CN111944153B - 一种用于检测登革热ns1蛋白的分子印迹聚合物微球及其应用 - Google Patents
一种用于检测登革热ns1蛋白的分子印迹聚合物微球及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测登革热NS1蛋白的分子印迹聚合物微球，其包括二氧化硅微球以及覆盖在其表面的分子印迹聚合物层，所述分子印迹聚合物层具有由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段形成的空穴。本发明的分子印迹聚合物微球能够准确、方便、高效、快速、灵敏、低成本地实现对登革热NS1蛋白的检测。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种用于检测登革热NS1蛋白的分子印迹聚合物微球及其应用。
背景技术
登革热(dengue fever)是主要由伊蚊叮咬感染登革病毒引起，伴有头痛、肌肉骨关节痛、发热、淋巴结肿大、疲乏等临床特征的一种急性传染病，广泛流行于热带和亚热带，可能出现多种临床表现，从轻度发热病到严重和致命疾病不等。随着疾病的发展，在发热阶段，症状与其它虫媒病毒感染以及麻疹、风疹、肠病毒感染、腺病毒感染和流感相似，需要根据临床表现和当地疾病流行情况结合诊断。
登革热由感染登革热病毒引起，根据患者血清中抗体的类型不同，可以将登革热病毒分为DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4等四个血清型。四个不同亚型的登革热病毒RNA序列基本一致。RNA翻译的蛋白分子主要分为两类，其中前端的结构基因片段翻译出C、prM、E等结构蛋白，之后的非结构基因片段翻译出NS1与其他六个非结构蛋白。首先翻译出的C蛋白又名衣壳蛋白，是登革热等黄热病科病毒的共通结构，起到保护病毒RNA的作用。prM蛋白是M蛋白的前驱体，经过糖基化的结构蛋白M会和结构蛋白E以一定的方式结合在登革热病毒表面。结构蛋白一般是同属病毒共同含有的蛋白分子，常用于鉴定病毒的种类，有些结构蛋白还起识别细胞的作用。非结构蛋白不和RNA组合成病毒，但在病毒识别、复制的过程中起到一定的作用。作为第一个翻译的非结构蛋白，登革热NS1蛋白是登革热病毒翻译的多种蛋白中三个糖蛋白之一，是登革病毒的翻译的最重要非结构蛋白。1985年GREG W.SMITH，NS1蛋白可以与登革热患者血清中的抗体结合，说明登革热NS1蛋白在登革热病毒复制和感染过程中起着关键作用，是诊断登革热的重要指标。登革热NS1蛋白主要以二聚体形式存在，其分子量约42～50KDa，分子量主要由NS1蛋白上连接的糖基侧链的大小决定。
深入研究登革热NS1蛋白的抗原性发现，尽管登革病毒存在四种血清亚型，但是DEN-NS1序列翻译出的NS1蛋白的特异性抗体能与其他型NS1蛋白发生交叉反应。这说明四型登革热的NS1蛋白存在共同性，登革热NS1蛋白与其对应抗体可以用来诊断登革热。Jyh-Hsiung Huang等发现登革热NS1蛋白的部分氨基酸序列肽段可以引起登革热抗体血清发生免疫结合反应，对应的lgM和lgG抗体在患者发热后2天和9天可被检测出，患者康复后仍然能检测出较高的登革热NS1蛋白抗体滴度。相关研究表明，NS1蛋白与登革热患者病情发展有着重大关系，原发性登革热感染者在出现发热症状后不久即可检测出NS1蛋白与NS1蛋白抗体，但继发性登革热感染者(包括重症登革热患者)的血清抗原抗体检测含量较低。
登革热若只通过症状表现诊断往往会被其他病症类似的疾病误导、耽误救治。早期病毒感染确诊需要分离出样品中的病毒毒株，此方法费时费力，操作失误还会产生假阴性结果。现阶段确诊登革热感染主要依靠检测登革热标志性生物分子。登革热病毒核酸与登革热NS1蛋白在登革热病毒感染不久后的病毒快速复制过程中即有大量表达。为了尽早确诊登革热，核酸检测和蛋白质检测是最常使用的检测方法。对于登革热RNA的检测，基本是使用聚合酶链式反应(PCR)原理。登革热核酸检测因为核酸序列的特异性确诊登革热准确率最高的方法，但是核酸检测法受到核酸提取困难的限制，而且相对应的仪器，如RT-PCR仪和荧光光谱仪，价格都比较昂贵，不是每个实验室都有条件使用检测。登革热NS1蛋白也是登革热病毒感染后表达出的重要蛋白，NS1蛋白及其lgM和lgG抗体蛋白常来确诊登革热。一般利用NS1蛋白和NS1蛋白抗体之间的酶联免疫反应，设计相应的识别反应产生信号，以此检测NS1蛋白及其抗体。酶联免疫法鉴定登革热蛋白往往需要登革热NS1蛋白的不同抗体(包括一抗二抗、抗一抗二等)，虽然检测速度快，但纯度高的抗体价格昂贵，且不论酶联免疫法设计如何精巧，利用登革热NS1蛋白酶联免疫作用的检测方法仍然受到蛋白质稳定性差的影响。据已有报道抗体依赖感染增强效应(ADE)，继发性感染登革热患者体内会出现NS1蛋白与lgG抗体结合的情况，患者体内的NS1蛋白免疫检测准确度明显降低。因此，急需一种准确、方便、高效、快速、低成本的检测方法，实现对登革热NS1蛋白的检测。
分子印迹聚合物材料是一种用抗体抗原结合的原料，通过人工化学合成的方法制备的特殊功能材料，被广泛利用于化学、生物、环境等领域。分子印迹聚合物(Molecularimprinting polemers，MIPs)具有特异性、选择性和环境耐久性。但针对蛋白质的分子印迹聚合物制备仍存在一些挑战。首先，制备MIPs需要的模板分子一般是待分离物质的纯品，通常蛋白质都难以获得且价格昂贵，导致生物大分子印迹材料的研究和应用受到极大限制；温度和环境变化很容易影响蛋白质的柔性结构和构象，从热力学的角度来看，制备这些分子的印迹聚合物的难度很大；第二，蛋白质结构复杂，表面存在的多种类型的结合位点都可能与MIPs作用，导致其专一性识别性能很低；第三，蛋白质分子体积庞大，严重影响高度交联的MIPs的吸附动力学性能。第四，蛋白质在血液或组织中基体复杂，浓度非常低，快速检测难度很大。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种灵敏度高、选择性强、可以快速检测登革热NS1蛋白的技术方案。
为了实现以上目的，本发明提供了一种用于检测登革热NS1蛋白的分子印迹聚合物微球，其包括二氧化硅微球以及覆盖在其表面的分子印迹聚合物层，所述分子印迹聚合物层具有由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段形成的空穴。
优选地，所述分子印迹聚合物层由硅氧烷功能单体制得，所述硅氧烷功能单体是巯丙基三乙氧基硅烷与以下任意一种或多种的反应产物：甲基丙烯酸、N-叔丁基丙烯酰胺、4-乙烯基咪唑。
优选地，所述硅氧烷功能单体是甲基丙烯酸、N-叔丁基丙烯酰胺和4-乙烯基咪唑的混合物与巯丙基三乙氧基硅烷的反应产物。
优选地，在所述混合物中，按摩尔量计，甲基丙烯酸的含量为20％-60％，N-叔丁基丙烯酰胺的含量是20％-33％，4-乙烯基咪唑的含量是20％-60％。更优选地，甲基丙烯酸、N-叔丁基丙烯酰胺、4-乙烯基咪唑的摩尔比为1:1:3或3:1:3或1:1:1。
优选地，所述硅氧烷功能单体的制备步骤如下：向甲基丙烯酸和/或N-叔丁基丙烯酰胺和/或4-乙烯基咪唑加入3-巯丙基三乙氧基硅烷、甲醇溶剂，调节pH至8.0，60℃水浴反应至少6小时。
另一方面，本发明还提供了所述的分子印迹聚合物微球用于检测登革热NS1蛋白的用途。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测登革热NS1蛋白的方法，其使用根据本发明所述的分子印迹聚合物微球，利用固相萃取和超高效液相色谱质谱，通过检测所述多肽片段来检测登革热NS1蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括根据本发明所述的分子印迹聚合物微球。
另一方面，本发明还提供了所述的分子印迹聚合物微球的制备方法，其包括以下步骤：
1)合成硅氧烷功能单体；
2)以所述多肽片段为模板，以甲醇为溶剂，配置多肽反应溶液，向所述多肽反应溶液中加入所述硅氧烷功能单体，一起混合预作用至少6小时；
3)活化二氧化硅微球；
4)进行二氧化硅微球表面印迹聚合反应。
优选地，该方法的具体步骤如下：
1)合成硅氧烷功能单体：将1mmol的甲基丙烯酸或N-叔丁基丙烯酰胺或4-乙烯基咪唑、1mmol的3-巯丙基三乙氧基硅烷和5mL的甲醇混合，加人三乙胺调节pH至8.0，60℃水浴反应6h，得到油状的硅氧烷功能单体。；
2)以所述多肽片段为模板，以甲醇为溶剂，配置1mg/L的多肽反应溶液，向5mL所述多肽反应溶液中加入所述硅氧烷功能单体，一起混合预作用6小时；
3)活化二氧化硅微球：将10g二氧化硅微球加入250mL浓度为8mol/L的盐酸中，110℃油浴回流反应8h，使二氧化硅微球表面的羟基活化，将产物以5000r/min离心5min分离，去掉上清液，沉淀加入去离子水超声10min，再次离心保留沉淀，重复上述过程至上清液pH＝7，将沉淀进行干燥；
4)进行二氧化硅微球表面印迹聚合反应：向0.2g活化后的二氧化硅微球加入35mL甲醇，超声10min混合均匀并脱气，加入所述硅氧烷功能单体和多肽片段已预作用的甲醇溶液共15mL和2.7mL TEOS作为交联剂，缓慢滴加1.8mL氨水，40℃水浴水解，反应结束后以5000r/min的转速离心分离，去掉上层液体，保留沉淀，加入1％v/v三氟乙酸甲醇溶液超声10min，以5000r/min的转速离心分离，沉淀再次加入无水乙醇，超声10min，并离心分离保留沉淀，交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止，沉淀于50℃干燥。
本发明利用蛋白质组学原理，合成了一种硅胶微球表面包覆印迹的硅胶分子印迹聚合物材料。首先利用点击反应将三种含有不同官能团的烯基分子(甲基丙烯酸、N-叔丁基丙烯酰胺和4-乙烯基咪唑)分别与3-巯丙基三甲基硅烷反应合成了三种分别含有羧基、叔丁基、咪唑基团的硅氧烷功能单体，然后根据登革热NS1蛋白的序列和蛋白酶的酶解特性位点，以硅氧烷水解表面印迹技术在10μmSiO2微球上印迹登革热NS1蛋白特征肽段(登革热NS1蛋白酶解消化后残留的特征肽段)，制备了一种对登革热NS1蛋白酶解液印迹吸附的固相萃取材料，该材料对目标多肽的吸附速度快、吸附量大，通过三个功能单体的正点、负点和疏水作用将确定的多肽片段以表面印迹聚合制备分子印迹聚合物固相萃取材料。
本发明解决了上述模板选择及其高效印迹的问题，即以蛋白质序列中裸露在表面的特异性短肽片段为模板，所合成的MIPs能有效识别整个蛋白质分子。该方法将生物大分子印迹简化为小分子印迹。本发明的分子印迹聚合物微球灵敏度高、选择性强，可以快速检测登革热NS1蛋白。
附图说明
图1是分子印迹聚合物合成及固相萃取UPLC-MS/MS检测原理图。
图2是功能单体与3-巯丙基硅烷的红外对比图。
图3是三种功能单体的核磁表征数据。
图4是三种功能单体的质谱表征数据。
图5是MIP与SiO2微球的红外表征数据图。
图6是印迹前(A)与印迹后(B)微球的SEM对比图。
图7示出了印迹聚合物与非印迹聚合物的EDX能谱分析元素分布。A为分子印迹聚合物，B为裸SiO2微球。
图8示出了印迹聚合物(MIP)与非印迹聚合物(NIP)热重表征数据。
图9示出了MIP与NIP氮气吸脱附表征数据与孔容孔径分布。
图10印迹微球动态吸附数据图。
图11示出了MIP和NIP对模板多肽的饱和吸附曲线。
图12示出了硅氧烷功能单体比例优化图。
图13是模板多肽超高效液相质谱离子对数据图。
图14是模板多肽UPLC-MS标准曲线图。
图15是酶解样品萃取前后液质图(XQ：血清；NS：NS1蛋白)。
图16是分子印迹柱与商品柱萃取性能对比图。
图17是登革热不同蛋白样品检测对比图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。值得注意的是，出于简要清楚的目的，以下实施例中对一些常规的技术操作步骤、试剂、仪器并未进行细致的描述，但应理解，如未特别说明，这些常规技术操作步骤、试剂、仪器对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
实施例1：登革热NS1蛋白酶解片段选择并建立UPLC-MS检测方法
根据登革热NS1蛋白序列结合胰蛋白酶，筛选出多肽片段(RTTTASGKLITE(SEQ IDNO.1))作为潜在模板。用甲醇配置浓度为10mg/10mL的多肽片段母液。母液放置于4℃冰箱内保存。用0.1％的甲酸水溶液将上述多肽片段母液稀释1000倍后配制为1mg/L、250mL的标准溶液，4℃冰箱内保存，用于之后稀释为UPLC-MS检测的系列溶液。
取有含4μg/10μL的登革热NS1蛋白试剂小管，加入1mL甲醇将其中的蛋白质完全溶解并重新定容，标记为登革热NS1蛋白原液，至于-8℃冰箱内保存。每次使用登革热NS1蛋白母液时，先将冷冻的母液瓶子放置在干净的烧杯内于室温下缓慢解冻回复至室温使用。取100μL登革热NS1蛋白母液，向其中加入1mL 50mmol/L的碳酸氢铵水溶液作为溶剂和缓冲剂，加入100μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液，震荡均匀后于37℃恒温培养箱内孵育1h。停止后加入100μL 0.3mol/L碘乙酸溶液，置于37℃恒温培养箱内暗室孵育1h后取出，加入200μL0.3mol/L二硫苏糖醇溶液和200μL 100ng/L的牛胰蛋白酶，置于37℃恒温培养箱内孵育6h，取出后加入0.1％的甲酸水溶液终止酶解反应并定容至5.0mL，放置于4℃冰箱内密封保存。
取多肽1mg/L的标准溶液，稀释为100μg/L的UPLC-MS工作溶液。以Waters UPLC-MS仪器自带的质谱检测通道直接进样，找出最强的分子离子信号，利用仪器自带的质谱条件优化程序，建立多肽的质谱检测最优条件，确定离子信息数据。
取2mL反应后的蛋白酶解液，以UPLC进样方式进行液质检测。以多肽的质谱条件和离子信息作为检测信号。对比蛋白酶解液和多肽的检测信号，确定酶解液中存在的多肽片段，并以此片段优化UPLC-MS液相条件。目标多肽液相梯度洗脱表如表1所示。
表1：目标多肽液相梯度洗脱表
| 时间(min) | 流速(mL/min) | 0.2％甲酸水溶液(％) | 色谱纯甲醇(％) |
| 0.01 | 0.300 | 95 | 5 |
| 1 | 0.300 | 95 | 5 |
| 2 | 0.300 | 5 | 95 |
| 3 | 0.300 | 5 | 95 |
| 3.2 | 0.300 | 95 | 5 |
| 4 | 0.300 | 95 | 5 |
| 5 | 0.300 | 95 | 5 |
| 6 | 0.300 | 95 | 5 |
将1mg/L的多肽标准溶液稀释为1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L和50μg/L系列浓度，以上述确定的液相条件和离子信息进行多肽标准系列溶液检测，以所得数据绘制多肽标准曲线。如图14所示，线性范围为1～50μg/L，检测限0.567μg/L。
实施例2：登革热NS1蛋白酶解片段的分子印迹表面聚合物材料合成
1、三种硅氧烷功能单体的合成
分别在三个25mL圆底烧瓶中加人1mmol的甲基丙烯酸、1mmol的N-叔丁基丙烯酰胺和1mmol的4-乙烯基咪唑，三个圆底烧瓶中都加人1mmol 3-巯丙基三乙氧基硅烷和5mL的甲醇溶剂，分别加人三乙胺调节pH到8.0，60℃水浴反应6h。三个反应产物按顺序标记为S-M、S-T和S-V。为了之后的功能单体表征，用氮吹仪设置温度为50℃将产物吹至扫半小时，蒸去甲醇溶剂和三乙胺，留下油状的硅氧烷功能单体。
2、二氧化硅球表面印迹聚合反应
以实施例1中确定存在的RTTTASGKLITE(SEQ ID NO.1)多肽序列为模板多肽，用甲醇配置该多肽的1mg/mL母液稀释成1mg/L的多肽反应溶液。取5.0mL多肽反应液，加入反应后的S-M、S-T和S-V三种功能单体，一起混合预作用6h。
称取10g SiO2微球，加入到盛有250mL 8mol/L盐酸的500mL的圆底烧瓶中，110℃油浴回流反应8h，使二氧化硅微球表面的羟基活化。将产物以5000r/min离心5min分离，去掉上清液，沉淀加入去离子水超声10min，再次离心保留沉淀。重复上述过程至上清液pH＝7。将沉淀转移到真空干燥箱内，80℃干燥。
在100mL圆底烧瓶中加入0.2g活化后SiO2硅微球，加入35mL甲醇作为溶剂，超声10min混合均匀并脱气。加入功能单体和模板多肽已预作用的甲醇溶液共15mL和2.7mLTEOS作为交联剂，缓慢滴加1.8mL氨水。于40℃水浴锅中缓慢水解12h反应结束后以5000r/min的转速离心分离，去掉上层液体，保留沉淀。加入1％三氟乙酸甲醇溶液超声10min，以5000r/min的转速离心分离，沉淀再次加入无水乙醇，超声10min，并离心分离保留沉淀。交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止。沉淀置于50℃真空干燥箱内干燥12h，非印迹微球也用上述方法合成，只是不需要加入模板多肽。
实施例3：固相萃取实验
取10μL登革热阳性患者血清样品，加入1.0mL乙腈将蛋白沉淀，以3000r/min转速离心，沉淀蛋白用1.0mL甲醇重新溶解，保存于-8℃冰箱内。血清沉淀蛋白的酶解方法与实施例1中的蛋白酶解方法一致，取100μL登革热阳性患者血清沉淀蛋白溶液，向其中加入1mL50mmol/L的碳酸氢铵水溶液作为溶剂和缓冲剂，加入100μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液，震荡均匀后于37℃恒温培养箱内孵育1h。反应停止后加入100μL 0.3mol/L碘乙酸溶液，置于37℃恒温培养箱内暗室孵育1h后取出，加入200μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液和200μL100ng/L的牛胰蛋白酶，置于37℃恒温培养箱内孵育6h，取出后加入0.1％的甲酸水溶液终止酶解反应并定容至5.0mL，放置于4℃冰箱内密封保存。
称取0.3g印迹聚合物填充到3mL的固相萃取空柱内，盖上筛板后用甲醇冲洗掉多余的粉末。将填充好的固相萃取分子印迹柱安装到固相萃取装置上，加入3mL甲醇滤过填料层，活化。取1mL酶解完的样品加入到固相萃取柱中进行固相萃取，分批加入5mL 1％的三氟乙酸甲醇溶液冲洗。收集洗脱液，将洗脱液用干式氮吹仪于50℃氮吹近干，以0.1％的甲酸水溶液重新定容至1mL。用0.22μm的滤膜过滤，转移到2mL样品瓶内，用实施例1中已优化的登革热NS1蛋白酶解多肽的UPLC-MS检测方法进行超高效液相色谱质谱(UPLC-MS质谱)检测。
如图13所示，模板多肽主要有两个主离子碎片和相应的一共四个离子对，他们分别为：m/z 426.78-m/z 84.04、m/z 426.78-m/z 148.02、m/z 639.72-m/z 84.11和m/z639.72-m/z129.12。四个离子对在3.0min左右都存在一个明显的液相峰，说明3.0min的峰是模板多肽产生的，而不是其他杂质信号。故可以使用3.0min的响应峰面积作为检测信号。
如图15所示，可以看出，分子印迹固相萃取柱可以富集目标多肽。特别是血清样品在酶解后存在多个类似的多肽峰，未经过分子印迹固相萃取柱前，目标多肽结合了较多的无机盐，使得其液相峰存在较多裂分，直接进样不但检测信号较差，也会污染质谱检测器，不利于检测实际样品。对于NS1蛋白样品的信息对比，因加入的NS1蛋白含量较低，富集效果有，但不如血清样品的明显。
实施例4：材料表征
1、三种功能单体红外、核磁和高分辨质谱表征
取经过氮吹提纯的功能单体用乙醇重新溶解，溶剂与单体比例大约为100:1。用涂膜法将乙醇溶解的功能单体滴涂在溴化钾窗片或氧化铊窗片上，用红外灯将乙醇溶剂蒸发，功能单体在窗片上形成一层薄膜，用该窗片进行单体傅里叶红外光谱表征测试。结果如图2所示。图2表明，S中2550cm-1处属于巯基的特征吸收峰在反应后的三个功能单体中都减弱或消失了，说明巯基参与了点击反应。其中，S-M的红外数据出现了1707cm-1处的吸收峰，这是属于羰基C＝O双键的特征吸收；S-T的红外数据中，1650cm-1是酰胺键中羰基C＝O的特征吸收峰，1539cm-1是酰胺键的特征吸收峰；S-V的红外数据中，1647cm-1和1507cm-1都是咪唑环上C＝C、C＝N的特征吸收。以上数据说明三个不同官能团的硅氧烷功能单体合成成功。
取经过氮吹提纯的功能单体，加入氘代氯仿充分震荡溶解，转移至核磁管内，进行核磁共振能谱表征测试。结果如图3所示。图3展示了三个硅氧烷功能单体的核磁数据图。三个硅氧烷功能单体的核磁数据与拟合数据吻合，证明三个硅氧烷功能单体合成成功。
取经过氮吹提纯的功能单体，用甲醇溶解，进行高分辨质谱检测。结果如图4所示，S-M与S-T硅氧烷的分子离子峰比较明显，但S-T分子离子峰较弱。并且样品内杂质较多，质谱结果可信度低。
2、分子印迹聚合物材料红外表征
用压片法制备固体红外测试薄片，对分子印迹聚合物材料(MIP)、非印迹聚合物材料(NIP)与裸二氧化硅微球(SiO2)进行红外光谱表征。在红外灯下，分别称取0.002g分子印迹聚合物材料与0.002g二氧化硅微球，分别加入0.2g光谱纯溴化钾，样品占总成分1％。充分研磨均匀后用压片机以10MPa的压力进行压制5min，确保压片均匀透明后用于红外检测，扫描波长为4000-400cm-1。结果如图5所示，分子印迹聚合物材料与裸SiO2微球的红外数据对比中可以发现3430cm-1处是氨基上N-H的特征吸收，1450cm-1和1300cm-1是芳烃骨架，这两者都属于咪唑的特征吸收峰，其证明了S-V单体参与了聚合反应。2950cm-1是甲基亚甲基特征吸收，是S-T单体参与聚合反应的结果。1716cm-1是属于羰基C＝O的特征吸收峰，是S-M单体的红外特征峰。Figure 2.3.4说明三个功能单体都参与了聚合反应，但是模板分子的特征红外吸收数据与单体的近似，无法在红外表征数据上体现。
3、分子印迹材料热重表征
分别称取0.02g左右分子印迹聚合物材料、非印迹聚合物材料与裸二氧化硅微球，进行热重分析。设置检测温度为40-800℃，升温速率为10℃/min。以失重百分比、失重速率为Y轴，温度变化为X轴作图。结果如图8所示，可以看出，MIP与NIP的失重曲线基本类似，在370℃左右达到最大失重速率，这是SiO2表面聚合物被烧去的结果。印迹与非印迹聚合物的差异主要体现在是否吸附模板，因此MIP会比NIP失重量更大一点。
4、分子印迹材料氮气吸脱附表征
分别称取0.1g左右分子印迹聚合物材料、非印迹聚合物材料与裸二氧化硅微球，置于氮气吸脱附表征样品管中先进行恒温脱气步骤。脱气温度为100℃，脱气时间3h。脱气后的样品管快速安装在氮气吸脱附仪器上，等样品管冷却后进行氮气吸脱附表征，测试期间确保液氮瓶内液氮液面高于样品管内样品。结果如图9所示，可以看到，MIP相较于NIP，在经过酸洗脱模板后生成了印迹空穴，提高了部分比表面积。从孔容孔径分布图来看，两个孔径基本一致，为50nm左右，但MIP的孔体积相比NIP大一点，这也符合MIP经过酸洗脱模板的结果。
5、分子印迹材扫描电镜和能谱表征
分子印迹聚合物材料与裸二氧化硅微球用乙醇分散，并超声30min。将超声后印迹聚合物材料与裸二氧化硅微球的分散液滴到粘有导电胶的扫描电镜样品台上，50℃真空干燥12h后进行扫描电镜观察，分散液滴到粘有铜箔的扫描电镜样品台上，50℃真空干燥12h后进行能谱表征。结果如图6和图7所示，可以明显看到印迹前后SiO2微球的表面发生明显变化，生成了一层比较粗糙的聚合物层。聚合前后SiO2微球大小无明显增大，并且由于微球直径为10μm左右，聚合前后直径变化无法在透射电子显微镜下体现，激光粒径分析也不适用这种较大的颗粒。整体来看，各个元素基本主要分布在球上，只有N元素因为其能谱峰容易被C元素掩盖，造成含量低和分布情况不明显。聚合前，SiO2的主要元素为Si、O等，上图中B中还含有C元素的成分是因为基底含有C元素而造成的偏差，从分布图中可以看出球上几乎不含C元素。聚合后C元素的成分因为单体的聚合大量增加，相应的Si和O元素的含量下降。作为功能单体之一的S-V提供了N元素，使得聚合后N元素也略微提高。
实施例5：分子印迹柱与商品柱吸附对比实验
将0.3g分子印迹聚合物材料(MIP)和非印迹聚合物材料(NIP)分别填入空的固相萃取柱中。选择waters公司生产的C18柱、HLB柱、WCX柱、MCX柱、WAX柱和MAX柱作为对照组，以国标中的固相萃取方法进行模板多肽分子固相萃取。加入1mL 1000μg/L的目标多肽溶液，用3mL甲醇冲洗，分批加入5mL 1％的三氟乙酸甲醇溶液洗脱。收集洗脱液，将洗脱液用干式氮吹仪于50℃氮吹近干，以0.1％的甲酸水溶液重新定容至1mL。用0.22μm的滤膜过滤，转移到2mL样品瓶内，用UPLC-MS/MS检测方法进行超高效液相质谱检测。结果图16所示，可以看出合成的分子印迹固相萃取柱对目标多肽的固相萃取性能优于商品化的固相萃取柱，分子印迹空穴在其中起到了决定性作用。商品柱主要由单一的官能团提供结合作用力，分子印迹柱不单单提供了三种官能团的结合作用，还提供了空间上分子印迹空穴的识别作用。分子印迹柱的固相萃取性能优于普通商品柱的性能。
实施例6：蛋白样品对比实验
选取牛血清蛋白、细胞色素C作为对照蛋白检测。将牛血清蛋白、细胞色素C配置成1000μg/L的溶液，保存于-8℃冰箱内。取100μL对照蛋白溶液，向其中加入1mL 50mmol/L的碳酸氢铵水溶液作为溶剂和缓冲剂，加入100μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液，震荡均匀后于37℃恒温培养箱内孵育1h。反应停止后加入100μL 0.3mol/L碘乙酸溶液，置于37℃恒温培养箱内暗室孵育1h后取出，加入200μL 0.3mol/L二硫苏糖醇溶液和200μL 100ng/L的牛胰蛋白酶，置于37℃恒温培养箱内孵育6h，取出后加入0.1％的甲酸水溶液终止酶解反应并定容至5.0mL，放置于4℃冰箱内密封保存。取1mL酶解完的样品加入到固相萃取柱中进行固相萃取，分批加入5mL 1％的三氟乙酸甲醇溶液冲洗。收集洗脱液，将洗脱液用干式氮吹仪于50℃氮吹近干，以0.1％的甲酸水溶液重新定容至1mL。用0.22μm的滤膜过滤，转移到2mL样品瓶内，用UPLC-MS/MS检测方法进行超高效液相质谱检测。
结果如图17所示，三个登革热血清样品的检测信号都很明显，但NS1蛋白的检测信号稍弱。而两个牛血清蛋白和细胞色素C的对照组则基本没有检测出。
实施例7：印迹微球对模板多肽的动态吸附
在10mL塑料离心管中加人0.05g干燥好的印迹微球，加入4mL甲醇和1mL 1mg/L的模板多肽溶液，常温下以400转/min的转速摇晃孵育。取0min、1min、2min、5min、7min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、120min、150min、180min、240min和3000min对应孵育时间的吸附溶液，用0.22μm滤膜过滤后用2.2.2中建立的方法测定残留含量，计算吸附量比例。结果如图10所示，可以看到，所合成的分子印迹聚合物微球对模板多肽的吸附速度比较快，5min左右已达到90％以上的吸附量，非常适合作为固相萃取柱的填料使用。
实施例8：印迹聚合物对模板多肽的饱和吸附
配置如表2-4中所列出的多肽浓度。取5mL系列浓度的模板多肽溶液，分别加入0.05g分子印迹聚合物，常温下以400转/min的转速摇晃孵育0.5h。之后用0.22μm滤膜过滤，并按照表中对应的稀释倍数用0.2％的甲酸水稀释，之后后用实施例1中建立的方法测定残留含量，加入多肽的量减去残留量得出吸附量后除以加入分子印迹聚合物的质量所得结果为图11。
表2：饱和吸附浓度及吸附后稀释倍数
从图11中可以看出，在低浓度下，MIP与NIP的吸附性能相近，但随着模板多肽浓度的增加，非印迹聚合物的吸附性能开始减弱，不能完全吸附模板多肽。当达到模板多肽的饱和吸附量时，MIP的吸附量大于NIP吸附量。计算印迹因子IF＝QMIP/QNIP，为2.93。
实施例9：单体比例吸附优化实验
改变预作用时加入的三个硅氧烷功能单体的比例(摩尔量)，继续合成单体比例的分子印迹聚合物微球。取0.05g干燥后的不同单体比例的印迹微球，加入4mL甲醇和1mL1mg/L的模板多肽溶液，常温下以400转/min的转速摇晃孵育0.5h。吸附液用0.22μm的滤膜过滤后进行超高效液相色谱质谱检测，计算吸附比例，所得数据汇总为制图为三角坐标图。
图12中，三角坐标图代表三个单体的百分比例，右侧颜色标尺代表吸附比例。图中的数据点的坐标为三角形三边平行线与坐标轴小数值的交点，颜色越红的位置说明该数据点所代表的三个硅氧烷功能单体比例合成的分子印迹微球对模板多肽的吸附量越大。图中上方的蓝色区域，说明S-V单体的含量在印迹过程中起辅助作用，S-M和S-V除了1:1:1的红色区域外，图中出现了几个红色较深的位置(1:1:3、3:1:3)，说明目标多肽虽然结构复杂，官能团较多，但三个不同官能团的硅氧烷功能单体可以提供不止一种效果较好的结合方式，显著提高吸附效果。
以上实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种用于检测登革热NS1蛋白的分子印迹聚合物微球及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu
1 5 10
Claims (3)
1.一种用于检测登革热NS1蛋白的分子印迹聚合物微球，其特征在于：包括二氧化硅微球以及覆盖在其表面的分子印迹聚合物层，所述分子印迹聚合物层具有由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽片段形成的空穴；
其中，所述分子印迹聚合物微球的制备方法包括以下步骤：
1)合成硅氧烷功能单体：分别将1mmol的甲基丙烯酸、1mmol的N-叔丁基丙烯酰胺、1mmol的4-乙烯基咪唑与1mmol的3-巯丙基三乙氧基硅烷和5mL的甲醇混合，加人三乙胺调节pH至8.0，60℃水浴反应6h，得到三种油状的硅氧烷功能单体S-M、S-T和S-V；
2)以所述多肽片段为模板，以甲醇为溶剂，配置1mg/L的多肽反应溶液，向5mL所述多肽反应溶液中加入所述硅氧烷功能单体S-M、S-T和S-V，一起混合预作用6小时，其中，S-M、S-T和S-V的摩尔比为1:1:1或1:1:3；
3)活化二氧化硅微球：将10g二氧化硅微球加入250mL浓度为8mol/L的盐酸中，110℃油浴回流反应8h，使二氧化硅微球表面的羟基活化，将产物以5000r/min离心5min分离，去掉上清液，沉淀加入去离子水超声10min，再次离心保留沉淀，重复上述过程至上清液pH＝7，将沉淀进行干燥；
4)进行二氧化硅微球表面印迹聚合反应：向0.2g活化后的二氧化硅微球加入35mL甲醇，超声10min混合均匀并脱气，加入所述硅氧烷功能单体和多肽片段已预作用的甲醇溶液共15mL和2.7mL TEOS作为交联剂，缓慢滴加1.8mL氨水，40℃水浴水解，反应结束后以5000r/min的转速离心分离，去掉上层液体，保留沉淀，加入1％v/v三氟乙酸甲醇溶液超声10min，以5000r/min的转速离心分离，沉淀再次加入无水乙醇，超声10min，并离心分离保留沉淀，交叉加入三氟乙酸甲酸溶液和无水乙醇，重复超声离心步骤至上次液体无法检测出多肽信号为止，沉淀于50℃干燥。
2.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物微球用于制备检测登革热NS1蛋白的试剂的用途。
3.一种试剂盒，其特征在于包括根据权利要求1所述的分子印迹聚合物微球。
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| "牛血清白蛋白表面印迹介孔纳米硅球的制备及应用";赵文革等;《第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会》;20150419;第P-084页 * |
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| Publication number | Publication date |
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| CN111944153A (zh) | 2020-11-17 |
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