CN116514987B - 一种抗cg7544蛋白的纳米抗体及编码基因和应用 - Google Patents

一种抗cg7544蛋白的纳米抗体及编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗CG7544蛋白的纳米抗体及编码基因和应用，涉及基因工程领域。该纳米抗体的氨基酸序列包括骨架区序列和互补决定区序列，所述骨架区序列选自SEQ ID NO：1‑4，所述互补决定区序列选自SEQ ID NO：5‑7。该纳米抗体分子量小，约17kda，但能够特异性结合果蝇CG7544蛋白，抗原结合力强，特异性高。

Description

一种抗CG7544蛋白的纳米抗体及编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种抗CG7544蛋白的纳米抗体及编码基因和应用。
背景技术
N6-甲基腺苷(m6A)修饰是在RNA中腺苷酸第6位N上发生的甲基化修饰，是真核细胞mRNA中最丰富的修饰形式，参与调控RNA转录、剪接、降解和翻译。m6A RNA甲基化功能的实现主要受m6A甲基转移酶复合物、m6A去甲基化酶和m6A读取蛋白来调控。METTL3是哺乳动物中的甲基转移酶，是甲基转移酶复合物的核心亚基。CG7544蛋白是果蝇编码的m6A甲基转移酶，目前功能尚不明确。
黒腹果蝇是遗传和发育生物学的模式生物，抗体在果蝇基础生物学研究过程中发挥重要作用。由于果蝇蛋白和哺乳动物蛋白同源性较低，一些抗人源、抗鼠源或抗兔源蛋白的抗体不适用于果蝇，因此制备果蝇蛋白抗体意义重大。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种抗CG7544蛋白的纳米抗体，该纳米抗体分子量小，约17kda，但能够特异性结合果蝇CG7544蛋白，抗原结合力强，特异性高。
为了达到上述目的，本发明提供了一种抗CG7544蛋白的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列包括骨架区序列和互补决定区序列，所述骨架区序列选自SEQ ID NO：1-4，所述互补决定区序列选自SEQ ID NO：5-7。
传统抗体指由重链和轻链组成的四聚体，大小约150kDa，通常通过免疫动物，分离血清或腹水获得。这种传统抗体常常存在免疫效果不佳、抗体量少、批次不稳定性及生产成本高等的局限。自然界中还存在一种仅由重链组成的二聚体抗体，称为重链抗体，大小约80-90kDa，目前在骆驼科和鲨鱼体内发现。天然重链抗体的单个可变区(VHH)部分足以识别并高效结合抗原，被称为单域抗体或纳米抗体。纳米抗体大小约15kDa，结构简单，稳定性好，虽然分子量小但抗原亲和力高。另外，纳米抗体易折叠、可溶性好、修饰少且部易形成聚集体，能在细菌及酵母等微生物中大量生产。这些优越的特性拓宽了纳米抗体在基础研究领域的应用。因此，本发明人提出开发果蝇蛋白纳米抗体，从而很大程度促进以果蝇为模式生物的基础研究。本发明利用果蝇胚胎蛋白裂解液免疫羊驼，随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立果蝇胚胎蛋白的纳米抗体文库，将纯化的CG7544蛋白固定在固相载体表面，利用噬菌体展示技术多轮筛选获得针对CG7544蛋白的高特异性的纳米抗体基因，并建立了该纳米抗体在大肠杆菌中的表达体系，有利于后续源源不断大规模生产性能稳定的抗CG7544纳米抗体。本发明的抗CG7544纳米抗体分子量小，约17kda，但抗原结合力和特异性高。
在其中一个实施例中，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明还提供了一种编码所述纳米抗体的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体含有所述基因。
本发明还提供了一种表达菌株，该表达菌株含有所述表达载体。
在其中一个实施例中，所述表达菌株的出发菌株为大肠杆菌SS320。
本发明还提供了一种用于检测CG7544蛋白的试剂盒，该试剂盒包括有所述纳米抗体。
本发明还提供了所述纳米抗体在制备用于检测CG7544蛋白的产品中的应用。
本发明还提供了所述基因在制备用于检测CG7544蛋白的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种抗CG7544蛋白的纳米抗体及编码基因和应用，该纳米抗体分子量小，约17kda，但能够特异性结合果蝇CG7544蛋白，抗原结合力强，特异性高。本发明利用果蝇胚胎蛋白裂解液免疫羊驼，随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立果蝇胚胎蛋白的纳米抗体文库，将纯化的CG7544蛋白固定在固相载体表面，利用噬菌体展示技术多轮筛选获得针对CG7544蛋白的高特异性的纳米抗体基因，并建立了该纳米抗体在大肠杆菌中的表达体系，有利于后续源源不断大规模生产性能稳定的抗CG7544纳米抗体。
附图说明
图1为实施例1中的电泳图；其中，图1A为实施例1中纳米抗体基因电泳图，泳道M是DNA marker，泳道VHH是PCR扩增的纳米抗体基因；图1B为实施例1中对本发明构建的纳米抗体文库质量进行的菌落PCR鉴定结果图，泳道M是DNA marker，泳道1到16是从所构建纳米抗体文库中随机挑取的单克隆，通过菌落PCR检测文库插入率，结果表明文库插入率达到93.8％；
图2为实施例4中表达载体pADL-10b-Flag-C4-His的图谱；
图3为实施例4中纯化的纳米抗体C4的电泳图；
图4为实施例5中ELISA法验证纯化的纳米抗体与CG7544蛋白的特异结合的结果图；其中，由左向右看，第1个柱形为加入C4抗体，第2个柱形是没有加入纳米抗体，第3个柱形是没有包被抗原CG7544蛋白。
图5为实施例6中等离子共振技术验证纯化的纳米抗体与CG7544蛋白的特异结合及亲和力的结果图；其中，图5A中的曲线由下至上依次为200nM、400nM、800nM、1600nM、3200nM，图5A为实验组，图5B为对照组。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
果蝇胚胎蛋白纳米抗体文库的构建。
1、收集果蝇胚胎，用裂解液裂解，得到胚胎蛋白裂解液，将浓度稀释到1mg/mL，每次免疫将1mg蛋白裂解液与等体积佐剂(购自GERBU公司)混合，免疫一只羊驼，每两周免疫一次，共免疫4次。
2、4次免疫结束后，抽取羊驼外周血50mL，分离血淋巴细胞，用Trizol法抽提细胞总RNA。
3、按照TAKARA公司的PrimerScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书，将提取的RNA反转录成cDNA，利用巢式PCR扩增羊驼重链抗体可变区(既VHH区域)。第一轮PCR所用引物如下：
上游引物(5’－3’)：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(SEQ ID NO：10)，
下游引物(5’－3’)：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO：11)；
反应条件：98℃，3min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min。
以第一轮pcr产物为模版进行第二轮PCR，所用引物如下：
上游引物(5’－3’)：
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO：12)
下游引物(5’－3’)：
GTGTTGGCCTCCCGGGCCACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO：13)。
反应条件：98℃，3min；98℃，10s，55℃，10s，72℃，30s，16个循环；72℃，10min。
切胶回收大小约500bp目的片段VHH。结果如图1A所示，泳道M是DNA marker，泳道VHH是VHH片段，即得到纳米抗体基因片段，大小约500bp左右。
4、用限制性内切酶Bgl II(购自NEB公司)分别酶切10μg噬菌体展示载体pADL-10b和4μg VHH，分别回收两个片段，并用T4连接酶(购自Thermo Fisher ScientificTM公司)连接两个片段，纯化连接产物。
5、将连接产物电转化到SS320感受态细胞中，构建纳米抗体细菌文库，测定库容量，大小约3×107个。同时随机挑取20个单克隆，通过PCR对所建纳米抗体细菌文库中纳米抗体基因插入率进行检测，所用引物如下：
上游引物(5’-3’)：CAGGAAACAGCTATGACCATGAT(SEQ ID NO：14)，
下游引物(5’-3’)：GCCCTCATAGTTAGCGTAACGAT(SEQ ID NO：15)。
结果如图1B所示，在挑取的16个克隆中能从15个克隆中扩增出包含纳米抗体基因的约700bp片段，表明纳米抗体细菌文库插入率达到93.8％，文库质量合格。
利用辅助噬菌体超感染，从纳米抗体细菌文库中获取纳米抗体噬菌体展示文库，测定噬菌体文库大小，用于后续筛选实验。
实施例2
CG7544蛋白特异的纳米抗体的富集过程。
1、取1μg CG7544蛋白与30μLDynabeads(DynabeadsTM His-Tag Isolation andPulldown，Invitrogen)室温孵育30min，使CG7544结合在磁珠上，然后用PBST清洗3次，洗去未结合的CG7544。
2、向磁珠中加入500μL上述构建噬菌体展示文库(含有5×1012个展示免疫羊驼纳米抗体的噬菌体)，室温翻转孵育2h。用PBST清洗25次，洗去没有结合或结合力弱的噬菌体。用500μL胰蛋白酶(0.25mg/mL)将与CG7544特异结合的噬菌体解离下来，向解离下来的噬菌体溶液中加入10μL protease inhibitor cocktail(50×)(购自Roche公司)进行中和。
3、取300μL解离下来的噬菌体溶液感染3mL处于对数生长期的SS320细胞，37℃孵育30min，之后再加入7mL培养基，30℃培养过夜。第二天纯化噬菌体用于下一轮筛选。
4、重复这个筛选过程3次，第二轮和第三轮筛选时用于孵育的噬菌体数量降为1×1012个。
在不断筛选过程，展示有特异结合CG7544的纳米抗体的噬菌体被不断富集，结果如下表所示，解离下来的噬菌体数量越来越多，从而达到从文库中富集CG7544纳米抗体的目的。
表1筛选前后噬菌体数量
实施例3
酶联免疫吸附方法(ELISA)筛选CG7544特异的纳米抗体阳性单克隆。
1、从实施例1中第三轮筛选后得到的培养过夜的纳米抗体细菌文库中随机挑选20个细菌单克隆，分别接种至LB培养基中，培养至细菌生长对数期，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃培养过夜，诱导纳米抗体表达。
2、第二天收集菌体，用1/10菌液体积的CelLyticTMB Cell Lysis Reagent(购自Sigma公司)裂解细菌获得纳米抗体粗提液。取100μL抗体粗提液，加入cycline包被好并用3％ BSA封闭好的ELISA板中，室温孵育1h。
3、用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的蛋白。加入anti-pIII抗体(1：1000，购自NEB公司)，室温孵育1h。
4、用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体(1:2000，购自Abcam公司)，室温孵育1h。
5、用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。每孔加入200μL碱性磷酸酶显色液DNPP(购自Sigma公司)，室温避光显色，不超过30min。
6、加入50μL 3N氢氧化钠终止反应，在酶标仪上，在405nm波长下，测定吸收值。
7、将吸收值为阴性对照组(不加纳米抗体粗体液或不加anti-pIII抗体)吸收值的2倍以上的克隆判定为阳性克隆。将阳性克隆的菌扩大培养，提取质粒，送测序。
8、利用MegAlign软件，对测序结果进行比对分析。
结果发现共有一种富集度最高的DNA序列，基因序列命名为C4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，氨基酸序列中的骨架区序列如SEQ IDNO：1-4所示，氨基酸序列中的互补决定区序列如SEQ ID NO：5-7所示。
MADVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASG(SEQ ID NO：1)；
FRQAPGKEREGV(SEQ ID NO：2)；
YADAVKGRFTVSRDSAKNTVYLEMDSLKPEDTAVYYC(SEQ ID NO：3)；
WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：4)；
FTFDSNAFGW(SEQ ID NO：5)；
SCISARDSTTF(SEQ ID NO：6)；
ATLYRATAQAMCAMSTLLGY(SEQ ID NO：7)；
MADVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSNAFGWFRQAPGKEREGVSCISARDSTTFYADAVKGRFTVSRDSAKNTVYLEMDSLKPEDTAVYYCATLYRATAQAMCAMSTLLGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：8)；
ATGGCAGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCGATAGCAATGCATTTGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGAAAGGAGCGCGAAGGGGTCTCATGTATTAGTGCTCGTGATAGCACCACATTTTATGCAGATGCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAGTGCCAAGAACACGGTGTATCTCGAAATGGACAGCCTGAAACCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGACCCTCTATCGGGCCACTGCTCAGGCCATGTGTGCTATGTCTACATTGTTGGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGC(SEQ ID NO：9)。
实施例4
CG7544纳米抗体在大肠杆菌中的原核表达和纯化。
1、本实施例利用pADL-10b改造得到重组载体pADL-10b-Flag-His，将C4克隆到pADL-10b-Flag-His中，获得表达载体pADL-10b-Flag-C4-His，图谱如图2所示，将鉴定正确的重组质粒通过热激法导入宿主菌SS320中进行表达。
2、挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜，第二天按1:100转接菌液到300mL LB培养基，37℃培养至OD600约为0.5时，加入0.02％的L-阿拉伯糖诱导C4表达，28℃培养过夜。
3、第二天离心收集菌体，用渗透压法破裂细菌，获得抗体粗体液，然后通过镍柱亲和层析纯化抗体，用20mM的咪唑洗去杂蛋白，最后用250mM的咪唑将抗体洗脱下来。
4、将所得纳米抗体进行电泳检测，结果如图3所示，泳道1为蛋白marker，泳道2为纯化的C4抗体。
实施例5
ELISA法验证CG7544纳米抗体与CG7544的结合能力。
1、首先用ELISA对纯化的CG7544纳米抗体进行功能验证，将CG7544(1μg/孔)包被在酶标板上，4℃过夜，用3％ BSA封闭，室温孵育2h,用PBST清洗5次，每次1min。
2、加入纳米抗体C4(1μg/孔)，室温孵育2h，用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。
3、加入鼠Flag抗体(1:1000)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min。
4、加入HRP偶联羊抗鼠抗体(1:2000，购自Abcam公司)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min。
5、最后加入100μL TMB显色液，室温避光显色20min。加入50μL 2M浓硫酸终止反应，在酶标仪上，测定450nm波长下的吸收值。本实施例设置了2组阴性对照，分别为不加纳米抗体和不加入HRP偶联的Flag抗体。每个实验组和对照组重复3次。
6、结果显示，实验组都呈现明显的颜色反应，吸收值结果如下表和图4所示。
如图4所示，纵坐标是450nm波长下的吸收值，横坐标是各个纳米抗体的实验组和阴性对照组，每个值都代表3次独立重复实验，结果实验组C4的吸收值都显著高于阴性对照组。
表2450nm波长下的吸收值
实施例6
等离子共振技术验证CG7544纳米抗体与CG7544的结合能力。
1、以CG7544蛋白为固定相，纳米抗体为流动相，使用PBS将固定相稀释到打印浓度作为固定相打印工作液，之后通过BiodotTM AD1520芯片，阵列打印机将打印工作液打印在3D光交联芯片上，每种样品打印4个重复点，四角打印4组阳性对照点(雷帕霉素，Rapamycin)。
2、将打印后的芯片进行真空干燥，之后放置于光交联仪器内进行光交联反应；然后依次使用DMF，C2H5OH，H2O进行摇洗15min，氮气吹干，装配Flowcell Cover备用。向流动相样品储备液加入PBST(pH＝7.4，0.1％ Tween 20)稀释为5个浓度梯度：200nM，400nM，800nM，1600nM，3200nM。所有样品依次流通，进行测试。PBST在整个实验中作为流动载体。互作测试环节，分析物以0.5μL·s-1流经在芯片表面。表面重生环节，用Glycine-HCl(pH＝2.0)溶液作为重生液，流速为2μL·s-1。
3、根据SPR设备的实时检测结果，导出实验组互作对及阴性数据，拟合得到了相互作用的动力学曲线并输出亲和力参数。
4、测试结果显示，CG7544纳米抗体与CG7544蛋白结合信号强，存在中等的相互作用，SPR试验的亲和力数据如下表、图5所示，图5A中的曲线由下至上依次为200nM、400nM、800nM、1600nM、3200nM，图5A为实验组，图5B为对照组。
其中，Avg Ka(1/Ms)表示结合反应的快慢，Ka越大代表结合越快，Ka越小代表结合越慢；AvgKd(1/s)表示解离反应的快慢，Kd越大代表解离越快，Kd越小代表解离越慢。AvgKD为平衡解离常数，KD越大说明解离越多，代表AB之间亲和力越弱，KD越小说明解离越少，代表AB间亲和力越强；Int.Intensity Level是对亲和力的判定，10-13至10-8之间为极强结合，10-8至10-5之间为强结合，10-5至2×10-2之间为中弱结合，2×10-2至100之间为极弱结合。ABS(tr_KD)是绝对亲和系数，ABS(tr_KD)＝ABS(log2(KD))，数值越高，亲和力越高。
表3SPR分析CG7544与CG7544纳米抗体的亲和力数据简表
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种抗CG7544蛋白的纳米抗体，其特征在于，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQID NO：9所示。
3.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有权利要求2所述的基因。
4.一种表达菌株，其特征在于，该表达菌株含有权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达菌株，其特征在于，所述表达菌株的出发菌株为大肠杆菌SS320。
6.一种用于检测CG7544蛋白的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求1所述的纳米抗体。
7.权利要求1所述纳米抗体在制备用于检测CG7544蛋白的试剂盒中的应用。
8.权利要求2所述基因在制备用于检测CG7544蛋白的试剂盒中的应用。
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