man i en foretrukken utførelsesform gjennomføre oppfinnelsens fremgangsmåte med den kommersielt tilgjengelige DiaMed ID-sentrifuge 12 SII med fast innstillbare parametre (t= 10 min., v = 85 g).

I en andre, ytterligere foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen kan man dog også arbeide med modifiserte sentrifugeringsmetoder som særlig tar hensyn til kinetikken i den til grunn liggende reaksjon. Dette gir seg utslag i en reaksjonsforsterkning av alle svake reaksjoner.

Videre er det for spesielle utførelsesformer av oppfinnelsens fremgangsmåte foretrukket å arbeide med matrikser som inneholder et andre antistoff, for eksempel et såkalt gruppespesifikt antistoff som anti-IgG. Herved skjer det en tofase-reaksjon i reaksjons-beholdeme. Den første reaksjon skjer i reaksjonskammeret når i en positiv reaksjon ligand-molekylet på de syntetiske partikler, for eksempel et antigen, reagerer med analytten, det vil si et antigen-spesifikt antistoff, i prøven. Det kan allerede her komme til tverrfornetning mellom de forskjellige syntetiske partikler (agglutinering), noe som når det gjelder IgG-reaksjonen ofte fører til kun meget svak agglutinering. De i matriksen tilstedeværende andre antistoff sørger ved ytterligere fornetning av allerede dannede agglutineringskomplekser for den ønskede effekt av en spesifikk reaksjonsforsterkning.

Ved en total testvarighet på kun 20 minutter tillater oppfinnelsens beskrevne testsystem en signifikant tidsbesparelse i forhold til kjente systemer. Sammenlignet med test-systemer som er basert på fikserte eller ikke-fikserte erytrocytter som agglutineringsreagenser ligger en ytterligere fordel i den langt lengre holdbarhet for de syntetiske partikler samt utgangsmaterialets bedre uniformitet.

Ved tilsvarende forberedelse av testsystemet er gjennomføringen enkel og resultatene kan avleses uten tvil slik at testen også kan gjennomføres av medisinsk hjelpepersonale. Anvendelsen er tenkelig enkel og omfatter kun to pipetteringstrinn. Med en akku-dreven sentrifuge og et lignende vortex-apparat kan bestemmelsen på enkel måte også gjennomføres utenfor faste laboratorie-innretninger uten strømtilkobling. På grunn av den lave mengde prøve, utelatte vaskeskritt samt muligheten for å lukke reaksjonsbeholderne efter benyttelse, er det sørget for en kortest mulig eksponering for personale mot potensielt infektiøse materialer og den størst mulige kontroll av potensielt infektiøst avfall.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er en reagens-kit for påvisning av en analytt i en prøve-væske, omfattende: (a) minst en reaksjonsbeholder som inneholder en inert matriks, og (b) minst en type syntetiske partikler med en midlere diameter < S um og en spesifikk densitet > 1,1 g/cm<3>, på hvis overflate det er immobilisert ligandmolekyler.

Ved bestemte typer av oppfinnelsens bestemmelsesmetode er det foretrukket å tilsette en detergens reaksjonsblandingen. Eksempler på egnede detergenser er ioniske detergenser som SDS, eller ikke-ioniske detergenser som Triton X-100 og Tween 20. Videre kan også tilsetningen av muciner være foretrukket. Ved tilsetning av detergenser og/eller muciner kan partiklenes enhetlighet i suspensjonen henholdsvis under gelpassasjen, forbedres. Dette fører til en mere fullstendig sedimentering ved negative reaksjoner.

Likeledes kan det vise seg hensiktsmessig å gjennomføre reaksjonen under tilsetning av en reduserende agens, for eksempel en sulfhydryl-reagens som 2-mercapto-etanol, ditiotreitol eller natriumditionit, eller en annen reduserende agens som tributylfosfin. Ved hjelp av reduksjonsmidler kan man redusere uønskede, ikke-spesifikke reaksjoner slik de for eksempel fremkalles på grunn av IgM-antistoffer.

Videre kan det ved spesielle prøver oppnås en forbedring av testresultatene ved en modifisering av sentrifugeringsbetingelsene. Dette gjelder særlig ved tester der det anvendes en matriks med en reseptor, for eksempel en matriks belagt med et andre antistoff. En foretrukken modifisering av sentrifugalbetingelsene omfatter en intervall-sentrifugering, det vil si et første sentrifugeirngstrinn, så en pause og så et andre sentri-fugeringstrinn. Eventuelt kan sentrifugeringen gjennomføres i flere intervall-trinn. Det første sentrifugeirngstrinn er fortrinnsvis et kort sentrifugeirngstrinn med en varighet på opp til 1 minutt og fortrinnsvis opp til 30 sekunder. Så følger en pause på for eksempel 1 til 10 minutter, henholdsvis ca. 5 minutter. Til slutt gjennomføres så et andre sentri-fugeringstrinn med lengre varighet og eventuelt også et høyere g-tall.

Ved hjelp av de følgende eksempler skal spesielle aspekter ved oppfinnelsen forklares nærmere under henvisning til figurene der:

Figur 1: viser resultatene som oppnås ved positiv, svakt positiv og negativ reaksjon i oppfinnelsens fremgangsmåte; Figur 2: viser en skjematisk illustrasjon av testgjennomføringen; Figur 3: viser reaksjonen som finner sted i en mikro-reaksjonsbeholder der matriksen inneholder anti-IgG-antistoffer:

a) i reaksjonskammeret og

b) i buffersupernatanten for matriksen henholdsvis i matriksen;

Figur 4: viser de skjematiske resultater for en differensial-diagnose på to

forskjellige analytter Al og A2 i en reaksjonsbeholder:

a) pasientprøve 1, antistoff positiv for Al; b) pasientprøve 2, antistoff positiv for A2; c) prøve 3 (blanding av sera fra pasient 1 og 2), antistoff positivt for

Al ogA2; og

d) pasientprøve 4, antistoff negativt for Al og A2; og

Figur 5: viser den skjematiske illustrasjon av reaksjonssoner til hvilke det

henvises i tabell 1. Sone 0 betyr: partiklene danner efter sentrifugering et sediment slik det er ønsket for en negativ reaksjon. Sone 5 betyr: ingen gjennomtrenging av gelmatriksen.

Eksempler:

1. Forsøk med syntetiske partikler fra den kjente teknikk og som ikke virker i gel-testen ( sammenligning!.

1. Testgjennomføring:

Suspensjonen av kommersielt tilgjengelige, farvede, syntetiske partikler som vanligvis foreligger i konsentrasjoner på 10 % faste partikler vekt/volum, ble vasket med 10 mM PBS-oppløsning, pH 7,4 (Sigma P 4417), 0,1 % Tween-20 (Sigma P 7949) (volum/- volum) og innstilt til en konsentrasjon på 0,15 % faste partikler i den samme oppløsning.

Fra denne suspensjon ble det i alle tilfeller pipettert 25 ul i et mikroreaksjonsrør og der sedimentert under de i tabell 1 angitte betingelser.

2. Fremstilling av e<g>nede, syntetiske partikler.

De i de følgende eksempler anvendte, syntetiske partikler ble fremstilt ved disper-geringspolymerisering da denne metode generelt er best egnet for fremstilling av partikler i området 1 til 5 um. I et første trinn ble det syntetisert basis-partikler poly-styren (2a). Derefter ble basis-partiklene svellet ved en kopolymerisering med styren/bromstyren til høydensitetspartikler (2b). I det derpå følgende trinn skjedde farvingen (2c).

2a. Polymerisering av basis- patriklene.

Gjennomføring:

60 g 1-heksadecanol (Aldrich 25,874-1), 216 g polyvinylpyrrolidon 40000 (PVP) (Aldrich 85,656-8), 1744 g dest. styren (Aldrich S497-2) og 10261 g industri-sprit (Banners IMS 99) ble veiet inn i en 201 rundkolbe-reaktor utstyrt med røreverk, vannkondensator og nitrogen-innløp. Omrøringshastigheten ble innstilt til 35 til 40 omdr./- min.. Blandingen ble gasset i 16 timer ved romtemperatur. Derefter ble temperaturen øket til 70°C. 17,4 g azo-bis-isobutyronitril (Fisons A/9050/50) ble nu satt til reaksjonsblandingen hvorved det dannet seg en hvit emulsjon. Efter ytterligere 24 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur. De resulterende partikler ble vasket ved gjentatt sentrifugering i metanol (3000 omdr./min., 5 minutter), og derfter, efter det siste vasketrinn, resuspendert i en 0,1 % vekt/volum SDS (Fisons S/5200/53). Fra denne sats oppnådde man 1573 g monodisperse polystyrenpartikler med en diameter på 2,3 um.

2b. Fremstilling av " høydensitets"- partikler.

Gjennomføring:

118,3 g av en 10 % vekt/volum-suspensjon av 2,3 g um partikler (fremstilt i henhold til eksempel 2a) og 250 g av en polyvinylalkohol (Harco 26-88) (PVA) (5 % vekt/volum)-oppløsning ble veiet inn i en 1-liters rundkolbereaktor med rørverk, vannkondensator og nitrogeninnløp hvoretter omdreiningshastigheten ble innstilt til 250 omdr./min.. 1,5 g benzoylperoksyd (Aldrich 22,887-7) ble oppløst i 21,6 g 4-bromstyren (Avocado 17896). Denne oppløsning ble emulgert i 250 ml av en 0,5 % vekfcVolum SDS-opp-løsning. Bromstyren-oppløsningen ble så satt til rundkolbe-reaktoren. Efter 3 timer ble det tilsatt 125 g 1 %-ig vekt/volum natrium-dikromat (Fisons S/3560/60)-oppløsning og temperaturen forhøyet til 70°C. Efter ytterligere 16 timer ble temperaturen øket til 80°C og omsetningen fikk fortsette i ytterligere 3 timer. Derefter ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur. De resulterende partikler ble vasket ved gjentatt sentrifugering i vann og ga et utbytte på 26,98 g partikler som nu hadde en diameter på 3,1 um. Det nominelle innhold av polymerbromstyren i disse partikler utgjorde 65 % vekt/volum. Sedimenteringsgraden for en 1 % vekt/volum-suspensjon av disse partikler i vann var 5,7 mm pr. time. Den teoretiske densitet lå ved 1,28 g/cm<3> (se tabell 2).

I henhold til denne metode ble det polymerisert forskjellige partikler med samme diameter men med forskjellige forhold bromstyren:styren og derved forskjellig høy densitet (se tabell 2).

2c. Innfarving av høvdensitetspartiklene.

Gjennomføring:

Sudan IV (rød):

200 g av en 10 % vekt/volum-suspensjon av syntetiske høydensitetspartikler (fremstilt som beskrevet i eksempel 2a og 2b) med diameter 3,1 um, 11,6 g av en 5 %-ig vekt/- volum-oppløsning av polyvinylalkohol (Harco 26-88), 40 g metanol (Hammond) og 240 g vann ble veiet inn i en 1 liters rundkolbereaktor med PTFE-røreverk og vannkondensator. 0,4 g farvestoff Sudan IV (Kodak 112 6150) ble oppløst i 30 g diklormetan (Fisons D/1852/25) og oppløsningen emulgert i 250 ml av en 0,5 vekt/volum SDS-oppløsning. Diklormetan-emulsjonen ble så satt til reaktoren ved romtemperatur. Efter 4 timer ble den resulterende emulsjon av røde partikler satt til et 2 liters begerglass. For å fordampe diklormetanet hurtigst mulig ble overflaten behandlet med nitrogengass under omrøringen. For å maksimalisere fordampingen ble suspensjonen i tillegg oppvarmet noe. De resulterende røde partikler ble vasket ved gjentatt sentrifugering i vann ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter. De ga et utbytte på 19,8 g.

Ferro FW 1263 (blå):

50 g av en 10 % vekt/volum-suspensjon av syntetiske høydensitetspartikler (fremstilt som i eksempel 2a og 2b) med diameter 3,1 um, 2,9 g av en 5 %-ig vekt/volum-oppløsning av polyvinylalkohol (Harco 26-88) og 60 g vann ble veiet inn i en 1 liters rundkolbereaktor med PTFE-røreverk og vannkondensator. 0,184 g farvestoff Ferro FW1263 (Ferro Normandy Plastics Ltd., Westgate, Aldridge, GB) ble oppløst i 7,5 g diklormetan (Fisons D/1852/25) og oppløsningen ble emulgert i 62,5 ml av en 0,5 % vann/volum SDS-oppløsning. Diklormetanoppløsningen ble så satt til reaktoren ved romtemperatur. Efter 2 timer ble den resulterende emulsjon av blå partikler satt til et 500 ml begerglass. For å fordampe diklormetanet hurtigst mulig ble overflaten av suspensjonen behandlet med nitrogen under omrøringen. For å maksimalisere fordampingen ble suspensjonen oppvarmet noe i tillegg. De resulterende blåe partikler ble så vasket ved gjentatt sentrifugering i vann ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter. Dette ga et utbytte på 4,8 g.

3. Funksjonalisering og streptavidinisering av partikkeloverflatene.

a) Fremstilling av aldehydpartikler.

En 1 ml aliquot av røde 3,1 um høydensitetspartikler (17,1 %) (vekt/volum) (fremstilt

som beskrevet i eksemplene 2a-c) ble satt til et 15 ml sentrifuge-rør og vasket 3 ganger ved sentrifugering ved ultrarent (18 MegOhm) vann ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter. Til de således vaskede partikler ble det satt 15 ml av en oppløsning av kalve-serum-albumin (2,67 mg/ml) (Sigma A9647) i 10 mM PBS, pH 7,4, 0,05 % NaN3, og det hele ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur. Partiklene ble vasket 4 ganger ved sentrifugering med 15 ml vann ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter. Derefter ble partiklene resuspendert i 10 ml vann for å oppnå en konsentrasjon på 1,7 % vekt/volum. Til en 0,5 ml aliquot av denne suspensjon ble det satt 3,75 ml vann for å oppnå en 0,2 % vekt/volum-suspensjon. Til denne ble det satt 4,25 ml av en 2 % glutar-aldehydopp-løsning i vann og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur. Partiklene ble vasket 4 ganger ved sentrifugering med 15 ml vann ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter.

b) Fremstilling av streptavidinpartikler.

En suspensjon av 8 mg røde 3,1 um høydensitetspartikler (fremstilt som beskrevet i

eksemplene 2a-c og funksjonalisert som beskrevet i eksempel 3a) ble resuspendert i 4 ml vann og inkubert i 1 minutt i et ultralyd vannbad (Sonomatic fra Langford Ultrasonics, Birmingham, GB). Derefter ble det tilsatt 4 ml av en 50 mM natriumacetat-

buffer, pH 3,25, fulgt av 1 ml av en vandig streptavidinoppløsning (4 mg/ml). Efter ytterligere 2 minutter i ultralyd vannbad ble det umiddelbart tilsatt 1 ml av en 50 mM natriumcyan-borhydrid (Aldrich 15, 615-0)-oppløsning i acetatbuffer. Denne blanding ble inkubert over natten ved romtemperatur under lett rysting. Partiklene ble vasket 3 ganger ved sentrifugering med 15 ml vann ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter og resuspendert i 5,33 ml 10 mM PBS, pH 7,4, slik at partikkelkonsentrasjonen ble innstilt til 0,15 % vekt/volum.

c) Fremstilling av polylysinpartikler.

Til en suspensjon av 500 mg røde 3,1 um høydensitetspartikler i 1 ml vann (fremstilt

som i 2 a-c og funksjonalisert som i 3a) ble det satt 4 ml 50 mM Na-acetat, pH 3,25. Derefter ble det tilsatt 4 ml av en 1 mg/ml poly-L-lysin (Sigma P 2636)-oppløsning i vann. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 4 minutter i ultralyd vannbad før 1 ml 50 mM natriumcyan-borhydrid i acetat buffer ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert over natten ved romtemperatur under lett rysting. Partiklene ble vasket 3 ganger ved sentrifugering med vann ved 1000 omdrVmin. og i 3 minutter og så resuspendert i 333 ml 10 mM PBS, pH 7,4, slik at partikkelkonsentrasjonen i suspensjonen ble innstilt til 0,15 % vekt/volum.

4. Kobling av ligandene til de funksjonaliserte partikler.

a) Høyaffin binding.

0,1 ml oppløsning av biotynylerte antigener ble satt til 1 ml av en 0,15 % vekt/volum-suspensjon av røde 3,1 um høydensitetspartikler (fremstilt som i 2a-c, funksjonalisert og streptavidinisert som i eksempel 3a og 3b) i et Eppendorf-mikrorør og så inkubert i 30 minutter under rysting. Dcke-bundet antigen ble vasket bort ved 2 ganger sentrifugering ved 1000 omdr./min. i 5 minutter og resuspensjon i 1 ml av den ovenfor nevnte buffer, slik at sluttkonsentrasjonen av partikkelsuspensjonen igjen utgjorde 0,15 % vekt/volum.

b) Dcke-kovalent kobling.

Til 500 ul av en 0,15 % suspensjon av røde 3,1 um høydensitets polylysin-partikler

(fremstilt som i 2a-c og 3a og 3c) ble det satt til 10 ul av en 20 ug/ml ds DNA (Sigma D 1501)-oppløsning i 10 mM PBS, pH 7,4. Efter et Vortex-trinn (Bender & Hobein, Vortex Genie 2) i 5 sekunder på trinn 8 ble det hele inkubert i 12 timer ved romtemperatur under lett rysting. Suspensjonen ble vasket 2 ganger ved sentrifugering med 1 ml 10 mM PBS, pH 7,4 ved 1000 omdrVmin. og i 5 minutter og på ny resuspendert i 500 ul lOmMPBS.pH 7,4.

5. Buffersammensetnine for gelmatriksen.

Gelmatriksen i mikroreaksjonsbeholderne befant seg i følgende vandige buffermedium: 5 mM KH2PO4 (Merck 4873)/Na2HP04 (Merck 6580), 150 mM NaCl (Fluka 71381), 0,024 % vekt/volum NaN3 (Fluka 71290), 1,875 % volum/volum Albumin (Miles 81-177), 0,05 % (vekt/volum) EDTA (Fluka 03685), 1,3 mM Tris (Merck 8382), 1,25 mM N-acetyl-L-cystein (Merck 12422), 0,025 % (vekt/volum) Mucin (Sigma M 1778). I tillegg inneholdt gelmatriksen eventuelt testavhengig forskjellige mengder anti-human-globulin.

6. Chagas- antistoff- test ( høyaffin binding av syntetiske peptider).

a) Antigener:

Syntetiske peptider Ag-2, TcD og TcE stammer fra Alta Bio-science (Birmingham,

UK).

b) Kobling:

I hvert tilfelle 1 ml av en 0,15 % vekt/volum-suspensjon av røde 3,1 um høydensitets-partikler (fremstilt som i 2a-c), funksjonalisert og streptavidinsisert som i eksempel 3a og 3b), ble koblet med 2 ng TcD, 35 ng Ag-2 og 282 ng TcE som i henhold til standard-teknikker ble syntetisert til antigen-sekvens med et biotinylert lysin og via RP-HPLC eventuelt ble renset i henhold til standardmetoder til > 90 % renhet. For dette formål ble det fra peptidene tilberedt en 10 x stamoppløsning i H2O (20 ng TcD, 350 ng Ag-2, 2820 ng TcE pr. ml). For koblingen ble det så i hvert tilfelle tilsatt 1 volum peptid-oppløsning til 10 volumer av en 0,15 % vekt/volum-suspensjon av syntetiske partikler og det hele blandet hurtig. Reaksjonsblandingen ble så inkubert 30 minutter ved romtemperatur under en lett rysting. Derefter ble partikkelsuspensjonen sentrifugert i 5 minutter ved 1000 omdr./min., supernatanten dekantert og vasket 2 ganger med 10 mM PBS, pH 7,4. Sluttkonsentrasjonen for partiklene utgjorde i suspensjonen igjen 0,15 % vekt/volum. De således sensitiviserte partikler ble lagret ved 4°C.

c) Testgjermomføring:

En 0,15 % vekt/volum-suspensjon av syntetiske partikler, sensitivisert som beskrevet i

eksempel 4a, ble behandlet i 5 minutter i ultralyd-vannbad. Derefter ble i hvert tilfelle 25 ul satt til 6 mikronar i et kort der mikrorørene på forhånd var fylt med en antihuman globulinholdig (0,5 % volum/volum) gelsuspensjon (se eksempel 5: ID-kortm DiaMed, Cressier sur Morat). Derefter ble 0,1 ul pasientserum eller -plasma tilsatt. Efter 10

minutters inkubering ved romtemperatur ble det hele sentrifugert i 10 minutter ved 85 g i en spesielt for mikrorørene utviklet sentrifuge (ID-sentrifuge 12 S n, DiaMed, Cressier sur Morat). Resultatene kunne umiddelbart avleses efter sentrifugeringen.

d) Bedømmelse:

Positive resultater kan detekteres som tydelige bånd på gelen eller 1 til 2 mm inne i gelen. Også agglutinater som er fordelt over hele gelen antyder positive reaksjoner. Resultatene er erkjennbare i et tydelig sediment av de på bunnen av beholderen sedimenterte, syntetiske partikler, et bånd i eller på gelen finnes det i dette tilfellet ikke. 7. Visceral Leishmaniasis antistoff- test ( høyaffin binding av rekombinant anti- gen).

a) Antigener:

Rekominant antigen rK39 fra Corixa Inc., Seattle, USA.

b) Biotinylering og kobling:

1 ml rekombinant antigen rK39 (0,6 mg/ml) i 10 mM Tris, pH 8,0, ble dialysert mot 10

mM BPS, pH 7,4 (Sigma P 4417) ved 4°C og så filtrert gjennom et Puradisc 25 AS Membranfilter (Whatman). Biotinyleringen skjedde med sulfo-NHS-biotin (Pierce 21217). En 500 ul Aliquot av rK39 i 10 mM PBS, pH 7,4 (300 ug) ble tilsatt 17,5 ul av en vandig 1 mg/ml oppløsning sulfo-NHS-biotin. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 150 minutter ved romtemperatur. Den biotinylerte rK39 ble så separert med en KwikSep-avsaltingssøyle (Pierce) fra det frie biotin. Elueringen skjedde med 10 mM PBS,pH 7,4, 0,05%NaN3.

Hver gang 1 ml av en 0,15 % vekt/volum-suspensjon av røde 3,1 um høydensitets-partikler (fremstilt som i 2a-c, funksjonalisert og streptavidiniserte som i eksempel 3a, 3b) ble koblet med 160 ng biotinylert rK39. For dette formål ble det fremstilt en 10 x stamoppløsning i H20 (1600 ng rK39 pr. ml). Den egentlige kobling skjedde så som beskrevet i eksempel 6b.

c) Testgjennomføring:

Testgjennomføringen er som i eksempel 6 kun at det i foreliggende tilfelle ble arbeidet

med en suspensjon av syntetiske partikler som var sensitivert med rK39.

d) Bedømmelse:

Som i eksempel 6.

8. Hepatitt- B- overlfate- antigen- test ( høyaffin binding av monoklonale antistoffer).

a) Antistoffer:

De mot hepatitt-B-overflate-antigen rettede monoklonale antistoffer (MA b) MIH9701

detekterer begge subtyper ad og ay og stammet fra Medix Biotech, Walchwil, Sveits.

b) Biotinylering og kobling:

200 ul av en 3 mg/ml oppløsning MIH9701 ble fortynnet med 0,1 M natriumacetat-buffer pH 5,5 til 1 ml og dialysert mot den samme buffer over natten ved 4°C. Til en 900 ul Aliquot av den resulterende MA b-oppløsning ble det tilsatt 900 ul av en iskald 20 mM natrium-metaperiodat-oppløsning i vann og reaksjonsoppløsningen ble inkubert i 20 minutter ved 0°C i mørke. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 11 (il av en 10 % vekt/volum glyceroloppløsning. MA b ble separert fra de øvrige reaksjonskompo-nenter i et kromatografi-skritt via en Kwiksep avsaltingssøyle. Derved ble det eluert med 0,1 M acetatbuffer pH 5,5. Volumet av MA b efter eluering var 2,7 ml. Hertil ble det satt 270 ul av en 50 mM oppløsning av EZ-link Biotin-LC-hydrazid (Pierce 21340) i dimetylsulfoksyd (Sigma D 8418) og det hele inkubert under lett rysting i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble nå dialysert ved 4°C mot 10 mM PBS, pH 7,4, 0,05 NaN3 og derefter filtrert på et 0,2 um Puradisc AS Filter (Whatman). Med en Kwiksep-avsaltingssøyle gjennomførte man nok en gang et avsluttende avsaltingsskritt mot 10 mM PBS, pH 7,4, 0,05 % NaN3.

Det således biotinylerte MA b ble innstilt i den samme PBS-buffer til 35 ug/ml. Til 1 ml av en 0,15 % vekt/volum-suspensjon av rød 3,1 um høydensitetspartikler (fremstilt som i 2a-c, funksjonalisert og streptavidinisert som i 3a, 3b), ble det nu satt 100 ul av den fortynnede MA b-oppløsning. Denne reaksjonsblanding ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur under lett rysting. Partiklene ble så vasket 3 ganger ved sentrifugering ved 1000 omdr./min. i 5 minutter med den samme buffer.

c) Testgjennomføring:

Testgjennomføringen var som i eksempel 6 med følgende forskjeller:

i) man arbeidet med en suspensjon av syntetiske partikler som var sensitivert med

MAbMIH9701.

ii) gel-matriksen inneholdt ikke anti-human-globuliner.

d) Bedømmelse:

Som i eksempel 6.

9. Test på anti- dsDNA- antistoff fikke- kovalent binding av ds- DNA).

a) Antigen:

Dobbeltstrenger (ds)-DNA, Type I, stammet fra Sigma (D-1501).

b) Kobling:

Til 500 ul av en 0,15 % vekt/volum suspensjon av røde 3,1 um høydensitetspartikler

(fremstilt som i 2a-c og 3a, 3c) ble det satt 10 ni av en 20 mg/ml dsDNA (Sigma D 1501) i 10 mM PBS, pH 7,4. Efter et Vortex-skritt (Bender & Hobein, Vortex Genie 2) i 5 sekunder på trinn 8 ble det hele inkubert i 12 timer ved romtemperatur under lett rysting. Suspensjonen ble vasket 2 ganger ved sentrifugering med 1 ml 10 mM PBS, pH 7,4 og resuspendert i 500 (il 10 mM PBS, pH 7,4. Slutt-konsentrasjonen for partiklene utgjorde 0,15 % vekt/volum, de sensitiverte partikler ble oppbevart ved 4°C.

c) Testgjennomføring:

Som i eksempel 6.

d) Bedømmelse:

Som i eksempel 6.

10. HIVI/Hl V 2 antistoff- differensierinestest ( anvendelse av to forskjellige sensitiverte spesier av syntetiserte <p>artikler med forskjellige farver men ellers med de samme fysikalske egenskaper).

a) Antigener:

Syntetiske peptidsekvenser fra HIV-1 gp41 og HIV-2 gp36, fra Alta Bioscience

(Birmingham, UK).

b) Kobling som i eksempel 6 med 72 ng gp-41-peptid pg 40 mg gp36 peptid hver

med 1 ml av en 0,15 % vekt/volum partikkelsuspensjon. Man sensitiverte røde partikler

(fremstilt som i 2a-c, funksjonalisert og streptavidinisert som i eksempel 3a, 3b) med det HTV-2-spesifikke peptid (antigen-sekvens fra gp36) og blå partikler (fremstilt som i 2a-c, funksjonalisert og streptavidinisert som i eksempel 3a, 3b) med det HTV-1 -spesifikke peptid (antigen-sekvens fra gp41).

c) Testgjennomføring:

Som i eksempel 6 med de følgende forskjeller: Det ble i hvert tilfelle pipettert 10 ul av

suspensjonen av røde og suspensjonen av blå partikler i reaksjonskammeret i et mikro-rør. Derefter ble det tilsatt 2,5 ul pasientserum.

d) Bedømmelse:

HIV-l/HIV-2-positive resultater var detekterbare som tydelige rød/blå bånd på gelen

eller 1 til 2 ml inn i gelen. Det var i dette tilfellet intet sediment av partikler. HIV-1-antistoff-positive resultater viste et blått bånd på gelen eller i gelen mens de røde partikler dannet et sediment på bunnen av reaksjonsbeholderen. HIV-2-antistoff-positive resultater viste et omvendt bilde. HIV-l/HIV-2-negative resultater kunne erkjennes på det tydelige rødblå sediment på bunnen av mikroreaksjonsbeholderen.

11. Spesifikk detekterin<g> av ikke- IgM- antistoffer.

a) Antigener:

S. aureus protein A stammet fra Sigma (P 6650); geit-anti-human IgM-antistoff (u-kjede-spesifikk)-biotinkonjugat F (ab)2-fragment stammet fra Sigma (B 2641).

b) Biotinylering og kobling:

Biotinyleringen av protein A skjedde som i eksempel 8. De biotinylerte anti-IgM-antistoffer ble innstilt i 10 mM PBS pH 7,4 i en sats til 40 ug/ml 3,1 ug høydensitets-partikler (1,5 % vekt/volum), i en ytterligere sats til 1 ug/ml partikler (0,15 % vekt/- volum), det biotinylerte protein A til en konsentrasjon på 1 ug/ml partikler (0,15 % vekt/volum). Til hver 1 ml av en suspensjon av røde 3,1 um høydensitetspartikler (fremstilt som i 2a-c, funksjonalisert og streptavidinisert som i 3a, 3b) ble det derved satt 100 Hl i hvert tilfelle 10 ganger konsentrerte oppløsninger med biotinylerte anti-IgM-antistoffer (400 ng/ml henholdsvis 10 jig/ml) henholdsvis protein A (10 ug/ml).

Denne reaksjonsblanding ble så inkubert i 30 minutter ved romtemperatur under lett rysting. Partiklene ble derefter vasket 3 ganger ved sentrifugering ved 1000 omdr./min. og i 5 minutter med den samme buffer.

c) Testgjennomføring:

1 ml av de anti-IgM-sensitiverte partikler ble sentrifugert i 5 minutter ved 1000 omdr./-

min. og supematanten kastet. Det ble tilsatt 20 ul av en 1:10-fortynnelse av serum fra en frisk person. Efter 5 sekunders Vortex på trinn 8 ble reaksjonsblandingen inkubert i 30 minutter ved romtemperatur under lett rysting. For å adsorbere serumets IgM-antistoffer. Efter en fornyet sentrifugering i 5 minutter ved 1000 omdr./min. ble supematanten fjernet. I et anti-IgG-holdig kort (som beskrevet i eksempel 6) pipetterte man nu som følger:

Posisjon 1: 25 ul protein A partikkel (1 ug/ml)

Posisjon 2:25 ul protein A partikkel (1 ug/ml)

Posisjon 3: 25 ul anti-IgM partikkel (1 ng/ml)

Posisjon 4: 25 ul anti-IgM partikkel (1 ug/ml).

Til posisjon 1 og 3 ble det i hvert tilfelle satt 5 ul av det l:10-fortynnede serum før adsorbsjon, i posisjon 2 og 4 hver gang 5 ni av det 1:10-fortynnede serum efter adsorbsjon. Efter 10 minutters inkubering ved romtemperatur sentrifugerte man i 10 minutter ved 85 g i en spesielt for mikrorør utviklet sentrifuge (ID-Centrifuge 12 S n, DiaMed, Cressier sur Morat).

d) Bedømmelse:

Begge kontrollrørene 1 og 3 viste tydelig positive reaksjoner som beskrevet i eksempel 6. Fra test-satsene 2 og 4 viste 2 en positiv reaksjon som ikke skilte seg fra den i rør 1 mens partiklene i posisjon 4 dannet et sediment på bunnen av reaksjonsbeholderen og dermed antydet en negativ reaksjon. Dette betyr at denne test spesifikt kan påvise en ikke-IgM-antistoff-reaksjon.

12. Modifisert sentrifugering for syntetiske partikler:

a) Antigener og kobling:

Opphav og kobling av de syntetiske peptider som i eksempel 6.

b) Testgjennomføring:

Konvensjonell:

Som beskrevet i eksempel 6 ble 25 ul av de sensitiverte syntetiske partikler og derefter 5 ul serum/plasma pipettert inn i inkubasjonskammeret i på forhånd ferdiggjorte mikrorrør. Efter 10 minutters inkubering ved romtemperatur ble det sentrifugert i 10 minutter ved 85 g i en for mikro regnet sentrifuge (ID-Centrifuge 12 SII, DiaMed, Cressier sur Morat).

Modifisert:

Som beskrevet i eksempel 6 ble 25 ul av de syntetiske partikler og derefter 5 ni serum/- plasma pipettert inn i inkubasjonskammeret av på forhånd ferdiggjorte mikrorrør. Efter 5 minutters inkubering ved romtemperatur ble kortene bragt inn i en modifisert ID-sentrifuge (DiaMed, Cressier sur Morat) som ble kjørt med følgende spesialprogram:

1) 5 sekunder sentrifugering, 30 g

2) 5 minutter pause, 0 g

3) 10 minutter sentrifugering, 85 g.

c) Bedømmelse:

Bedømmelsen skjedde som i eksempel 6.1 prøver som arbeidet med anti-IgG-holdige

gel-matriser kan man observere en generell forsterkning av fremfor alt svake, positive resultater.

Claims (27)

1. Fremgangsmåte for påvisning av en analytt i en prøvevæske under agglutinering hvorved prøve-væsker bringes i kontakt med en agglutineringsreagens og en inert matriks, reaksjonsblandingen utsettes for gravitasjon og reaksjonen mellom analytt og agglutineringsreagensen bestemmes, karakterisert v e d at man som agglutineirngsreagens anvender syntetiske partikler som overfor matriksen i det vesentlige oppfører seg som erytrocytter og som oppviser en midlere diameter < 5 um og en spesifikk densitet > 1,1 g/cm3.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de syntetiske partikler oppviser en midlere diameter i området 1-5 um.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at de syntetiske partikler oppviser en midlere diameter i området 2-4 um.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de syntetiske partikler oppviser en spesifikk densitet i området 1,1-1,8 g/cm<3>.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at de syntetiske partikler oppviser en spesifikk densitet i området 1,15-1,4 g/cm<3>.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at man anvender syntetiske partikler av organiske polymerer eller kopolymerer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man anvender syntetiske partikler av styren eller styrenderivater.

8. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-7, karakterisert v e d at man anvender farvede partikler.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at man anvender rødfarvede partikler.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, karakterisert ved at det på overflaten av partiklene er immobilisert ligand-molekyler som er bindedyktige med analyttene som skal bestemmes.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at ligandmolekylene er immobilisert via adsorbtive, kovalente eller høyaffine vekselvirkninger.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at det på overflaten av partiklene er immobilisert peptider, proteiner, nukleinsyrer, nukleinsyreanaloger, sakkarider, lipider, hormoner eller metabolitter via kovalente eller høyaffine vekselvirkninger.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert v e d at det på overflaten av partiklene er bundet cellemembraner, fragmenter av cellemembraner eller lysater av celler eller patogener ved adsorbtive vekselvirkninger.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert ved at bestemmelsen av analytten skjer ved en immunreaksjon.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at analytten er et antistoff.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at det gjennomføres en klassespesifikk påvisning av antistoffer.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at analytten er et antigen.

18. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-13, karakterisert ved at bestemmelsen av analytten skjer ved en nukleinsyre-hybridiseringsreaksjon.

19. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-18, karakterisert ved at man anvender en partikkelforrnig matriks.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at den midlere diameter for matrikspartiklene ligger i området 10 til 200 um.

21. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-20, karakterisert ved at det bestemmes flere analytter samtidig hvorved det for hver analytt anvendes en forskjellig farvet agglutineringsreagens.

22. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-21, karakterisert ved at reaksjonsblandingen inneholder detergenser og/eller muciner.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-22, karakterisert ved at reaksjonsblandingen inneholder et reduksj onsmiddel.

24. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-23, karakterisert ved at innvirkningen av gravitasjonen på reaksjonsblandingen omfatter en sentrifugering.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at sentrifugeringen gjennomføres i flere intervaller.

26. Reagens-kit for påvisning av en analytt i en prøve-væske, karakterisert ved at den omfatter: (a) minst en reaksjonsbeholder som inneholder en inert matriks, og (b) minst en type syntetiske partikler med en midlere diameter < 5 um og en spesifikk densitet > 1,1 g/cm<3>, på hvis overflate det er immobilisert ligandmolekyler.

27. Reagens-kit ifølge krav 26, karakterisert ved at det er anordnet flere reaksjonsbeholdere på et kart eller en skive.