CN111679068B - 一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法,具体涉及纳米材料、生物催化及分析化学技术领域。本发明以铂纳米材料代替天然酶作为标记物,采用分子印迹技术与纳米酶相结合实现对组胺的高灵敏检测。本发明操作简单,方法稳定,选择性高,对其他生物胺类(酪胺、色胺)无明显响应,适用于食品中组胺的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及组胺的检测方法,特别是涉及一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法,属于食品安全检测技术领域。
背景技术
组胺(Histamine,HA)又名组织胺,它是在微生物和组氨酸脱羧酶共同作用下,由蛋白质降解产生的组氨酸发生脱羧作用而产生的,广泛存在于各种食品及生物体中,尤其是发酵食品(如:大豆发酵制品、酸奶、啤酒等)中。人食用含有高水平组织胺的食物后可能会导致类似过敏的食物中毒。组胺过敏不仅会导致局部或全身毛细管扩张,使毛细管壁的通透性增加,从而诱发高血压。还会引发支气管收缩,使人体产生胸闷。过敏症状表现为头痛、恶心、呼吸紊乱等,严重时甚至危及生命。
过量的组胺给人体健康构成了潜在威胁,对我国产品出口也带来了挑战。目前,针对组胺含量的检测方法主要包括:高效液相色谱法、荧光分光光度法与质谱联用等。这些方法既繁琐又耗时,所用的检测设备价格昂贵,不适用于现场快速检测需求。
酶联免疫分析法是一种广泛用于检测组胺的方法,但由于传统生物抗体制备困难、成本高,使得其应用受到了限制。分子印迹聚合物由于其稳定性好、特异性强等优点,可作为仿生抗体代替传统生物抗体应用于免疫分析。但传统的聚合方法存在位点包埋等现象,对目标物吸附能力和洗脱效果差。此外,传统酶易失活,在环境中不稳定,而且传统酶通常是大分子物质,与目标物连接后限制其接近聚合物的结合位点,对其使用造成极大限制。
发明内容
针对上述现有技术所存在的问题,本发明的目的是提供一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法。本发明以Pt@SiO2纳米材料代替天然酶标记抗原,以多孔芳香骨架材料(PAF-45)为支持载体的分子印迹聚合物作为仿生抗体,实现了对组胺的灵敏检测;而且本发明样品分析时间短、操作简单,方法稳定,适用于食品中组胺的快速检测。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法,包括以下步骤:
(1)采用Pt@SiO2纳米材料标记抗原,以PAF-45为支持载体的分子印迹聚合物作为仿生抗体,将Pt@SiO2纳米材料标记抗原、仿生抗体和系列浓度梯度的组胺标样溶液混合,室温竞争反应30-50min,取上清液,加入TMB底物溶液进行显色反应,用酶标仪在450nm波长下读取紫外吸收值,计算抑制率;以组胺标样溶液浓度对数值为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制标准曲线;
(2)利用步骤(1)绘制的工作曲线对经前处理的待测物中的组胺含量进行检测。
优选的,步骤(1)中,所述Pt@SiO2纳米材料标记抗原具体如下:
将Pt@SiO2材料和戊二醛混合0.5~1h;加入组胺溶液,继续反应3~5h,反应结束后,离心分离,洗涤,得到Pt@SiO2纳米材料标记抗原。
更优选的,所述Pt@SiO2材料由如下方法制备而成:
将H2PtCl6·6H2O水溶液、聚乙烯吡咯烷酮和乙醇混合,在100℃下加热回流2-4h,冷却,制备得到PtNPs;
向制备的PtNPs中加入氨水作为催化剂,滴加四乙氧基硅烷并持续搅拌分散,在室温下反应1-3h,离心分离得到Pt@SiO2纳米颗粒,乙醇洗涤,去除多余的四乙氧基硅烷和氨水;将Pt@SiO2纳米颗粒分散在乙醇中,滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷,反应3-5h,离心收集,乙醇洗涤,即制备得到Pt@SiO2材料。
优选的,步骤(1)中,所述以PAF-45为支持载体的分子印迹聚合物由如下方法制备而成:
将模板分子组胺二盐酸盐溶于二甲基亚砜中,加入甲基丙烯酸,进行预聚合反应,再加入PAF-45材料、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈,搅拌均匀,得到混合溶液;超声脱气,在氮气环境下,水浴反应14~18h,反应结束后用甲醇-冰乙酸溶液索氏提取除去模板分子,得到分子印迹聚合物。
更优选的,所述模板分子组胺二盐酸盐、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和PAF-45材料加入的质量比为1:1.4:3.23:0.43~1.00。
更优选的,预聚合反应的时间是30min。
更优选的,所述PAF-45材料由如下方法制备而成:
将6g氯化铝和100mL的CHCl3混合剧烈搅拌6h,然后80℃加热30min;随后加入40mL含有800mg联苯的CHCl3溶液,持续加热40min后,将温度调至70℃,继续加热搅拌40min,冷却后过滤得到紫黑色粗品;然后,用50%的乙醇和50%的盐酸反复洗涤产物,去除剩余的联苯和AlCl3,最后用水冲洗至中性,将其置于60℃的真空环境中过夜,即制备得到PAF-45材料。
优选的,步骤(1)中,所述组胺标样溶液由乙醇配成而成,其梯度浓度分别为:0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L、60mg/L和300mg/L。
优选的,步骤(2)中,所述前处理具体为:
向待测物中加入三氯乙酸溶液涡旋离心,重复提取2-4次,合并提取液,加入NaCl饱和后,用NaOH调节pH至12,用等比例的正丁醇-氯仿进行萃取,合并萃取液,40℃下氮气吹干,用5mL乙醇溶解残余物,0.22μm滤膜过滤。
更优选的,所述待测物与三氯乙酸溶液加入量的比为5g:(10-20)mL。
本发明的有益效果:
(1)本发明以Pt高活性纳米酶标记组胺作为标记物,用其内在的过氧化物酶样活性,催化TMB底物发生显色反应,代替传统天然酶,弥补天然酶体积大,易失活的缺点。利用PAF-45材料自身比表面积大、稳定性高、孔道结构好的特点作为聚合物的载体材料,提供更多的结合位点,方便目标物吸附和洗脱。采用本发明的纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析方法对组胺的最低检出限为0.128mg/L,能够满足实际样品检测需要。
(2)本发明的仿生免疫分析方法具有良好的稳定性,制备方法简单,分析时间短,在食品中的组胺含量测定中具有广泛的应用。
本发明与现有其他方法检测组胺的比较:
附图说明
图1:组胺标准曲线。
由图1可知,该方法对组胺最低检出限为0.128mg/L。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中所提及的“室温”是指温度为15-30℃。
正如背景技术部分所介绍的,目前针对组胺的检测方法主要是高效液相色谱法、荧光分光光度法与质谱联用等,这些方法既繁琐又耗时,所用的检测设备价格昂贵,不适用于现场快速检测需求。因此,研发快速、准确、稳定的组胺检测方法具有重要意义。
分子印迹技术是将某种特定的物质当作模板分子,也即是待检测物质,选取某种合适的材料作为功能单体。将模板分子和功能单体放入某种溶剂中并在一定的聚合条件下进行聚合,此时功能单体和模板分子会通过共价键或非共价键的形式形成预组装复合物,再加上引发剂和交联剂的作用就能够固定住这种预组装物的结构而形成一种稳定的聚合物。之后将聚合物中的模板分子洗脱出来,该聚合物就会出现一个特异吸附该种模板分子的空腔,这种具有空腔的聚合物就被称作是分子印迹聚合物。将分子印迹聚合物作为仿生抗体代替传统生物抗体建立仿生免疫分析方法,通过免疫分析方法就能快速的对目标物质进行特异性检测。
但是,采用传统聚合方法制备的分子印迹聚合物是高度交联的聚合物网络,对模板分子包埋过深、过紧,洗脱比较困难;印迹位点分布不均一,位于印迹聚合物孔道壁上的,模板分子向其传质速率较快,而包埋于聚合物本体中的印迹空穴,受位阻影响,可接近性差,从而降低了印迹位点的利用率。这些问题制约了分子印迹技术在食品安全检测中的应用。
多孔芳香骨架材料(PAF)是一种重要的全芳香性单元骨架材料,PAF-45是其中的一种多孔芳香骨架材料,具有较高的比表面积。目前,PAF-45材料主要应用于气体分离和水体中有害化学物质的吸附。还未见有利用PAF-45作为支持载体制备分子印迹聚合物的相关报道。
基于此,为实现快速、准确检测组胺含量,本发明是以Pt@SiO2纳米酶作为标记,代替易失活的天然酶。该纳米酶具有良好的催化活性,且以PAF-45材料作为分子印迹聚合物的载体,提供更多的结合位点,避免位点包埋现象,达到吸附时间短、吸附量大的效果。采用本发明的方法对组胺的最低检出限达0.128mg/L,实现了对组胺的高效检测。
本发明是以铂纳米酶标记组胺和PAF-45材料作为载体的分子印迹聚合物作为仿生抗体的主要组成成分,建立了纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺的方法。
在本发明的一种实施方案中,给出了纳米酶标记抗原的制备方法,包括如下步骤:
将氯铂酸溶液与聚乙烯吡咯烷酮混合在乙醇溶液中,在100℃条件下加热回流3~4h,待冷却后,将成品放入4℃避光保存;
在Pt NPs溶液加入氨水作为催化剂,滴加硅酸四乙酯,在室温条件下反应2~4h,得到包覆二氧化硅的Pt@SiO2;
对得到的Pt@SiO2进行多次洗涤,除去过剩的硅酸四乙酯,然后在室温条件下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷,反应3~6h,反应结束后,多次洗涤,得到修饰后的Pt@SiO2纳米酶;
将氨基化的Pt@SiO2材料和戊二醛混合0.5~1h;加入组胺溶液进行标记,反应结束后,离心分离,对反应物洗涤三次,得到Pt@SiO2@HA。
本发明所制备的纳米酶标记抗原中,铂纳米粒子具有较高的催化活性,SiO2作为壳结构,可以使铂纳米粒子具有良好的分散性,不易聚集,还提供了较大的比表面积和易修饰的识别位点,便于与抗原进行连接。
在本发明的另一实施方案中,给出了PAF-45材料的制备方法和分子印迹聚合物的制备方法,包括以下步骤:
PAF-45材料的合成:将氯化铝(AlCl3)和CHCl3在250mL圆底烧瓶中混合剧烈搅拌4~6h,然后在80℃下加热。随后将含有800mg联苯的CHCl3溶液加入烧瓶中。持续加热一段时间,降低温度,继续加热搅拌,冷却后过滤得到紫黑色粗品。然后,用50%的乙醇和50%的盐酸反复洗涤产物,去除剩余的联苯和AlCl3。最后用水冲洗至中性,将其置于60℃的真空干燥过夜。
本发明所采用的PAF-45材料具备良好的孔结构、热稳定和化学稳定性好、高比表面积的特点,提供更多的结合位点,避免位点包埋现象。
采用表面印迹聚合法制备了分子印迹聚合物:
将组胺二盐酸盐溶于二甲基亚砜混合溶液中,加入甲基丙烯酸,先进行预聚合过程,再加入PAF-45材料、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈,搅拌均匀,得到混合溶液;超声脱气,在氮气环境下,水浴反应14~18h,反应结束后用甲醇-冰乙酸溶液索氏提取除去模板分子,得到分子印迹聚合物。
本发明首次将PAF-45材料作为支持载体用于分子印迹聚合物的制备,以提高所制备聚合物的吸附性能,进而提高仿生免疫分析方法的灵敏度。
为了在PAF-45材料表面制备均一性良好的分子印迹聚合物,本发明首先对模板分子组胺二盐酸盐、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和PAF-45材料的比例进行了系统优化,结果发现:模板分子组胺二盐酸盐、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和PAF-45材料加入的质量比为1:1.4:3.23:0.43~1.00时,能够使整个体系达到最佳的状态。
对于本发明的分子印迹聚合物的制备而言,各原料的加入顺序非常关键,对制备的分子印迹聚合物的形貌有重要的影响。具体来说:在PAF-45材料加入之前,先将模板分子和功能单体进行预聚合,使模板分子和功能单体之间充分结合,以提高所制备聚合物的选择吸附性能。如果先加入PAF-45材料再加入甲基丙烯酸,将会大大影响模板分子与功能单体之间的结合,进而影响聚合物的选择吸附性能。
综上,本发明以铂纳米材料代替天然酶作为标记物,以PAF-45材料作为支持载体制备的分子印迹聚合物作为仿生抗体,采用分子印迹技术与纳米酶相结合实现对组胺的高灵敏检测。
而且,本发明的检测方法选择性高,对其他生物胺类(酪胺、色胺)无明显响应。
我们对组胺的结构类似物酪胺和色胺进行交叉反应实验,结果如下:
表1:本方法对三种生物胺的交叉反应率
由表1可知,该方法选择性较高,对组胺的结构类似物酪胺和色胺的交叉反应率明显低于组胺。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
实施例1:
1.Pt@SiO2@HA的合成:
(1)将1.55mL H2PtCl6·6H2O水溶液(38.6mM)、6.66mg聚乙烯吡咯烷酮PVP和81mL乙醇加入圆底烧瓶中混合。将上述混合物在100℃下加热回流3h,制备得到PtNPs。待冷却后,将成品放入4℃的暗处保存。
(2)Pt NPs修饰:将20mL的PtNPs分散在50mL的圆底烧瓶中。加入100μL氨水作为催化剂。滴加200μL四乙氧基硅烷并持续搅拌分散。反应物溶液在室温下反应2h。通过离心分离得到Pt@SiO2纳米颗粒,用乙醇反复洗3次,去除多余的四乙氧基硅烷和氨水。将Pt@SiO2纳米颗粒分散在10mL乙醇中。然后滴加200μL3-氨基丙基三乙氧基硅烷,反应4h。经离心收集,用乙醇反复洗3次。最后,加入1mL戊二醛(30%),连续搅拌1h。将上述溶液加入组胺溶液10mL(0.45M),反应4h后离心,用乙醇洗3次,分散到50mL乙醇中备用。
2.PAF-45材料的合成:
将6g氯化铝和100mL的CHCl3在250mL圆底烧瓶中混合剧烈搅拌6h,然后80℃加热30min。随后将40mL含有800mg联苯的CHCl3溶液加入烧瓶中。持续加热40min后,将温度调至70℃,继续加热搅拌40min,冷却后过滤得到紫黑色粗品。然后,用50%的乙醇和50%的盐酸(1M)反复洗涤产物,去除剩余的联苯和AlCl3。最后用水冲洗至中性,将其置于60℃的真空环境中过夜。
3.分子印迹聚合物的制备:
采用表面印迹聚合法制备了分子印迹聚合物。以组胺二盐酸盐(1mmol)为模板分子,溶于4mL的二甲基亚砜中,将3mmol甲基丙烯酸加入上述溶液中。搅拌30min后,加入80mg的PAF-45材料。搅拌60min后加入20mg偶氮二异丁腈和3mmol二甲基丙烯酸乙二醇酯。30min后,超声脱气和充氮,60℃水浴加热18h。聚合物60℃真空干燥12h后,用甲醇溶液/冰乙酸(9:1,v/v)索氏提取18h,甲醇洗脱6h。最后真空干燥60℃过夜得到印迹聚合物。
4.纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测组胺,具体如下:
(1)将5mg分子印迹聚合物放入玻璃管中,并标记序号1-8。1号管设为空白组,只添加5mL的乙醇;2号管设为对照组,加入5mL的纳米酶标记组胺溶液和5mL的乙醇;第3~8号管,分别加入5mL(0.1-300mg/L)的组胺标准溶液和5mL的纳米酶标记组胺溶液;室温竞争反应40min。离心后取100uL上清液,加入TMB底物溶液进行显色反应,用酶标仪在450nm波长读取紫外吸收值,计算抑制率;以组胺标样浓度对数值为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制标准曲线。抑制率计算公式如下:
%CR=(1-A/Ao)×100
其中,A表示标准液或样液的平均吸光度;Ao表示对照孔的平均吸光度。
其中,用乙醇配制组胺标准溶液,梯度浓度分别为0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L、60mg/L和300mg/L。
(2)准确称取风干虾5±0.05g,加入10mL三氯乙酸溶液涡旋离心,重复提取两次,合并提取液,加入NaCl饱和后,用NaOH调节pH至12,取5mL处理液加入5mL正丁醇-氯仿等比例溶液漩涡震荡,离心,重复三次,合并萃取液,40℃下氮气吹干。用5mL乙醇溶解残余物,0.22μm滤膜过滤得样品提取液。
(3)将样品提取液代替标样稀释液,重复步骤4操作,根据标准曲线计算出风干虾中组胺含量为18.2mg/kg。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种纳米酶标记直接竞争仿生免疫分析检测风干虾中组胺的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采用Pt@SiO2纳米材料标记抗原,以PAF-45为支持载体的分子印迹聚合物作为仿生抗体,将Pt@SiO2纳米材料标记抗原、仿生抗体和系列浓度梯度的组胺标样溶液混合,室温竞争反应30-50min,取上清液,加入TMB底物溶液进行显色反应,用酶标仪在450nm波长下读取紫外吸收值,计算抑制率;以组胺标样溶液浓度对数值为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制标准曲线;
(2)利用步骤(1)绘制的工作曲线对经前处理的待测物中的组胺含量进行检测;
步骤(1)中,所述以PAF-45为支持载体的分子印迹聚合物由如下方法制备而成:
将模板分子组胺二盐酸盐溶于二甲基亚砜中,加入甲基丙烯酸,进行预聚合反应,预聚合反应的时间是30min;再加入PAF-45材料、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈,搅拌均匀,得到混合溶液;超声脱气,在氮气环境下,水浴反应14~18h,反应结束后用甲醇-冰乙酸溶液索氏提取除去模板分子,得到分子印迹聚合物;
所述模板分子组胺二盐酸盐、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和PAF-45材料加入的质量比为1:1.4:3.23:0.43~1.00;
所述PAF-45材料由如下方法合成:
将6g氯化铝和100mL的CHCl3在250mL圆底烧瓶中混合剧烈搅拌6h,然后80℃加热30min;随后将40mL含有800mg联苯的CHCl3溶液加入烧瓶中;持续加热40min后,将温度调至70℃,继续加热搅拌40min,冷却后过滤得到紫黑色粗品;然后,用50%的乙醇和50%的盐酸反复洗涤产物,去除剩余的联苯和AlCl3;最后用水冲洗至中性,将其置于60℃的真空环境中过夜;
步骤(1)中,所述Pt@SiO2纳米材料标记抗原由如下方法制备而成:
以PVP作为Pt@SiO2纳米酶合成的稳定剂,将氯铂酸溶液与聚乙烯吡咯烷酮混合在乙醇溶液中,在100℃条件下加热回流3~4h,待冷却后,将成品放入4℃避光保存;
在Pt NPs溶液加入氨水作为催化剂,滴加硅酸四乙酯,在室温条件下反应2~4h,得到包覆二氧化硅的Pt@SiO2;
对得到的Pt@SiO2进行多次洗涤,除去过剩的硅酸四乙酯,然后在室温条件下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷,反应3~6h,反应结束后,多次洗涤,得到修饰后的Pt@SiO2纳米酶;
将氨基化的Pt@SiO2材料和戊二醛混合0.5~1h;加入组胺溶液进行标记,反应结束后,离心分离,对反应物洗涤三次,得到Pt@SiO2@HA;
步骤(2)中,所述前处理具体为:
向待测物中加入三氯乙酸溶液涡旋离心,重复提取2-4次,合并提取液,加入NaCl饱和后,用NaOH调节pH至12,用等比例的正丁醇-氯仿进行萃取,合并萃取液,40℃下氮气吹干,用5mL乙醇溶解残余物,0.22μm滤膜过滤;
所述待测物与三氯乙酸溶液加入量的比为5g:(10-20)mL。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述组胺标样溶液由乙醇配成而成,其梯度浓度分别为:0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L、60mg/L和300mg/L。
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