CN107515295B

CN107515295B - 一种检测环境中真菌毒素的方法

Info

Publication number: CN107515295B
Application number: CN201710967376.3A
Authority: CN
Inventors: 黄大伟; 秦品珠; 徐子昊; 马倩慧; 邴永鑫; 洪伟; 崔恺; 郑文丽; 张政科; 于晓巍
Original assignee: South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Current assignee: South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2037-10-17
Also published as: CN107515295A

Abstract

本发明公开了一种检测环境中真菌毒素的方法，包括：荧光染料标记aptamer识别探针，aptamer与待测真菌毒素配体特异结合，制备纳米颗粒修饰的捕获探针，未反应的aptamer探针与磁性纳米颗粒修饰的探针发生杂交反应；磁性分离，测定上清液中荧光信号强弱判断与aptamer结合的真菌毒素的量；对磁性分离后的杂交体，进行解链，水洗，再磁性分离，实现磁性纳米颗粒标记探针的再生。本发明的方法，整个检测过程时间短，操作步骤简单快捷，具体反应步骤没有用到大型仪器，较易于推广。可重复利用，节约资源，同时省去制备捕获探针的步骤，使得检测更加快捷简单，检测限低，特异性好，具有很好的实用性。

Description

一种检测环境中真菌毒素的方法

技术领域

本发明涉及真菌毒素检测技术领域，具体涉及一种检测环境中真菌毒素的方法。

背景技术

真菌毒素是特定的真菌或者霉菌产生的毒性次级代谢产物，可致癌、致畸、致突变，也可造成中毒性肾损害、肝细胞毒性、免疫抑制等，给人类的健康造成极大的威胁。目前真菌毒素的分析方法主要有薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)、高效液相色谱-荧光检测发(HPLC-FLD)、毛细管电泳法(CE)、免疫分析法等。色谱分析法灵敏度高，但是操作复杂、仪器昂贵，且需要专业人员实施，不能满足现场快速检测的需求。用于现场快速检测的方法主要为免疫分析法包括：胶体金快捷型(直接法)、胶体金精准型(萃取复溶法)及酶联免疫试剂盒Elisa，前两者只能定性分析，酶联免疫试剂盒操作相对复杂，检测样品范围较窄，不适合基层现场检测。而且基于免疫技术的方法抗体制备成本高，容易受到pH值、温度等环境因素的影响，也限制了其发展和应用。

分子生物学及分子遗传学的发展，使人们对真菌霉素的检测也从生化、免疫方法转向基因水平的检测。核酸适配体(aptamer)是近几年来通过体外筛选技术(指数富集的配体系统进化技术，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。Aptamer与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构：如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G-四分体(G-quartet)等。Aptamer可以通过范德华力、氢键作用、静电作用和形状匹配等各种相互作用与配体产生高特异性的结合力。Apatamer比蛋白质体积小、合成容易、稳定性更好，且拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，成为近年来国内外研究者的热点，已在食品安全检测、环境检测、新药研发、临床诊断及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。基于apatmer技术的真菌毒素检测也有了应用突破，目前研究者已经成功筛选了赭曲霉素A(OTA)、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、伏马菌素B1、玉米赤霉烯酮等真菌毒素的适配体序列。利用aptamer与配体的适应性识别的特性可以应用于真菌毒素检测前的前处理，该净化方法可有效地避免使用大量有机溶剂、排除其它物质干扰，再生时间短可以多次反复使用。基于aptamer技术和各种新型材料相结合的光化学、电化学真菌毒素的分析技术不断出现：如基于“Signal-off”、“Signal-on”模式的传感器用来检测食品中的真菌毒素，但是电化学传感器容易受到电流、电压信号的影响。

如何采用更好的方法或较为简单的仪器进行高灵敏度检测是目前研究的热门课题，荧光标记法是常用的方法，由于其背景低、检测灵敏度高，使基于该检测方法的aptamer也成为分子识别的研究重点。出现了基于适配体结构开关的生物荧光传感器、免疫标记分子信标荧光生物传感器等。

磁性纳米粒子由于生物相容性好、超顺磁性、毒性小、易制备等优点，广泛应用于分子生物学领域。在外界磁场作用下，磁性纳米粒子可以发生聚集，在纳米粒子表面修饰一些与病原体特异结合的分子后可以起到分离一些病毒以及净化环境等作用。磁性纳米颗粒可以在磁场中定向运动，从而在反应结束后能利用磁铁实验反应体系和未反应体系的快速分离，而且整个净化过程时间短，磁性纳米颗粒修饰的核酸序列制备成捕获探针与荧光标记的aptamer识别探针杂交分离后又可以通过热解析而实现捕获探针的再生，而基于磁性纳米技术的荧光分析方法用来检测环境中的真菌毒素未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种检测环境中真菌毒素的方法，具有快速、灵敏、稳定、准确、可再生等优点。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测环境中真菌毒素的方法，具体步骤如下：

1)用荧光染料标记从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，得到荧光染料标记的aptamer识别探针，将荧光染料标记的aptamer识别探针加入待测样品中，aptamer与待测真菌毒素配体特异结合，其中，荧光染料标记的aptamer识别探针过量；

2)用生物素标记从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段互补碱基，再用磁性纳米颗粒修饰，得到纳米颗粒修饰的捕获探针；

3)将纳米颗粒修饰的捕获探针加入到待测样品中，未反应的aptamer识别探针与磁性纳米颗粒修饰的捕获探针发生杂交反应；磁性分离后，通过测定上清液中荧光信号强弱判断与aptamer结合的真菌毒素的量；

4)通过磁性分离后的杂交体，解链，水洗，再磁性分离，即可实现磁性纳米颗粒标记探针的再生。

步骤1)的具体过程为：在反应瓶中加入80uL tris结合缓冲液，加入8uL 25uMaptamer识别探针，加入8uL 25uM(2*10^-10mol)的OTA溶液，45℃，反应20min。

步骤2)的具体过程为：在反应瓶中加48uL 10mg/mL的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒，加入8uL 25uM的生物素标记的捕获探针，37℃下，反应30min，得到磁性纳米颗粒修饰的捕获探针，NP-aptamer’。

步骤3)的具体过程为：加入制备好的56uL NP-aptamer’，30℃下杂交50min；置于磁力架上进行磁分离，弃上清，并用上样缓冲液淋洗；测定上清液的荧光强度。

步骤3)中，用荧光分光光度计测量，最大吸收：490-495nm，最大发射：520-530nm，测定荧光强度。

步骤4)的具体过程为：将移去上清液只剩瓶底的磁性纳米颗粒的复合物加入300uL tris结合缓冲溶液摇匀，放入45℃的恒温摇床里解链30min，取出样品，再利用磁铁在瓶底吸附，弃上清液，瓶底即为回收的磁性纳米颗粒修饰的捕获探针。

tris结合缓冲溶液的配置：50mL 0.1mol/L的三羟基氨基甲烷溶液(0.60565g的三羟基氨基甲烷固体加水50mL)与42mL 0.1mol/L的盐酸(9mL的浓盐酸加1000mL的水)，再加入约1mL的吐温20再定容到lL。

OTA溶液的配置：样品中加入5mL甲醇，配制成1.0g/L的标准溶液。取1009uL 1.0g/L的标准溶液定容到100mL的容量瓶中，得到100mL 25uM的OTA使用液。

本发明运用分子生物学方法、磁性纳米技术等研究手段，构建高灵敏度、高选择性、可再生的新技术，为环境中真菌毒素的分析提供有效而简便实用的方法学与技术基础。现有技术检测环境中真菌毒素，方法大都较为繁琐而且不够灵敏。磁性纳米颗粒可以在磁场中定向运动，从而在反应结束后能利用磁铁实验反应体系和未反应体系的快速分离，而且整个检测过程时间短，磁性纳米颗粒修饰的核酸序列制备成捕获探针与荧光标记的aptamer识别探针杂交分离后又可以通过热解析而实现捕获探针的再生，达到重复利用的目的，节约资源。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本方法利用磁性纳米颗粒可以在磁场中定向运动从而在反应结束后能利用磁铁实现反应体系和未反应体系的快速分离的特点，制成磁性纳米颗粒修饰的核酸序列与溶液中过量的荧光染料标记的互补序列结合，在给予一定方向的磁场时，带有磁性纳米颗粒的结合产物会快速沉降到底部，这种方法可以使整个检测过程时间短。操作步骤简单快捷，具体反应步骤没有用到大型仪器，较易于推广。

2)磁性纳米颗粒修饰的核酸序列制备成捕获探针与荧光标记的aptamer识别探针杂交分离后又可以通过热解析而实现捕获探针的再生，达到重复利用的目的，节约资源。同时省去制备捕获探针的步骤，使得检测更加快捷简单。

3)检测限低：该方法检测限可以达到nM级别。

4)特异性好：在OTB存在的情况下，也能很好得测定OTA。

附图说明

图1是检测环境中真菌毒素的方法的流程图；

图2是不同杂交温度下信号强度图；

图3是不同解链温度下信号强度图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。以下实施例中，所使用到的试剂，具体配置方法如下：

tris结合缓冲溶液的配置(加吐温)：50mL 0.1mol/L的三羟基氨基甲烷溶液(0.60565g的三羟基氨基甲烷固体加水50mL)与42mL 0.1mol/L的盐酸(9mL的浓盐酸加1000mL的水)，再加入约1mL的吐温20再定容到lL。

aptamer识别探针溶液的配置：于上海生工购得样品：引物序列5'-3'：GAT CGGGTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA，5'端用荧光染料羧基荧光素FAM标记，在2.5OD的样品瓶中加入260uL PBS缓冲溶液就是25uM的aptamer识别探针溶液。

OTA溶液的配置：于sigma公司购得样品，赭曲霉素A，OTA标准品，5mg，样品中加入5mL甲醇，配制成1.0g/L的标准溶液。取1009uL 1.0g/L的标准溶液定容到100mL的容量瓶中，得到100mL 25uM的OTA使用液。

生物素标记的捕获探针溶液的配置：于上海生工购得样品：引物序列5'-3'：TTTTTT TTT CCG ATG CTC CCT，5'端用生物素标记，在2.5OD样品瓶中，加入580uL缓冲溶液配置成25uM的溶液(1.45*10^-8mol)。

PBS缓冲溶液配置：0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾，加去离子水约800mL，然后加浓盐酸调节pH＝7.4再定容到1L。

实施例1

一种检测环境中真菌毒素的方法，流程图如图1所示，具体步骤如下：

1、首先从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段(即aptamer)用荧光染料(即羧基荧光素FAM)标记，得到荧光染料标记的aptamer识别探针。然后将过量的荧光染料标记的aptamer识别探针加入待测样品(即真菌毒素样品，本实施例中指的是赭曲霉素A)中，aptamer与待测真菌毒素配体特异结合。具体过程如下：

在一个新的反应瓶中加入80uL tris结合缓冲液。然后加入8uL 25uM(2*10^-10mol)的aptamer识别探针，加入8uL 25uM(2*10^-10mol)的OTA溶液。45℃，反应20min。

2、接着从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段互补碱基(即aptamer’)，设计生物素标记的捕获探针，再用磁性纳米颗粒(即链霉亲和素磁珠)修饰，得到纳米颗粒修饰的捕获探针。具体过程如下：

在反应瓶中加48uL 10mg/mL的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒(无锡百迈格生物科技有限公司购得)，加入8uL 25uM的生物素标记的捕获探针(购买自上海生工)，37℃下，振荡反应30min，得到了磁性纳米颗粒修饰的捕获探针(NP-aptamer’)。

3、再将纳米颗粒修饰的捕获探针加入到待测样品中，(由于DNA杂交能力小于aptamer与配体的特异性结合能力)未反应的aptamer识别探针与磁性纳米颗粒修饰的捕获探针发生杂交反应。磁性分离后，即可通过测定上清液中荧光信号强弱判断与aptamer结合的真菌毒素的量。具体过程如下：

加入制备好的56uL NP-aptamer’(用少量的tris结合缓冲溶液冲洗3次，为了保证平行，可以每次取50uL)，30℃下杂交50min(室温振荡反应)。磁性分离：置于磁力架上进行磁分离，弃上清，并用上述缓冲液重复淋洗3次(用少量的tris结合缓冲溶液冲洗3次，为了保证平行，可以每次取50uL)。测定上清液的荧光强度。溶液量比较少，可以用缓冲溶液(可以用PBS缓冲溶液)冲洗磁性颗粒几次(用少量的PBS缓冲溶液冲洗3次，为了保证平行，可以每次取50uL)，定容到反应瓶，用荧光分光光度计测量，最大吸收：490-495nm，最大发射：520-530nm，测定荧光强度。

4、通过磁性分离后的杂交体在45℃下解链，水洗，再磁性分离，即可实现磁性纳米颗粒标记探针的再生。具体过程如下：

将移去上清液只剩瓶底的磁性纳米颗粒的复合物加入300uL tris结合缓冲溶液摇匀，放入45℃的恒温摇床里解链30min，取出样品，再利用磁铁在瓶底吸附，弃上清液，瓶底即为回收的磁性纳米颗粒修饰的aptamer捕获探针。

实施例2

检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，其中：在反应瓶中加48uL 10mg/mL的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒，加入8uL 25uM的生物素标记的捕获探针，37℃下摇动反应30min，得到了磁性纳米颗粒修饰的捕获探针(NP-aptamer’)。在不同的反应瓶中加入分别加入80uL tris结合缓冲液和SSC缓冲溶液。按照试验的方法分别加入8uL 25uM(2*10^- ¹⁰mol)的aptamer识别探针，8uL 25uM(2*10^-10mol)的OTA溶液。45℃，反应20min后继续在反应瓶中加入制备好的的56uL NP-aptamer’，分别用缓冲溶液冲洗3次(每次取10uL)，37℃下杂交40min。置于磁力架上进行磁分离，分离上清液，并用上述缓冲液重复淋洗，测定上清液的荧光强度。结果显示在Tris-HCl杂交缓冲溶液下荧光强度为543，而在SSC缓冲溶液中为397，说明在Tris-HCl杂交缓冲溶液中荧光强度较强。

实施例3

检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，其中：以不加吐温20的tris结合缓冲溶液代替实施例1中的缓冲溶液，测定上清液的荧光强度，荧光强度由556降为388，结果表明吐温20可以有效地增强荧光信号。

实施例4

检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，其中：杂交温度为25、30、35、40℃。结果如图2所示，表明，最好的杂交温度为30℃。

实施例5

检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，其中：杂交时间为20、30、40、50min。结果如表1所示，表明，最好的杂交时间为50min。

表1不同杂交时间下荧光强度

杂交时间	荧光强度
		20min	331
30min	342
		40min	507
50min	654

实施例6

检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，其中：采用不同浓度OTA：25uM、10uM、1uM、0.1uM、0.01uM、0.001uM。结果如表2所示，当OTA浓度到达1nM时都能与空白样品区分开来，证明最低检测OTA浓度已经达到nM级别。

表2不同浓度OTA的测定

OTA浓度(mol/L)	荧光强度
		空白	0
1×10<sup>-9</sup>	89
		1×10<sup>-8</sup>	114
1×10<sup>-7</sup>	164
		1×10<sup>-6</sup>	226
1×10<sup>-5</sup>	303

实施例7

检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，其中：在三组样品中分别加入总量相同的OTA、OTB溶液(赭曲霉素B溶液，配置方法同OTA)，及OTA、OTB混合物，以及做一组空白比较。结果如表3所示，表明，该体系对OTA表现出了很强的特异性。

表3特异性实验

样品	荧光强度
		空白	0
OTA	226
		OTB	64
OTA+OTB	160

实施例8

取玉米，大米，面包发霉物质1mg左右加入5mL酒精和5mL水配成溶液，利用实施例1的检测环境中真菌毒素的方法测定其OTA的情况。结果如表4所示，表明，该体系的荧光强度要明显高于空白实验，说明该方法可以应用于实际样品中OTA的测定。

表4发霉食品检测

样品	荧光强度
		空白	0
玉米	154
		大米	401
面包	202

实施例9

该方法测定完后，通过磁性分离后的杂交体在一定温度下解链，再磁性分离，即可实现磁性纳米颗粒标记的捕获探针的再生。检测环境中真菌毒素的方法同实施例1，通过磁性分离后的杂交体分别在40℃、45℃、50℃、60℃温度下解链，水洗3次，测定上清液的荧光强度，结果如图3所示，得到最佳解链温度为45℃。

Claims

1.一种检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）用荧光染料标记从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，得到荧光染料标记的aptamer识别探针，将荧光染料标记的aptamer识别探针加入待测样品中，aptamer与待测真菌毒素赭曲霉素A配体特异结合，其中，荧光染料标记的aptamer识别探针过量；

2）用生物素标记从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段互补碱基即aptamer’，再用磁性纳米颗粒修饰，得到纳米颗粒修饰的捕获探针；

3）将纳米颗粒修饰的捕获探针加入到待测样品中，未反应的aptamer识别探针与磁性纳米颗粒修饰的捕获探针发生杂交反应；磁性分离后，通过测定上清液中荧光信号强弱判断与aptamer结合的真菌毒素赭曲霉素A的量；

4）通过磁性分离后的杂交体，解链，水洗，再磁性分离，即可实现纳米颗粒修饰的捕获探针的再生。

2.根据权利要求1所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，步骤1）的具体过程为：在反应瓶中加入80μL tris结合缓冲液，加入8μL 25μM aptamer识别探针，加入8μL 25μM 2*10^-10mol的OTA溶液，45℃，反应20min。

3.根据权利要求1所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，步骤2）的具体过程为：在反应瓶中加48μL 10mg/mL的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒，加入8μL 25μM的生物素标记的捕获探针，37℃下，反应30min，得到磁性纳米颗粒修饰的捕获探针NP-aptamer’。

4.根据权利要求1所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，步骤3）的具体过程为：加入制备好的56μL 纳米颗粒修饰的捕获探针，30℃下杂交50min；置于磁力架上进行磁分离，弃上清，并用上样缓冲液淋洗；测定上清液的荧光强度。

5.根据权利要求1或4所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，步骤3）中，用荧光分光光度计测量，最大吸收：490-495nm，最大发射：520-530nm，测定荧光强度。

6.根据权利要求1所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，步骤4）的具体过程为：将移去上清液只剩瓶底的杂交体加入300μL tris结合缓冲溶液摇匀，放入45℃的恒温摇床里解链30min，取出样品，再利用磁铁在瓶底吸附，水洗3次，弃上清液，瓶底即为回收的磁性纳米颗粒修饰的捕获探针。

7.根据权利要求2所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，tris结合缓冲溶液的配置：50mL 0.1mol/L的三羟基氨基甲烷溶液，0.60565g的三羟基氨基甲烷固体加水50mL，与42mL 0.1mol/L的盐酸，9mL的浓盐酸加1000mL的水，再加入约1mL的吐温20再定容到lL。

8.根据权利要求2所述的检测环境中真菌毒素的方法，其特征在于，OTA溶液的配置：样品中加入5mL甲醇，配制成1.0g/L的标准溶液；取1009μL 1.0g/L的标准溶液定容到100 mL的容量瓶中，得到100mL 25μM的OTA使用液。