JP3804817B2 - 抗体測定試薬及びその製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原感作不溶性担体粒子からなる感染性病原体に対する抗体測定試薬及びその製造法に関する。さらに詳しくは、トレポネーマ・パリダムに対する抗体測定試薬及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療分野において、血液や尿など、様々な物質が含まれる検体中の特定の物質を検出するために、感度や特異性に優れる抗原及び抗体に基づく免疫学的反応を利用した測定法が開発され広く用いられている。
【０００３】
例えば、抗体又は抗原を不溶性担体粒子に担持（以下、感作と言う）させ、これを測定試薬とし、これと検体中の抗原又は抗体との免疫学的反応により生じる不溶性担体粒子の凝集の度合いを検出することにより検体中の抗原又は抗体を測定する粒子凝集法がある。このような粒子凝集法としては、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られている。
【０００４】
赤血球凝集反応法は、不溶性担体粒子として赤血球を用い、抗原又は抗体を感作した感作赤血球を試薬として用いることにより、大きな凝集塊を形成させる測定方法である。この測定方法は、特別な測定装置を必要とせずに、測定操作が簡便であるという特徴を有している。しかし、凝集像を目視で判定する主観的方法で、測定結果の再現性に乏しく、試薬に使用する赤血球自身が抗原性を有するため、目的の免疫学的反応以外の非特異反応を生じる等の問題もある。
【０００５】
そこで、上記の課題を解決しうる測定方法として、赤血球の代わりにカオリン、ベントナイト、コロジオン、炭素、ラテックス粒子等の人工的な不溶性担体粒子が使用されるようになっている。さらに、不溶性担体粒子の粒径、比重、表面官能基等の性質を自由にコントロールできることからポリスチレン等のラテックス粒子が広く用いられている。医療の診断分野において、赤血球の代わりにラテックス粒子を不溶性担体粒子として用いるラテックス凝集法及びそのための測定試薬が開発され、広く用いられている。
【０００６】
粒子凝集法は、免疫学的反応に伴い生じる凝集の検出手段の点から、さらに、凝集像を目視判定による方法、濁りの変化として光学的強度を測定する方法及び粒子を計数する測定方法が知られている。しかし、使用する測定試薬は、基本的には同じ抗原又は抗体感作不溶性担体粒子である。
【０００７】
また、測定装置を持たずに少数の検体を処理する施設や、緊急検査で迅速な測定結果を求められる場合には、目視判定による測定法を採用することもあるが、最近は、測定結果の客観性、再現性と共に多検体の迅速な測定処理が求められ、それに対応できる自動化された専用装置、生化学自動分析装置等が開発され普及する中で、光学的強度を測定する方法や粒子を計数する方法を採用する施設が増加してきている。
【０００８】
さらに、粒子凝集法に使用する抗原又は抗体を感作した不溶性担体粒子からなる測定試薬は、種々の物質を簡便、迅速に測定できることから、測定対象として様々な測定項目に対して数多くの測定試薬が開発されている。測定項目の中でも、梅毒、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ等の感染性病原体に対する抗体の測定は、輸血等の緊急検査項目として重要であるばかりでなく、スクリーニング項目としても検査頻度の高い測定対象となっている。また、上記の測定項目は、特に、測定の簡便性、迅速性及び測定の信頼性が強く求められ、さらに、試薬製造コストの低減化による安価な試薬の供給も強く求められる測定対象である。
【０００９】
この抗体を感作した不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬の製造法は、不溶性担体粒子に抗原又は抗体を感作させ、その後、試薬中の未感作の抗原や抗体を遠心分離による洗浄操作で除去する方法が行われている。しかし、遠心分離による洗浄操作を行っても、必ずしも未感作の抗原や抗体を完全に除去することはできない。この未感作の抗原や抗体が試薬中に残存した試薬を用いて測定すると、未感作の抗原や抗体が、抗原又は抗体を感作した不溶性担体粒子と検体中の反応の相手（抗体又は抗原）との反応を競合的に阻害し、その結果、著しい検出感度の低下を来たすという問題がある。現在、その問題を改善する試薬の製造法として、遠心分離による洗浄操作の回数を多く繰り返すことにより未感作の抗原や抗体を少なくする方法が行われている（Matsumoto,M,et al.,:Clin. Chem.39(8),1700,1993、特開平２−２３４０６３号、特開平３−２１８４６５号、特開平４−８６５５９号）。しかし、その方法でも、試薬の製造時における、遠心分離や遠心分離後のピペッティング操作等の物理的な衝撃により、感作された抗原又は抗体が変性され、検体中の反応の相手との免疫学的反応性が低下され、測定の検出感度が著しく低下される場合がある。さらに、洗浄操作の繰り返しにより、感作された不溶性担体粒子の回収が低下し、試薬の生産効率が低下するという問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１及び２記載の発明は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との免疫学的反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、検出感度及び再現性が優れる抗体測定試薬の製造法を提供するものである。
請求項３記載の発明は、請求項１及び２記載の発明に加えて、遠心分離を繰り返すことにより、未感作抗原を洗浄除去する煩雑な操作を行うことなく、抗原感作不溶性担体粒子試薬の調製を、簡単な操作で、短時間にでき、しかも、抗原感作不溶性担体粒子試薬の回収と生産性を改善できる抗体測定試薬の製造法を提供するものである。
請求項４、５及び６記載の発明は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、測定の検出感度及び再現性が優れる抗体測定試薬を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
（１）本発明は、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理を行うことを特徴とする抗体測定試薬の製造法に関する。
（２）本発明は、免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原がトレポネーマ・パリダムに由来する、上記（１）記載の抗体測定試薬の製造法に関する。
（３）本発明は、遠心分離による未感作抗原の洗浄除去操作を行うことなく、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理を行う、上記（１）又は（２）記載の抗体測定試薬の製造法に関する。
【００１２】
（４）本発明は、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬に関する。
（５）本発明は、免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原がトレポネーマ・パリダムに由来する、上記（４）記載の抗体測定試薬に関する。
（６）本発明は、遠心分離による未感作抗原の洗浄除去操作を行うことなく、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる上記（４）又は（５）記載の抗体測定試薬に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における抗体測定試薬としては、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる試薬である。
【００１４】
抗原感作不溶性担体粒子を分散させる媒体としては、一般に、生化学分野で使用される緩衝液を利用することができ、このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液中に、必要に応じ塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を加えてもよい。上記緩衝液のとしては、pH５．０〜１１．０が好ましく、より好ましくはpH６．０から１０．０、さらに好ましくはpH６．５〜９．０である。
【００１５】
本発明の加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬において、不溶性担体粒子に感作される抗原は、測定しようとする検体中の感染性病原体に対する抗体に対して免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原であり、測定対象の検体中の抗体が生産された原因となる感染性病原体に由来する抗原である。
【００１６】
感染性病原体はヒトやその他の動物感染し感染症を引き起こす。この感染症は、感染する経路によって、接触感染による感染症、飛沫感染による感染症等に分けられる。接触感染による感染症としては、例えば、性行為感染症、皮膚病、狂犬病、鼠咬病等が挙げられる。性行為感染症としては、例えば、梅毒、淋病、軟性下疳、鼠径リンパ肉芽腫症、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ等が挙げられる。これらの性行為感染症の病原体の具体例としては、梅毒の場合はトレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum：以下ＴＰと略す）菌が、淋病の場合はネイセリア・ゴノローエ（Neisseria gonorrhoeae）菌が、Ｂ型肝炎の場合は、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus：以下ＨＢＶと略す）が、Ｃ型肝炎の場合は、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus：以下ＨＣＶと略す）が、エイズの場合は、エイズウイルス（human immunodeficiency virus：以下ＨＩＶと略す）が、軟性下疳の場合はヘモフィラス・ダクレイ（Hemophilus ducrey）菌が、鼠径リンパ肉芽腫症の場合はクラミジア（Chlamydia）菌等が挙げられる。
【００１７】
なお、ＴＰ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶに対する抗体検査は、性行為感染症の診断としてのみならず、輸血検査の緊急検査としても重要な検査項目である。
本発明において、測定の対象としては、上記の種類の感染性病原体に対する抗体に制限されないが、多検体の処理能力に優れた不溶性担体粒子を用いる粒子凝集法の利点から、検査頻度の高い性行為感染症等のスクリーニング項目がより好ましい。例えば、血清中の梅毒抗体のスクリーニング検査としてのＴＰ、クラミジア感染性病原体由来の抗原を使用する項目であることが好ましい。また、簡便性、迅速性に優れた不溶性担体粒子を用いる粒子凝集法の利点から、輸血検査等において、迅速な測定結果が求められるＴＰ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ等の感染性病原体由来の抗原を使用する緊急検査項目であることがより好ましい。さらに、抗原感作不溶性担体粒子試薬の回収が良好であることからＴＰのように合成培地で培養できない貴重な感染性病原体由来の抗原を使用する項目であることがさらに好ましい。
【００１８】
以下、本発明の抗体測定試薬の製造法とともに抗体測定試薬について説明する。
本発明において、担体として用いる不溶性担体粒子としては、感染性病原体に由来する抗原を感作させることができるものであれば特に制限されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然高分子、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸の共重合体、スチレン−ブタジエンの共重合体のような有機合成高分子のラテックスやシリカ、アルミナのような無機酸化物及び金コロイドのような金属等が挙げられる。感染性病原体に由来する抗原を感作できる不溶性担体粒子であれば特に制限されないが、不溶性担体粒子の粒径、比重、表面官能基等の性質を自由にコントロールできることからポリスチレン等のラテックス粒子の使用が好ましい。
【００１９】
その不溶性担体粒子の平均粒径は、０．０１〜１０μｍの範囲が好ましく、０．０５〜５μｍの範囲がより好ましい。担体の粒径が小さすぎると、検出感度が低下する傾向となり、担体の粒径が大きすぎると、抗原（タンパク質）分子の結合可能な表面積（結合部位）が少なくなり、これに伴い測定可能な濃度範囲が狭くなる傾向となる。
【００２０】
また、これらの不溶性担体粒子を分散させる媒体として、又、不溶性担体粒子に抗原を感作させる際に用いる媒体としては、一般に、生化学分野で使用される緩衝液を利用することができ、このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液中に、必要に応じ塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を加えてもよい。上記緩衝液のとしては、pH５．０〜１１．０が好ましく、より好ましくはpH６．０〜１０．０であり、さらに好ましくはpH６．５〜９．０である。
【００２１】
本発明において、不溶性担体粒子に感作される抗原は、測定しようとする検体中の感染性病原体に対する抗体に対して免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原である。即ち、測定対象の検体中の抗体が生産された原因となる感染性病原体に由来する抗原である。
【００２２】
不溶性担体粒子の感作に使用できる感染性病原体に由来する抗原としては、菌体、菌体の外膜成分、菌体の産生する菌体外毒素等からの抽出成分であることが好ましい。抗原の抽出には、一般に、生化学分野で使用される緩衝液を利用することができ、抗原が失活しないような緩衝液が好ましい点から、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が好ましい。抗原の安定化や可溶化のために、これらの緩衝液に塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を加えてもよく、オクチルグルコシドやドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を加えてもよい。さらに、測定の非特異反応を抑え、特異性を高めるため、感染性病原体の特異的なタンパク質、糖タンパク、リポタンパク等まで精製することがより好ましい。感染性病原体の特異的なタンパク質、糖タンパク、リポタンパクは、硫安沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法などの通常の方法を単独又２つ以上組合わせて精製又は部分精製できる。また、カラムクロマトグラフィーは１種類のカラムを用いてもよく、２種類以上のカラムを組合わせてもよい。通常のカラムクロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等が用いられる。
【００２３】
なお、合成培地等で培養可能な感染性病原体の場合には、培養後抗原を抽出し、必要に応じて精製して用いることができる。また、ＴＰのように合成培地で培養できない感染性病原体は、あらかじめ、その病原体を動物に感染させ、その動物の体内でその病原体を増殖させた後、抗原を抽出し、必要に応じて精製して用いることもできる。
【００２４】
本発明において、抗原を不溶性担体粒子に感作する方法は、通常行われるように、物理的に吸着させてもよく、化学的に結合させてもよく、さらに、両方を併用してもよい。
感作する抗原の量は不溶性担体粒子の粒径や使用濃度により大きく異なるが、測定範囲を広くするためには、通常は感作できる最大量（不溶性担体粒子の表面の結合可能な部位を完全に覆う飽和量）で感作されるのが好ましい。しかし、測定範囲が問題にならない場合は、最大量より少ない量で感作できる。不溶性担体粒子に抗原を感作した後は、通常、不溶性担体粒子上の未感作部分をアルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチン等で被覆するが、飽和量で感作した場合には不必要なこともある。
【００２５】
感染性病原体に由来する抗原を物理的に不溶性担体粒子に感作させる方法としては、例えば、感染性病原体由来の抗原を含有する溶液（抗原液）を不溶性担体粒子と接触させることで感作できる。感作時には攪拌や振とうを行ってもよく、静置しておいてもよい。感作時の温度は４〜４０℃が好ましく、３０分間〜２４時間の反応で感作させることができる。
【００２６】
また、感染性病原体由来の抗原を化学的に不溶性担体粒子に結合させる方法としては、例えば、前記感染性病原体由来の抗原、表面にカルボキシル基を有する不溶性担体粒子及びカルボジイミドを混合して放置する方法又は前記感染性病原体由来の抗原、表面にアミノ基を有する不溶性担体粒子及びグルタルアルデヒドを混合して放置する方法等が挙げられる。
【００２７】
本発明の抗体測定試薬の製造において、上記のようにして、感染性病原体に由来する抗原を不溶性担体粒子に一定温度条件下で感作させた後、さらに、この感作の温度以上の温度条件で加温処理することにより、未感作の抗原を失活させることが必要である。
【００２８】
加温処理条件としては、不溶性担体粒子に感染性病原体に由来する抗原を感作させた温度以上の条件であり、不溶性担体粒子に感作された抗原が活性を維持し、しかも、未感作の抗原が失活する温度であればよく、低温で長時間又は高温で短時間行う。例えば、３７℃で９６時間〜６０℃で３時間の範囲で加温処理することが好ましく、３９℃で４８時間〜５５℃で５時間の範囲で加温処理することがより好ましく、さらに、４０℃で３６時間〜５０℃で６時間の範囲で加温処理することがさらに好ましい。３７℃未満では、未感作の抗原が失活するのに多大な時間を要し、６０℃を超えると不溶性担体に感作した抗原の活性低下が大きくなる傾向がある。
【００２９】
この加温処理により、不溶性担体粒子に感作された感染性病原体に由来する抗原は、抗体との結合活性を維持するが、不溶性担体粒子に感作されずに未感作の状態で遊離している抗原は、抗体との結合活性を低下される。例えば、ＴＰ菌体から抽出した抗原の場合、３７℃で９６時間の加温処理又は６０℃で３時間の加温処理により、不溶性担体粒子に感作された感染性病原体に由来する抗原は、特異抗体との結合活性を７０％以上維持しているが、未感作の状態で遊離している抗原は、特異抗体との結合活性が１０％以下まで低下している。未感作の遊離抗原が失活する加温処理を行った抗体測定試薬を使用することにより、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との目的の抗原抗体反応が、未感作の遊離抗原により、競合干渉を受けることなく、測定の検出感度と再現性を大幅に向上できる。特に、微量な抗体の検出において好適である。
【００３０】
さらに、加温処理により、未感作の遊離抗原を失活できるため、本発明の試薬の調製においては、未感作抗原を除去するために、従来の試薬製造で行う、抗原感作不溶性担体粒子を前記媒体の緩衝液（適宜、ＢＳＡ、塩化ナトリウム又は塩化カリウム等の添加剤を含有してもよい）を用い分散させ、さらに、遠心分離と再分散を２〜３回又はそれ以上繰り返す煩雑な洗浄除去操作を省略してもよい。本発明によれば、このような煩雑な操作を行なわなくてもよいので、抗原感作不溶性担体粒子試薬の調製、試薬の製造が、簡単に、迅速に、しかも、抗原感作不溶性担体粒子試薬の歩留まりを抑え、回収良く、生産性が向上できる。特に、ＴＰ菌体のように、菌体の人工培養ができない貴重な抗原を用いる試薬に好適である。
【００３１】
また、本発明において、免疫学的反応における粒子凝集反応の反応性を調節するため、反応を促進する物質や反応を抑制する物質が使用できる。使用される凝集反応を促進する物質としては、ポリエチレングリコール等が挙げられる。ポリエチレングリコールの平均分子量としては、１、０００以上のものが好ましい。分子量が大きくなると凝集反応の促進効果が大きくなる、小さすぎると効果が小さくなる傾向となり、高分子量のポリエチレングリコールを用いた時の反応促進効果を低分子量ポリエチレングリコールで達成するには、大量の低分子量のポリエチレングリコールを必要がある。ポリエチレングリコールは、最終反応液中の濃度で０．１〜５．０重量％の範囲で存在させることが好ましい。ポリエチレングリコールの濃度が高すぎると感作された不溶性担体粒子の非特異的な凝集が起こりやすくなり、少なすぎると反応の促進効果が小さい。これら反応を促進する物質の一種又は二種以上組み合わせ使用できる。
【００３２】
凝集反応を抑制する物質としては、トリアルキルアミン、その塩類、第４級アンモニウム塩及び糖類などが挙げられる。トリアルキルアミンとしては、トリエチルアミン等、トリアルキルアミンの塩類としてはトリエチルアミンの塩酸塩等、第４級アンモニウム塩としては、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、塩酸ベタイン等、糖類としてはショ糖等がある。上記凝集反応を抑制する物質は、最終反応液中の濃度で０〜３Ｍの範囲で存在させることが好ましい。濃度が高すぎると測定感度が低下し、測定試薬の粘度増加とともに測定値の再現性が低下する傾向となる。これらの凝集反応を抑制する物質は一種又は二種以上組み合わせ使用できる。
なお、凝集反応を促進する物質及び抑制する物質とを組み合わせ使用することにより粒子凝集反応の反応性を調節することもできる。
【００３３】
上記、免疫学的反応における粒子凝集反応の反応性を調節するため、反応を促進する物質や反応を抑制する物質は、緩衝液に溶解し不溶性担体粒子の分散液と別に試料と混合しても良いし、上記の不溶性担体粒子の分散液中に溶解させても良いし、分散液の液量調整用の希釈液中に溶解し使用時に分散液と混合して用いても良い。また、感作した抗原と試料中の抗体との反応性が低い場合には、このような凝集反応を抑制する物質を入れることなく測定を行うことができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を使用することが好ましい。また、この媒体中に、適宜、ＢＳＡ、塩化ナトリウム又は塩化カリウム等を溶解させてもよい。
【００３４】
本発明において、測定しようとする検体としては、例えば、ヒトの各種液体成分が挙げられるが、検体提供者の臨床像が反映される点から、ヒト血液、ヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト尿等が好ましく、ヒト血液がより好ましく、その中でもヒト血清がさらに好ましい。また、既知濃度の標準液等、抗体を有すると思われる溶液であればこれらに制限されるものではない。
【００３５】
本発明の抗体測定試薬は、粒子凝集法に制限されることなく適用できる。粒子凝集法は、感染性病原体に対する抗体を有する一定量の検体と感染性病原体由来の抗原を感作した不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬の一定量とを混合する。その結果、感染性病原体に対する抗体が存在する場合は、その抗体分子が抗原感作粒子の架橋剤として作用し、抗原感作粒子の凝集反応が生じる。最終的に、この粒子の凝集を何らかの手段を用いて検出する。例えば、凝集像を目視判定による方法、濁りの変化として光学的強度の変化を測定する方法及び凝集の変化として粒子を光学的に計数する測定方法等が挙げられ、これらの測定方法に本発明の抗体測定試薬を適応できる。なお、ここで、光学強度とは、吸光度又は散乱光強度を意味する。光学的に測定する場合の測定装置としては、汎用の分光光度計、分光生化学自動分析装置、専用装置、粒子計数装置等が挙げられる。
【００３６】
少数の検体を緊急で検査する場合、また、測定装置がない施設において、測定の迅速性と操作の簡便性を重視する場合には、目視判定による測定ができる。しかし、目視判定のような主観性を排除し、測定結果の客観性や再現性を重視する場合には、光学的な測定が好ましい。
【００３７】
汎用の分光光度計、分光生化学自動分析装置、専用装置を用いる方法として、具体的には、反応混合物に光りを照射して、粒子の凝集に起因する濁りの変化を、吸光度又は散乱光強度等の光学的強度の変化（変化速度、一定時間あたりの変化量等を含む）を測定する。測定する光の波長は、特に制限されないが、感度、測定範囲等の面から４００〜１２００nmが好ましい。測定波長が４００nm以下では媒体分散液自体の光学的強度が大きくなり、測定範囲が狭くなる。測定は１波長で行ってもよいし、２波長で行ってもよい。測定波長を２波長（主波長及び副波長）に設定すると、セルの汚れや迷光及び電気的ノイズ等による測定値の変動が少なくなり、測定精度が向上する。２波長に設定する場合にも、測定波長は４００〜１２００nmに範囲から選択される２波長が好ましく、特に選択される２波長の差は１００〜５００nmの範囲にあることが好ましい。２波長の差が１００nm以下であると感度が低くなり、５００nmを超えると２波長測定の効果が得られにくくなる傾向となる。また、感度の面から、散乱光強度よりも、吸光度を測定することが好ましい。なお、光学的強度の測定は、反応開始後の光学的強度の変化量又は変化速度を、１回又は２回以上の点での測定により求めることができる。
【００３８】
さらに、光学的な粒子計数装置を用いる方法（カウンティングイムノアッセイ法）によっても測定できる。これは、抗原抗体反応による個々のラテックス凝集をシースフロー中でレーザー光の散乱強度として検出解析することにより、未凝集ラテックス数と凝集ラテックス数を直接カウントすることができ、微量のタンパク質も高感度に測定できる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
免疫学的反応を生じる抗原として、トレポネーマ・パリダムの抽出抗原（以下ＴＰ抗原と略す）をミツバ貿易株式会社（本社：東京都新宿区四谷）から購入した。
ＴＰ抗原（μg/ml）を５ml、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．８）を３ml及び１０（Ｗ／Ｖ）％ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．４μｍ、日本合成ゴム(株)製）を２ml、蓋付きポリプロピレン製の容器内で混合し、２５℃で１時間、往復振とう（６０往復／分）した。次いで１（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡ（ＫＰＬ社製、商品名：ＢＳＡ希釈／ブロッキング用１０倍濃縮液）を３９０ml加え、２５℃で１．５時間、往復振とう（６０往復／分）した。これをＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液（ラテックス粒子の最終濃度：０．０５（Ｗ／Ｖ）％、液量：４００ml）とした。
【００４０】
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、３７℃のインキュベータ中に入れ、９６時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬１（１−Ｒ２と略す）を得た。
【００４１】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
最初に使用したラテックス粒子に対して、回収されたＴＰ抗原感作ラテックス粒子の回収率を百分率として表した。
その結果、表１に示したように回収率は９９％であった。
【００４２】
３．測定方法
次に、上記で得られた１−Ｒ２を用いて検体を測定した。
測定には、日立７１５０型全自動分析装置（(株)日立製作所製）を用いた。
検体希釈液（以下Ｒ１と略す）として、１％ＢＳＡ（ＫＰＬ社製、商品名：ＢＳＡ希釈／ブロッキング用１０倍濃縮液）を用いた
検体は、梅毒陰性血清を１種類、梅毒陽性血清を４種類用いた。
測定条件は以下のように設定した。
試料容量 ２０μｌ
Ｒ１容量 １２０μｌ
Ｒ２容量 １２０μｌ
波長 ７００nm
測定温度 ３７℃
測定方法は、測定開始後、６０秒目と３００秒目における測定波長７００nmでの吸光度の変化量（以下ΔＯＤ７００と略す）を測定した。
【００４３】
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００４４】
実施例２
１． ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
実施例１と同様に行った。
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、４１℃のインキュベータ中に入れ、１２時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬２（２−Ｒ２と略す）を得た。
【００４５】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を２−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は９９％であった。
３．測定方法
１−Ｒ２を２−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
【００４６】
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００４７】
実施例３
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
実施例１と同様に行った。
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、５５℃のインキュベータ中に入れ、５時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬３ （３−Ｒ２と略す）を得た。
【００４８】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を３−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は９９％であった。
【００４９】
３．測定方法
１−Ｒ２を３−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００５０】
実施例４
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
実施例１と同様に行った。
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、６０℃のインキュベータ中に入れ、３時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬４ （４−Ｒ２と略す）を得た。
【００５１】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を４−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は９９％であった。
３．測定方法
１−Ｒ２を４−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００５２】
比較例１
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
ＴＰ抗原は実施例１と同一のものを用いた。
ＴＰ抗原を５ml、１００mlリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．８）を３ml及び１０（Ｗ／Ｖ）％ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．４μｍ、日本合成ゴム(株)製）を２ml、蓋付きポリプロピレン容器内で混合し、２５℃で１時間、往復振とう（６０往復／分）した。次に、１２、０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを５０ml加えた後、再懸濁した。この操作を２回繰り返して、未感作のＴＰ抗原を除去した。最後にラテックス粒子の濃度が０．０５％になるように１（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡを加え、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬５（５−Ｒ２と略す）を得た。
【００５３】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を５−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は７３％であった。
３．測定方法
１−Ｒ２を５−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２から明らかなように、比較例１に対して実施例１、２、３及び４の方法で作製した不溶性担体粒子試薬の方が、全ての陽性試料検体でΔＯＤ７００の値が高く、高い活性を保持していることがわかった。
以上の結果から、本発明の製造法を利用することにより、高活性の不溶性担体粒子試薬を、簡便に、高い回収率で製造できることが明らかになった。
【００５７】
【発明の効果】
請求項１及び２記載の抗体測定試薬の製造法は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との免疫学的反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、検出感度及び再現性が優れる抗体測定試薬を製造できる。
請求項３記載の抗体測定試薬の製造法によれば、請求項１及び２記載の効果を奏し、さらに、遠心分離を繰り返すことにより未感作抗原を洗浄除去する煩雑な操作を行うことなく、抗原感作不溶性担体粒子試薬の調製を、簡単に、迅速にでき、しかも、抗原感作不溶性担体粒子試薬の歩留まりを抑え、回収良く製造できる。
請求項４、５及び６記載の抗体測定試薬は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、測定の検出感度及び再現性が優れる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原感作不溶性担体粒子からなる感染性病原体に対する抗体測定試薬及びその製造法に関する。さらに詳しくは、トレポネーマ・パリダムに対する抗体測定試薬及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療分野において、血液や尿など、様々な物質が含まれる検体中の特定の物質を検出するために、感度や特異性に優れる抗原及び抗体に基づく免疫学的反応を利用した測定法が開発され広く用いられている。
【０００３】
例えば、抗体又は抗原を不溶性担体粒子に担持（以下、感作と言う）させ、これを測定試薬とし、これと検体中の抗原又は抗体との免疫学的反応により生じる不溶性担体粒子の凝集の度合いを検出することにより検体中の抗原又は抗体を測定する粒子凝集法がある。このような粒子凝集法としては、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られている。
【０００４】
赤血球凝集反応法は、不溶性担体粒子として赤血球を用い、抗原又は抗体を感作した感作赤血球を試薬として用いることにより、大きな凝集塊を形成させる測定方法である。この測定方法は、特別な測定装置を必要とせずに、測定操作が簡便であるという特徴を有している。しかし、凝集像を目視で判定する主観的方法で、測定結果の再現性に乏しく、試薬に使用する赤血球自身が抗原性を有するため、目的の免疫学的反応以外の非特異反応を生じる等の問題もある。
【０００５】
そこで、上記の課題を解決しうる測定方法として、赤血球の代わりにカオリン、ベントナイト、コロジオン、炭素、ラテックス粒子等の人工的な不溶性担体粒子が使用されるようになっている。さらに、不溶性担体粒子の粒径、比重、表面官能基等の性質を自由にコントロールできることからポリスチレン等のラテックス粒子が広く用いられている。医療の診断分野において、赤血球の代わりにラテックス粒子を不溶性担体粒子として用いるラテックス凝集法及びそのための測定試薬が開発され、広く用いられている。
【０００６】
粒子凝集法は、免疫学的反応に伴い生じる凝集の検出手段の点から、さらに、凝集像を目視判定による方法、濁りの変化として光学的強度を測定する方法及び粒子を計数する測定方法が知られている。しかし、使用する測定試薬は、基本的には同じ抗原又は抗体感作不溶性担体粒子である。
【０００７】
また、測定装置を持たずに少数の検体を処理する施設や、緊急検査で迅速な測定結果を求められる場合には、目視判定による測定法を採用することもあるが、最近は、測定結果の客観性、再現性と共に多検体の迅速な測定処理が求められ、それに対応できる自動化された専用装置、生化学自動分析装置等が開発され普及する中で、光学的強度を測定する方法や粒子を計数する方法を採用する施設が増加してきている。
【０００８】
さらに、粒子凝集法に使用する抗原又は抗体を感作した不溶性担体粒子からなる測定試薬は、種々の物質を簡便、迅速に測定できることから、測定対象として様々な測定項目に対して数多くの測定試薬が開発されている。測定項目の中でも、梅毒、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ等の感染性病原体に対する抗体の測定は、輸血等の緊急検査項目として重要であるばかりでなく、スクリーニング項目としても検査頻度の高い測定対象となっている。また、上記の測定項目は、特に、測定の簡便性、迅速性及び測定の信頼性が強く求められ、さらに、試薬製造コストの低減化による安価な試薬の供給も強く求められる測定対象である。
【０００９】
この抗体を感作した不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬の製造法は、不溶性担体粒子に抗原又は抗体を感作させ、その後、試薬中の未感作の抗原や抗体を遠心分離による洗浄操作で除去する方法が行われている。しかし、遠心分離による洗浄操作を行っても、必ずしも未感作の抗原や抗体を完全に除去することはできない。この未感作の抗原や抗体が試薬中に残存した試薬を用いて測定すると、未感作の抗原や抗体が、抗原又は抗体を感作した不溶性担体粒子と検体中の反応の相手（抗体又は抗原）との反応を競合的に阻害し、その結果、著しい検出感度の低下を来たすという問題がある。現在、その問題を改善する試薬の製造法として、遠心分離による洗浄操作の回数を多く繰り返すことにより未感作の抗原や抗体を少なくする方法が行われている（Matsumoto,M,et al.,:Clin. Chem.39(8),1700,1993、特開平２−２３４０６３号、特開平３−２１８４６５号、特開平４−８６５５９号）。しかし、その方法でも、試薬の製造時における、遠心分離や遠心分離後のピペッティング操作等の物理的な衝撃により、感作された抗原又は抗体が変性され、検体中の反応の相手との免疫学的反応性が低下され、測定の検出感度が著しく低下される場合がある。さらに、洗浄操作の繰り返しにより、感作された不溶性担体粒子の回収が低下し、試薬の生産効率が低下するという問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１及び２記載の発明は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との免疫学的反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、検出感度及び再現性が優れる抗体測定試薬の製造法を提供するものである。
請求項３記載の発明は、請求項１及び２記載の発明に加えて、遠心分離を繰り返すことにより、未感作抗原を洗浄除去する煩雑な操作を行うことなく、抗原感作不溶性担体粒子試薬の調製を、簡単な操作で、短時間にでき、しかも、抗原感作不溶性担体粒子試薬の回収と生産性を改善できる抗体測定試薬の製造法を提供するものである。
請求項４、５及び６記載の発明は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、測定の検出感度及び再現性が優れる抗体測定試薬を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
（１）本発明は、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理を行うことを特徴とする抗体測定試薬の製造法に関する。
（２）本発明は、免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原がトレポネーマ・パリダムに由来する、上記（１）記載の抗体測定試薬の製造法に関する。
（３）本発明は、遠心分離による未感作抗原の洗浄除去操作を行うことなく、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理を行う、上記（１）又は（２）記載の抗体測定試薬の製造法に関する。
【００１２】
（４）本発明は、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬に関する。
（５）本発明は、免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原がトレポネーマ・パリダムに由来する、上記（４）記載の抗体測定試薬に関する。
（６）本発明は、遠心分離による未感作抗原の洗浄除去操作を行うことなく、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる上記（４）又は（５）記載の抗体測定試薬に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における抗体測定試薬としては、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる試薬である。
【００１４】
抗原感作不溶性担体粒子を分散させる媒体としては、一般に、生化学分野で使用される緩衝液を利用することができ、このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液中に、必要に応じ塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を加えてもよい。上記緩衝液のとしては、pH５．０〜１１．０が好ましく、より好ましくはpH６．０から１０．０、さらに好ましくはpH６．５〜９．０である。
【００１５】
本発明の加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬において、不溶性担体粒子に感作される抗原は、測定しようとする検体中の感染性病原体に対する抗体に対して免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原であり、測定対象の検体中の抗体が生産された原因となる感染性病原体に由来する抗原である。
【００１６】
感染性病原体はヒトやその他の動物感染し感染症を引き起こす。この感染症は、感染する経路によって、接触感染による感染症、飛沫感染による感染症等に分けられる。接触感染による感染症としては、例えば、性行為感染症、皮膚病、狂犬病、鼠咬病等が挙げられる。性行為感染症としては、例えば、梅毒、淋病、軟性下疳、鼠径リンパ肉芽腫症、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ等が挙げられる。これらの性行為感染症の病原体の具体例としては、梅毒の場合はトレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum：以下ＴＰと略す）菌が、淋病の場合はネイセリア・ゴノローエ（Neisseria gonorrhoeae）菌が、Ｂ型肝炎の場合は、Ｂ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus：以下ＨＢＶと略す）が、Ｃ型肝炎の場合は、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus：以下ＨＣＶと略す）が、エイズの場合は、エイズウイルス（human immunodeficiency virus：以下ＨＩＶと略す）が、軟性下疳の場合はヘモフィラス・ダクレイ（Hemophilus ducrey）菌が、鼠径リンパ肉芽腫症の場合はクラミジア（Chlamydia）菌等が挙げられる。
【００１７】
なお、ＴＰ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶに対する抗体検査は、性行為感染症の診断としてのみならず、輸血検査の緊急検査としても重要な検査項目である。
本発明において、測定の対象としては、上記の種類の感染性病原体に対する抗体に制限されないが、多検体の処理能力に優れた不溶性担体粒子を用いる粒子凝集法の利点から、検査頻度の高い性行為感染症等のスクリーニング項目がより好ましい。例えば、血清中の梅毒抗体のスクリーニング検査としてのＴＰ、クラミジア感染性病原体由来の抗原を使用する項目であることが好ましい。また、簡便性、迅速性に優れた不溶性担体粒子を用いる粒子凝集法の利点から、輸血検査等において、迅速な測定結果が求められるＴＰ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ等の感染性病原体由来の抗原を使用する緊急検査項目であることがより好ましい。さらに、抗原感作不溶性担体粒子試薬の回収が良好であることからＴＰのように合成培地で培養できない貴重な感染性病原体由来の抗原を使用する項目であることがさらに好ましい。
【００１８】
以下、本発明の抗体測定試薬の製造法とともに抗体測定試薬について説明する。
本発明において、担体として用いる不溶性担体粒子としては、感染性病原体に由来する抗原を感作させることができるものであれば特に制限されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然高分子、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸の共重合体、スチレン−ブタジエンの共重合体のような有機合成高分子のラテックスやシリカ、アルミナのような無機酸化物及び金コロイドのような金属等が挙げられる。感染性病原体に由来する抗原を感作できる不溶性担体粒子であれば特に制限されないが、不溶性担体粒子の粒径、比重、表面官能基等の性質を自由にコントロールできることからポリスチレン等のラテックス粒子の使用が好ましい。
【００１９】
その不溶性担体粒子の平均粒径は、０．０１〜１０μｍの範囲が好ましく、０．０５〜５μｍの範囲がより好ましい。担体の粒径が小さすぎると、検出感度が低下する傾向となり、担体の粒径が大きすぎると、抗原（タンパク質）分子の結合可能な表面積（結合部位）が少なくなり、これに伴い測定可能な濃度範囲が狭くなる傾向となる。
【００２０】
また、これらの不溶性担体粒子を分散させる媒体として、又、不溶性担体粒子に抗原を感作させる際に用いる媒体としては、一般に、生化学分野で使用される緩衝液を利用することができ、このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液中に、必要に応じ塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を加えてもよい。上記緩衝液のとしては、pH５．０〜１１．０が好ましく、より好ましくはpH６．０〜１０．０であり、さらに好ましくはpH６．５〜９．０である。
【００２１】
本発明において、不溶性担体粒子に感作される抗原は、測定しようとする検体中の感染性病原体に対する抗体に対して免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原である。即ち、測定対象の検体中の抗体が生産された原因となる感染性病原体に由来する抗原である。
【００２２】
不溶性担体粒子の感作に使用できる感染性病原体に由来する抗原としては、菌体、菌体の外膜成分、菌体の産生する菌体外毒素等からの抽出成分であることが好ましい。抗原の抽出には、一般に、生化学分野で使用される緩衝液を利用することができ、抗原が失活しないような緩衝液が好ましい点から、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が好ましい。抗原の安定化や可溶化のために、これらの緩衝液に塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を加えてもよく、オクチルグルコシドやドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を加えてもよい。さらに、測定の非特異反応を抑え、特異性を高めるため、感染性病原体の特異的なタンパク質、糖タンパク、リポタンパク等まで精製することがより好ましい。感染性病原体の特異的なタンパク質、糖タンパク、リポタンパクは、硫安沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法などの通常の方法を単独又２つ以上組合わせて精製又は部分精製できる。また、カラムクロマトグラフィーは１種類のカラムを用いてもよく、２種類以上のカラムを組合わせてもよい。通常のカラムクロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等が用いられる。
【００２３】
なお、合成培地等で培養可能な感染性病原体の場合には、培養後抗原を抽出し、必要に応じて精製して用いることができる。また、ＴＰのように合成培地で培養できない感染性病原体は、あらかじめ、その病原体を動物に感染させ、その動物の体内でその病原体を増殖させた後、抗原を抽出し、必要に応じて精製して用いることもできる。
【００２４】
本発明において、抗原を不溶性担体粒子に感作する方法は、通常行われるように、物理的に吸着させてもよく、化学的に結合させてもよく、さらに、両方を併用してもよい。
感作する抗原の量は不溶性担体粒子の粒径や使用濃度により大きく異なるが、測定範囲を広くするためには、通常は感作できる最大量（不溶性担体粒子の表面の結合可能な部位を完全に覆う飽和量）で感作されるのが好ましい。しかし、測定範囲が問題にならない場合は、最大量より少ない量で感作できる。不溶性担体粒子に抗原を感作した後は、通常、不溶性担体粒子上の未感作部分をアルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチン等で被覆するが、飽和量で感作した場合には不必要なこともある。
【００２５】
感染性病原体に由来する抗原を物理的に不溶性担体粒子に感作させる方法としては、例えば、感染性病原体由来の抗原を含有する溶液（抗原液）を不溶性担体粒子と接触させることで感作できる。感作時には攪拌や振とうを行ってもよく、静置しておいてもよい。感作時の温度は４〜４０℃が好ましく、３０分間〜２４時間の反応で感作させることができる。
【００２６】
また、感染性病原体由来の抗原を化学的に不溶性担体粒子に結合させる方法としては、例えば、前記感染性病原体由来の抗原、表面にカルボキシル基を有する不溶性担体粒子及びカルボジイミドを混合して放置する方法又は前記感染性病原体由来の抗原、表面にアミノ基を有する不溶性担体粒子及びグルタルアルデヒドを混合して放置する方法等が挙げられる。
【００２７】
本発明の抗体測定試薬の製造において、上記のようにして、感染性病原体に由来する抗原を不溶性担体粒子に一定温度条件下で感作させた後、さらに、この感作の温度以上の温度条件で加温処理することにより、未感作の抗原を失活させることが必要である。
【００２８】
加温処理条件としては、不溶性担体粒子に感染性病原体に由来する抗原を感作させた温度以上の条件であり、不溶性担体粒子に感作された抗原が活性を維持し、しかも、未感作の抗原が失活する温度であればよく、低温で長時間又は高温で短時間行う。例えば、３７℃で９６時間〜６０℃で３時間の範囲で加温処理することが好ましく、３９℃で４８時間〜５５℃で５時間の範囲で加温処理することがより好ましく、さらに、４０℃で３６時間〜５０℃で６時間の範囲で加温処理することがさらに好ましい。３７℃未満では、未感作の抗原が失活するのに多大な時間を要し、６０℃を超えると不溶性担体に感作した抗原の活性低下が大きくなる傾向がある。
【００２９】
この加温処理により、不溶性担体粒子に感作された感染性病原体に由来する抗原は、抗体との結合活性を維持するが、不溶性担体粒子に感作されずに未感作の状態で遊離している抗原は、抗体との結合活性を低下される。例えば、ＴＰ菌体から抽出した抗原の場合、３７℃で９６時間の加温処理又は６０℃で３時間の加温処理により、不溶性担体粒子に感作された感染性病原体に由来する抗原は、特異抗体との結合活性を７０％以上維持しているが、未感作の状態で遊離している抗原は、特異抗体との結合活性が１０％以下まで低下している。未感作の遊離抗原が失活する加温処理を行った抗体測定試薬を使用することにより、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との目的の抗原抗体反応が、未感作の遊離抗原により、競合干渉を受けることなく、測定の検出感度と再現性を大幅に向上できる。特に、微量な抗体の検出において好適である。
【００３０】
さらに、加温処理により、未感作の遊離抗原を失活できるため、本発明の試薬の調製においては、未感作抗原を除去するために、従来の試薬製造で行う、抗原感作不溶性担体粒子を前記媒体の緩衝液（適宜、ＢＳＡ、塩化ナトリウム又は塩化カリウム等の添加剤を含有してもよい）を用い分散させ、さらに、遠心分離と再分散を２〜３回又はそれ以上繰り返す煩雑な洗浄除去操作を省略してもよい。本発明によれば、このような煩雑な操作を行なわなくてもよいので、抗原感作不溶性担体粒子試薬の調製、試薬の製造が、簡単に、迅速に、しかも、抗原感作不溶性担体粒子試薬の歩留まりを抑え、回収良く、生産性が向上できる。特に、ＴＰ菌体のように、菌体の人工培養ができない貴重な抗原を用いる試薬に好適である。
【００３１】
また、本発明において、免疫学的反応における粒子凝集反応の反応性を調節するため、反応を促進する物質や反応を抑制する物質が使用できる。使用される凝集反応を促進する物質としては、ポリエチレングリコール等が挙げられる。ポリエチレングリコールの平均分子量としては、１、０００以上のものが好ましい。分子量が大きくなると凝集反応の促進効果が大きくなる、小さすぎると効果が小さくなる傾向となり、高分子量のポリエチレングリコールを用いた時の反応促進効果を低分子量ポリエチレングリコールで達成するには、大量の低分子量のポリエチレングリコールを必要がある。ポリエチレングリコールは、最終反応液中の濃度で０．１〜５．０重量％の範囲で存在させることが好ましい。ポリエチレングリコールの濃度が高すぎると感作された不溶性担体粒子の非特異的な凝集が起こりやすくなり、少なすぎると反応の促進効果が小さい。これら反応を促進する物質の一種又は二種以上組み合わせ使用できる。
【００３２】
凝集反応を抑制する物質としては、トリアルキルアミン、その塩類、第４級アンモニウム塩及び糖類などが挙げられる。トリアルキルアミンとしては、トリエチルアミン等、トリアルキルアミンの塩類としてはトリエチルアミンの塩酸塩等、第４級アンモニウム塩としては、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、塩酸ベタイン等、糖類としてはショ糖等がある。上記凝集反応を抑制する物質は、最終反応液中の濃度で０〜３Ｍの範囲で存在させることが好ましい。濃度が高すぎると測定感度が低下し、測定試薬の粘度増加とともに測定値の再現性が低下する傾向となる。これらの凝集反応を抑制する物質は一種又は二種以上組み合わせ使用できる。
なお、凝集反応を促進する物質及び抑制する物質とを組み合わせ使用することにより粒子凝集反応の反応性を調節することもできる。
【００３３】
上記、免疫学的反応における粒子凝集反応の反応性を調節するため、反応を促進する物質や反応を抑制する物質は、緩衝液に溶解し不溶性担体粒子の分散液と別に試料と混合しても良いし、上記の不溶性担体粒子の分散液中に溶解させても良いし、分散液の液量調整用の希釈液中に溶解し使用時に分散液と混合して用いても良い。また、感作した抗原と試料中の抗体との反応性が低い場合には、このような凝集反応を抑制する物質を入れることなく測定を行うことができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を使用することが好ましい。また、この媒体中に、適宜、ＢＳＡ、塩化ナトリウム又は塩化カリウム等を溶解させてもよい。
【００３４】
本発明において、測定しようとする検体としては、例えば、ヒトの各種液体成分が挙げられるが、検体提供者の臨床像が反映される点から、ヒト血液、ヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト尿等が好ましく、ヒト血液がより好ましく、その中でもヒト血清がさらに好ましい。また、既知濃度の標準液等、抗体を有すると思われる溶液であればこれらに制限されるものではない。
【００３５】
本発明の抗体測定試薬は、粒子凝集法に制限されることなく適用できる。粒子凝集法は、感染性病原体に対する抗体を有する一定量の検体と感染性病原体由来の抗原を感作した不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬の一定量とを混合する。その結果、感染性病原体に対する抗体が存在する場合は、その抗体分子が抗原感作粒子の架橋剤として作用し、抗原感作粒子の凝集反応が生じる。最終的に、この粒子の凝集を何らかの手段を用いて検出する。例えば、凝集像を目視判定による方法、濁りの変化として光学的強度の変化を測定する方法及び凝集の変化として粒子を光学的に計数する測定方法等が挙げられ、これらの測定方法に本発明の抗体測定試薬を適応できる。なお、ここで、光学強度とは、吸光度又は散乱光強度を意味する。光学的に測定する場合の測定装置としては、汎用の分光光度計、分光生化学自動分析装置、専用装置、粒子計数装置等が挙げられる。
【００３６】
少数の検体を緊急で検査する場合、また、測定装置がない施設において、測定の迅速性と操作の簡便性を重視する場合には、目視判定による測定ができる。しかし、目視判定のような主観性を排除し、測定結果の客観性や再現性を重視する場合には、光学的な測定が好ましい。
【００３７】
汎用の分光光度計、分光生化学自動分析装置、専用装置を用いる方法として、具体的には、反応混合物に光りを照射して、粒子の凝集に起因する濁りの変化を、吸光度又は散乱光強度等の光学的強度の変化（変化速度、一定時間あたりの変化量等を含む）を測定する。測定する光の波長は、特に制限されないが、感度、測定範囲等の面から４００〜１２００nmが好ましい。測定波長が４００nm以下では媒体分散液自体の光学的強度が大きくなり、測定範囲が狭くなる。測定は１波長で行ってもよいし、２波長で行ってもよい。測定波長を２波長（主波長及び副波長）に設定すると、セルの汚れや迷光及び電気的ノイズ等による測定値の変動が少なくなり、測定精度が向上する。２波長に設定する場合にも、測定波長は４００〜１２００nmに範囲から選択される２波長が好ましく、特に選択される２波長の差は１００〜５００nmの範囲にあることが好ましい。２波長の差が１００nm以下であると感度が低くなり、５００nmを超えると２波長測定の効果が得られにくくなる傾向となる。また、感度の面から、散乱光強度よりも、吸光度を測定することが好ましい。なお、光学的強度の測定は、反応開始後の光学的強度の変化量又は変化速度を、１回又は２回以上の点での測定により求めることができる。
【００３８】
さらに、光学的な粒子計数装置を用いる方法（カウンティングイムノアッセイ法）によっても測定できる。これは、抗原抗体反応による個々のラテックス凝集をシースフロー中でレーザー光の散乱強度として検出解析することにより、未凝集ラテックス数と凝集ラテックス数を直接カウントすることができ、微量のタンパク質も高感度に測定できる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
免疫学的反応を生じる抗原として、トレポネーマ・パリダムの抽出抗原（以下ＴＰ抗原と略す）をミツバ貿易株式会社（本社：東京都新宿区四谷）から購入した。
ＴＰ抗原（μg/ml）を５ml、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．８）を３ml及び１０（Ｗ／Ｖ）％ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．４μｍ、日本合成ゴム(株)製）を２ml、蓋付きポリプロピレン製の容器内で混合し、２５℃で１時間、往復振とう（６０往復／分）した。次いで１（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡ（ＫＰＬ社製、商品名：ＢＳＡ希釈／ブロッキング用１０倍濃縮液）を３９０ml加え、２５℃で１．５時間、往復振とう（６０往復／分）した。これをＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液（ラテックス粒子の最終濃度：０．０５（Ｗ／Ｖ）％、液量：４００ml）とした。
【００４０】
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、３７℃のインキュベータ中に入れ、９６時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬１（１−Ｒ２と略す）を得た。
【００４１】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
最初に使用したラテックス粒子に対して、回収されたＴＰ抗原感作ラテックス粒子の回収率を百分率として表した。
その結果、表１に示したように回収率は９９％であった。
【００４２】
３．測定方法
次に、上記で得られた１−Ｒ２を用いて検体を測定した。
測定には、日立７１５０型全自動分析装置（(株)日立製作所製）を用いた。
検体希釈液（以下Ｒ１と略す）として、１％ＢＳＡ（ＫＰＬ社製、商品名：ＢＳＡ希釈／ブロッキング用１０倍濃縮液）を用いた
検体は、梅毒陰性血清を１種類、梅毒陽性血清を４種類用いた。
測定条件は以下のように設定した。
試料容量 ２０μｌ
Ｒ１容量 １２０μｌ
Ｒ２容量 １２０μｌ
波長 ７００nm
測定温度 ３７℃
測定方法は、測定開始後、６０秒目と３００秒目における測定波長７００nmでの吸光度の変化量（以下ΔＯＤ７００と略す）を測定した。
【００４３】
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００４４】
実施例２
１． ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
実施例１と同様に行った。
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、４１℃のインキュベータ中に入れ、１２時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬２（２−Ｒ２と略す）を得た。
【００４５】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を２−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は９９％であった。
３．測定方法
１−Ｒ２を２−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
【００４６】
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００４７】
実施例３
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
実施例１と同様に行った。
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、５５℃のインキュベータ中に入れ、５時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬３ （３−Ｒ２と略す）を得た。
【００４８】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を３−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は９９％であった。
【００４９】
３．測定方法
１−Ｒ２を３−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００５０】
実施例４
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
１）抗原感作操作
実施例１と同様に行った。
２）加温操作
上記ＴＰ抗原感作ラテックス懸濁液を含むその容器を、さらに、６０℃のインキュベータ中に入れ、３時間静置することにより加温処理した。この加温処理することにより、未感作のＴＰ抗原を失活させ、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬４ （４−Ｒ２と略す）を得た。
【００５１】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を４−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は９９％であった。
３．測定方法
１−Ｒ２を４−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００５２】
比較例１
１．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の調製
ＴＰ抗原は実施例１と同一のものを用いた。
ＴＰ抗原を５ml、１００mlリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．８）を３ml及び１０（Ｗ／Ｖ）％ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．４μｍ、日本合成ゴム(株)製）を２ml、蓋付きポリプロピレン容器内で混合し、２５℃で１時間、往復振とう（６０往復／分）した。次に、１２、０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを５０ml加えた後、再懸濁した。この操作を２回繰り返して、未感作のＴＰ抗原を除去した。最後にラテックス粒子の濃度が０．０５％になるように１（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡを加え、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬５（５−Ｒ２と略す）を得た。
【００５３】
２．ＴＰ抗原感作ラテックス試薬の回収率
１−Ｒ２を５−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
その結果、表１に示すように回収率は７３％であった。
３．測定方法
１−Ｒ２を５−Ｒ２に変更した以外は実施例１と同様に行った。
４．測定結果
各検体に対する吸光度の変化量を表２に示した。なお、吸光度の変化量の値は、ΔＯＤ７００を１００００倍を乗じた値で示した。
【００５４】
【表１】
【表２】
表２から明らかなように、比較例１に対して実施例１、２、３及び４の方法で作製した不溶性担体粒子試薬の方が、全ての陽性試料検体でΔＯＤ７００の値が高く、高い活性を保持していることがわかった。
以上の結果から、本発明の製造法を利用することにより、高活性の不溶性担体粒子試薬を、簡便に、高い回収率で製造できることが明らかになった。
【００５７】
【発明の効果】
請求項１及び２記載の抗体測定試薬の製造法は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との免疫学的反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、検出感度及び再現性が優れる抗体測定試薬を製造できる。
請求項３記載の抗体測定試薬の製造法によれば、請求項１及び２記載の効果を奏し、さらに、遠心分離を繰り返すことにより未感作抗原を洗浄除去する煩雑な操作を行うことなく、抗原感作不溶性担体粒子試薬の調製を、簡単に、迅速にでき、しかも、抗原感作不溶性担体粒子試薬の歩留まりを抑え、回収良く製造できる。
請求項４、５及び６記載の抗体測定試薬は、検体中の抗体と試薬中の抗原感作不溶性担体粒子との反応における、未感作抗原の競合干渉が改善され、測定の検出感度及び再現性が優れる。
Claims (6)
- 不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理を行うことを特徴とする抗体測定試薬の製造法。
- 免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原がトレポネーマ・パリダムに由来する、請求項１記載の抗体測定試薬の製造法。
- 遠心分離による未感作抗原の洗浄除去操作を行うことなく、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理を行う、請求項１又は２記載の抗体測定試薬の製造法。
- 不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる抗体測定試薬。
- 免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原がトレポネーマ・パリダムに由来する、請求項４記載の抗体測定試薬。
- 遠心分離による未感作抗原の洗浄除去操作を行うことなく、不溶性担体粒子に免疫学的反応を生じる感染性病原体に由来する抗原を一定温度条件下で感作し、次いで、該感作の温度以上の温度条件でさらに加温処理された抗原感作不溶性担体粒子からなる請求項４又は５記載の抗体測定試薬。
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