JP4005093B2

JP4005093B2 - Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬および抗ｈｃｖ抗体検出方法

Info

Publication number: JP4005093B2
Application number: JP2005152692A
Authority: JP
Inventors: 洋一高浜; 順一白石
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2005-05-25
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2016-05-07
Also published as: JP2005257700A

Description

発明の属する技術分野

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を検出するためのＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬、および検体試料中の抗ＨＣＶ抗体を検出する抗ＨＣＶ抗体検出方法に関する。

従来の技術

Ｃ型肝炎は１９８８年、米国のカイロン社の研究グループによってＨＣＶ遺伝子がウイルスに先立って発見された。このＨＣＶに対する抗体を検出するために各種組換え抗原や合成ペプチドが検討され、ＨＣＶ関連抗体を検出するキットが開発されている。また、検出方法としては、寒天ゲル拡散法、対向免疫電気泳動法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、受身赤血球凝集法、ラテックス凝集法などがある。

ＨＣＶ関連抗体を検出するために用いられるＨＣＶ抗原タンパクとしては、構造領域タンパクとしてコアおよびエンベロープタンパク、非構造領域タンパクとしてＮＳ１〜ＮＳ５タンパクが知られている。１つのＨＣＶ抗原タンパクのみでは検出感度が十分高くなく、特異性にも問題があるので、構造領域と非構造領域のタンパクを適宜組み合わせて用いられている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10011-10015, 1992）。また、さらに検出感度を高めるための試みもなされている。例えば、粒子凝集法では、感作するＨＣＶ抗原の数をさらに増やしたり、ＨＣＶ抗原活性ポリペプチドを加熱処理したり（特開平６−１００２２７３号）、あるいはＨＣＶ抗原タンパクとキャリアータンパクとの融合タンパクを親水性粒子に感作して用いる（特開平７−１９８７２３号）などが行われている。

また、抗原として合成ペプチドを用いる試みもなされているが、合成ペプチドを用いた場合には一般に検出感度が低くなると言われている。
〔発明が解決しようとする課題〕

したがって、より高感度で迅速にＣ型肝炎ウイルス感染症を検出することができるＨＣＶ感染症の診断薬および検出方法が求められている。
［課題を解決するための手段］

本発明は、合成ペプチドＨＣＶ抗原と遺伝子組換えＨＣＶ抗原を固相に感作したＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬であって、前記合成ペプチドＨＣＶ抗原が、キャリアータンパク質との化学結合により調製された複合抗原として固相に感作されていることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬および前記診断薬を用いる抗ＨＣＶ抗体の検出方法を提供する。

キャリアータンパク質としては、水溶性タンパクであれば特に制限はないが、好ましくは分子量１０，０００〜１，０００，０００、より好ましくは３０，０００〜１５０，０００であり、具体的にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、ヘモシアニンなどが好適に用いられる。この他にも、水溶性合成高分子、例えばポリビニルアルコール、デキストランなども使用できる。

固相としては、担体粒子、ミクロタイタープレート、試験管などを使用できる。担体粒子を用いることが好ましい。担体粒子としては、通常粒子凝集法の診断薬で用いられる公知の粒子を用いることができる。例えば、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などを用いることができる。より好ましくはポリスチレンラテックスが用いられる。

本発明の診断薬で使用するＨＣＶ抗原タンパク質は、公知のＨＣＶの構造領域タンパク質や非構造タンパク質である。構造領域タンパク質としては、コアタンパク、非構造領域タンパク質としてはＮＳ３タンパク、ＮＳ４タンパク、およびＮＳ５タンパクを使用できる。なお、これらの抗原タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列については文献（特表平５−５０８２１９号）に記載されている。抗原タンパク質の由来についてはＨＣＶ抗原活性を有するものであれば特に制限されず、天然から単離したもの、化学合成によるもの、および遺伝子組換え法により製造したものを使用できる。抗原タンパク質としてはこれらの領域のタンパク質のうちの種々の長さのペプチドを用いることができ、好ましくは、少なくとも１つのエピトープを含む８個以上のアミノ酸からなるペプチドを用いる。より好ましくは、分子量１，０００〜５，０００の合成ペプチドを用いる。ペプチドは当業界で公知の方法、例えば固相合成法、フラグメント縮合法、または古典的溶液合成法を用いて合成することができる。好ましくは文献（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963）に記載の固相ペプチド合成法により製造できる。なお、本発明では、コア、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５のそれぞれの抗原タンパク質として、少なくとも１つ以上の異なるエピトープを含む１種類以上の抗原を組み合わせて、これらを直接あるいはキャリアータンパク質との複合抗原として担体粒子に感作することができる。後述する実施例ではコア抗原として特表平５−５０８２１９号記載のコア領域のうちのアミノ酸４９〜６８を含むペプチドを使用し、ＮＳ４ペプチドとして特表平５−５０８２１９号記載のＮＳ４領域のうちのアミノ酸１７０６〜１７２５、１７１８〜１７３７および１７２４〜１７４３を含むペプチドを使用し、またＮＳ５ペプチドとして特表平５−５０８２１９号記載のＮＳ５領域のうちのアミノ酸２２８７〜２３０６、２２９９〜２３１８および２３１１〜２３３０を含むペプチドを使用し、またＮＳ３抗原としては特表平５−５０８２１９号記載のＮＳ３領域のうちのアミノ酸１１９２〜１４５７のペプチドを使用したが、これに限定されない。

上記抗原タンパク質のそれぞれをキャリアータンパク質と化学結合により結合して複合抗原を調製する。抗原タンパク質は直接担体粒子に感作させるよりも複合抗原として感作させた方が検出感度のよいことが見いだされた。ただし、本発明で使用したＮＳ３抗原のように分子量が１０，０００以上のものについては顕著な差は観察されず、したがってそのような抗原タンパク質を直接担体粒子に感作し、他の抗原タンパク質を複合抗原として感作させてもよい。キャリアータンパク質と抗原タンパク質との結合には公知の方法を用いることができ、例えば、カルボジイミド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、グルタルアルデヒド法などを用いることができる。グルタルアルデヒドによる架橋により行うことによって反応性が増大するのでグルタルアルデヒド法を用いることが好ましい。また、キャリアータンパク質と抗原タンパク質は、分子数の比で、約１：３〜１：２０、好ましくは約１：４〜１：９、より好ましくは約１：６〜１：８の割合で混合して複合抗原を調製する。このようにして調製した複合抗原を公知の方法により担体粒子と結合（感作）する。例えば、物理的吸着、化学的吸着によって行うことができる。上述したように、ＮＳ３抗原はキャリアータンパク質と複合抗原を形成することなく直接担体粒子に感作することもできるが、これも同様の方法を用いることができる。感作は緩衝作用のある緩衝液中で行い、例えばリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液を用い、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜５で行う。

また、固相として担体粒子を用いた上記Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の場合、このＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬を検体試料に添加し、担体粒子の凝集度をフローサイトメーターで測定することによってＣ型肝炎ウイルス感染症を検出することができる。このＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬は、検体試料中に抗ＨＣＶ抗体が存在する場合にはこれに反応して凝集を生じる。生じた凝集は目視、あるいは濁度、吸光度などでも測定は可能であるが、フローサイトメータの原理を応用した全自動免疫凝集測定装置（例えば東亜医用電子社製のＰＡＭＩＡ−３０^TM）を用いて凝集粒子の大きさを光学的に測定することにより迅速かつ高感度、高精度に測定することができる。すなわち、試料をシースフロー機構によりフローセル中に導き、１列に並べて通過させる。ここにレーザー光を照射して生じる散乱光の強度を測定することによっても凝集の程度を知ることができる。凝集粒子数（Ｐ：Ｐｏｌｙｍｅｒ）と未凝集粒子数（Ｍ：Ｍｏｎｏｍｅｒ）を計数する。このＰとＭからＰ／Ｔ（Ｔ＝Ｐ＋Ｍ）を演算し、あらかじめ得られたカットオフ値からＨＣＶ抗体の有無を定性判定するものである。この方法を用いることによって、ＨＣＶ抗体をより高感度に検出することができる。また、粒径を適当なものとすれば、電気抵抗法を用いた血液分析装置や粒度分析測定装置により測定することも可能である。ただし検出器の目詰まりなどの問題を考慮すると、光学的な方法で測定する方が好ましい。
〔発明の効果〕

本発明のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬によれば、Ｃ型肝炎ウイルスへの感染を感度よく、かつ市販の診断薬よりも早期に診断することが可能である。すなわち、ＨＣＶ抗体が陽性化していく過程で同一人から経時的に採血した数検体から構成されるパネル血清（例えば、ＨＣＶセロコンバージョンパネル、輸入販売元：協和メディックス、製造元：ＢＯＳＴＯＮＢＩＯＭＥＤＩＣＡ，ＩＮＣ）を用いて試験したところ、特定のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬は、従来のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬（赤血球を用いる受動血球凝集法（ＰＨＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、および酵素免疫ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））に比べてより早期に、すなわち感染初期にＨＣＶへの感染を検出できることが明らかとなった。

また、本発明の検出方法に用いる診断薬と、同じ抗原を用いるがキャリアータンパク質と複合抗原を調製することなく直接固相に感作することによって製造した診断薬とを比較したところ、本発明の診断薬の方が、検出感度が優れていることが判明した。

さらに、本発明の診断薬は、長期保存をした後にも検出感度が落ちず、安定な診断薬であるといえる。
本発明の診断薬として、固相として担体粒子を用いた診断薬を用いた場合には、ＥＬＩＳＡなどの従来法と比較して、繁雑な洗浄工程を伴わず、ＨＣＶ感染症診断薬（好ましくは担体粒子がラテックス粒子）を、検体試料（好ましくは被験者血液）と混合するだけの操作によって実施することが可能である。また、本発明の上記ＨＣＶ感染症診断薬を用いると、上記混合操作および測定操作のいずれをも全自動で行う測定機による測定が可能であり、多数の検体を測定するのに好適である。
［実施例］

以下の実施例において本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
実施例１：ＨＣＶ複合抗原の調製
ＨＣＶ抗原として、ＮＳ３抗原は、特表平５−５０８２１９号の実施例１の記載に基づいて遺伝子組換え法により製造し使用した。用いたＮＳ３ペプチドはＨＣＶタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７である。

コア抗原、ＮＳ４抗原、ＮＳ５抗原については、特表平５−５０８２１９号に記載されたアミノ酸配列のうち、それぞれ４９〜６８、１７０６〜１７２５、２２８７〜２３０６を含むペプチドを、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ社のペプチドシンセサイザＭｏｄｅｌ４３１Ａを用いて合成し使用した。

ＢＳＡ（市販品、分子量６６，０００）を１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．０中に、１％（ｗ／ｖ）の濃度で調製したもの１容量に、コア抗原（アミノ酸４９〜６８のペプチド）を１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．０中に０．１％（ｗ／ｖ）の濃度に調製したもの７容量を添加し、最終的に１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．０を加えて９容量となるよう調製する。その後、１％グルタルアルデヒド水溶液を添加し反応を開始する。反応温度は３０℃で行い、３０分後に２０％グリシン水溶液１容量を添加して反応を停止する。

ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５抗原についても同様の操作を行い、１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ６〜８の緩衝液を用い、１容量の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液に対し、１〜８容量の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＣＶ抗原溶液を反応させてＨＣＶ複合抗原を調製した。
実施例２：ＨＣＶ抗原感作ラテックスの製造
粒径０．７８μｍのポリスチレンラテックス粒子（積水化学工業株式会社製）を１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ４．０中に５％（ｗ／ｖ）の濃度に調製し、この中に実施例１で調製したコア抗原、ＮＳ３複合抗原、ＮＳ４複合抗原、ＮＳ５複合抗原をラテックス分散液１ｍｌ当たり５０μｇ添加し、４℃で２４時間反応させた。その後遠心（１２０００ｒｐｍ、１０分）を行い、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む０．１ＭＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．０を最初と同量添加し粒子を分散させた。再度遠心処理を行い、同じ緩衝液中に分散させてＨＣＶ抗原感作ラテックスとした。
実施例３：凝集反応
検体試料（被験者血液）１０μｌに実施例２で調製したＨＣＶ抗原感作ラテックス（５％）１０μｌを添加し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液８０μｌを加え、４５℃で１５分間反応させた後、ラテックス粒子の凝集度を測定した。この反応および測定は全自動免疫測定装置ＰＡＭＩＡ−３０（東亜医用電子株式会社製）を用い、前方散乱光を測定した。

凝集度はトータルの粒子数に対する凝集した粒子数のパーセント（Ｐ／Ｔ％）で示される。
測定結果を以下の表１に示す。表１から明らかなように、ＨＣＶ抗体陽性検体において十分な凝集度が得られている。また、ＨＣＶ抗体陰性検体ではラテックスは凝集せず、ＨＣＶ抗体を含む検体試料では凝集が認められることから、ＨＣＶ抗原で感作したラテックス粒子がＨＣＶ抗体と反応することによって凝集が生じたことがわかる。

実施例４：早期検出感度
ＨＣＶ抗体が陽性化していく過程で同一人から経時的に採血した数検体から構成される、市販のＨＣＶセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０１、ＰＨＶ９０２およびＰＨＶ９０３（輸入販売元：協和メディックス、製造元：ＢＯＳＴＯＮＢＩＯＭＥＤＩＣＡ，ＩＮＣ）を用いて、ＨＣＶ抗体陽転の早期検出感度を試験した。実施例２で調製した診断薬を用いる本発明のカウンティングイムノアッセイ（ＣＩＡ）を、以下の方法を用いる他社製品と比較した：
Ａ社：赤血球を用いる受動血球凝集法（ＰＨＡ）
使用ＨＣＶ抗原：コア、ＮＳ３、ＮＳ４
Ｂ社：酵素免疫検定法（ＥＩＡ）
使用ＨＣＶ抗原：コア、ＮＳ３、ＮＳ４
Ｃ社：酵素免疫ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）
使用ＨＣＶ抗原：コア、ＮＳ３、ＮＳ４
得られた結果を以下の表２、表３および表４に示す（なお、表中のＢ社およびＣ社のデータはパネルに添付のデータを記載した）。本発明の診断薬ならびに診断法を用いると、パネルＰＨＶ９０２およびＰＨＶ９０３（これらのパネルの被験者は採血第１日目からＰＣＲによる抗体検査は陽性である）において、他社のいずれの診断薬よりも早期にＨＣＶ感染を検出できた。

実施例５：ＨＣＶ抗原を直接感作した診断薬との比較
本発明の診断薬と、同じＨＣＶ抗原を直接感作して調製した診断薬とを用いて、ＨＣＶ抗体の検出感度試験を行った。

ＮＳ３抗原（遺伝子組換え法により得たもの）、コア抗原（合成法により得たペプチド）、ＮＳ４抗原（合成法により得たペプチド）、およびＮＳ５抗原（合成法により得たペプチド）はそれぞれＢＳＡとの複合抗原とした後に、実施例２の方法により感作して、ＨＣＶ複合抗原感作ラテックスとした。

対照として、同じ抗原、同じ感作条件を用いてすべて直接感作によりＨＣＶ抗原直接感作ラテックスを調製した。
これらのラテックスを用いて、実施例３の方法により、ＨＣＶ抗体陽性の検体試料（Ａ〜Ｅ）およびＨＣＶ抗体陰性の検体（Ｆ〜Ｊ）の凝集度（Ｐ／Ｔ％）を測定した。カットオフ値（複合抗原感作ラテックスで１．９５％；抗原直接感作ラテックスで１．０１％）を考慮して各検体のＨＣＶ抗体陽性または陰性を判定した。得られた結果を以下の表５に示す。

ＨＣＶ抗体陽性検体である検体試料ＡおよびＥにおいて、抗原を直接感作した診断薬ではＨＣＶ抗体を検出できなかったが、本発明による複合抗原を感作した診断薬では検出可能であった。
実施例６：長期保存安定性試験
実施例５のＨＣＶ抗原感作ラテックス５％（ｗ／ｖ）、０．１ＭＰＢＳ、ｐＨ７．０懸濁液を冷蔵保存し、試薬の保存安定性を試験した。得られた結果を以下の表６に示す。

以上の結果から明らかなように、複合抗原感作ラテックスは１３カ月の長期保存後でも凝集度が安定していた。一方、直接感作ラテックスでは、ＨＣＶ抗体陰性プール血清を用いた試験では凝集度が長期保存とともに徐々に上昇し、ＨＣＶ抗体陽性プール血清を用いた試験では凝集度が徐々に低下し、またカットオフ値が徐々に上昇することが観察された。
実施例７：ＨＣＶ抗原感作ラテックスの製造（２）
ＨＣＶ抗原として、実施例１と同じものを用い、ＮＳ３抗原を複合抗原とせずに直接感作した以外は、実施例２と同様に操作を行い、ＨＣＶ抗原感作ラテックスと調製した。
実施例８：ＨＣＶ抗原感作ラテックスの製造（３）
ＮＳ３抗原は、実施例１と同じものを用い、コア抗原として、前記公報（特表平５−５０８２１９号）記載のアミノ酸４９〜６８のペプチド、ＮＳ４抗原として、同じくアミノ酸１７０６〜１７２５、１７１８〜１７３７のペプチド、ＮＳ５抗原として、同じくアミノ酸２２８７〜２３０６、２２９９〜２３１８のペプチドを用い、実施例１と同様に１容量の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液に対し、１〜８容量の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＣＶ抗原溶液を反応させてＨＣＶ複合抗原を調製し、実施例２と同様にＨＣＶ抗原感作ラテックスを調製した。
実施例９：ＨＣＶ抗原感作ラテックスの製造（４）
ＮＳ３抗原は、実施例１と同じものを用い、コア抗原として、前記公報記載のアミノ酸４９〜６８のペプチド、ＮＳ４抗原として、同じくアミノ酸１７０６〜１７２５、１７１８〜１７３７、１７２４〜１７４３のペプチド、ＮＳ５抗原として、同じくアミノ酸２２８７〜２３０６、２２９９〜２３１８、２３１１〜２３３０のペプチドを用い、実施例１と同様に１容量の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液に対し、１〜８容量の０．１％（ｗ／ｖ）ＨＣＶ抗原溶液を反応させてＨＣＶ複合抗原を調製し、実施例２と同様にＨＣＶ抗原感作ラテックスを調製した。

Claims

合成ペプチドＨＣＶ抗原と遺伝子組換えＨＣＶ抗原を固相に感作したＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬であって、前記合成ペプチドＨＣＶ抗原が、キャリアータンパク質との化学結合により調製された複合抗原として固相に感作されていることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記遺伝子組換えＨＣＶ抗原がＨＣＶの非構造領域タンパク質であり、前記合成ペプチドＨＣＶ抗原がＨＣＶの構造領域タンパク質である請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記合成ペプチドＨＣＶ抗原とは異なる第２の合成ペプチドＨＣＶ抗原とキャリアータンパク質との化学結合により調製された第２の複合抗原が固相に感作されており、第２の合成ペプチドＨＣＶ抗原がＨＣＶの非構造領域タンパク質である請求項１または２記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記合成ペプチドＨＣＶ抗原および前記第２合成ペプチドＨＣＶ抗原とは異なる第３の合成ペプチドＨＣＶ抗原とキャリアータンパク質との化学結合により調製された第３の複合抗原が固相に感作されており、第３の合成ペプチドＨＣＶ抗原がＨＣＶの非構造領域タンパク質である請求項３記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記合成ペプチドＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ４抗原またはＮＳ５抗原であり、前記遺伝子組換えＨＣＶ抗原がＮＳ３抗原である請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記合成ペプチドＨＣＶ抗原の分子量が１０００〜５０００である請求項１記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記遺伝子組換えＨＣＶ抗原が直接固相に感作されている請求項１〜６のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
前記遺伝子組換えＨＣＶ抗原がキャリアータンパク質との化学結合により調製された複合抗原として固相に感作されている請求項１〜６のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
キャリアータンパク質がＢＳＡ、卵白アルブミンまたはヘモシアニンから選択される請求項１〜８のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
固相が担体粒子である請求項１〜９のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬。
請求項１〜１０のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス感染症診断薬によって、検体試料中の抗ＨＣＶ抗体を検出することを特徴とする抗ＨＣＶ抗体の検出方法。