CN110317812B - 一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法 - Google Patents

一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法，纳豆激酶核酸适配体DNA序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：17；纳豆激酶核酸适配体的筛选方法将购置的纳豆激酶进行层析纯化，鉴定；应用纯化的蛋白进行适配体的筛选。本发明的核酸适配体具有精准的特异性、高亲合力、便于化学修饰，可作为一种有效的分子识别工具用于蛋白质的高灵敏分析，基于核酸适配体的识别技术为NK测定和高效分离纯化的发展方向提供依据。

Description

一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
目前业内常用磁珠法筛选，需要将蛋白靶标固定到磁珠上，液相中的寡核苷酸分子自由扩散。遇到固体支持物表面的相应靶分子可以与其结合以除去未结合或结合的弱寡核苷酸分子。洗脱/分离与靶分子结合的寡核苷酸链，然后进行PCR扩增和下一个循环。此方法需要多次循环，耗时长，容易产生非特异性吸附。
纳豆激酶(Nattokinase，NK)作为溶栓剂具有纤溶活性高、安全、经济的特点。由于NK活性受外界因素的影响大，纳豆激酶活性的定量测定方法仍是限制其进行高效分离纯化、溶栓机理研究的重要技术瓶颈。在测定NK酶活性的几种方法中，科学家们使用最多的是纤维蛋白平板法，通过表观的溶解圈的面积大小定量纤溶活性，检测误差大，灵敏度低。此外该方法受时间和温度及产品纯度影响较大，另因纤维蛋白源和凝血酶价格高导致检测成本难以降低。
中国、日本、印度、韩国和加拿大的科学家都使用这种方法。
很多中国、印度和日本的科学家也在使用纤维蛋白降解法。有日本科学家在使用酶联免疫吸附法。NK测定方法虽然很多，但没有完全规范统一的标准。上述各活性检测方法的局限性常导致相关研究结果之间存在差异，难以进行比对。在其生产优化和分离提纯的研究中，不同菌种、不同发酵工艺所得分子量等理化性质也有差别，使得其准确测定和分离较困难。
在实际应用中，酶活性的测定有时并不直接反映NK的真实产量。这些都限制了其作为溶栓剂的规模生产和开发应用。近些年的报道说明，核酸适配体具有精准的特异性、高亲合力、便于化学修饰，还可作为一种有效的分子识别工具用于蛋白质的高灵敏分析，基于核酸适配体的识别技术有望成为NK测定和高效分离纯化的发展方向，目前未见有纳豆激酶适配体的相关报道。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术中，各活性检测方法的局限性导致相关研究结果之间存在差异，难以进行比对；在其生产优化和分离提纯的研究中，对于不同菌种、不同发酵工艺所得的分子量很难进行准确测定和分离。
(2)对于核酸适配体具有精准的特异性、高亲合力、便于化学修饰，为一种有效的分子识别工具用于蛋白质的高灵敏分析，目前未见有纳豆激酶适配体的相关报道。纳豆激酶的性质不够稳定，难以得到纯品。关于适配体的筛选现有技术不够成熟。其活性测定的方法仍然采用传统方法，
(3)传统筛选方法操作繁琐、费时、效率低、重复性差的。
解决上述技术问题的难度：
传统筛选方法不能解决操作繁琐、费时、效率低、重复性差的难题。
解决上述技术问题的意义：
本发明采用表面等离子共振技术初步探索了候选适配体与靶标的相互作用，了解分子间相互作用的动力学和热力学等特性，为适配体评价体系的建立提供关键依据。有利于核酸适配体充分发挥其独特优势，促进NK活性位点、催化机理、分离纯化等领域的研究进展。
利用纳豆激酶适配体建立其浓度或活性测定方法，解决了NK的高准确性、高灵敏度、高特异性的分析问题。将适配体作为分子识别工具用于为NK分离纯化提供了关键依据。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法。本发明的主要创新点是筛选出的一组纳豆激酶核酸适配体是一种新的适配体。筛选方法为不经过指数富集的配体系统进化的毛细管电泳方法，利用适配体的分子识别功能，进行纳豆激酶的准确检测，此法灵敏度高，特异性好，能够解决复杂基质中纳豆激酶活性测定困难的问题。
本发明是这样实现的，一种一组纳豆激酶核酸适配体，所述纳豆激酶核酸适配体DNA序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：17。
本发明的另一目的在于提供一种一组纳豆激酶核酸适配体的筛选方法。将购置的纳豆激酶进行层析纯化，鉴定；应用纯化的蛋白进行适配体的筛选；具体包括：
步骤一，建立适用于纳豆激酶适配体筛选的毛细管电泳分析方法，优化运行缓冲液、最佳检测波长实验条件，确定50mmol/L硼酸-硼砂缓冲液作为毛细管电泳的运行缓冲液和纳豆激酶样品的溶剂，检测波长为280nm；
步骤二，利用CE和不对称PCR技术对筛选的PCR过程进行表征，不对称PCR的最优条件为：退火温度60℃；扩增循环数为30；下游引物P2的初始浓度为75μmol/L，上游引物P1与下游引物的浓度比为30:1；
步骤三，设计和优化随机核酸文库，选用69nt-ssDNA随机文库与NK结合，通过不对称PCR制备次级文库；
步骤四，利用优化的筛选条件进行筛选；筛选收集所得NK-ssDNA复合物为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行毛细管电泳分析和表征、序列克隆鉴定，获得SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：17共17条候选适配体；
进一步，步骤一，硼酸-硼砂缓冲液的pH7.8。
进一步，获得17条候选适配体后，还需进行：
用Mfold软件分析17条候选适配体二级结构，所得7条候选适配体序列存在颈环结构；选取亲合力大的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：17十条候选适配体，用CE-荧光检测技术对亲合力进行初步鉴定。
进一步，步骤三，核酸文库及引物设计中，
利用核酸引物设计软件Primer设计所需随机核酸文库和引物序列，并利用NUPACK软件、The mfold Web Server对所设计的核酸链进行二级结构评估。
进一步，步骤一，建立适用于纳豆激酶适配体筛选的毛细管电泳分析方法，包括：
固定荧光标记的寡聚核苷酸文库的浓度为0.5μmol/L，纳豆激酶的浓度为0.125μmol/L，将两者混合，避光条件下30℃孵育，每10min取出摇动，30min后进样分离；分离条件为：毛细管温度25℃，0.5psi，20s进样，分离电压20KV；首次每次进样前，依次用甲醇、超纯水、0.1mol/L盐酸溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH再生液A、超纯水、运行缓冲液冲洗，冲洗条件：20psi，5.0min；每两次进样之间分别用超纯水和运行缓冲液冲洗，冲洗条件：15psi，3.0min。
进一步，步骤四中，反复步骤三进行3-4轮筛选，用最后一轮筛选得到的复合物进行PCR扩增，得到与纳豆激酶结合的纯核酸；
具体包括：第一步，利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对基因组DNA定量，确定PCR反应加入的DNA量；PCR所用的引物引入Illumina桥式PCR兼容引物SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24
PCR体系按照如下进行：
Figure BDA0002029518170000041
配置好的PCR体系按照如下反应条件进行PCR扩增：
Figure BDA0002029518170000051
第二步，将扩增得到的核酸纯化，包括：
1)在40ulPCR产物中加入体积0.6倍或0.8倍的磁珠，震荡充分悬浮后放在磁力架上吸附5min，吸出上清；
2)加入50ul0.6倍或0.8倍的磁珠洗涤液，震荡充分悬浮后放在磁力架上吸附5min,吸出上清；
3)加入90ulWashBuffer或者70％乙醇,反向放置在磁力架上，使磁珠吸附到PCR管的另外一面，吸附后吸出上清。
4)将PCR管或8联管放在55℃烘箱5min；
5)加入30ul Elution Buffer洗脱；
6)将PCR管放在吸附架上5min，吸附，移出上清到干净的1.5mL离心管中，定量备用；
7)纯化后的核酸利用Qubit2.0DNA检测试剂盒精确定量,按照1：1的等量混合后测序；等量混合时，每个样品DNA量取10ng，上机测序浓度为20pm ol；
8)测序得到核酸的序列，通过Mfold软件，在25℃、Na+为50mmol/L条件下，对所得序列进行二级结构的预测；挑选候选适配体；
9)对候选适配体与纳豆激酶亲合力进行鉴定。
进一步，步骤9)对候选适配体与纳豆激酶亲合力进行的方法包括：对未加入纳豆激酶的核酸文库进行CE分析；加入纳豆激酶，孵育前后再一次进行CE电泳分析；亲合力用峰面积变化百分比S＝(A0-A1)/A0表示，其中A0为核酸文库的峰面积，A1为与靶标纳豆激酶混合孵育后，核酸文库中未与靶标集合部分的峰面积；比例越大，纳豆激酶与核酸文库间亲合力越大。
进一步，步骤9)对候选适配体与纳豆激酶亲合力进行的方法进一步包括：选取二级结构具有代表性的核酸适配体，进行5`6-FAM(FITC)荧光标记合成；将核酸适配体用50mmol/L pH7.8硼酸缓冲液溶至0.5μmol/L，将易溶解的随机寡核苷酸文库放至95℃环境下变性不低于10min，缓慢冷却至室温；取50μL，加入浓度为0.05mg/mL纳豆激酶溶液10μL，加入50mM pH7.8硼酸缓冲液溶补足至100μL，获得aptamer浓度为0.25μmol/L，NK浓度为0.005mg/mL的混合液，将混合液30℃孵育30min后上样分析。
本发明的另一目的在于提供一种搭载所述纳豆激酶核酸适配体的蛋白质分子识别试剂盒。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明采用毛细管电泳技术进行适配体的筛选，极大地提高了适配体的筛选效率。
本发明的核酸适配体具有精准的特异性、高亲合力、便于化学修饰，可作为一种有效的分子识别工具用于蛋白质的高灵敏分析，基于核酸适配体的识别技术为NK测定和高效分离纯化的发展方向提供依据。
利用表面等离子共振技术测定七条适配体的解离常数，得到其亲合力，为8.7-87nM.表明其亲合力较强。
表所筛十条适配体的亲合力常数KS
Figure BDA0002029518170000061
本发明筛选出与纳豆激酶靶标特异性结合的适配体为一种新型核酸适配体，为适配体家族增加了新成员。采用毛细管电泳技术进行适配体的筛选，极大地提高了适配体的筛选效率，解决了传统筛选方法操作繁琐、费时、效率低、重复性差的难题。采用表面等离子共振技术和毛细管电泳技术初步探索了候选适配体与靶标的相互作用，了解分子间相互作用的动力学和热力学等特性，为适配体评价体系的建立提供关键依据。有利于核酸适配作为分子识别工具体充分发挥其独特优势，促进NK活性位点、催化机理、分离纯化等领域的研究进展
附图说明
图1是本发明实施例提供的一组纳豆激酶核酸适配体的筛选方法流程图。
图2是本发明实施例提供的七条适配体与复合物的毛细管电泳图。
图中：(a)、SEQ ID NO：2；(b)、SEQ ID NO：3；(c)、SEQ ID NO：4；(d)、SEQ ID NO：12(e)、SEQ ID NO：13；(f)、SEQ ID NO：14；(g)、SEQ ID NO：15。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术中，各活性检测方法的局限性导致相关研究结果之间存在差异，难以进行比对；在其生产优化和分离提纯的研究中，对于不同菌种、不同发酵工艺所得的分子量很难进行准确测定和分离。对于核酸适配体具有精准的特异性、高亲合力、便于化学修饰，为一种有效的分子识别工具用于蛋白质的高灵敏分析，目前未见有纳豆激酶适配体的相关报道。
为解决上述问题下面附图对本发明作详细描述。
本发明实施例提供的用于快速鉴定和分离纳豆激酶的特异性分子识别工具-核酸适配体，即与纳豆激酶特异性结合的核酸适配体的序列为：
Figure BDA0002029518170000081
为得到上述核酸适配体，本发明所采用的技术方案如下：
如图1所述，本发明实施例提供的一组纳豆激酶核酸适配体的筛选方法将购置的纳豆激酶进行层析纯化，鉴定。应用纯化的蛋白进行适配体的筛选。具体包括：
S101，建立适用于纳豆激酶适配体筛选的毛细管电泳分析方法，优化了运行缓冲液、最佳检测波长等实验条件，确定50mmol/L硼酸-硼砂缓冲液(pH7.8)作为毛细管电泳的运行缓冲液和纳豆激酶样品的溶剂，检测波长为280nm。
S102，利用CE和不对称PCR技术对筛选的PCR过程进行表征，不对称PCR的最优条件为：退火温度60℃；扩增循环数为30；下游引物(引物P2)的初始浓度为75μmol/L，上游引物(引物P1)与下游引物的浓度比为30:1。
S103，设计和优化随机核酸文库，选用69nt-ssDNA随机文库与NK结合，通过不对称PCR制备次级文库。
S104，利用优化的筛选条件进行了三轮筛选。筛选收集所得NK-ssDNA复合物为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行毛细管电泳分析和表征、序列克隆鉴定，最终获得17条候选适配体。
S105，用Mfold软件分析其二级结构可知，所得序列普遍存在颈环结构。选取亲合力较大的十条候选适配体，用CE-荧光检测技术对亲合力进行了初步鉴定。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例
本发明实施例提供的一组纳豆激酶核酸适配体的筛选方法包括：
1)核酸文库及引物设计
利用核酸引物设计软件Primer设计实验所需序列，并利用NUPACK软件、The mfoldWeb Server对所设计的核酸链进行二级结构评估。
2)毛细管电泳分离纳豆激酶、核酸和复合物
固定荧光标记的寡聚核苷酸文库的浓度为0.5μmol/L，纳豆激酶的浓度为0.125μmol/L，将两者混合，避光条件下30℃孵育，每10min取出轻轻摇动一次，30min后进样分离。分离条件为：毛细管温度25℃，0.5psi，20s进样，分离电压20KV；首次每次进样前，依次用甲醇、超纯水、0.1mol/L盐酸溶液、超纯水、再生液A(0.1mol/L NaOH溶液)、超纯水、运行缓冲液冲洗，冲洗条件：20psi，5.0min；每两次进样之间分别用超纯水和运行缓冲液冲洗，冲洗条件：15psi，3.0min。
2)确定复合物出峰时间，并对复合物进行收集。
3)对收集的复合物进行不对称PCR反应扩增，制备次级核酸文库。
PCR体系所用引物、模板等的核酸序列见表1；
表1 PCR体系中所用的序列及长度
Figure BDA0002029518170000101
PCR体系所用各物质及其浓度见表2
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002029518170000102
PCR体系的基本反应程序见表3
表3 PCR反应基本程序
Figure BDA0002029518170000103
4)反复步骤3进行3-4轮筛选，用最后一轮筛选得到的复合物进行PCR扩增，得到与纳豆激酶结合的纯核酸。具体操作如下：利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量,以确定PCR反应应加入的DNA量。PCR所用的引物引入Illumina桥式PCR兼容引物：
190294-F引物：AGCAGCACAGAGGTCAGATG SEQ ID NO：23。
190294-R引物：TTCACGGTAGCACGCATAGG SEQ ID NO：24
PCR体系按照如下进行：
Figure BDA0002029518170000111
配置好的PCR体系按照如下反应条件进行PCR扩增：
Figure BDA0002029518170000112
5)将扩增得到的核酸纯化。具体操作为：
1)在40ulPCR产物中加入体积0.6倍(0.8倍)的磁珠，震荡充分悬浮后放在磁力架上吸附5min，小心的用移液枪吸出上清。
2)加入50ul0.6倍(0.8倍)的磁珠洗涤液，震荡充分悬浮后放在磁力架上吸附5min,小心吸出上清。
3)加入90ulWashBuffer(或者70％乙醇),反向放置在磁力架上，使磁珠吸附到PCR管的另外一面，充分吸附后吸出上清。
4)将PCR管或8联管放在55℃烘箱5min，使里面的酒精完全挥发。
5)加入30ul Elution Buffer洗脱。
6)将PCR管放在吸附架上5min，充分吸附，移出上清到干净的1.5mL离心管中，定量备用。
6).将纯化后的核酸利用Qubit2.0DNA检测试剂盒精确定量,以方便按照1：1的等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA量取10ng，最终上机测序浓度为20pmol。
7)测序得到核酸的序列，通过Mfold软件，在25℃、Na+为50mmol/L条件下，对所得序列进行二级结构的预测。挑选候选适配体。
8)进一步对候选适配体与纳豆激酶亲合力进行鉴定。
首先对未加入纳豆激酶的核酸文库进行CE分析；加入纳豆激酶，孵育前后再一次进行CE电泳分析。亲合力用峰面积变化百分比S＝(A0-A1)/A0表示，其中A0为核酸文库的峰面积，A1为与靶标纳豆激酶混合孵育后，核酸文库中未与靶标集合部分的峰面积。比例越大，说明纳豆激酶与核酸文库间亲合力越大。
具体操作为：选取二级结构具有代表性的核酸适配体，进行5`6-FAM(FITC)荧光标记合成。将核酸适配体用50mmol/L pH7.8硼酸缓冲液溶至0.5μmol/L，将易溶解的随机寡核苷酸文库放至95℃环境下变性不低于10min，缓慢冷却至室温。取50μL，加入浓度为0.05mg/mL纳豆激酶溶液10μL，加入50mM pH7.8硼酸缓冲液溶补足至100μL，获得aptamer浓度为0.25μmol/L，NK浓度为0.005mg/mL的混合液，将混合液30℃孵育30min后上样分析。
下面结合证明部分(能够证明本发明创造性的正面实验数据、证据材料、鉴定报告、商业数据、研发证据、商业合作证据等)
图2是本发明实施例提供的七条适配体与复合物的毛细管电泳图。表面与纳豆激酶相互结合的亲合力较强。图中：(a)、SEQ ID NO：2；(b)、SEQ ID NO：3；(c)、SEQ ID NO：4；(d)、SEQ ID NO：12(e)、SEQ ID NO：13；(f)、SEQ ID NO：14；(g)、SEQ ID NO：15。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一组纳豆激酶核酸适配体及其筛选方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcctgaggg atgacctgtt catgtaggg 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactaccgcg gagatctcca atcgggatg 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaatgaggac ctcattatct taggaaggt 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccttaaaaa cgtccttagt gacgtttac 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcacgtag attaaactat gctaagagc 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cattgcaatg taactgtcta gcttgactg 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggtcgcca tgggggagct gcgtaccgc 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccattccaac tcgctttaaa cataaatcg 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgtgaacca aggattcatg ccggtaaac 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggttacgat cagtctcatg gaaacgacc 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttgcaagga aagctatgcc tatgcccca 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcgtgtaaa acgatggtag ctgtacttg 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaggcgctg tgcacagtgt ccccgcggg 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgaggggaa ttcaccacga atcgcctct 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgatagttg tactggagtg aatcactga 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagactccag tcgcggcctc tatccggga 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acccaagtag gcgagttcag aactgtgtg 29
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgacgagac acctgacatc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttgagcctac gagcgatacc 20
<210> 20
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgagcctac gagcgatacc gagtgacaat cgacacatat tagtatcttc aacccgtaga 60
tgtcaggtgt ctcgtcgt 78
<210> 21
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttgagcctac gagcgatacc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
gatgtcaggt gtctcgtcgt 80
<210> 22
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgagcctac gagcgatacc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng atgtcaggtg 60
tctcgtcgt 69
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agcagcacag aggtcagatg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttcacggtag cacgcatagg 20

Claims (2)

1.一组纳豆激酶核酸适配体，其特征在于，所述一组纳豆激酶核酸适配体DNA序列为：SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：17。
2.一种搭载权利要求1所述一组纳豆激酶核酸适配体的蛋白质分子识别试剂盒。
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