WO2009107682A1 - ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法 - Google Patents

ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2009107682A1
WO2009107682A1 PCT/JP2009/053456 JP2009053456W WO2009107682A1 WO 2009107682 A1 WO2009107682 A1 WO 2009107682A1 JP 2009053456 W JP2009053456 W JP 2009053456W WO 2009107682 A1 WO2009107682 A1 WO 2009107682A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human
type
fcγri
receptor
bacillus
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/053456
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
秀峰 小林
輝彦 井出
Original Assignee
東ソー株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東ソー株式会社 filed Critical 東ソー株式会社
Publication of WO2009107682A1 publication Critical patent/WO2009107682A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

Definitions

  • the present invention relates to a method for expressing a large amount of Fc ⁇ RI, which is one of human Fc receptors, using a bacterium belonging to the genus Bacillus without performing solubilization or the like.
  • Fc receptors are a group of molecules that bind to the Fc region of immunoglobulin molecules. Fc receptors are classified according to the type of immunoglobulin to which they bind, and include Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgG, Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgE, Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgA, etc. Patent Document 1). Each receptor is further classified according to the difference in structure. In the case of Fc ⁇ receptor, the presence of Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RII and Fc ⁇ RIII has been reported (Non-patent Document 1).
  • Fc ⁇ RI which is one of the Fc ⁇ receptors, is expressed in monocytes and macrophages, and is inducibly expressed in neutrophils by ⁇ interferon (Non-patent Document 1).
  • Fc ⁇ RI has a high binding affinity for IgG, and its equilibrium dissociation constant (Kd) is 10 ⁇ 8 M or less (Non-patent Document 2).
  • Fc ⁇ RI is divided into an extracellular region, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region, and binding to IgG occurs in the Fc region of IgG and the extracellular region of Fc ⁇ RI, and then a signal is transmitted to the cytoplasm.
  • Fc ⁇ RI is composed of two types of subunits, an ⁇ chain with a molecular weight of about 42000 that is directly involved in binding to IgG, and a ⁇ chain.
  • the ⁇ chain covalently binds at the boundary between the cell membrane and the extracellular region, thereby forming homodimers.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of human Fc ⁇ RI.
  • the amino acid numbers in the figure correspond to the amino acid numbers described in SEQ ID NO: 1.
  • the unexpected immunosuppressive biological properties of Fc receptors have attracted attention as pharmaceuticals, particularly in the areas of autoimmune disease or autoimmune syndrome, transplant rejection and malignant lymphoproliferation.
  • Reference 2 the antibody adsorption ability, which is a function of Fc ⁇ RI, can also be used as a protein responsible for the capture function of various antibody purification chromatography gels.
  • Non-Patent Document 4 The amino acid sequence and gene base sequence of the Fc ⁇ RI ⁇ chain (Non-Patent Document 4) were clarified by Janet et al., And then expression using E. coli (Patent Document 1) or animal cells has been reported by genetic recombination techniques.
  • the expression amount of the extracellular region protein of Fc ⁇ RI is extremely low, and the expressed protein is expressed in the cell, so that the expressed protein often becomes an insoluble inclusion body.
  • Inclusion body protein can be prepared as an active protein by an operation such as solubilization, but it requires a complicated operation.
  • an expression level higher than that of Escherichia coli has been reported (Non-patent Document 3), but it takes a long time to culture and the productivity is not high.
  • An object of the present invention is to produce a microorganism that produces human Fc receptor Fc ⁇ RI with high productivity on an industrial production scale. Furthermore, human Fc ⁇ RI production is performed using a novel Fc receptor production system to provide the human Fc ⁇ RI.
  • the inventors of the present application have converted the human type Fc receptor Fc ⁇ RI gene codon from a human type into a Bacillus genus bacterial type, and then inserted the converted polynucleotide into an expression plasmid vector.
  • active Fc ⁇ RI that does not require solubilization and the like can be directly produced, and the expression level is also dramatically increased. Found to improve.
  • the present invention includes the following inventions: (1) The polynucleotide sequence encoding the human type Fc receptor Fc ⁇ RI shown in SEQ ID NO: 1 is characterized in that at least the 64th to 867th nucleotide codons have been converted from a human type to a Bacillus bacterium type. A polynucleotide encoding the human type Fc receptor Fc ⁇ RI. (2) The polynucleotide encoding the human Fc receptor Fc ⁇ RI according to (1) above, which is the polynucleotide of SEQ ID NO: 3. (3) A plasmid vector into which the polynucleotide according to (1) or (2) is inserted.
  • the human type Fc ⁇ RI can be obtained by converting the codon of the gene encoding the human type Fc receptor Fc ⁇ RI from a human type to a bacterium belonging to the genus Bacillus, and transforming a plasmid into which the polynucleotide has been inserted into a bacterium belonging to the genus Bacillus. It can be expressed in large quantities without manipulation such as solubilization. This expression system is useful for the production of human Fc ⁇ RI on an industrial production scale.
  • Bacillus Fc ⁇ RI is the base sequence of human Fc ⁇ RI (SEQ ID NO: 2) converted to a Bacillus bacterial codon
  • HumanFc ⁇ RI is the base sequence of human Fc ⁇ RI (SEQ ID NO: 1) before codon conversion.
  • Bacillus Fc ⁇ RI is the base sequence of human Fc ⁇ RI (SEQ ID NO: 2) converted to a Bacillus bacterial codon
  • HumanFc ⁇ RI is the base sequence of human Fc ⁇ RI (SEQ ID NO: 1) before codon conversion.
  • plasmid vector pBBFcR It is a figure which shows the base sequence of plasmid vector pNCMO2 multicloning site.
  • the polynucleotide of the present invention comprises at least the 64th to 867th polynucleotides of the polynucleotide sequence encoding Fc ⁇ RI, which is one of the human Fc receptors shown in SEQ ID NO: 1 (the amino acid number 22 of SEQ ID NO: 1).
  • a polynucleotide encoding a human Fc receptor Fc ⁇ RI comprising a polynucleotide obtained by converting a codon of alanine (Ala) to 289 valine (Val) encoding a codon from a human type to a Bacillus bacterium type
  • the human Fc receptor wherein the polynucleotide obtained by converting the codons of the 64th to 867th polynucleotides from human to Bacillus is a polynucleotide of SEQ ID NO: 3 Polynucleo encoding Fc ⁇ RI In degrees.
  • the polynucleotide obtained by converting the codon of the polynucleotide encoding Fc ⁇ RI of the present invention from the human type to the Bacillus genus bacterial type is a polynucleotide of at least the 64th to 867th nucleotides of SEQ ID NO: 1 among the genes encoding the human type Fc ⁇ RI.
  • the rare codon in the Bacillus genus bacteria present in is obtained by converting the encoded amino acid into a codon that is frequently used in the translation mechanism of the Bacillus bacterium while keeping the encoded amino acid identical.
  • the rare codon means a codon that is used less frequently in the host.
  • the frequency of codon usage in the host can be inferred from the analysis results of the base sequence of the genomic gene and the like.
  • the rare codon in Brevibacterium choshinensis a kind of bacteria belonging to the genus Bacillus, UCA, leucine (Leu) codon CUA, arginine (Arg) codon CGG, AGA, AGG and isoleucine (Ile) codon AUA.
  • Information on codon usage frequency can also be obtained from a public database (http://www.kazusa.or.jp/codon/). Conversion from a rare codon to a frequently used codon is possible by converting the corresponding base sequence.
  • a known mutagenesis method such as Site-directed mutagenesis can be used.
  • a preferable conversion method is a DNAWorks method (Non-patent Document 5) or a Synthetic Gene Designer method (Non-patent Document 6) in which a synthetic oligonucleotide and PCR are combined.
  • a full-length gene can be prepared by synthesizing an oligonucleotide group consisting of several tens of bases based on the amino acid sequence encoding the polypeptide and assembling the synthetic oligonucleotide by the PCR method.
  • the codon conversion of the human Fc ⁇ RI-encoding polynucleotide from the human type to the Bacillus genus bacterial type is carried out by removing all rare codons of the human type Fc ⁇ RI gene sequence (SEQ ID NO: 1) from the human type as described in Examples. It may be converted into a Bacillus bacterium type (SEQ ID NO: 2), or a part of rare codons, for example, a rare codon at positions 64 to 867 in the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be changed from a human type to a Bacillus bacterium type. You may convert (sequence number 3).
  • the polynucleotide encoding human Fc ⁇ RI encodes methionine for initiating transcription on the 5 ′ end side of the polynucleotide obtained by converting the codon of the polynucleotide encoding human Fc ⁇ RI from the human type to the Bacillus genus bacterial type. May be added, or an oligonucleotide encoding a signal peptide sequence may be added to the 5′-terminal side of the polynucleotide described above.
  • the signal peptide described here is a polypeptide for allowing a protein expressed in the cytoplasm to pass through the cell membrane and be secreted outside the cell membrane, and is usually present on the N-terminal side of the protein and after passing through the cell membrane. Cleaved by specific protease enzymes. Examples of the signal peptide include peptides of amino acid numbers 1 to 15 or 1 to 20 of SEQ ID NO: 1.
  • an oligonucleotide encoding a peptide serving as a tag may be added to the polynucleotide described above.
  • the tag peptide include polyhistidine tag (His-tag), Mick tag (C-myc tag) and the like.
  • the position to be added may be on either the N-terminal side or the C-terminal side as long as the biological activity of the above-mentioned polypeptide is not impaired.
  • Addition of an oligonucleotide encoding a tag peptide to the oligonucleotide described above can be made by genetic engineering by a method well known to those skilled in the art.
  • the gene recombinant plasmid vector into which the human type Fc ⁇ RI polynucleotide in which the codon has been converted from the human type to the Bacillus bacterium type according to the present invention is inserted into the above-described human type Fc ⁇ RI polynucleotide at an appropriate position of the known expression plasmid vector.
  • a recombinant plasmid vector capable of expressing human Fc ⁇ RI can be obtained.
  • Examples of known expression plasmid vectors include pUB110, pC194, pE194, pWVO1, etc. used for transformation of Bacillus bacteria.
  • the appropriate position mentioned here means a position that does not destroy the replication function of the plasmid vector, a desired antibiotic marker, or a region related to transmissibility.
  • human Fc ⁇ RI can be expressed by culturing a transformant obtained by transforming the aforementioned recombinant plasmid vector into a bacterium belonging to the genus Bacillus.
  • the host cell used for transformation in the present invention may be a bacterium belonging to the genus Bacillus that is the target of codon conversion. megaterium, Bacillus mecerans, Bacillus coagulans, Bacillus lentus and the like.
  • Breibacillus choshinensis (Non-patent Document 7), in which a spore formation-related gene is disrupted and the intracellular protease gene jmp and extracellular protease gene emp are also preferably used as the host cell.
  • derived by carrying out the mutation process of the bacteria which belong to the said Bacillus genus can also be utilized. Mutation treatment may be performed using a mutating agent well known to those skilled in the art, such as nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonate, ultraviolet light, and radiation.
  • the procedures and methods for the introduction and expression of foreign genes into Bacillus bacteria of the present invention include those conventionally used in the field of genetic engineering in addition to the methods described in the Examples. Examples of the electroporation method and the Tris-PEG method.
  • Bacteria belonging to the genus Bacillus used for producing human-type Fc ⁇ RI of the present invention can be grown on a known medium suitable for culturing selected host cells. Any medium can be used as the medium used in the present invention as long as bacteria can grow and produce human Fc ⁇ RI.
  • the carbon source includes molasses, glucose, fructose, maltose, sucrose, starch, Lactose, glycerol, acetic acid, etc.
  • nitrogen sources include natural ingredients such as corn steep liquor, peptone, yeast extract, meat extract, soybean meal, and amino acids such as ammonium acetate, aspartic acid, glycine, etc.
  • Phosphate and sodium chloride such as monosodium acid, disodium phosphate, monopotassium phosphate, and dipotassium phosphate include magnesium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, ferric sulfate, and chloride.
  • Copper chloride, manganese sulfate, manganese chloride, and yeast extract as vitamins, biotin, nicotinic acid, thiamine, riboflavin, inositol, pyridoxine, or the like can be used.
  • the medium may contain a selection agent based on the construction of the expression plasmid vector in order to selectively allow growth of Bacillus bacteria containing the expression plasmid vector.
  • a selection agent based on the construction of the expression plasmid vector in order to selectively allow growth of Bacillus bacteria containing the expression plasmid vector.
  • neomycin is added to the medium for the growth of cells expressing the neomycin resistance gene.
  • a suitable nutrient source may be added to the medium. If desired, it may contain one or more reducing agents selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycolate and dithiothreitol.
  • the culture temperature in the growth of Bacillus bacteria is preferably about 20 to 40 ° C, more preferably 25 to 35 ° C, and particularly preferably about 30 ° C.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to 10, more preferably 7.0.
  • the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution is measured, After the transition from the logarithmic growth phase to the stationary phase, the protein can be secreted and expressed in the culture solution by subsequent culturing.
  • the culture time is preferably 24 to 96 hours, more preferably 40 to 50 hours, but the optimum culture time varies depending on conditions such as medium components, culture temperature, and aeration volume. It is preferable to determine by measuring and the like.
  • an extraction method may be appropriately selected depending on the form of expression.
  • the cells When expressed in the culture supernatant, the cells are separated by centrifugation, and human-type Fc ⁇ RI may be extracted from the resulting culture supernatant.
  • the bacterial cells When expressed in the cytoplasm, the bacterial cells are collected by centrifugation, and the bacterial cells are disrupted by adding an enzyme treatment agent, a surfactant or the like, and human Fc ⁇ RI can be extracted.
  • liquid chromatography can be used. Examples of liquid chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like.
  • a high-purity human Fc ⁇ RI can be prepared by performing a purification operation by combining these chromatographies.
  • the antibody can be adsorbed and separated from the liquid phase by immobilizing the purified human Fc ⁇ RI obtained according to the present invention on the stationary phase.
  • the stationary phase include polysaccharides such as cellulose and agarose, glass, ceramics, and plastic materials such as polypropylene, vinyl chloride, and polystyrene. It can also be used as a chromatography gel for antibodies by filling a column with human Fc ⁇ RI immobilized on a solid phase.
  • human serum as a specimen, highly specific immunoassay is possible, and it can be used as various diagnostic materials.
  • Example 1 Design of DNA sequence encoding human Fc receptor Codon was converted to Brevibacillus genus by DNAworks method (Non-patent Document 5) based on the amino acid sequence of human Fc receptor Fc ⁇ RI described in SEQ ID NO: 1. did.
  • FIG. 2 shows the result of comparing the base sequence of human Fc ⁇ RI (SEQ ID NO: 2) whose codons were converted by this method with the base sequence of human Fc ⁇ RI (SEQ ID NO: 1) before codon conversion. As shown in FIG. 2, the DNA sequence was converted without changing the amino acid sequence, and the similarity between the DNA sequences was 75%.
  • Example 2 Preparation of DNA sequence encoding human Fc receptor A DNA sequence in which the codon of the human Fc ⁇ RI gene was converted from human to Brevibacillus was prepared by the following method. (1) 52 types of oligonucleotides for synthesizing a human Fc ⁇ RI gene codon from a human type to a Brevibacillus genus bacterial type were synthesized. The synthesized oligonucleotides are shown in SEQ ID NOs: 4 to 55. (2) In order to prepare DNA encoding full-length human Fc ⁇ RI from the oligonucleotide synthesized in (1), two-step PCR was performed.
  • the reaction solution of the first stage PCR is as shown in Table 1, and the reaction conditions are 94 ° C for 5 minutes after heat treatment, 94 ° C for 30 seconds first step, 62 ° C for 30 seconds second. Step, the third step of 72 ° C. for 1 minute is performed 25 cycles, followed by the fourth step of 72 ° C. for 7 minutes.
  • the DNA mix in Table 1 is a solution in which a fixed amount of each of 52 types of synthesized 50 pmol / ⁇ L oligonucleotides was sampled and mixed.
  • the second-stage PCR was performed using the reaction solution of the first-stage PCR and the reaction solution composition shown in Table 2.
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 (5′-ATgTggTTCTTgACAACTCTCCTgCTTTggggTCCC-3 ′) and SEQ ID NO: 55 (5′-AgTAgCgCCTTgCggTTCTTTACgATgCACgCCCTCC-3 ′) was used.
  • the reaction conditions were as follows: heat treatment at 94 ° C. for 5 minutes, 25 cycles of the first step at 94 ° C. for 30 seconds, the second step at 65 ° C. for 30 seconds, and the third step at 72 ° C. for 1 minute.
  • the fourth step at 7 ° C.
  • a human Fc ⁇ RI expression plasmid vector was prepared by the following method.
  • SEQ ID NO: 56 (5′-ACATg [CCATgg] CTTTCgCTgCAgATCCgCTgTAATCACTCTgCAgCCAC-3 ′: the base in the brackets is the restriction enzyme NcoI site) and SEQ ID NO: 57 (5′-gC [TCTAgA] CTAATggTgTgTgTggggg ': PCR was carried out using the oligonucleotide in the restriction bracket XbaI site as a primer for the base in square brackets to amplify the DNA encoding the extracellular region.
  • a PCR primer was designed so that a polyhistidine tag was added to the C-terminal side of the expressed protein (SEQ ID NO: 57).
  • the reaction conditions were as follows: heat treatment at 94 ° C. for 5 minutes, 25 cycles of the first step at 94 ° C. for 30 seconds, the second step at 65 ° C. for 30 seconds, and the third step at 72 ° C. for 1 minute.
  • the fourth step at 7 ° C. Table 3 shows the reaction solution composition.
  • FIG. 4 shows the base sequence around the multicloning site of the pNCMO2 plasmid vector
  • FIG. 5 shows an outline of the method for preparing the plasmid vector pNCBBFcR described above.
  • an expression vector using human codon DNA encoding the extracellular region of human Fc ⁇ RI was also prepared.
  • An insert fragment was prepared by PCR, and a human cDNA clone TC119841 plasmid vector (manufactured by Origen) was used as a template.
  • SEQ ID NO: 59 (5′-gC [TCTAgA] CTAATggTgATggTgATggTggACAggAgTTggTAACTgg-3 ′: the base in brackets is the restriction enzyme XbaI site) was used as a PCR primer.
  • a PCR primer was designed so that a polyhistidine tag was added to the C-terminal side of the expressed protein (SEQ ID NO: 59).
  • the first step at 94 ° C. for 30 seconds, the second step at 65 ° C. for 30 seconds, and the third step at 72 ° C. for 1 minute are performed for 25 cycles. ⁇
  • the fourth step of 7 minutes. Table 4 shows the reaction solution composition.
  • FIG. 6 shows an outline of a method for preparing the plasmid vector pNCHUFcR described above.
  • Example 4 Confirmation of Sequence A Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (trade name) (PE Applied Biosystems) based on the chain terminator method was used to insert the DNA sequences inserted into the pNCBBFcR and pNCHUFcR plasmid vectors prepared in Example 3. The sample was subjected to a cycle sequence reaction and analyzed with a fully automatic DNA sequencer ABI Prism 310 DNA analyzer (trade name) (PE Applied Biosystems). The oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 60 (5′-CgCTTgCAggATTCgg-3 ′) and 61 (5′-CAATgTAATTgTTCCCTACCTgC-3 ′) were used as sequencing primers.
  • Example 6 Evaluation of Antibody Binding Activity of Transformant Antibody binding activity of the culture supernatant of the transformant prepared in Example 5 was evaluated by ELISA reaction.
  • Results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, it was found that the antibody binding activity of the culture supernatant derived from Bacillus bacteria transformed with pNCBBFcR was significantly higher than that of pNCHUFcR. That is, when human-type Fc ⁇ RI is expressed in a host Bacillus bacterium, a gene in which the codon of the base sequence encoding the protein is converted from a human type to a Bacillus bacterium type is higher expressed in the Bacillus bacterium host. . In addition, human type Fc ⁇ RI expressed using the transformant prepared in Example 5 was obtained because an active protein having antibody binding property was obtained without any manipulation such as solubilization. The protein production method using the transformant prepared in Example 5 can be said to be useful for production of the protein as compared with the conventional system using E. coli or animal cells.
  • Example 7 Changes in culture time of Bacillus bacteria transformed with pNCBBFcR Among the arbitrary colonies evaluated in Example 5, the clone with the highest antibody binding activity was selected and cultured in a flask. That is, a highly active clone was inoculated into a 500 mL baffled flask added with 200 mL TM liquid medium (Table 6) added with 10 ⁇ g / mL antibiotic neomycin, and cultured at 30 ° C. with stirring at 150 rpm. The culture solution was sampled for an appropriate time, and a culture supernatant was prepared in the same manner as in Example 6. The antibody binding activity was evaluated in the same manner as in Example 6. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, it was found that human Fc ⁇ RI was produced from about 24 hours in culture and most produced in 53 hours of culture.
  • Example 8 Detection of Fc receptor by Western blotting method
  • the culture supernatant prepared in Example 7 was subjected to SDS-PAGE electrophoresis, and detection by Western blotting was performed.
  • (1) 10 ⁇ L of the culture supernatant and 10 ⁇ L of a sample buffer containing mercaptoethanol were mixed, and after heat treatment at 98 ° C. for 5 minutes, electrophoresis using a polyacrylamide gel with a 10 to 20% gradient was performed.
  • the present invention provides a method for expressing a large amount of Fc ⁇ RI, which is one of human Fc receptors, using a bacterium belonging to the genus Bacillus, without performing operations such as solubilization. It is useful for the production of human Fc ⁇ RI on an industrial production scale. It should be noted that the entire contents of the specification, claims, drawings and abstract of Japanese Patent Application No. 2008-046438 filed on February 27, 2008 are cited here as disclosure of the specification of the present invention. Incorporated.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　工業生産規模においてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを生産する微生物を作製し、さらには、新規Ｆｃレセプター生産系を利用してヒト型ＦｃγＲＩ生産を行ない、該ＦｃγＲＩを提供する。 　ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドを調製し、当該ポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドベクターをバチルス属細菌に形質転換することでヒト型ＦｃγＲＩを可溶化等の操作をせずに大量発現させることが可能となる。

Description

ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
　本発明は、ヒト型ＦｃレセプターのひとつであるＦｃγＲＩを、バチルス属に属する細菌を用いることで、可溶化等の操作をせずに大量発現させる方法に関する。
　Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
　Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０－８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後、細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
　ヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列および細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９４のロイシン（Ｌｅｕ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
　近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
　ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内発現のため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化等の操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
特表２００４－５３０４１９号公報 Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１ Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ　Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５ Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５ Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ　Ｐｕｒｉｆ．、４７、４４１－４４５、２００６ Ｍａｓａｙａ　Ｎａｇａｏ等、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１、６７０、１９９７
　本発明の目的は工業生産規模においてヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩを高い生産性を以って生産する微生物を作製することである。さらには、新規Ｆｃレセプター生産系を利用してヒト型ＦｃγＲＩ生産を行ない、当該ヒト型ＦｃγＲＩを提供することにある。
　本願発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをヒト型からバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌型に変換後、変換したポリヌクレオチドを発現プラスミドベクターに挿入し、当該挿入されたプラスミドベクターにより形質転換されたバチルス属に属する細菌を用いて発現させることで、可溶化等の操作が不要な活性型ＦｃγＲＩを直接生産することができ、かつ、その発現量も飛躍的に向上することを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号１に示すヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のヌクレオチド配列のコドンがヒト型からバチルス属細菌型に変換されたことを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
（２）配列番号３のポリヌクレオチドであることを特徴とする、上記（１）に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
（３）上記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドベクター。
（４）上記（３）に記載のプラスミドベクターをバチルス属に属する細菌に形質転換することにより得られる、形質転換体。
（５）上記（４）に記載の形質転換体を培養する工程を含むヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩポリペプチドの製造方法。
　ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードする遺伝子のコドンを、ヒト型からバチルス属細菌型に変換し、当該ポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドをバチルス属に属する細菌に形質転換させることで、ヒト型ＦｃγＲＩを可溶化等の操作なく大量に発現させることが可能となる。この発現系は、工業生産規模におけるヒト型ＦｃγＲＩの生産に有用なものである。
ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造を示す図である。 ヒト型ＦｃγＲＩのヒト型コドンおよびバチルス属細菌型コドン間の塩基配列を比較した図である。図中、ＢａｃｉｌｌｕｓＦｃγＲＩがバチルス属細菌型コドンに変換したヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号２）、ＨｕｍａｎＦｃγＲＩがコドン変換前のヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号１）である。 プラスミドベクターｐＢＢＦｃＲの構造を示す図である。 プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２マルチクローニングサイトの塩基配列を示す図である。 プラスミドベクターｐＮＣＢＢＦｃＲの作製方法を示す図である。 プラスミドベクターｐＮＣＨＵＦｃＲの作製方法を示す図である。 実施例５で調製した形質転換体（ヒト型コドン由来、またはバチルス属細菌型コドン由来）を用いて発現させたヒト型ＦｃγＲＩの抗体結合活性を比較した図である。 バチルス属細菌によるヒト型ＦｃγＲＩの生産を示す図である。 ウエスタンブロッティング法によるヒト型ＦｃγＲＩの検出結果を示す図である。なお、図中のレーン番号は、１が培養２４時間後、２が３３時間後、３が４８時間後、４が５８時間後、５が１００時間経過後の培養上清に対して、抗ＣＤ６４抗体により検出した結果である。
発明を実施するための形態
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す、ヒト型Ｆｃレセプターの一つであるＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド（配列番号１のアミノ酸番号２２のアラニン（Ａｌａ）から２８９のバリン（Ｖａｌ）をコードするポリヌクレオチド）のコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、上記６４番目から８６７番目のポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドが、配列番号３のポリヌクレオチドであることを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドである。
　本発明のＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードする遺伝子のうち、少なくとも配列番号１の６４番目から８６７番目のポリヌクレオチド中に存在するバチルス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ　ｃｏｄｏｎ）を、コードするアミノ酸を同一のまま、バチルス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換することにより得られる。なお、レアコドンとは、その宿主におけるコドンの使用頻度が少ないものをいう。宿主におけるコドンの使用頻度は、ゲノム遺伝子の塩基配列等の解析結果等から推測することが可能であり、例えば、バチルス属細菌の一種であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓにおけるレアコドンとしては、アミノ酸セリン（Ｓｅｒ）コドンのＵＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧおよびイソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡがあげられる。また、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）からも得ることができる。レアコドンから利用頻度の高いコドンへの変換は対応する塩基配列を変換することにより可能である。塩基配列の変換はＳｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法など公知の変異導入法を利用することができる。好ましい変換方法は、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）やＳｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）である。上記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲ法により合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。なお、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのヒト型からバチルス属細菌型へのコドン変換は、実施例に記載のように、ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子配列（配列番号１）のすべてのレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換（配列番号２）しても良いし、一部のレアコドン、例えば配列番号１に示すポリヌクレオチド配列のうち６４番目から８６７番目にあるレアコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換（配列番号３）してもよい。
　さらにヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒト型ＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドのコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したポリヌクレオチドの５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンをコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良く、また上記記載のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを付加しても良い。ここに述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側に存在しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの例としては、配列番号１のアミノ酸番号１から１５、あるいは１から２０のペプチドをあげることができる。
　本発明は、ヒト型ＦｃγＲＩを簡便に精製することを目的として、上記記載のポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）、ミックタグ（Ｃ－ｍｙｃ　ｔａｇ）等を例示することができる。付加させる位置は、上述のポリペプチドの生物活性を損なわない限りにおいて、Ｎ末端側、Ｃ末端側どちらでも構わない。上記記載のオリゴヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
　本発明の、コドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換したヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドが挿入された遺伝子組換えプラスミドベクターは、上記記載のヒト型ＦｃγＲＩポリヌクレオチドを公知の発現プラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、ヒト型ＦｃγＲＩが発現可能な遺伝子組換えプラスミドベクターを得ることができる。公知の発現プラスミドベクターとしては、例えば、バチルス属細菌の形質転換に利用されるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＷＶＯ１等をあげることができる。ここで述べる適当な位置とはプラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しないような位置等を意味する。そして、上記記載の遺伝子組換えプラスミドベクターをバチルス属の属する細菌に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、ヒト型ＦｃγＲＩを発現させることがきる。
　本発明で形質転換に用いる宿主細胞は、コドンの変換対象であるバチルス属に属する細菌であれば良く、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ等をあげることができる。特に、胞子形成関連遺伝子が破壊されており、かつ、菌体内プロテアーゼ遺伝子ｊｍｐや菌体外プロテアーゼ遺伝子ｅｍｐも破壊されている、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ（非特許文献７）を宿主細胞として用いるのが好ましい。また、上記バチルス属に属する細菌を変異処理することにより誘導されるバチルス属細菌変異株を利用することもできる。変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線、放射線等の当業者において周知の変異処理剤を利用して行なえばよい。
　本発明の、バチルス属細菌への外来遺伝子の導入および発現のための手順、および方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法等をあげることができる。
　本発明の、ヒト型ＦｃγＲＩを生産するために用いられるバチルス属に属する細菌は、選択した宿主細胞の培養に好適な公知の培地で増殖させることができる。なお、本発明に用いる培地としては細菌が増殖し、ヒト型ＦｃγＲＩを生産し得るものであれば何れも使用してよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガン等が、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。好ましい実施態様では、発現プラスミドベクターを含有するバチルス属細菌の増殖を選択的に可能にするために、培地は発現プラスミドベクターの構成を基にした選抜剤を含んでもよい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のためにネオマイシンを培地に添加する。培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を加えてもよい。所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでも良い。バチルス属細菌増殖における培養温度は、好ましくは約２０から４０℃、より好ましくは２５から３５℃であり、特に好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、好ましくは約５から１０、より好ましくは７．０である。
　本発明の発現プラスミドベクターに宿主菌の細胞壁タンパク質由来のプロモータを用いる場合には、菌の生育が定常期に入ってから活発に働くため、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、対数増殖期から定常期に移行した後、引き続き培養することによりタンパク質を培養液中へ分泌発現させることができる。培養時間は好ましくは２４から９６時間、より好ましくは４０から５０時間であるが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したタンパク質の発現量や活性等を測定して決定するのが好ましい。
　培養液から、本発明のヒト型ＦｃγＲＩを取得するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒト型ＦｃγＲＩを抽出すればよい。細胞質内で発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集め、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、ヒト型ＦｃγＲＩを抽出することができる。抽出タンパク質の中からヒト型ＦｃγＲＩを分離・精製するためには液体クロマトグラフィーを利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒト型ＦｃγＲＩを調製することができる。
　本発明により得られた精製したヒト型ＦｃγＲＩを、固定相に固定化することにより抗体を液相から吸着させ分離することができる。固定相としてはセルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、セラミックス、あるいは、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン等のプラスチック素材を例示することができる。また、固相に固定したヒト型ＦｃγＲＩをカラムに充填することにより抗体に対するクロマトグラフィーゲルとしても利用することができる。また、ヒト血清を検体にすることにより特異性の高いイムノアッセイが可能であり各種診断材料としても利用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例１　ヒト型ＦｃレセプターをコードするＤＮＡ配列の設計
　配列番号１に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩのアミノ酸配列を基にＤＮＡｗｏｒｋｓ法（非特許文献５）により、コドンをブレビバチルス属細菌型に変換した。該方法によりコドンを変換したヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号２）とコドン変換前のヒト型ＦｃγＲＩの塩基配列（配列番号１）を比較した結果を図２に示す。図２の通り、アミノ酸配列はそのままにＤＮＡ配列の変換が行われ、そのＤＮＡ配列間の類似性は７５％であった。
　実施例２　ヒト型ＦｃレセプターをコードするＤＮＡ配列の作製
　ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをヒト型からブレビバチルス属細菌型に変換したＤＮＡ配列を以下の方法で作製した。
（１）ヒト型ＦｃγＲＩ遺伝子のコドンをヒト型からブレビバチルス属細菌型に変換したＤＮＡ配列を作製するための５２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドを配列番号４から５５に示す。
（２）（１）で合成したオリゴヌクレオチドから完全長のヒト型ＦｃγＲＩをコードするＤＮＡを作製するために、二段階のＰＣＲを行なった。
（２－１）一段階目のＰＣＲの反応液は表１の通りで、反応条件は９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６２℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、次いで、７２℃・７分の第四ステップである。表１中のＤＮＡミックスは５２種類の合成した５０ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （２－２）二段階目のＰＣＲは一段階目のＰＣＲの反応液を用いて、表２の反応液組成で行なった。ＰＣＲプライマーの配列は、配列番号４（５’－ＡＴｇＴｇｇＴＴＣＴＴｇＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴｇＣＴＴＴｇｇｇＴＣＣＣ－３’）と配列番号５５（５’－ＡｇＴＡｇＣｇＣＣＴＴｇＣｇｇＴＴＣＴＴＴＡＣｇＡＴｇＣＡＣｇＣＣＣＴＣＣ－３’）のオリゴヌクレオチドを用いた。反応条件は９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の第四ステップである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　反応終了後０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンド（約１１００塩基対）を確認することができた。
（３）目的バンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）後、抽出ＤＮＡの５’末端をリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドベクターに挿入し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。これをｐＢＢＦｃＲとした。図３に構造を示す。
　実施例３　ヒト型ＦｃγＲＩ細胞外領域発現プラスミドベクターの作製
　ヒト型ＦｃγＲＩの細胞外領域を発現させるために、以下に示す方法でヒト型ＦｃγＲＩ発現プラスミドベクターの作製を行なった。
（１）ｐＢＢＦｃＲをテンプレートにし、配列番号５６（５’－ＡＣＡＴｇ［ＣＣＡＴｇｇ］ＣＴＴＴＣｇＣＴｇＣＡｇｇＡＴＣＣｇＣＴｇＴＡＡＴＣＡＣＴＣＴｇＣＡｇＣＣＡＣ－３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）と配列番号５７（５’－ｇＣ［ＴＣＴＡｇＡ］ＣＴＡＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇｇＡＣＴｇｇＡｇＴＡｇｇＣＡｇＴＴｇ－３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行ない、細胞外領域をコードするＤＮＡを増幅した。なお、ヒト型ＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した（配列番号５７）。反応条件は９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の第四ステップである。反応液組成を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
（２）目的バンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）後、抽出ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）とライゲーションし、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し調製した。これをｐＮＣＢＢＦｃＲとした。図４にｐＮＣＭＯ２プラスミドベクターのマルチクローニングサイト周辺の塩基配列、図５に上記に記載したプラスミドベクターｐＮＣＢＢＦｃＲの作製方法の概略を示す。
（３）並行して、ヒト型ＦｃγＲＩの細胞外領域をコードするヒト型コドンのＤＮＡを用いた発現ベクターも作製した。挿入断片の作製はＰＣＲで行ない、Ｈｕｍａｎ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ＴＣ１１９８４１プラスミドベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号５８（５’－ＣｇＣ［ｇｇＡＴＣＣ］ｇＣＡｇＴｇＡＴＣＡＣＴＴＴｇＣＡｇＣＣＴＣＣＡＴｇｇｇ－３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＢａｍＨＩサイト）と配列番号５９（５’－ｇＣ［ＴＣＴＡｇＡ］ＣＴＡＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇＡＴｇｇＴｇｇＡＣＡｇｇＡｇＴＴｇｇＴＡＡＣＴｇｇ－３’：角かっこ内の塩基は制限酵素ＸｂａＩサイト）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ヒト型ＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した（配列番号５９）。ＰＣＲは９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の第四ステップである。反応液組成を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　反応終了後０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
（４）目的バンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）後、抽出ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（商品名）：タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し調製した。これをｐＮＣＨＵＦｃＲとした。図６に、上記に記載したプラスミドベクターｐＮＣＨＵＦｃＲの作製方法の概略を示す。
　実施例４　配列の確認
　実施例３において作製したｐＮＣＢＢＦｃＲ　およびｐＮＣＨＵＦｃＲプラスミドベクターに挿入したＤＮＡの配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（商品名）（ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３１０　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（ＰＥアプライドバイオシステム社）にて解析した。なお、配列番号６０（５’－ＣｇＣＴＴｇＣＡｇｇＡＴＴＣｇｇ－３’）と６１（５’－ＣＡＡＴｇＴＡＡＴＴｇＴＴＣＣＣＴＡＣＣＴｇＣ－３’）に示すオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
　解析の結果、ｐＮＣＢＢＦｃＲおよびｐＮＣＨＵＦｃＲに挿入したＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。ｐＮＣＢＢＦｃＲおよびｐＮＣＨＵＲｃＲにより発現されるヒト型ＦｃγＲＩのアミノ酸配列を配列番号６２および６３にそれぞれ示す。それぞれの配列にはｐＮＣＭＯ２プラスミドベクター上のシグナル配列を含めている。
実施例５　形質転換体の培養
　ｐＮＣＢＢＦｃＲプラスミドベクターを１０μｇ／ｍＬの抗生物質ネオマイシンを添加したＴＭ寒天培地（表５）によりＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ　ＳＰ３株（タカラバイオ社製）に形質転換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　３７℃で１８時間培養後、出現した任意のコロニーを選択し１０μｇ／ｍＬの抗生物質ネオマイシンを添加したＴＭ液体培地１ｍＬを含む試験管に接種した。表６にＴＭ液体培地の組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　激しく撹拌しながら３０℃で４８時間培養後、遠心分離操作（１００００ｒｐｍ、１０分間）により菌体と培養上清に分離した。ｐＢＢＨＵＦｃＲプラスミドベクターについても同様に操作し、任意にコロニーから培養上清を調製した。
実施例６　形質転換体の抗体結合活性評価
　実施例５で調製した形質転換体の培養上清をＥＬＩＳＡ反応により抗体結合活性を評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ/ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することにより固定した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ　Ｂｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３）同様に、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、実施例５で調製した任意のコロニー由来の培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体であるヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ－ｐｒｏｂｅ（Ｈ－１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　結果を図７に示す。図７の通り、ｐＮＣＢＢＦｃＲにより形質転換されたバチルス属細菌由来の培養上清の抗体結合活性はｐＮＣＨＵＦｃＲのものに比べて有意に高いことが分かった。すなわち、ヒト型ＦｃγＲＩを宿主バチルス属細菌において発現させる場合、同タンパク質をコードする塩基配列のコドンをヒト型からバチルス属細菌型に変換した遺伝子の方がバチルス属細菌宿主にとっては高発現であった。また、実施例５で調製した形質転換体を用いて発現させたヒト型ＦｃγＲＩは、可溶化等の操作をしなくても抗体結合性を持った活性型のタンパク質が得られたことから、実施例５で調製した形質転換体を用いた当該タンパク質の生産方法は従来技術である大腸菌や動物細胞を用いた系と比較し、当該タンパク質の生産に有用なものといえる。
　実施例７　ｐＮＣＢＢＦｃＲにより形質転換されたバチルス属細菌の培養経時変化
　実施例５で評価した任意のコロニーの中から最も抗体結合活性の高かったクローンを選択しフラスコにより培養した。すなわち、１０μｇ／ｍＬの抗生物質ネオマイシンを添加した２００ｍＬのＴＭ液体培地（表６）を添加した５００ｍＬ容のバッフル付フラスコに高活性クローンを接種し、１５０ｒｐｍの撹拌により３０℃で培養した。適当な時間、培養液をサンプリングし実施例６と同様に培養上清を調製し、実施例６と同様に抗体結合活性を評価した。結果を図８に示した。図８の通り、ヒト型ＦｃγＲＩは培養約２４時間から生産され培養５３時間で最も多く生産されることが分かった。
　実施例８　ウエスタンブロッティング法によるＦｃレセプターの検出
　実施例７で調製した培養上清をＳＤＳ―ＰＡＧＥ電気泳動に供し、ウエスタンブロッティング法による検出を行なった。
（１）培養上清１０μＬとメルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液１０μＬを混合し、９８℃、５分間の熱処理後、１０から２０％グラジエントのポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動を行なった。
（２）ＣＢＢ染色後、４％のスキムミルクにより事前にブロッキングしたＰＶＤＦメンブランに転写した（１５０ｍＡ、１２０分間）。
（３）０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で２０００倍希釈した抗ＣＤ６４（ＦｃレセプターＦｃγＲＩの別名）抗体（ｇｏａｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体）（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、３０℃で２時間反応させた。
（４）反応終了後、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液を用いて洗浄し、二次抗体である抗ｇｏａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体－ＨＲＰ標識（ＺＹＭＥＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を２０００倍希釈し添加、反応させた。
（５）０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で洗浄後、電気泳動ゲル１枚あたり２ｍＬのＥＣＬ　ｐｌｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を添加し、メンブラン上で５分間静置後、フィルムを感光させた。
　現像結果を図９に示す。図９の通り、培養２４時間後から１００時間後までの間にサンプリングした調製液からヒト型ＦｃγＲＩが検出された。
　本発明は、ヒト型ＦｃレセプターのひとつであるＦｃγＲＩを、バチルス属に属する細菌を用いることで、可溶化等の操作をせずに大量発現させる方法を提供するものであり、この発現系は、工業生産規模におけるヒト型ＦｃγＲＩの生産に有用なものである。
　なお、２００８年２月２７日に出願された日本特許出願２００８－０４６４３８号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (5)

  1. 　配列番号１に示すヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも６４番目から８６７番目のヌクレオチド配列のコドンがヒト型からバチルス属細菌型に変換されたことを特徴とする、ヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
  2. 　配列番号３のポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチド。
  3. 　請求項１または２に記載のポリヌクレオチドが挿入されたプラスミドベクター。
  4. 　請求項３に記載のプラスミドベクターをバチルス属に属する細菌に形質転換することにより得られる、形質転換体。
  5. 　請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含むヒト型ＦｃレセプターＦｃγＲＩポリペプチドの製造方法。
PCT/JP2009/053456 2008-02-27 2009-02-25 ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法 WO2009107682A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008046438A JP2009201403A (ja) 2008-02-27 2008-02-27 ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
JP2008-046438 2008-02-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009107682A1 true WO2009107682A1 (ja) 2009-09-03

Family

ID=41016071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/053456 WO2009107682A1 (ja) 2008-02-27 2009-02-25 ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2009201403A (ja)
WO (1) WO2009107682A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2546341A1 (en) * 2010-03-10 2013-01-16 Sagami Chemical Research Institute Fc binding protein and method for producing same

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5585041B2 (ja) * 2009-09-30 2014-09-10 東ソー株式会社 ヒト型Ｆｃレセプター発現酵母、およびそれを用いたヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
JP5575463B2 (ja) * 2009-12-02 2014-08-20 東ソー株式会社 抗体結合タンパク質およびそれの製造方法
JP5691164B2 (ja) * 2009-12-02 2015-04-01 東ソー株式会社 抗体結合タンパク質およびその製造方法
JP2012072091A (ja) * 2010-09-29 2012-04-12 Tosoh Corp 抗体の精製方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001509030A (ja) * 1997-01-21 2001-07-10 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｆｃレセプターおよびポリペプチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001509030A (ja) * 1997-01-21 2001-07-10 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｆｃレセプターおよびポリペプチド

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COOK BL. ET AL: "Study of a synthetic human olfactory receptor 17-4: expression and purification from an inducible mammalian cell line", PLOS ONE, vol. 3, no. 8, August 2008 (2008-08-01), pages E2920 *
ERNST LK. ET AL: "Three genes for the human high affinity Fc receptor for IgG (Fc gamma RI) encode four distinct transcription products", J. BIOL. CHEM., vol. 267, no. 22, 1992, pages 15692 - 15700 *
HOOVER DM. ET AL: "DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 30, no. 10, 2002, pages E43 *
REN H. ET AL: "High-Level Production, Solubilization and Purification of Synthetic Human GPCR Chemokine Receptors CCR5, CCR3, CXCR4 and CX3CR1", PLOS ONE, vol. 4, no. 2, 18 February 2009 (2009-02-18), pages E4509 *
WU G. ET AL: "The Synthetic Gene Designer: A flexible web platform to explore sequence manipulation for heterologous expression", PROTEIN EXPR PURIF., vol. 47, 2006, pages 441 - 445 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2546341A1 (en) * 2010-03-10 2013-01-16 Sagami Chemical Research Institute Fc binding protein and method for producing same
EP2546341A4 (en) * 2010-03-10 2013-10-23 Sagami Chemical Res Inst FC BINDING PROTEIN AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
US9453066B2 (en) 2010-03-10 2016-09-27 Sagami Chemical Research Institute FC binding protein and method for manufacturing same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009201403A (ja) 2009-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schimmel Aminoacyl tRNA synthetases: general scheme of structure-function relationships in the polypeptides and recognition of transfer RNAs
Harris et al. Assessing genetic heterogeneity in production cell lines: detection by peptide mapping of a low level Tyr to Gln sequence variant in a recombinant antibody
JP6976860B2 (ja) 誘導性共発現系における使用のためのベクター
JP2022502039A (ja) タンパク質精製方法
JP5308630B2 (ja) Ｆｃレセプター細胞外領域を含むポリペプチド及びその製造方法
CN110343689B (zh) 一种链霉菌胰蛋白酶gm2938及其在枯草芽孢杆菌中的异源表达
WO2009107682A1 (ja) ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
CN111320684A (zh) 人源N-甲基-D-天冬氨酸受体的GluN1/GluN2A四聚体的表达及其应用
CN114957415B (zh) 链霉亲和素突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌
CN111263813B (zh) 耐碱性提高的Fc结合性蛋白质及其制造方法、使用该蛋白质的抗体吸附剂和分离抗体的方法
JP6710451B2 (ja) 改変型組換えＦｃγＲＩＩｂ
CN112661820B (zh) 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用
JP5865002B2 (ja) 組換えプラスミドベクターおよびそれを用いたタンパク質の製造方法
WO2005033286A2 (en) Compositions and methods for synthesizing, purifying and detecting biomolecules
CN113249353B (zh) 一种n糖基转移酶突变体f13及其应用
CN113061611B (zh) 果蝇myc纳米抗体的编码基因及制备方法和应用
JP6171331B2 (ja) Ｆｃ結合性タンパク質の精製方法および定量方法
CN110386986A (zh) 人工改造蛋白质及其构建方法与应用
CN113087807B (zh) 用于检测糖类抗原的基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针、制备方法
JP2009525749A (ja) 組換えタンパク質の精製のためのアフィニティーポリペプチド
CN115232804B (zh) 一种重组羧肽酶g2突变体及其基因、制备方法和应用
JP2014027916A (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質およびその製造方法
CN116359504B (zh) Akap4截断蛋白在肺癌筛查中的应用
WO2023048290A1 (ja) ポリペプチドの作製方法、タグ、発現ベクター、ポリペプチドの評価方法、核酸ディスプレイライブラリの作製方法及びスクリーニング方法
JP2018011515A (ja) 大腸菌を用いた遺伝子組換えタンパク質の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09715922

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09715922

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1