CN112316492A - 可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法 - Google Patents

可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法 Download PDF

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张晨
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Abstract

本发明公开了一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法，本发明基于简单、快速的光引发聚合技术和惰性制孔技术，将具有高亲水性的单体、高比表面积的低聚倍硅氧烷交联剂及多种不同的抗真菌毒素核酸适配体，采用“一锅法”协同“巯基‑烯”点击化学反应，快速制备得到一种多功能核酸适配体亲和整体柱。该多功能亲和整体柱制备过程简单、反应迅速、耗时少，其固定相基质具有较高的亲水性，整体柱柱体结构稳定，修饰有多种真菌毒素核酸适配体，核酸适配体反应效率和活性高，有利于提高与目标物之间的特异选择识别，可用于实现多种不同理化性质真菌毒素的高特异性、高灵敏度分析、识别。

Description

可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体 柱及其制备方法
技术领域
本发明属于整体柱聚合材料制备领域，具体涉及一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法。
背景技术
真菌毒素是一类由丝状真菌在多种气候条件下产生的天然低分子量次级代谢产物，在自然界中分布极广，污染食品及农产品等，严重威胁到人类和动物健康。这些毒素中毒性最大的主要为霉菌类(如AFB1)、曲霉类(如OTA)以及镰刀菌类(如ZEN)，由于真菌毒素含量较低，普通方法难以准确测定，因此在分析真菌毒素前需要对样品进行一定的前处理，传统的前处理手段包括：液-液萃取、固相萃取及基质固相分散等，然而样品背景复杂，传统的前处理手段往往会将具有相似理化性质的物质同时提取，难以实现对痕量真菌毒素的特异性识别、分析。
亲和色谱是一种将亲和配体通过物理吸附或化学键合方式固载于基质固定相上，利用亲和配体与分析物之间不同程度的亲和相互作用力达到样品与其他干扰杂质分离的重要分离检测技术。亲和色谱分离检测技术已被广泛应用于在环境、食品和生物样品等复杂基质样品中痕量或超痕量目标物的富集、纯化和定量定性分析。核酸适配体是通过体外筛选合成技术(SELEX)从大容量的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一种短链DNA或RNA序列，可通过氢键、范德华力、碱基之间互补配对和静电作用等分子内的相互作用，折叠形成多种特定的三维空间结构，从而实现其与特定靶标进行高亲和力特异性结合。核酸适配体适用的目标范围广从小分子到大分子蛋白质、细胞乃至整个生物体，同时具有易合成修饰以及化学性质稳定、成本远低于抗体以及高特异性等优点，为发展快速、高效识别痕量真菌毒素检测技术提供了一个良好的契机，以核酸适配体代替抗体作为亲和配体用于分析检测方面的研究受到了高度的关注，并展示出了广阔的应用前景。
为了进一步提高毛细管整体柱对特定痕量目标的选择性保留行为，减少其他化学成分的干扰，将核酸适配体键合到整体柱固定相上制备核酸适配体亲和整体柱作为一种新型的高选择性的分离技术得到了快速的发展，被广泛应用于固相萃取、固相微萃取、液相色谱和毛细管电泳等领域。通过结合毛细管整体柱和核酸适配体的优势，利用亲和配体与待测靶标分析物之间的高亲和作用力，使得核酸适配体亲和整体柱在选择性识别、富集和纯化复杂样品中特定靶标分子中发挥了重要作用，可进一步用于实现复杂背景环境中痕量真菌毒素的高选择性识别、分析。
目前已见报道的核酸适配体亲和整体柱主要有：有机聚合亲和整体柱和硅胶杂化亲和整体柱，而有机整体柱制备往往包括一些疏水性单体，若固定相具有较强疏水性，与疏水性目标物会产生一定的非特异性吸附作用，从而降低选择性。硅胶杂化整体柱通过“溶胶-凝胶”反应引入极性硅氧烷制备而成，其可在一定程度上降低由于疏水作用导致的非特异吸附，但亲和整体柱固相基质暴露出大量的硅-羟基会又带来非特性吸附。另外，现有技术中大多以热聚合为主，并通过柱后修饰单一核酸适配体的方式(如：戊二醇法、纳米金法以及非化学键作用的联袂亲和素法等)来制备单一用途核酸适配体亲和整体柱，这导致核酸适配体亲和整体柱的制备过程繁琐、耗时较长，核酸适配体的利用率和活性也将受制备条件的影响波动较大从而进一步影响亲和整体柱在使用过程中的重现性。因此，如何快速制备出低非特异性、高特异性核酸适配体修饰的亲和整体柱越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱。其可以克服现有技术中存在的缺陷，可以对多种不同理化性质真菌毒素(如赭曲霉毒素A、黄曲霉素B1及玉米赤霉烯酮)的进行高特异性、高灵敏度分析、识别。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱，该亲和整体柱是将高亲水性有机聚合单体、多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂、和包含抗真菌霉毒素核酸适配体水溶液的三元制孔剂、及光引发剂，基于光引发聚合，采用“一锅法”协同“巯基-烯”点击化学反应而直接将多种抗真菌毒素核酸适配体功能化修饰到整体柱上得到的亲和整体柱。一光引发聚合反应具有反应速度快，节省聚合反应时间，反应高效且节约能源，反应可在室温下进行。通过快速的光引发聚合技术，采用“一锅法”同时引入多种核酸适配体，制备多功能核酸适配体亲和整体柱，可大大的提高核酸适配体亲和整体柱使用范围。
进一步地，所述高亲水性有机聚合单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体；所述多面体低聚倍半硅氧烷交联剂为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷；所述丙烯酸酯交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述光引发剂为安息香双甲醚。
进一步地，所述多种真菌毒素包括：赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1以及玉米赤霉烯酮；所述抗赭曲霉毒素A的核酸适配体碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTG GCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'；所述抗黄曲霉毒素B1的核酸适配体碱基序列为5′-SH-C6-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC-3′；所述抗玉米赤霉烯酮毒素的核酸适配体碱基序列为5′-SH-C6-TCA TCT ATC TAT GGT ACA TTA CTATCT GTA ATG TGA TAT-3′。
本发明还提供了上述可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，该制备方法简单，可快速得到可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱。其技术方案如下：
一种上述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其包括以下步骤：
S1：分别将多种不同抗真菌毒素的巯基修饰的核酸适配体在10000r/min的转速下离心10min后，加水稀释后置于90℃恒温水浴锅中加热3min退火处理，自然冷却至室温得溶液a，将30μL 5mmol/L的三(2-羧乙基)膦加入到20μL溶液a中，室温下摇床孵育1h，混合形成多种核酸适配体混合储备液1；
S2：将多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂、高亲水性有机聚合单体、光引发剂、致孔剂加入2mL离心管中振荡并稍加热，使其充分混匀，形成均一透明预聚溶液，取步骤S1得到的多种核酸适配体混合储备液1加入所述预聚溶液中，通过三元致孔剂溶解，室温下涡旋振荡10min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液2；
S3：将步骤S2得到的溶液2注入经烯基化硅烷试剂预处理好的透明石英毛细管中，两端密封后放入紫外交联仪内光照辐射反应7min，反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇水溶液将柱内填料中残留试剂清洗干净，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1；
S4：将pH为8.0的缓冲液通过高压输液泵通入步骤S3所制得的整体柱，于4℃环境中密封保存备用。
进一步地，步骤S2中加入2mL离心管中的多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂及高亲水性有机聚合单体的配比按质量百分数之和为100％计为：高亲水性有机聚合单体14.00％～14.50％、多面体低聚倍硅氧烷交联剂3.50％～4.00％、丙烯酸酯交联剂82.50％。
进一步地，所述三元致孔剂为N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇以及多种核酸适配体混合储备液1，其组成按质量分数计为：N,N-二甲基甲酰胺占84.25％～91.75％，聚乙二醇占4.25％，多种核酸适配体混合储备液1占4.00％～11.50％，以上各组分质量分数之和为100％。
更进一步地，所述多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂及高亲水性有机聚合单体的重量总和W1，N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇以及多种核酸适配体混合储备液1的重量总和W2，W1与W2的重量比为2:8。
进一步地，所述步骤S2中，光引发剂的用量为多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂及高亲水性有机聚合单体三者总量的1.0wt％；
所述多种核酸适配体混合储备液的摩尔总量为3.84～11.04nmol，优选为8.64nmol；
所述聚乙二醇的分子量为10000；
进一步地，所述烯基化硅烷试剂为甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基硅氧烷基)硅烷。
进一步地，步骤S4中所述缓冲液由10mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl、5mmol/LKCl和20mmol/L CaCl2组成。
采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：
1、本发明提供的亲和整体柱修饰有多种真菌毒素核酸适配体，可同时用于多种不同理化性质的真菌毒素(如赭曲霉毒素A、黄曲霉素B1及玉米赤霉烯酮)的高特异性、高灵敏度分析、识别，制备过程简单、反应迅速、耗时少。
2、本发明采用制备简单、快速的光引发聚合技术和惰性制孔技术代替传统的热引发聚合，引入高亲水性的单体、高比表面积的低聚倍硅氧烷交联剂及多种不同的抗真菌毒素核酸适配体，基于简单的“一锅法”协同高反应效率“巯基-烯”点击化学反应，快速制备得到一种多功能核酸适配体亲和整体柱。通过该方法制备得到多功能亲和整体柱的光引发聚合时间仅为7min，很大程度改善了核酸适配体亲和整体柱繁琐的制备过程，制备过程简单、反应迅速、耗时少，其固定相基质具有较高的亲水性，可降低疏水性非特异性吸附作用，整体柱柱体结构稳定，修饰有多种真菌毒素核酸适配体，改变传统亲和整体柱使用的单一性。另外，该制备方法核酸适配体反应效率高，可保证核酸适配体的活性，有利于提高与目标物之间的特异选择识别，可同时用于实现多种不同理化性质的真菌毒素(如赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)以及玉米赤霉烯酮(ZEN))的高特异性、高灵敏度分析、识别。
附图说明
图1为本发明提供的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的示例结构示意图。
图2为本发明提供的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的示例电镜形貌图，其中，图(a)和图(b)分别为放大倍数为700倍和1500倍核酸适配体亲和整体柱的截面扫描电镜图。
图3为本发明提供的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱连接高效液相色谱(HPLC-FLD)在线检测分析流程。
图4为不同整体柱对赭曲霉毒素A的识别情况对比图，左侧为空白对照柱识别情况，A1-A3分别表示空白对照柱富集液、清洗液及洗脱液的检测图谱；右侧为多功能核酸适配体亲和整体柱识别情况，B1-B3分别表示多功能核酸适配体亲和整体柱富集液、清洗液及洗脱液的检测图谱。峰位置1代表赭曲霉毒素A(检测浓度10ng/mL)。
图5为不同整体柱对黄曲霉毒素B1的识别情况对比图，左侧为空白对照柱识别情况，A1-A3分别表示空白对照柱富集液、清洗液及洗脱液的检测图谱；右侧为多功能核酸适配体亲和整体柱识别情况，B1-B3分别表示多功能核酸适配体亲和整体柱富集液、清洗液及洗脱液的检测图谱。峰位置2代表黄曲霉毒素B1(检测浓度10ng/mL)。
图6为不同整体柱对玉米赤霉烯酮的识别情况对比图，左侧为空白对照柱识别情况，A1-A3分别表示空白对照柱富集液、清洗液及洗脱液的检测图谱；右侧为多功能核酸适配体亲和整体柱识别情况，B1-B3分别表示多功能核酸适配体亲和整体柱富集液、清洗液及洗脱液的检测图谱。峰位置3代表玉米赤霉烯酮(检测浓度10ng/mL)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料和设备均为市售所得。
实施例1
一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，
其包含以下制备步骤：
1、多种核酸适配体混合储备液1的制备：
分别将多种不同抗真菌毒素的巯基(5'-SH)修饰的核酸适配体在10000r/min的转速下离心10min后，用移液器移取一定体积的水于离心管中，溶解制备形成1500μmol/L的核酸适配体水溶液母液，置于90℃恒温水浴锅中加热3min退火处理，自然冷却至室温得溶液a，取20μL的溶液a，向其中加入30μL 5mmol/L的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，室温下摇床孵育1h，混合形成200μmol/L浓度配比的多种核酸适配体混合储备液1；
具体的，本步骤中，所述多种真菌毒素可以是三种，具体为：赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)以及玉米赤霉烯酮(ZEN))，抗赭曲霉毒素A的核酸适配体碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'；抗黄曲霉毒素B1的核酸适配体碱基序列为5′-SH-C6-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCGCTA GGC CC-3′；抗玉米赤霉烯酮毒素的核酸适配体碱基序列为5′-SH-C6-TCA TCT ATCTAT GGT ACA TTA CTA TCT GTA ATG TGA TAT-3′。
2、多功能核酸适配体亲和整体柱的制备：
(1)将多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂、高亲水性有机聚合单体、光引发剂、致孔剂加入2mL离心管中振荡并稍加热，使其充分混匀，形成均一透明预聚溶液，取步骤1得到的多种核酸适配体混合储备液1加入所述预聚溶液中，通过三元致孔剂溶解，室温下涡旋振荡10min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液2；
具体的，本步骤中，多面体低聚倍硅氧烷交联试剂可以为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)；丙烯酸酯交联剂可以为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)；高亲水性有机聚合单体可以为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体(AMPS)；光引发剂可以为安息香双甲醚(DMPA)。
本步骤的优选过程如下：按照表1中的配方称取甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)交联剂、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)交联剂、高亲水性有机聚合单体2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)，致孔剂聚乙二醇(PEG-10000)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)以及光引发剂安息香双甲醚(DMPA)于2mL离心管中振荡并稍加热，使其充分混匀，形成均一透明预聚溶液，取适量多种核酸适配体混合储备液1于上述透明预聚液中，通过三元致孔剂溶解(这里的三元致孔剂包含聚乙二醇(PEG-10000)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和多种核酸适配体混合储备液1，三元致孔剂作用之一是将单体(包括POSS-MA、EDMA及AMPS)和固定制孔剂(包括聚乙二醇(PEG-10000)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF))溶解，作用之二就是聚合物形成以后，可用冲洗液将致孔剂冲出，形成多空聚合骨架结构)，于室温下涡旋振荡10min，超声脱气20min，使其形成均一的溶液2；
表1多功能核酸适配体亲和整体柱的组分含量表
Figure BDA0002737012220000081
备注：a:单体和交联剂之和:三元致孔剂(wt/wt)＝20％:80％；
b:PEG为分子量MW＝10000的聚乙二醇；
c:Water(containing aptamer)为浓度为200μmol/L的多种核酸适配体混合储备液1。
(2)：将得到的溶液2注入经烯基化硅烷试剂预处理好的透明石英毛细管柱中(100μm i.d.×360μm o.d.)，两端用硅胶塞密封，放入紫外交联仪内光照辐射反应7min，反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇水溶液将柱内填料中残留试剂清洗干净，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1；
具体的，本步骤中，毛细管柱预处理的具体过程包含以下步骤：
a:将透明石英毛细管空柱依次采用0.1mol/L的HCl溶液冲洗30min、二次水通至中性、0.1mol/L的NaOH溶液冲洗180min、二次水通至中性、甲醇溶液冲洗30min，然后在室温环境(25℃)氮气吹干备用；
b:配制硅烷化试剂溶液，具体实施为甲醇/甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基硅氧烷基)(体积比v/v＝1:1)，将硅烷化试剂溶液注入步骤1中得到的透明石英毛细管中，两端用橡胶塞密封后至于60℃恒温水浴中反应24h，再采用甲醇溶液冲洗30min后在70℃、0.4MPa条件下氮气吹3h，制得预处理毛细管柱。
容易理解的是，毛细管柱预处理，可以在步骤1之前，也可以在步骤1之后，步骤2的第二个小步骤(2)之前，由于其预处理过程大于24小时，所以优选放在步骤1之前进行。
(3)将pH 8.0的缓冲液通过高压输液泵通入步骤(2)所制得的整体柱中，置于4℃环境中密封保存备用。所述缓冲液由10mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl、5mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
图1示出了本发明提供的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱结构示意图；图2示出了本发明提供的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的示例电镜形貌图，其中，图(a)和图(b)分别为放大倍数为700倍和1500倍核酸适配体亲和整体柱的截面扫描电镜图。从扫面电镜图(如图1所示)可以看出，所制备的用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱柱体结构完整、均匀，填料与柱壁结合紧密，柱体结构稳定。
实施例2
本实施例选用实施例1中表1内配方2分别制备不修饰抗真菌毒素核酸适配体的空白对照柱和修饰核酸适配体的多功能亲和整体柱连接高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)分别进行平衡、富集、清洗和洗脱，检测分析流程如图3所示，其具体步骤如下：
(1)平衡过程：将不修饰抗真菌毒素核酸适配体的空白对照柱和修饰多种抗真菌毒素(包括赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)以及、玉米赤霉烯酮(ZEN))核酸适配体的亲和整体柱分别用结合缓冲液平衡。所述的结合缓冲液包含10mM(即mmol/L)Tris-HCl(pH 8.0)，120mM NaCl，5mM KCl，20mM CaCl2；平衡背压为500psi反压阀，流速0.02mL/min，平衡30min；
(2)富集过程：分别注入20L 10ng/mL待测真菌毒素样品溶液(包括赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)以及玉米赤霉烯酮(ZEN))，在空白对照柱和修饰多种抗真菌毒素核酸适配体的亲和整体柱富集30min。富集过程背压为500psi反压阀，流速0.02mL/min。收集富集液，待测。
(3)清洗过程：用结合缓冲液清洗空白对照柱和修饰多种抗真菌毒素核酸适配体的亲和整体柱，清洗过程背压为1000psi反压阀，流速0.5mL/min，一定体积清洗后，收集清洗液，待测。
(4)洗脱过程：采用30％ACN:70％TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，2.5mM EDTA)作为洗脱剂将真菌毒素(OTA、AFB1或ZEN)从空白对照柱和修饰多种抗真菌毒素核酸适配体的亲和整体柱上洗脱下来，收集洗脱液待测，洗脱过程背压为500psi反压阀，流速0.1mL/min。
(5)检测过程：分别将上述各过程收集的富集液、清洗液和洗脱液连接HPLC-RF-20A进行真菌毒素检测。检测OTA条件：流动相：2％乙酸水:乙腈＝38:62，Ex＝333nm，Em＝460nm，1mL/min，检测结果如图4；检测AFB1条件：流动相：2％乙酸水:乙腈＝38:62，Ex＝350nm，Em＝455nm，1mL/min，检测结果如图5；检测ZEN条件：流动相：水:乙腈:甲醇＝30:60:10，Ex＝274nm，Em＝440nm，1mL/min，检测结果如图6。
由图4-图6可知：不修饰抗真菌毒素核酸适配体的空白对照柱的富集液及清洗液中分别检测到真菌毒素(OTA、AFB1及ZEN)，而采用洗脱剂洗脱后，在洗脱液中三种真菌毒素均未检出，空白对照柱对三种真菌毒素未见有效保留；而亲和整体柱的富集液及清洗液中均未检测到三种真菌毒素(OTA、AFB1及ZEN)，而洗脱液中分别检测到真菌毒素(OTA、AFB1及ZEN)，证明本发明提供一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱，能够实现对三种不同理化性质的真菌毒素(OTA、AFB1及ZEN)高特异性、高灵敏度分析、识别，并具有制备简单，快速，反应效率高等有点，极大程度上扩大了核酸适配体亲和整体柱的用途。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述亲和整体柱是将高亲水性有机聚合单体、多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂、和包含抗真菌霉毒素核酸适配体水溶液的三元制孔剂、及光引发剂，基于光引发聚合，采用“一锅法”协同“巯基-烯”点击化学反应而直接将多种抗真菌毒素核酸适配体功能化修饰到整体柱上得到的亲和整体柱。
2.根据权利要求1所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述高亲水性有机聚合单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体；所述多面体低聚倍半硅氧烷交联剂为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷；所述丙烯酸酯交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述光引发剂为安息香双甲醚。
3.根据权利要求1所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱，其特征在于：所述多种真菌毒素包括：赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1以及玉米赤霉烯酮；所述抗赭曲霉毒素A的核酸适配体碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CAT CGG ACA-3'；所述抗黄曲霉毒素B1的核酸适配体碱基序列为5′-SH-C6-GTTGGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC-3′；所述抗玉米赤霉烯酮毒素的核酸适配体碱基序列为5′-SH-C6-TCA TCT ATC TAT GGT ACA TTA CTA TCTGTA ATG TGA TAT-3′。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：分别将多种不同抗真菌毒素的巯基修饰的核酸适配体在10000r/min的转速下离心10min后，加水稀释后置于90℃恒温水浴锅中加热3min退火处理，自然冷却至室温得溶液a，将30μL 5mmol/L的三(2-羧乙基)膦加入到20μL溶液a中，室温下摇床孵育1h，混合形成多种核酸适配体混合储备液1；
S2：将多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂、高亲水性有机聚合单体、光引发剂、致孔剂加入2mL离心管中振荡并稍加热，使其充分混匀，形成均一透明预聚溶液，取步骤S1得到的多种核酸适配体混合储备液1加入所述预聚溶液中，通过三元致孔剂溶解，室温下涡旋振荡10min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液2；
S3：将步骤S2得到的溶液2注入经烯基化硅烷试剂预处理好的透明石英毛细管中，两端密封后放入紫外交联仪内光照辐射反应7min，反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇水溶液将柱内填料中残留试剂清洗干净，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1；
S4：将pH为8.0的缓冲液通过高压输液泵通入步骤S3所制得的整体柱，于4℃环境中密封保存备用。
5.根据权利要求4所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：步骤S2中加入2mL离心管中的多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂及高亲水性有机聚合单体的配比按质量百分数之和为100％计为：高亲水性有机聚合单体14.00％～14.50％、多面体低聚倍硅氧烷POSS试剂3.50％～4.00％、丙烯酸酯交联剂82.50％。
6.根据权利要求4所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述三元致孔剂为N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇以及多种核酸适配体混合储备液1，其组成按质量分数计为：N,N-二甲基甲酰胺占84.25％～91.75％，聚乙二醇占4.25％，多种核酸适配体混合储备液1占4.00％～11.50％，以上各组分质量分数之和为100％。
7.根据权利要求4所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，光引发剂的用量为多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂及高亲水性有机聚合单体三者总量的1.0wt％；所述多种核酸适配体混合储备液1的摩尔总量为8.64nmol；所述聚乙二醇的分子量为10000。
8.根据权利要求6所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述多面体低聚倍半硅氧烷交联剂、丙烯酸酯交联剂及高亲水性有机聚合单体的重量总和W1，N,N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇以及多种核酸适配体混合储备液1的重量总和W2，W1与W2的重量比为2:8。
9.根据权利要求4所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述烯基化硅烷试剂为甲基丙烯酰氧丙基三(三甲基硅氧烷基)硅烷。
10.根据权利要求4所述的可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱的制备方法，其特征在于：步骤S4中所述缓冲液由10mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、5mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114121154A (zh) * 2021-10-18 2022-03-01 江南大学 一种利用分子设计导向提高适配体特异性和亲和力的方法
CN115990355A (zh) * 2022-10-13 2023-04-21 福州大学 一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法
CN116440874A (zh) * 2023-04-25 2023-07-18 北京市农林科学院 一种基于核酸适配体功能化磁性疏水聚合物的交链孢酚吸附剂及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110115992A (zh) * 2019-06-06 2019-08-13 福州大学 一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法
CN110215737A (zh) * 2019-06-13 2019-09-10 厦门华厦学院 一种基于石墨烯-纳米金复合界面超高负载核酸适配体的亲和整体柱及其制备方法
CN110605104A (zh) * 2019-08-08 2019-12-24 福州大学 特异性识别赭曲霉毒素a的核酸适配体-印迹整体柱及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110115992A (zh) * 2019-06-06 2019-08-13 福州大学 一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法
CN110215737A (zh) * 2019-06-13 2019-09-10 厦门华厦学院 一种基于石墨烯-纳米金复合界面超高负载核酸适配体的亲和整体柱及其制备方法
CN110605104A (zh) * 2019-08-08 2019-12-24 福州大学 特异性识别赭曲霉毒素a的核酸适配体-印迹整体柱及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114121154A (zh) * 2021-10-18 2022-03-01 江南大学 一种利用分子设计导向提高适配体特异性和亲和力的方法
CN115990355A (zh) * 2022-10-13 2023-04-21 福州大学 一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法
CN116440874A (zh) * 2023-04-25 2023-07-18 北京市农林科学院 一种基于核酸适配体功能化磁性疏水聚合物的交链孢酚吸附剂及其应用

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