CN116162626A - 一种可特异性结合prrsv病毒n蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种可特异性结合prrsv病毒n蛋白的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的N蛋白的核酸适配体及其用途。本发明利用亲和层析柱法，从核酸文库中筛选出了针对PRRSV N蛋白的候选核酸适配体，通过测序比对，选出了重复率较高的适配体，后续通过序列分析、二级结构预测、亲和力和特异性测定等对适配体进行评价，最终获得了两条结合力和特异性极好的PRRSV N蛋白核酸适配体，为后续PRRSV的检测技术的发展和酶联适配体法的建立提供了有利的技术支撑。

Description

一种可特异性结合PRRSV病毒N蛋白的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于分子免疫领域，具体涉及了一种可特异性结合呼吸综合征病毒PRRSV的N蛋白的核酸适配体及其用途。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是近三十年来给全球养猪业造成严重影响的一种高度传染性疾病，能够引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸系统疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症，其在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。该病主要传播途径有接触感染、精液传播、空气传播。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)，是单股正链且不分节段的RNA病毒，基因组长度为14.9kb～15.5kb，基因组至少含有10个开放阅读框,由ORF7编码的核衣壳蛋白N(N蛋白)是高度保守区域，占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在PRRSV的流行病学监测和诊断等方面具有重要意义。
核酸适配体是通过体外筛选技术从随机单链核酸序列库中筛选到的能特异性与靶物质高度亲和的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，其长度一般为60～100bp。在合适的条件下寡核苷酸单链可以形成特殊的三维结构，这种结构是适配体与靶物质特定区域结合的基础。在氢键、疏水堆积作用、形状匹配等作用下适配体与目标分子紧密结合。适配体具有与单克隆抗体相似的亲和力与特异性，同时又具有抗体所不具备的优点。适配体的优势包括：高度亲和力和特异性；结构稳定，不易受环境因素影响而变性；生产简单，易于制备；免疫原性和毒性低；容易修饰，可操作性强；目标靶范围广，包括蛋白质、多肽、小分子、细胞、组织切片等。以上这些优点使其在在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景和快速发展的趋势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可特异性结合PRRSV病毒N蛋白的核酸适配体，该核酸适配体可用于制备用于预防或检测PRRSV病毒的制品。
本发明首先提供一种可特异性结合PRRSV病毒N蛋白的核酸适配体，所述的核酸适配体的核苷酸序列如下：
5′-ATCCAGAGTGACGCAGCACGG-X-GGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′；其中X代表的核酸片段的序列为TCGGAAAGGGCAGGCATTTTGAACGAGTTATGGCGACACC(SEQ ID NO：1)或AAGTGGGGGAATGCCGAAGTGCCAAGGTACGGTTATACGG(SEQ ID NO：2)。
更进一步的，所述的核酸适配体使用生物素、地高辛、荧光物质、氨基、氨基酸及其衍生物、维生素、纳米发光材料、酶或胶体金进行修饰。
本发明再一个方面还提供所述的核酸适配体的一种用途，是在制备用于检测呼吸综合征病毒PRRSV的制品中的用途；
所述的制品，为试剂或检测试剂盒。
本发明另一个方面还提供所述的核酸适配体的另一种用途，是在制备预防或治疗PRRSV的制品中的用途。
本发明筛选获得了可特异性结合PRRSV病毒N蛋白的的核酸适配体，所提供的核酸适配体对PRRSV病毒N蛋白的具有极好的特异性和亲和力，为RRSV病毒的检测和防治提供了重要技术支撑。
附图说明
图1：本发明实施例3中核酸适配体N-PRRSV-27、N-PRRSV-8、N-PRRSV-15和N-PRRSV-32二级结构预测结果图。
图2：本发明核酸适配体亲合力检测结果图，其中N-PRRSV-27与靶标分子之间的解离平衡常数KD值为5.091nM；N-PRRSV-8与靶标分子之间的解离平衡常数KD值为3.576nM。
图3：本发明的核酸适配体特异性检测结果图。
图4：本发明中适配体的敏感性检测结果图。
具体实施方式
本发明基于于配体指数富集进化系统(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)技术，以带有组氨酸(His)标签的PRRSV N蛋白为正向筛选蛋白，以Ni-NTA固定介质为负向筛选物，从核酸文库中筛选出与PRRSV N蛋白特异性结合的核酸适配体，之后对核酸适配体的亲和力和特异性进行评价，从而优选出2条结合力最高、特异性良好的核酸适配体。
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，应当指出，本发明保护范围不局限于所述内容，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下进行的类似替换和改进，这些改动也被视为本发明的保护范围。本实施例中的实验方法如无特殊说明的均按常规方法操作，实验所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
下述实施例中的初始适配体文库委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，实验蛋白由青岛动保国家工程技术研究中心采用原核表达方式获得,并且重组蛋白PRRSV-N、PRRSV-GP5、PRRSV-M均带有组氨酸(His)标签，两株鼠抗PRRSV-N蛋白单克隆抗体(8A2和6D3)由青岛动保国家工程技术研究中心筛选所得。
实施例1：PRRSV N蛋白特异性核酸适配体的筛选
1、PRRSV N蛋白在Ni-NTA介质上的固定(在琼脂糖微球中固定靶标)：由于多聚组氨酸标签(His-Tag)可以与多种金属离子(如Ca2+、Ni2+、Cu2+等)发生特殊的相互吸附作用，所以利用重组蛋白所带有的His标签，将PRRSV-N蛋白固定吸附到Ni-NTA介质上，为接下来的核酸适配体筛选做准备。将PRRSV N固定于Ni-NTA介质的具体步骤为：取1ml的Ni-NTA介质加入空层析柱中，用5倍体积的去离子水洗涤Ni-NTA介质，洗去介质的保存液，之后将层析柱底部关闭，向其中一个层析柱中加入1mL PRRSV N蛋白溶液，置摇床中冰浴，200rpm缓慢摇晃2h左右，孵育完成后将层析柱的底部开关打开，排出孵育的溶液，使用偶联缓冲液冲洗多次，此预处理完毕的固定有PRRSV N蛋白的层析柱作为后续核酸适配体筛选的正筛柱。
2、核酸适配体的负向筛选
核酸适配体文库中可能存在与固定介质相结合的核酸适配体序列，在筛选过程中选择性加入了负向筛选过程，筛除能与固定介质相结合而不与靶蛋白结合的非特异性核酸序列。负向过程如下：取1ml的Ni-NTA介质加入到准备好的层析柱中，用5倍体积的去离子水洗涤Ni-NTA介质，洗去介质的保存液，之后将层析柱底部关闭，加入制备好的单链文库，并且加入2ml的偶联缓冲液，使Ni-NTA介质悬浮起来，室温下20rpm孵育2h。孵育完成后将反筛柱的底部开关打开，收集流穿液，该流穿液做为筛选用的起始单链核酸文库。
3、核酸适配体的正向筛选
①寡核苷酸文库预处理：取20μL(100μM)的初始适配体文库于100μL的PBS缓冲液中混匀。之后立即冰浴15分钟，使寡聚核苷酸复性以恢复三维空间结构。
②寡核苷酸文库与靶分子的孵育：取已在Ni-NTA介质上固定了PRRSV N蛋白的正筛管，向其中加入2ml的偶联缓冲液，使N蛋白-Ni-NTA介质处于悬浮状态，加入预处理的单链文库，室温下20rpm孵育2h。孵育完成后，用10mM PBS缓冲液洗涤多次，之后加四倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM EDTA，10mM PBS溶液)将单链DNA-N蛋白复合物洗脱下来。
③次级文库的制备：按照DNA片段回收试剂盒的步骤对洗脱液中的ssDNA进行回收。以回收的ssDNA文库作为PCR模板，采用优化了的PCR反应体系和反应条件，通过引物扩增获得DsDNA。上游引物：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCACGG，下游引物：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCACC，20μL反应体系如表1所示，PCR反应程序为：95℃，3min；25个循环包括95℃，30s，56℃，40s，72℃，30s；72℃,5min；4℃终止反应。
表1：一级文库dsDNA的扩增体系表
试剂 体积(μL)得改
Premix Taq 2× 10
上游引物(100m M) 0.5
下游引物(100m M) 0.5
cDNA 3
DdH2O 6
总体积 20
为了获得更纯的次级文库，PCR扩增结束后需将得到的DsDNA文库进行琼脂糖凝胶回收，并将切胶回收后的dsDNA进行95℃加热10min，之后置于冰上进行冷却，从而获得ssdna，此ssDNA即可在下轮筛选中使用。
重复上述的步骤，总计进行20轮的筛选；为了获得高特异性和高亲和力的核酸适配体，适当使用严苛的筛选条件。在筛选的过程中，降低PRRSV N蛋白浓度、适当增加洗涤次数，逐渐缩短ssDNA与PRRSV N蛋白的孵育时间，并且在筛选过程中加入负向筛选流程，排除非特异性核酸序列。用于筛选PRRSV N蛋白核酸适配体的总体方案如下：
表2：PRRSV N蛋白核酸适配体筛选方案
筛选次序 重组蛋白 孵育后洗涤次数 负向筛选
1～3 20μg 3 +
4～6 17μg 4 -
7～10 15μg 5 +
11～14 12μg 6 -
15～20 10μg 7 +
注：(+)表示在筛选起始加入负向筛选步骤；(-)表示在筛选起始不加入负向筛选步骤。
实施例2：PRRSV N蛋白核酸适配体的测序
在进行完第20轮的筛选后，所得到的文库扩增产物进行琼脂糖凝胶回收，回收所得的文库与pMD19T载体连接，转入DH5α中，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。本研究中挑取了100个阳性单克隆进行测序，共测序成功96个，利用DNAMAN 8对测序成功的结果进行对比分析，得到了4条出现频率较高的核酸适配体序列，N-PRRSV-27、N-PRRSV-8、N-PRRSV-15和N-PRRSV-32分别重复出现16、9、8、6次(如表3所示)，表明在筛选过程中这些重复序列得到了最大程度富集，其中N-PRRSV-27和N-PRRSV-8出现的频次最高，可能这两条序列与PRRSV N蛋白的亲和力较高，因此后续还需对核酸适配体的亲和力进行鉴定。
表3：核酸适配体测序结果统计表
名称 测序频次 序列
N-PRRSV-27 16 TCGGAAAGGGCAGGCATTTTGAACGAGTTATGGCGACACC
N-PRRSV-8 9 AAGTGGGGGAATGCCGAAGTGCCAAGGTACGGTTATACGG
N-PRRSV-15 8 ATCTGTCTGTGGTGAGGTACTGTGTGAGTTCTTGTGTGTG
N-PRRSV-32 6 TGAATTGGTCTCGGGGGGCGATCTCTGTGTCCGTATACCG
实施例3：PRRSV N蛋白核酸适配体二级结构预测
核酸适配体能够通过折叠形成独特的空间结构，以特异性地识别靶标分子。重组PRRSV N蛋白作为一种高分子化合物，其具有复杂的空间结构能够被不同的核酸适配体识别。通过在线Mfold软件对筛选得到的出现频次较高的四种核酸适配体的二级结构进行预测和分析，条件设置为26℃，Na+浓度150mM，Mg2+浓度1mM。预测结果如图1所示，核酸适配体中出现较多的二级结构为茎环结构，该结构在tRNA中多作为识别结构，可推测核酸适配体二级结构中茎环结构是其识别靶标分子的主要形式。通过观察这四条的二级结构预测图可知，其中N-PRRSV-27、N-PRRSV-8、N-PRRSV-15均具有茎环结构，而N-PRRSV-32的二级结构与其他的核酸适配体的结构具有较大的差异。比较了四条适配体核苷酸的吉布斯自由能，其中适配体N-PRRSV-27的吉布斯自由能最低，与其他适配体相比其更加稳定。
实施例4：PRRSV N蛋白核酸适配体亲和力检测
选择出现频次较多的四条核酸适配体，在5′端用生物素进行标记，通过简介酶联适配体法测定各适配体与N蛋白之间的亲和力强弱，具体步骤如下：
①重组N蛋白包被：用碳酸盐包被缓冲液将N蛋白稀释到浓度为10μg/mL，吸取100μL加入到96孔ELISA微孔板中，4℃放置过夜。
②封闭：第二天弃去包被液，用PBST(含0.05％Twe en 20的PBS)洗涤三次，每孔加入200μL 1％的BSA，37℃封闭2h。
③加适配体：弃去封闭液，用TBST洗涤三次,加入100μL的1、5、10、15、20nM生物素标记的核酸适配体溶液，37摄氏度孵育1h；
④加二抗：弃去适配体溶液，PBST洗涤三次，向孔中加入100μL 1:6000稀释的SA-HRP二抗，37℃孵育1h。
⑤显色：弃去二抗，PBST洗涤四次，拍干孔中残留的洗涤液，将显色液A、显色液B等体积混合，吸取100μL显色液加入到微孔中，37℃显色10min。
⑥终止显色：每孔加入50μL终止液(2M H2SO4)终止显色。在450nm处测量吸光度。为减少实验误差，每个样品设置3个重复。
核酸适配体分子(ssDNA)与靶标分子之间的亲和力的强弱常用解离常数KD值进行表征。KD值越小，说明核酸适配体与靶标分子之间的亲和力越强。本实施例采用ELONA法进行KD值的测量，其中包被的重组N蛋白浓度为固定值，将适配体N-PRRSV-27、N-PRRSV-8、N-PRRSV-15以及N-PRRSV-32设置不同的浓度梯度。以适配体的浓度为横坐标，以450nm波长下测量的吸光度OD450作为纵坐标，建立非线性拟合曲线，并进行KD值计算。结果如图2所示，其中N-PRRSV-27与靶标分子之间的解离常数KD值最高，为5.091nM，N-PRRSV-8与靶标分子之间的解离常数KD值次之，为3.576nM，由KD值可以说明，四条适配体中N-PRRSV-27、N-PRRSV-8与重组PRRSV N蛋白具有较高的亲和力。
实施例5：PRRSV N蛋白核酸适配体特异性检测
根据亲合力检测结果，四条核酸适配体中仅有两条表现出对PRRSV N蛋白的较强亲合力，因此再针对这两条亲合力较好的核酸适配体进行研究。为了验证筛选得到的核酸适配体对于重组N蛋白是否具有特异性，利用ELONA法对两条核酸适配体PRRSV-N-27和PRRSV-N-8进行特异性的鉴定。实验以BSA作为空白对照，阴性对照分别为重组PRRSV-GP5和PRRSV-M蛋白，这两种蛋白均为本实验室经原核表达获得，且都带有his标签。对测序所得到的两条核酸适配体进行了检测，用包被液将PRRSV-N、PRRSV-GP5和PRRSV-M等蛋白包被于96孔ELISA微孔板中，封闭后加入20nM生物素标记的核酸适配体作为一抗，HRP标记的链霉亲和素(1：6000稀释)作为二抗，TMB显色并终止，酶标仪测定OD450值(图3)。
实施例6：凝胶阻滞实验检测核酸适配体与重组蛋白的结合
为了进一步探究该适配体是否能够识别重组N蛋白，利用凝胶阻滞实验对核酸适配体与N蛋白的结合进行了探究。实验步骤如下：制备5％的TAE-PAGE凝胶，凝胶配方包括10×TAE溶液2mL，40％丙烯酰胺2.5mL，APS 0.05g，TEMED 12μL，ddH20 15.5mL。将20μg重组N蛋白分别与20μM核酸适配体PRRSV-N-27、PRRSV-N-8于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中孵育3h，孵育后的复合物与非变性的1×loading buffer混匀后上样，110V，电泳40min。电泳结束后，凝胶使用SYBR Green I染色30min，在凝胶成像系统中观察结果。
利用ELONA法对核酸适配体PRRSV-N-27和PRRSV-N-8进行特异性的检测。将带有His标签的重组PRRSV-GP5和PRRSV-M蛋白作为阴性对照，BSA作为空白对照。检测结果发现BSA、PRRSV-GP5和PRRSV-M与核酸适配体均无特异性识别，PRRSV-GP5和PRRSV-M中都含His标签，说明核酸适配体对于His标签无特异性识别。核酸适配体PRRSV-N-27和PRRSV-N-8能够特异性识别重组PRRSV-N。
实施例7：基于适配体的夹心ELISA法测定PRRSV N蛋白的方法建立
①用包被液将纯化的鼠抗N蛋白单克隆抗体(8A2)稀释至4μg/mL，吸取100μL加入到96孔ELISA微孔板中，37℃孵育1h；
②弃去包被液，用PBST(含0.05％Twe en 20的PBS)洗涤三次，每孔加入200μL 1％的BSA，37℃封闭2h；
③用PBS将N蛋白分别稀释为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL，每孔加入100μL N蛋白溶液，同时设立加入PBS的对照孔，37℃孵育1h。
④将生物素标记的适配体PRRSV-N-27稀释至100nM，95℃变性10min，迅速放置冰上15min，取处理好的适配体100μL加入到试验孔；将1:400倍稀释的鼠抗ASFV p30单克隆抗体(6D3)加入阳性对照孔，PEDV、CSFV、PRV和PCV2作为阴性对照，细胞上清和PBS作为空白对照，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；
⑤向孵育了生物素标记的适配体的试验孔中加入100μL 1:6000稀释的SA-HRP，向孵育了鼠抗PRRSV N蛋白单克隆抗体(7C3)的对照孔中加入HRP标记的山羊抗鼠IgG，1:1000倍稀释，每孔100μL，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次3min；
⑥将显色液A、显色液B等体积混合，吸取100μL显色液加入到微孔中，37℃避光显色10min，每孔加入50μL终止液(2M H2SO4)终止显色。在450nm处测量吸光度OD450，结果如图4所示，按照试验结果的OD值大于或等于阴性对照OD值的2.1倍即为阳性判断，由此得出适配体PRRSV-N-27对PRRSV N蛋白的最低检出量为0.5μg/mL，优于鼠抗PRRSV N单克隆抗体(6D3)的最低检出量为1μg/mL。
本发明不受上述实施例的限制，以上所述仅是对本发明的较佳实施例进行描述，在不脱离本发明设计精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的核苷酸序列如下：5′-ATCCAGAGTGACGCAGCACGG-X-GGTGGACACGGTGGCTTAGT-3′；其中X代表的核酸片段的序列为SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述核酸适配体，其特征在于，所述的X代表的核酸片段的序列为SEQID NO：2。
3.如权利要求1或2所述核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体使用生物素、地高辛、荧光物质、氨基、氨基酸及其衍生物、维生素、纳米发光材料、酶或胶体金进行修饰。
4.权利要求1或2所述的核酸适配体的用途，其特征在于，所述的用途，是所述的核酸适配体在制备用于检测呼吸综合征病毒PRRSV的制品中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的制品为检测试剂或检测试剂盒。
6.权利要求1或2所述核酸适配体的用途，其特征在于，所述的用途，是所述的核酸适配体在制备预防或治疗PRRSV的制品中的用途。
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