CN118063556A - 一种提高重组抗体产量的信号肽及其应用 - Google Patents

一种提高重组抗体产量的信号肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高重组抗体产量的信号肽，其氨基酸序列为MKLPVRLLVLMFWIPAASA，通过设计优化信号肽，促进细胞表达性能满足使用要求的重组抗体，可以降低抗体的表达周期和生产成本，本发明还公开了该信号肽在制备诱导性表达载体和在引导目的蛋白分泌表达中的应用。

Description

一种提高重组抗体产量的信号肽及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高重组抗体产量的信号肽及其应用。
背景技术
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创立杂交瘤技术，从此打开单克隆抗体应用的大门，越来越多的医药、体外诊断公司，逐步扩大单克隆抗体的应用。长久以来，单克隆抗体的生产方式主要为体内诱导，该方式需要应用到大量的小鼠，须兼顾动物伦理且抗体的性能受动物个体影响，批间差异较大，故越来越多厂家开始寻求新型抗体生产模式。
随着基因工程的不断发展，许多体外诊断试剂厂家开始应用基因工程技术进行重组抗体研发、生产，涵盖重组鼠源抗体、重组人源化抗体、重组Fab抗体，而提升重组抗体的产量是本领域共通的追求。
重组抗体的产量与跨膜转运息息相关，而跨膜转运依赖于信号肽，信号肽是一种引导蛋白，主要功能是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移，通过对信号肽进行设计筛选可以提高蛋白的分泌表达，即提高重组抗体的产量。如申请号202210107465.1的专利文献公开了一种在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，该方法是基于苏云金芽孢杆菌的分泌性杀虫蛋白Vip3的分泌信号肽序列或其局部序列或这些多肽序列的突变体或相应的人工模拟多肽序列。
上述专利技术选用的苏云金芽孢杆菌的分泌性杀虫蛋白Vip3的分泌信号肽分泌量稍显不足，本发明旨在设计合成一种新的信号肽以提高重组抗体的产量。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种提高重组抗体产量的信号肽，以克服现有相关技术所存在的分泌量稍显不足的技术问题，本发明还公开了该信号肽的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种提高重组抗体产量的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
SEQ ID NO.14：MKLPVRLLVLMFWIPAASA。
本发明通过设计优化信号肽，促进细胞表达性能满足使用要求的重组抗体，可以降低抗体的表达周期和生产成本。
具体地，所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
ATGAAGCTGCCCGTGAGGCTGCTGGTGCTGATGTTCTGGATCCCCGCCGCCAGCG CC。
优选地，所述信号肽的编码序列直接连接或间接连接于目的基因的N端。
本发明还公开了上述的提高重组抗体产量的信号肽在制备诱导性表达载体中的应用。
优选地，所述诱导性表达载体为重组原核表达质粒。
优选地，所述重组原核表达质粒的目的基因至少包含抗cTnI抗体基因，所述信号肽的编码序列融合于所述抗cTn I抗体基因的N端；
所述cTnI抗体基因的轻链基因序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，重链基因序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
具体地，如SEQ ID NO.2所示的轻链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.6所示，下游引物如SEQ ID NO.7所示；
如SEQ ID NO.3所示的重链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.8所示，下游引物如SEQ ID NO.9所示；
如SEQ ID NO.4所示的轻链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.10所示，下游引物如SEQ ID NO.11所示；
如SEQ ID NO.5所示的重链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.12所示，下游引物如SEQ ID NO.13所示。
本发明还公开了上述的提高重组抗体产量的信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用。
优选地，所述目的蛋白为抗cTn I抗体。
考虑到真核细胞表达系统的表达周期较长、生产成本较高，因此，优选目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达。
本发明通过优化后的信号肽在原核细胞表达cTn I抗体，有效提高了表达抗体产量，与杂交瘤技术、CHO细胞培养技术相比较，可以大幅度降低抗体生产成本，并在化学发光平台检测验证，检测灵敏度、特异性满足试剂使用要求；另一方面，利用原核表达使本发明的重组抗体批间差异低，无动物伦理问题。
优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌BL21菌株及其衍生菌株中的任意一种，衍生菌株为大肠杆菌BL21(DE3)等。
附图说明
图1为对比例2与对比例1表达抗体检测结果对比；
图2为对比例2与实施例1表达抗体检测结果对比；
图3为对比例1与实施例1表达抗体检测结果对比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种提高重组抗体产量的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。SEQ ID NO.14：MKLPVRLLVLMFWIPAASA。
上述信号肽的编码序列如下(SEQ ID NO.1)：
ATGAAGCTGCCCGTGAGGCTGCTGGTGCTGATGTTCTGGATCCCCGCCGCCAGCG CC。所述信号肽的编码序列直接连接或间接连接于目的基因的N端，形成融合基因，再连接至重组原核表达质粒。
具体操作如下：
一、重组原核表达质粒的构建
1、cTnI抗体基因的获得
1)本实验室自行研发获得2个抗cTnI的杂交瘤细胞株；
2)分别抽提2个杂交瘤细胞株的总RNA，设计RT引物序列为TTTTTTTT，对mRNA进行RT-PCR，获得总cDNA；
3)应用5’RACE技术，设计下游引物分别扩增抗体重链、抗体轻链的可变区基因；引物如下表所示：
抗体轻链引物 TTAGCACTCATTCCTGTTGAAGC
抗体重链引物 TTATTTACCAGGAGAGTGGGAGA
4)获得抗体重链、轻链可变区基因后，送往合作商(生工)进行抗体基因测序，获得抗体基因序列，分别标记为cTnI 1#和cTnI 2#；抗体基因序列如下所示：
2、根据所得抗体基因序列和上述信号肽的编码序列，设计抗体重链、轻链上下游引物，以扩增抗体重链、轻链基因，同时在引物末端添加酶切位点(ECOR I、BamH I)，用于后期质粒构建。
扩增用的酶切位点序列如下表所示：
3、基因扩增或得目的基因后，将2个抗体的轻链、重链，利用酶切位点(ECOR I、BamH I)分别单独构建进质粒PET-28a(+)中，获得两组重组原核表达质粒，即诱导性表达载体。
二、信号肽引导目的抗体的分泌表达测试
本实施例选用的原核表达系统为大肠杆菌BL21，真核表达系统为CHO细胞，用上述两组重组原核表达质粒分别转染CHO细胞和转化大肠杆菌BL21，获得目的抗体。
1、瞬时转染条件如下：
1)接种细胞并培养至适当密度，转染密度为3.0×106cells/ml；
2)制备转染复合物
A、质粒稀释液制备：将质粒加入培养基中，轻轻混匀，质粒稀释液体积为细胞培养总体积的5％；质粒量为10ug质粒每毫升细胞培养液。
B、转染试剂稀释液制备：将转染试剂加入培养基中，轻轻混匀，转染试剂稀释液的体积建议为总体积的5％；转染试剂使用量为10ul转染试剂每微克质粒。
C、质粒-转染试剂复合物制备：将转染试剂稀释液加入质粒稀释液中，轻轻混匀后在室温下孵育10-15min，充分反应形成质粒-转染试剂的复合物。
3)转染细胞
A、将孵育好的质粒-转染试剂复合物直接加入培养好的待转染细胞中，轻柔混匀。
B、置于37℃培养箱中继续培养，表达抗体。
2、用上述两组原核表达质粒分别转化大肠杆菌菌株BL21(天根采购)；转化、诱导方式如下：
A、准备冰盒，感受态放冰上融化，取2μL质粒加到100μBL21感受态中，混匀，冰浴30min。
B、放置42℃水浴锅，热激45s，热激后，放置冰盒，冰浴1min，勿振动。
C、加800μL液体LB培养基(酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，定容至1L超纯水中，混匀后121℃、30min灭菌后使用)轻轻混匀。37℃摇床(斜放)，200rpm，1h。
D、重悬(用枪轻轻吹打混匀)，吸取200μL加入平板(已加kan抗生素)中，涂板。
37℃倒置培养14h—16h。
E、挑选单菌落，进行扩培。
F、细菌在37℃进行扩培，至细菌OD为0.6时，添加IPTG进行诱导，终浓度为1mM，温度调整为32℃，进行诱导表达蛋白。
3、抗体纯化
使用Protein A亲和填料，对分泌表达的抗体进行纯化，记录抗体产量。
抗体纯化方式(CHO、大肠杆菌表达抗体纯化方式一致)如下：
A、将装填好的rProtein ABeads 4FF重力柱用5倍柱体积平衡液(1×PBS)进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。
B、将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min，保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
C、用10-15倍柱体积的洗杂液(1×PBS)进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
D、使用5-10倍柱体积的洗脱液(pH值3的柠檬酸缓冲液)洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测蛋白浓度，收集高浓度蛋白。洗脱组分需要立即调成中性，使用pH9.0 Tris缓冲液进行中和。
对比例1
选用分泌量最大的大肠杆菌OmpA信号肽的一级结构P-AQA作为本对比例的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，也是本发明的优化对象。
SEQ ID NO.15：:MKKTAIAIAVALAGFATVAQA
其余操作与实施例1相同。
对比例2
本对比例为分别分泌抗cTn I 1#单克隆抗体和抗cTn I 2#单克隆抗体的杂交瘤细胞。
实验结果
1、实施例1和对比例1的产量如下表：
对比本发明的信号肽在CHO细胞表达抗体性能与大肠杆菌表达抗体性能可知，本发明的信号肽在原核表达中抗体的产量最高。
2、抗体效价检测
对纯化后的实施例1、对比例1和对比例2进行效价间接检测。
抗体稀释浓度为1ug/mL、0.33ug/mL、0.11ug/mL、0.036ug/mL、0.012ug/mL、0.004ug/mL，使用间接法检测抗体效价，检测结果：10组抗体elisa检测效价接近，具体检测结果见下表。
3、化学发光平台检测灵敏度、特异性
挑选50例临床样本在发光平台检测，分别使用杂交瘤抗体试剂盒(即对比例2)、CHO细胞表达抗体试剂盒(即对比例1中产量较高的“CHO细胞”组别)、原核细胞表达抗体试剂盒(即实施例1中产量较高的“原核细胞”组别)，对临床样本进行检测。
具体结果如图1、图2和图3所示，检测结果表明：本发明信号肽制成的原核表达抗体试剂与杂交瘤抗体试剂、CHO表达抗体试剂结果高度一致，即本发明通过优化后的信号肽在原核细胞表达cTn I抗体，其成品的检测灵敏度、特异性满足试剂使用要求，且本发明的信号肽可以提高表达抗体产量，与杂交瘤技术、CHO细胞培养技术相比较，可以大幅度降低抗体生产成本，且利用原核表达使本发明的重组抗体批间差异低，无动物伦理问题。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种提高重组抗体产量的信号肽，其特征在于，其氨基酸序列如下：
MKLPVRLLVLMFWIPAASA。
2.根据权利要求1所述的提高重组抗体产量的信号肽，其特征在于，所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的提高重组抗体产量的信号肽，其特征在于，所述信号肽的编码序列直接连接或间接连接于目的基因的N端。
4.权利要求1至3任一权利要求所述的提高重组抗体产量的信号肽在制备诱导性表达载体中的应用，其特征在于，所述诱导性表达载体为重组原核表达质粒；
所述重组原核表达质粒的目的基因至少包含抗cTnI抗体基因，所述信号肽的编码序列融合于所述抗cTn I抗体基因的N端；
所述cTnI抗体基因的轻链基因序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，重链基因序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求6所述的提高重组抗体产量的信号肽在制备诱导性表达载体中的应用，其特征在于，
如SEQ ID NO.2所示的轻链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.6所示，下游引物如SEQID NO.7所示；
如SEQ ID NO.3所示的重链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.8所示，下游引物如SEQID NO.9所示；
如SEQ ID NO.4所示的轻链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.10所示，下游引物如SEQID NO.11所示；
如SEQ ID NO.5所示的重链基因序列的上游引物如SEQ ID NO.12所示，下游引物如SEQID NO.13所示。
6.权利要求1至3任一权利要求所述的提高重组抗体产量的信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用，其特征在于，所述目的蛋白为抗cTn I抗体。
7.根据权利要求8所述的提高重组抗体产量的信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用，其特征在于，所述目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达。
8.根据权利要求9所述的提高重组抗体产量的信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用，其特征在于，所述原核表达系统为大肠杆菌BL21菌株及其衍生菌株中的任意一种。
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