JP2022502039A - タンパク質精製方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、可溶化されると、適正にフォールディングされた、活性なタンパク質を生じる可溶化可能な複合体の形態で発現されるタンパク質を精製する方法を提供する。本発明の更なる態様は、タンパク質の発現及び精製において使用され得るポリペプチドに関する。【選択図】図１

Description

関連出願に対する参照
本出願は、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる２０１８年９月２５日に出願された米国仮出願第６２／７３５，８６１号の優先権の有益性を主張する。
配列表に対する参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年９月２０日に作成され、６３キロバイト（ＫＢ）のサイズを有する「ＡｂＳｃｉ−００５ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題のファイルで、電子的に提出された配列表を包含する。
発明の分野
本発明は、分子生物学及び生物工学的製造の総合技術分野におけるものである。より詳細には、本発明は、組換えタンパク質産生の技術分野におけるものである。
組換えタンパク質又は他の遺伝子産物の効率的な発現は、系の使用を必要とし、その様々な態様、即ち、発現構築物（複数可）、宿主細胞株、増殖条件、及び精製方法は全て、材料及び時間の消費を最低限に抑えながら、十分な量で所望の産物を作製するように共同する。
組換え産物の工業生産に現在使用されている多くの発現系は、高価な哺乳動物細胞培養に依存するか、又は細菌細胞質における遺伝子産物の発現よりも、細胞１つ当たりの産物の量に限りがあり、且つより時間がかかる細菌細胞のペリプラズムへのタンパク質の分泌を利用する。細菌細胞質が、組換え発現に好ましい細胞区画として使用される他者らによって開発された多くの発現系では、所望のタンパク質が、不溶性封入体として産生されることが一般的である（例えば、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｇｉａｎｔ ｇｒｏｕｐｅｒ （Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｓ）ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｒｏｍ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ２０１５ Ｊｕｎ；１１０：７９−８８；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｅｐ．２０１５．０２．０１２；Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｆｅｂ １９を参照）。幾つかの可溶性で正確にフォールディングされたタンパク質を封入体から回収するためには、更なるリフォールディングステップを実施する必要がある（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，「Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ」，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４ Ｆｅｂ ２０；４（１）：２３５−２５１；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｂｉｏｍ４０１０２３５；Ｒｅｖｉｅｗ）。ジスルフィド結合を含有するタンパク質に関して、これらのリフォールディングステップは通常、任意の不適切に形成されるジスルフィド結合、特に不溶性封入体への凝集に寄与している可能性がある分子間ジスルフィドを、チオール基に変換するための還元剤の使用を包含する。
適切にフォールディングされた溶解形態で、また市販の産生レベルにまでスケールアップすることが可能な様式で、組換えタンパク質等の遺伝子産物をより効率的に産生するための改善された発現系及びそれらを使用する方法が、明らかに必要とされている。
本発明は、還元剤の使用を必要とせずに、可溶化されると、適正にフォールディングされた、活性な遺伝子産物を生じる可溶化可能な複合体の形態で発現されるタンパク質及び他の遺伝子産物を精製する方法を提供する。本発明の利点は、可溶化可能なペレットの形態で遺伝子産物の可溶化可能な複合体を収集することができることであり、宿主細胞溶解物の望ましくない構成分を、上清中に廃棄させることが可能である。遺伝子産物の可溶化可能な複合体が、例えば、宿主細胞溶解物中に存在する場合、可溶化可能な複合体を、遠心分離又は他の手段によって沈降させてペレットにすることができ、宿主細胞溶解物の主に液体画分と分離させることができる点で、この混合物は懸濁液とみなすことができる。本明細書中で使用する場合、「溶液」という用語は、懸濁液の特性を示すことができる混合物を包含する。本発明の更なる態様は、タンパク質の発現及び精製において使用され得るポリペプチドプロ配列に関する。
本発明の態様は、１つ又は複数の遺伝子産物を産生する方法であって、宿主細胞において発現された少なくとも１つの遺伝子産物を含む第１の溶液を提供するステップであって、第１の溶液中の上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、９００×ｇの力で、又は９００×ｇ〜７，０００×ｇで、又は７，０００×ｇで遠心分離（ｐＨ７．４及び４℃にて２００ｍＭ ＮａＣｌの塩条件で）によって沈降させて、可溶化可能なペレットを形成することができる、ステップと、上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、可溶化溶液中に配置するステップとを含む方法である。本発明の上記方法は、下記のパラグラフにおいて表されるような本発明の方法の任意の態様に従って、それらの任意の組合せで利用され得る：
上記少なくとも１つの遺伝子産物が、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成するポリペプチドである、本発明の方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物が、単一ペプチドを欠如しているポリペプチドである、本発明の方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物が、（ａ）レプチン、メトレレプチン、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、インスリンの成熟鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び（ｂ）（ａ）のポリペプチドのいずれかの断片からなる群から選択されるポリペプチドを含む、本発明の方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物が、成熟インスリン鎖のアミノ酸配列並びに（ａ）配列番号１２〜配列番号１４及び配列番号３７のいずれか及び（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの長さの少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）に対して、少なくとも７０％（又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）アミノ酸配列同一性を共有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、本発明の方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物が、（ａ）配列番号２７〜配列番号３６のいずれか及び（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの長さの少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）に対して、少なくとも７０％（又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）アミノ酸配列同一性を共有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、本発明の方法。
少なくとも１つの遺伝子産物が、Ａｓｐ−Ｐｒｏアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、本発明の方法であって、Ａｓｐ−Ｐｒｏアミノ酸配列での上記プロペプチドの切断を更に含む、本発明のこの方法。
第１の溶液が、上記宿主細胞の溶解物である、本発明の方法であって、上記宿主細胞の溶解物が、宿主細胞を、リゾチームと接触させることによって産生されたか、又は上記宿主細胞の溶解物が、機械的溶解によって産生された、本発明のこの方法。
宿主細胞が、原核細胞である、本発明の方法であって、宿主細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である、本発明のこの方法。
宿主細胞が、より酸化している細胞質を有するように修飾されている、本発明の方法であって、上記宿主細胞の修飾が、ｔｒｘＢ、ｇｏｒ、ｇｓｈＡ、及びｇｓｈＢからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の欠損をもたらし、上記宿主細胞が、ａｈｐＣ遺伝子において突然変異を更に含む、本発明のこの方法。
宿主細胞が、１つ又は複数の発現構築物を含む、本発明の方法であって、上記少なくとも１つの前記発現構築物が、少なくとも１つの誘導性プロモーターを含み、上記少なくとも１つの誘導性プロモーターが、アラビノース誘導性プロモーター、プロピオネート誘導性プロモーター、ラムノース誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、及びホスフェート欠失によって誘導可能なプロモーターからなる群から選択され、及び／又は上記宿主細胞が、上記少なくとも１つの誘導性プロモーターの少なくとも１つの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能のレベルの低減を有し、少なくとも１つの遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択される、本発明のこの方法。
前記第１の溶液を、遠心分離に付すステップを更に含む、本発明の方法であって、遠心分離が、９００×ｇ、又は９００×ｇ〜２５，０００×ｇ、又は９００×ｇ〜７，０００×ｇ、又は２，０００×ｇ〜２０，０００×ｇの力で、或いは３，３００×ｇ、又は３，３００×ｇ〜２０，０００×ｇで、或いは７，０００×ｇ、又は７，０００×ｇ〜２０，０００×ｇであり、上記第１の溶液が、可溶性画分及びペレットに分離され、上記ペレットが、上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを含み、上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、上記ペレットから回収するステップを更に含み、上記ペレット中に存在する上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかが、可溶化溶液中に配置される、本発明のこの方法。
上記可溶化溶液が、少なくとも１つのカオトロピック剤を含む、本発明の方法であって、上記少なくとも１つのカオトロピック剤が、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、塩酸グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、及び尿素からなる群から選択され、上記記少なくとも１つのカオトロピック剤が、２Ｍ〜１０Ｍの濃度の尿素及び２Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジンからなる群から選択されるか、又は７Ｍ〜８Ｍの濃度の尿素である、本発明のこの方法。
可溶化溶液中の上記少なくとも１つのカオトロピック剤の濃度を低減させるステップを更に含む、本発明の方法であって、可溶化溶液中の上記少なくとも１つのカオトロピック剤の濃度が、可溶化溶液中のその初期濃度の５０％又はそれ未満に低減され、及び／又は可溶化溶液中の上記少なくとも１つのカオトロピック剤の初期濃度が、７Ｍ〜８Ｍの濃度の尿素であり、上記少なくとも１つのカオトロピック剤の濃度が、３Ｍ〜４Ｍの濃度の尿素に低減され、可溶化溶液中の上記少なくとも１つのカオトロピック剤の濃度の低減が、透析、希釈、及びダイアフィルトレーションからなる群から選択される方法によって達成され、低減された濃度の上記少なくとも１つのカオトロピック剤を含む可溶化溶液を、少なくとも１時間、２時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、１２時間〜２４時間、２４時間、２４時間〜７２時間、３６時間、４８時間、７２時間、７２時間〜１２０時間、及び１２０時間からなる群から選択される期間、インキュベートするステップを更に含む、本発明のこの方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、上記可溶化溶液から回収するステップを更に含む、本発明の方法であって、上記可溶化溶液から回収された上記少なくとも１つの遺伝子産物の量が、上記第１の溶液中に存在する上記少なくとも１つの遺伝子産物の総量の少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％であり、及び／又は上記可溶化溶液から回収された上記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかが、適正に形成されたジスルフィド結合及び遺伝子産物活性からなる群から選択される特性を有し、上記可溶化溶液から回収された少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％が、適正に形成されたジスルフィド結合を有する、本発明のこの方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物のクロマトグラフィー精製を更に含む、本発明の方法であって、クロマトグラフィー精製が、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、クロマトグラフィー精製が、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを利用する、本発明のこの方法。
上記少なくとも１つの遺伝子産物が、還元剤と接触されない、本発明の方法。
本発明の更なる態様は、（ａ）配列番号１２〜配列番号１４及び配列番号２７〜配列番号３６のいずれか、並びに（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれかの長さの少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）に対して、少なくとも７０％（又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）アミノ酸配列同一性を共有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
図１は、本発明の方法によって産生された可溶化可能な遺伝子産物複合体を精製する方法を概要するフローチャートである。 図２は、本発明の方法に従って発現及び可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンが、ジスルフィド結合を含有することを示す図である。８Ｍ尿素で可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンを、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。宿主細胞は、宿主細胞培養液の濃度よりも５倍（「５Ｘ」）又は１０倍（「１０Ｘ」）高い濃度で溶解させた。
Figure 2022502039
可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンを、還元剤ＤＴＴで処理することにより、可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンを、ゲル上で、わずかにゆっくりとした速度で移動させ、ＤＴＴ処理が、非還元型の可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン中に存在するジスルフィド結合を還元したこと示した。図２はまた、可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン複合体をペレット化することにより、宿主細胞溶解物中に存在する潜在的に混入する（レーン１及びレーン２）タンパク質の大部分を、可溶化可能なペレットから除去させ、可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの非常に精製された調製物をもたらす（レーン３〜レーン６）ことを示す。
図３は、ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンポリペプチドの略図である。Ａ鎖及びＢ鎖のアミノ酸は、それぞれ、淡灰色及び濃灰色の丸として示される。Ｎ末端ＣＰＢｐｒｏプロペプチドは、破線として示され、Ａ鎖及びＢ鎖を結合させるＣ−ペプチド（又は「結合性ペプチド」）は、灰色アーチとして示される。Ａ鎖におけるシステイン残基とＢ鎖におけるシステイン残基との間にある濃灰色の実線、及びＡ鎖内の２つのシステインを結合している濃灰色の実線は、正確にフォールディングされたインスリングラルギン中に存在されるジスルフィド結合を表す。 図４は、質量分析による特性決定のための架橋ペプチド断片を生成するための精製されたＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの、トリプシン及びグルタミルエンドペプシダーゼ（「Ｇｌｕ−Ｃ」）による消化を表す模式図である。ジスルフィド結合は、システイン残基を結合している濃灰色の実線によって表される。 図５は、ペレット化された可溶化可能な複合体からの可溶化によってのみ精製されたＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの９３％が、ジスルフィド結合の正確な形成を有し、したがって、適正にフォールディングされていることを示す１組の３つの質量分析クロマトグラフである。パネルＡ：ベースピーククロマトグラム（非還元型）；パネルＢ：２つのジスルフィド結合を有するペプチド断片に相当するピークを示す、抽出イオンクロマトグラム（非還元型、＋／−５ｐｐｍ）；パネルＣ：１つのジスルフィド結合を有するペプチド断片に相当するピークを示す、抽出イオンクロマトグラム（非還元型、＋／−５ｐｐｍ）。矢印は、インスリングラルギン標準物質によって生じるクロマトグラムに対する比較によって決定されるように、表示したペプチド断片に相当するピークを示す。「スワップされた形態」と標識された矢印は、成熟インスリンのＡ６位及びＡ７位にあるシステイン（図４を参照）が、「スワップされた」ジスルフィド結合パートナーを有するコンホメーションに相当する微量なピークを示す。＊：アスタリスクは、正確な電荷状態において、ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンに由来するはずのないピークを指し示している。
商業規模で、また活性形態で組換えタンパク質等の遺伝子産物を産生する問題は、本明細書中に記載されるタンパク質発現及び精製方法を提供することによって対処される。ポリペプチド等の遺伝子産物が、十分な遺伝子産物密度になるように、また遺伝子産物が発現された場合に適正にフォールディングされて、どのジスルフィド結合も適正に形成されるのを可能にする様式で宿主細胞において発現された場合、ポリペプチド等の遺伝子産物は、他の細胞構成成分から容易に精製され、続いて、適正フォールディングされ、推定上、活性な遺伝子産物を産生するように可溶化される可溶化可能な複合体を形成することを、本発明者らは見出した。かかる可溶化可能な複合体の形態での遺伝子産物の産生、適正にフォールディングされた遺伝子産物の続く精製に関する本発明のこれらの方法は、遺伝子産物を還元剤と接触させることを伴う手順を必要としないという利点を有する。
本発明の別の態様として、細胞溶解後に不溶性画分及び可溶性画分を分離するための初期の遠心分離ステップを有さずに、可溶化可能な複合体の形態で宿主細胞によって産生されるポリペプチドの直接的な可溶化に関する、及びかかるポリペプチドを還元剤とを接触させる必要なく、ジスルフィド結合を形成する、適正にフォールディングされ及び／又は活性なポリペプチドの精製を可能にする方法が提供される。
１つ又は複数のポリペプチドを含む遺伝子産物等の遺伝子産物の適切なフォールディングは、その遺伝子産物中のどのジスルフィド結合も、その遺伝子産物内の適正な位置で形成されていることと整合する。したがって、遺伝子産物が適切にフォールディングされているかどうかを決定することは、実施例２Ｃ及び実施例８において更に記載されるように、遺伝子産物中に存在するあらゆるジスルフィド結合の特性決定を伴い、それらのジスルフィド結合が適正に形成されているかどうかを評価することができる。適正に形成されたジスルフィド結合は、アッセイされると、２つの硫黄原子を結合する共有結合であり、ポリペプチド内、又は２つのポリペプチド間に存在する場合には、ポリペプチド（複数可）を含む遺伝子産物の所望の形態でジスルフィド結合によって連結される２つの硫黄含有アミノ酸残基（システイン又はＣｙｓ残基）の硫黄原子を連結する（又は結合する）共有結合であるものである。例えば、図３に示されるようなグラルギンプロインスリンに関して、３つの適正に形成されたジスルフィド結合は、配列番号６の６位及び１１位にあるＣｙｓ残基、配列番号６の７位及び配列番号７の７位にあるＣｙｓ残基、並びに配列番号６の２０位及び配列番号７の１９位にあるＣｙｓ残基を結合するものである。
活性な遺伝子産物は、遺伝子産物の所望の形態と関連付けられるタイプの測定可能な形態を有する任意の遺伝子産物を含む。例えば、活性なインスリン遺伝子産物は、測定可能なインスリン受容体結合活性、又は測定可能な抗インスリン抗体結合活性、又はインスリン遺伝子産物の所望の形態と関連付けられる活性の任意の他のタイプを有し得る。
タンパク質の適正にフォールディングされた、及び／又は活性な形態の、封入体からの回収は通常、少なくとも１つの還元剤による処理を含む。「還元剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、ｐＨ７．０及び２５℃で−０．２６Ｖよりも負の還元電位を伴う化学物質（非タンパク質）、例えば、ＤＴＥ（ジチオエリスリトール）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、及びＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン）を包含し、したがって、「還元剤」という用語は、Ｌ−システイン（「Ｌ−ｃｙｓ」）又はグルタチオンを含まない。遺伝子産物の、封入体からの回収とは異なり、還元剤の使用を含まない本明細書中に開示される可溶化方法は、遺伝子産物の実質的により高い回収、例えば、実施例７に記載される方法によって算出される場合に、宿主細胞溶解物中に存在する総遺伝子産物材料の少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％の回収をもたらす。細胞溶解物において達成された高収量の遺伝子産物（５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ）を考慮すると、本明細書中に記載される可溶化方法（実施例１〜実施例３で見られるように）は、遺伝子産物の収量（４ｇ／Ｌ〜１６ｇ／Ｌ）をもたらし得る。
宿主細胞が、可溶化可能な複合体の形態で遺伝子産物（複数可）を産生するためには、本明細書中に詳述されるように、遺伝子産物発現の下記態様Ｉ〜ＩＶの適切な組合せを利用することが、最も好適である：
Ｉ．所望の遺伝子産物（複数可）の発現において使用されるべき任意のトランスポーター、補因子、シャペロン、及び／又はタグ若しくはプロペプチドを含む、産生されるべき遺伝子産物（複数可）。
ＩＩ．遺伝子産物（複数可）の発現に使用されるべき発現構築物（複数可）。
ＩＩＩ．遺伝子産物（複数可）をコードする発現構築物（複数可）を発現するのに使用されるべき宿主細胞。
ＩＶ．宿主細胞増殖及び発現の誘導に関する条件。
セクションＶ．は、本発明の可溶化及び精製方法について記載する。
その全てが参照により本明細書に明らかに組み込まれる下記の特許公報及び特許出願（複数可）は、遺伝子産物、発現構築物、宿主細胞、並びに本発明の精製方法に適した可溶化可能な複合体の産生に用いられ得る増殖及び誘導条件の更なる例を提供する：ＵＳ９６１７３３５Ｂ２号、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、ＷＯ２０１６２０５５７０Ａ１号、「Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７０６４号、「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」。
Ｉ．本発明の方法によって作製される産物
多数の発現用途において、及び産物の特性において、本発明の遺伝子発現及び遺伝子産物精製方法を利用する際に広い万能性が見られる。
本発明の方法によって産生される遺伝子産物は、下記のいずれか、又は１つよりも多くを含み得る：１−アンチトリプシン；２Ｃ４；アクチビン；アドレシン；アルカリホスファターゼ；抗ＣＤ１１ａ；抗ＣＤ１８；抗ＣＤ２０；プロテインＣ等の抗凝固因子；抗ＨＥＲ−２抗体；抗ＩｇＥ；抗ＩｇＧ；抗ＶＥＧＦ；抗体及び抗体断片；ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインにおける領域（ＥｒｂＢ２のおよそ残基２２からおよそ残基５８４の領域におけるいずれかの１つ又は複数の残基、端を含む）に結合する２Ｃ４（ＷＯ０１／００２４５号、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ−１２６９７）等のＥｒｂＢ２ドメイン（複数可）に対する抗体；Ａｐｏ２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ）；心房性ナトリウム利尿因子；ＢＤＮＦ；ベータ−ラクタマーゼ；ボンベシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ボツリヌス毒素；脳ＩＧＦ−Ｉ；カルシトニン；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）等のカルジオトロフィン（心肥大因子）；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９等のＣＤタンパク質；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォンヴィルブランド因子等の凝固因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；サイトカイン；崩壊促進因子；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；ＤＮアーゼ；エンケファリナーゼ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；エリスリポエチン；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞増殖因子；卵胞刺激ホルモン；グルカゴン；ｇｐ１２０；グレリン；ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；造血増殖因子；ホーミング受容体；ＨＳＡ；ＩＧＦ−Ｉ；ＩＧＦ−ＩＩ；免疫毒素；インヒビン；インスリン鎖（インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖）又はプロインスリン；インスリン様増殖因子結合タンパク質；インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；インテグリン；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、及びインターフェロン−ガンマ等のインターフェロン；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；レプチン；リポタンパク質；肺界面活性剤；黄体ホルモン、メトレレプチン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ミュラー管阻害物質；神経成長因子（ＮＧＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５、又はニューロトロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）等の神経栄養因子；骨誘導因子；副甲状腺ホルモン；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；プロリラクシン；プロテインＡ又はＤ；ホルモン又は増殖因子に関する受容体；調節タンパク質；リラクシンＡ鎖；リラクシンＢ鎖；レンニン；リウマチ因子；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミン；スーパーオキシドジムスターゼ；表面膜タンパク質；Ｔ細胞受容体；ＴＧＦ−ベータ；トロンビン；トロンボポエチン；甲状腺刺激ホルモン；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５を含む、ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ等のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；輸送タンパク質；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；ウロキナーゼ；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部等のウイルス抗原；上記のいずれかの断片、及び上記タンパク質若しくはそれらの断片又は抗体Ｆｃドメイン、抗体単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、酵素活性を有するドメイン（グリコシドヒドロラーゼドメイン又はキナーゼドメイン等の）、ＥＶＨ１（Ｅｎａ／Ｖａｓｐ相同性、又はＷＨ１）ドメイン、ＰＡＳ（Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍ）ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＰＯＵ（Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ、Ｕｎｃ−８６）ドメイン、ＳＰＲ（Ｓｐｒｅａｄ、Ｓｐｒｏｕｔｙ）ドメイン、ＶＷＦＣ（フォンヴィルブランド因子、タイプＣ又はＶＷＣ）ドメイン、若しくはジンクフィンガードメイン（例えば、ＲＩＮＧ−フィンガードメイン）の１つ又は複数に共有結合されている上記のいずれか若しくはそれらの断片。
本発明によって産生される遺伝子産物は、下記のインスリンポリペプチドのいずれか、又は１つよりも多くを含み得る。本発明の方法によって産生されるインスリンポリペプチドは、幾つかの実施形態では、インスリンの成熟Ａ鎖又は成熟Ｂ鎖のアミノ酸配列を含み、他の実施形態では、成熟Ａ鎖及び成熟Ｂ鎖の両方を含む。プロインスリンポリペプチドは、インスリン成熟Ａ鎖及びインスリンの成熟Ｂ鎖を含む。インスリンポリペプチド鎖は、或る特定の実施形態では、インスリンの天然に存在するアミノ酸配列、若しくはそれらの断片のいずれかの１つ又は複数を含み、他の実施形態では、１つ又は複数のインスリン類似体アミノ酸配列、若しくはそれらの断片を含み、更なる実施形態では、天然に存在するインスリンアミノ酸配列及び／又はインスリン類似体アミノ酸配列の組合せを含む。天然に存在するインスリンアミノ酸配列及びインスリン類似体アミノ酸配列の例を表１に示す。
Figure 2022502039
プレプロインスリンポリペプチドは、好ましくは下記のＮ末端からＣ末端への順序で、下記の構成成分を含み得る：宿主細胞シグナルペプチダーゼによってタンパク質発現中に切断されるシグナルペプチドであり得るプレペプチド；プロペプチド；Ｂ鎖；Ｃ−ペプチド（又は「結合性ペプチド」）；及びＡ−鎖。プレプロインスリンポリペプチドはまた、異なるＮ末端からＣ末端への順序、例えば：プレペプチド；プロペプチド；Ａ鎖；Ｃ−ペプチド；及びＢ鎖で、Ａ鎖及びＢ鎖を含み得る。宿主細胞の細胞質において発現されるべきプロインスリンポリペプチドに関しては、シグナル配列を含むプレペプチドは、存在しない。プロインスリングラルギンポリペプチドの図を、図３に示す。Ｃ−ペプチドの例として、ヒトインスリンのＣ−ペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２７８８２６．１のアミノ酸５５〜アミノ酸８９、配列番号１０）、及び人工Ｃ−ペプチドＲＲＹＰＧＤＶＫＲ（配列番号ＮＯ：１１）が挙げられる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｎｉ−ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９８ Ｆｅｂ １；３２９（Ｐｔ ３）：６３１−６３５）。プロインスリンポリペプチドにおいて使用され得る更なるＣ−ペプチドアミノ酸配列は、ヒトＣ−ペプチド（配列番号１２及び配列番号１３）の人工変異体、及び人工Ｃ−ペプチドＲＲＤＤＮＬＥＲ（配列番号１４）である。Ｃ−ペプチドアミノ酸配列は一般に、プロインスリンポリペプチドが、トリプシン消化プロセスにより成熟インスリンに変換される場合に、通常切断される末端アルギニン及びリジン酸基を含むものとして、本明細書中に提示されている。図３に示されるようなプロインスリングラルギンのＣ−ペプチドは例外である：インスリングラルギンの成熟Ｂ鎖が、２つのアルギニン（Ｒ）残基を有するので、これらのアルギニン残基は、図３では、Ｃ−ペプチドの一部としてではなく、インスリングラルギンの成熟Ｂ鎖の一部として表されている。
本発明の方法によって産生される遺伝子産物は、レプチン及び／又はメトレレプチンポリペプチドを含み得る。メトレレプチンとも呼ばれるレプチンポリペプチドの例は、配列番号１５に示され、そのＮ末端でメチオニン残基を有する成熟ヒトレプチンに相当する。レプチンポリペプチドの他の例は、配列番号１５のアミノ酸２〜アミノ酸１４７等のＮ末端メチオニン残基を欠如しているアミノ酸配列を含む。レプチンの一般的なアイソフォームは、配列番号１５の７４位で、バリン残基に代わって、メチオニン残基を有する。本発明の方法によって産生されるレプチンポリペプチドは、幾つかの実施形態では、そのＮ末端でメチオニン残基を（メトレレプチン）、他の実施形態では、レプチンポリペプチドのＮ末端に付加されたタグ、リンカー又は他のプロペプチドアミノ酸配列（以下で更に記載されるような）を、幾つかの実施形態ではメトレレプチンアミノ酸配列のＮ末端でメチオニンを含み、また他の実施形態ではメトレレプチンアミノ酸配列のＮ末端でメチオニンを含まずに有するレプチンポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
シグナルペプチド。本発明の方法によって産生されるポリペプチド遺伝子産物は、シグナルペプチドを有し得るか、又は欠如し得る。本発明の或る特定の実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、かかる遺伝子産物が、宿主細胞の酸化している細胞質において保持されることが好適であるため、シグナルペプチドを欠如している。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダー配列、又はリーダーペプチドとも称される）は、単一のアルファヘリックスを形成する傾向にある、構造的に、およそ５アミノ酸長〜２０アミノ酸長、多くの場合はおよそ１０アミノ酸長〜１５アミノ酸長の一続きの疎水性アミノ酸を特徴とする。この疎水性の一続きは多くの場合、正に帯電したアミノ酸（特に、リジン）に富んだより短い一続きが、すぐ前に先行する。成熟ポリペプチドから切断されるべきシグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼによって認識及び切断される一続きのアミノ酸で終わっている。場合によってはシグナルアンカー配列と称される、ポリペプチド遺伝子産物の、膜への挿入を誘導するシグナペプチドは、シグナルペプチダーゼによって切断されるアミノ酸配列を欠如してもよく、その場合、ポリペプチド遺伝子産物において保持される。シグナルペプチドは多くの場合、機能的に、ポリペプチドの、同時翻訳で、又は翻訳後に、細胞質から、また例えば、原核生物の原形質膜（又はＥ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性菌の内膜）を通って、又は真核細胞の小胞体への直接的な輸送を誘導する能力を特徴とし得る。シグナルペプチドが、ポリペプチドを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような宿主細胞のペリプラズム腔へ輸送させることを可能にする程度は、以下の実施例９に提供する方法等の方法を使用して、ペリプラズムタンパク質を、細胞質において保持されるタンパク質と分離させることによって決定され得る。
遺伝子産物とともに使用することができるタグ及び他のポリペプチド配列
タグ。本発明の方法によって発現されるべき遺伝子産物は、遺伝子産物の精製及び／又は検出に役立つ分子部分を含むように設計され得る。多くのかかる部分は、当該技術分野で既知であり、一例として、ポリペプチド遺伝子産物は、そのＮ又はＣ末端に、連続する６個又はそれよりも多いヒスチジン、好ましくは６個〜１０個のヒスチジン残基、最も好ましくは６個のヒスチジン（「６×Ｈｉｓ」）のポリヒスチジン「タグ」配列を含むように設計され得る。ポリペプチドの末端上のポリヒスチジン配列の存在により、それを、コバルト又はニッケルベースの親和性媒体によって結合させて、他のポリペプチドと分離することが可能となる。ポリヒスチジンタグ配列は、エキソペプチダーゼによって除去することができる。
本発明の方法によって産生されるポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸配列のＮ末端で発現される更なるタグは、或る特定の実施形態では、（１）豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）とも呼ばれブタコレラウイルス（Ａｌｆｏｒｔ株）（配列番号１６）等のペスチウイルス由来、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）及びウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）由来のポリタンパク質の自己切断型Ｎ末端部分（Ｎｐｒｏ）、及びそれらの断片、及び／又は（２）低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）（配列番号１７、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ５５８５３．１）を含む。任意のＮ末端タグはそれ自体、そのＮ末端で、６×Ｈｉｓ等のポリヒスチジンタグで、更にタグ付けされてもよく、ニッケルカラム上でのタグ付けされたポリペプチドの初期精製、続いて、それぞれ、Ｎｐｒｏ等のタグの自己切断、又はＳＵＭＯプロテアーゼによるＳＵＭＯ Ｎ末端タグの酵素的切断、及び解放されたポリペプチドの、カラムからの溶出が可能となる。この方法の一実施形態では、ＳＵＭＯプロテアーゼポリペプチドはまた、６×Ｈｉｓタグを含む融合タンパク質であり、２ステップ精製が可能となり、第１のステップでは、発現された６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯでタグ付けされたポリペプチドが、ニッケルカラムへの結合、続く、カラムからの溶出によって精製される。第２のステップでは、精製されたポリペプチド上のＳＵＭＯタグを、６×Ｈｉｓでタグ付けされたＳＵＭＯプロテアーゼによって切断し、ＳＵＭＯプロテアーゼ−ポリペプチド反応混合物を、第２のニッケルカラムに流し、第２のニッケルカラムは、ＳＵＭＯプロテアーゼを保持するが、この段階でタグ付けされていないポリペプチドを流すことが可能である。
別の例として、蛍光タンパク質配列は、ポリペプチド遺伝子産物の一部として発現させることができ、蛍光タンパク質に関するアミノ酸配列は好ましくは、ポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸配列のＮ又はＣ末端で付加される。得られた融合タンパク質は、或る特定の波長の光に曝露されると蛍光を発して、融合タンパク質の存在を視覚的に検出することが可能となる。周知の蛍光タンパク質は、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質であり、多くの他の蛍光タンパク質は、それらをコードするヌクレオチド配列とともに市販されている。
リンカー。リンカーは、２つの他のポリペプチドを結合するのに使用されるポリペプチドである。アルファ−ヘリックスを形成するリンカーポリペプチドの例は、配列番号１８及び配列番号１９として提供される（Ａｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｌｉｎｋｅｒ ｌｅｄ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｆ−ｂａｓｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００９ Ｍａｒ；２６（３）：５２３−５２８；ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０９５−００８−９７６７−０；Ｅｐｕｂ ２００８ Ｎｏｖ １１）。
切断配列。切断配列は、化学試薬又は酵素によって作用を受けて、切断配列を含有するポリペプチドの切断を達成することができる別個のアミノ酸配列である。これらの配列の１つ又は複数は、タグ又はプロペプチド配列と、ポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸配列との間位に導入されて、遺伝子産物の精製プロセス中にタグ又はプロペプチドが切断されるのを可能にすることができる。切断配列の例として、アミノ配列ＤＰ及びＧＧＤＰＧＧＧ（配列番号２０、これは、Ｄ（Ａｓｐ）とＰ（Ｐｒｏ）との間の結合で、ギ酸による処理によって切断され得る）が挙げられる。或る特定の酸切断可能な配列は、以下で記載される特定のプロペプチド内に存在する（配列番号３３〜配列番号３５）。更なる例は、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ（切断配列ＥＮＬＹＦＱＧＧ（配列番号２１））、エンテロキナーゼ（切断配列ＤＤＤＤＫＧ（配列番号２２））、及びトロンビン（切断配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３））等のプロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列である。
プロペプチド。本明細書中に記載されるプロペプチドは、ポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸配列に対してＮ末端若しくはＣ末端のいずれか、又は両方で、ポリペプチド遺伝子産物に結合され、ポリペプチド遺伝子産物のアミノ酸初列に直接、又はプロペプチドと、ポリペプチド遺伝子産物との間に配置されるリンカー若しくはタグ等の他のポリペプチド配列を用いて結合され得る。プロペプチドとして使用され得るポリペプチドの例として、哺乳動物カルボキシペプチダーゼＢ前駆体タンパク質（以下で更に記載される）及びシグナル配列を有するマルトース結合タンパク質又は「ＭＢＰ」（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０ＡＥＸ９．１、配列番号２４）が挙げられ、配列番号２４のアミノ酸２〜アミノ酸２６を除去して、細胞質中で局在化されたままであるプロペプチドを生成することができる。プロペプチドとして使用されてきた別のポリペプチドは、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）キシラナーゼ１０ａ由来のファミリー９炭水化物結合モジュール又は「ＣＢＭ９」（配列番号２５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ６００３７のアミノ酸７００〜アミノ酸８６８、Ｎｏｔｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ９ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ｘｙｌａｎａｓｅ １０Ａ ｉｎ ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ−ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１ Ｍａｙ ２９；４０（２１）：６２４８−６２５６）である。
カルボキシペプチダーゼＢプロペプチド（ＣＰＢｐｒｏ）。典型的な哺乳動物カルボキシペプチダーゼＢ前駆体タンパク質は、そのＮ末端にシグナルペプチドを、続いて、そのＣ末端に、アルギニン残基を有する９５個のアミノ酸のプロペプチドを有し、カルボキシペプチダーゼＢ活性化ドメインとも称されるこのプロペプチドは、トリプシン加水分解によってカルボキシペプチダーゼＢ酵素（ＥＣ ３．４．１７．２）の残部から切断されて、酵素は活性化される（Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｒｏｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｂ：ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ」，ＥＭＢＯ Ｊ １９９１ Ｊａｎ；１０（１）：１−９）。ヒトカルボキシペプチダーゼＢ前駆体タンパク質又はＣＰＢｐｒｏのアミノ酸配列は、配列番号２６として提供される。
「ＣＰＢｐｒｏ」及び「ＣＰＢｐｒｏプロペプチド」という用語は、本明細書中に開示される新規変異体を含むカルボキシペプチダーゼＢプロペプチドを指すのに本明細書中で使用される。ＣＰＢｐｒｏプロペプチドは、例えばＣＢＰｐｒｏプロペプチドのＣ末端アルギニン残基で、目的のポリペプチドの所望のＮ末端残基に融合される、組換えポリペプチドの産生に使用することができ、ＣＰＢｐｒｏ＿ポリペプチドの発現後、ＣＰＢｐｒｏプロペプチドは、トリプシンによって目的のポリペプチドから切断して、所望のＮ末端を生成することができる。変異体ＣＰＢｐｒｏプロペプチドの例として、配列番号２７〜配列番号３６が挙げられ、配列番号３７のアミノ酸配列を有する更なるプロペプチドが提供される。
可溶化可能な遺伝子産物の形成。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載される発現方法を使用した遺伝子産物の発現は、遺伝子産物に対するタグ又は他のポリペプチドの付加を必要とせずに、可溶化可能な遺伝子産物複合体の形成をもたらす。例えば、小容積実験で、本明細書中に記載される発現方法に従った、メトレレプチン（配列番号１５）とＥｒｖ１ｐスルフィドリルオキシダーゼ（配列番号３８、以下に記載）との同時発現は、発現されたメトレレプチン形成性可溶化可能な複合体の大部分（約７０％）を生じ、Ｅｒｖ１ｐと、ＣＰＢｐｒｏ変異体プロペプチド（配列番号２７）のメトレレプチン（配列番号１５）への付加によって形成される遺伝子産物（配列番号３９）との類似した同時発現は、より大部分の遺伝子産物（約８４％）形成性可溶化可能な複合体を生じる。可溶化可能な複合体における遺伝子産物（複数可）の発現の最適化に関して、遺伝子産物（複数可）はまず、修飾せずに発現させることができ、産生された可溶化可能な複合体の量を決定することができる。次に、様々なポリペプチド配列（タグ、プロペプチド、任意選択で、組合せで、並びに任意選択で、リンカー及び／又は切断配列との更なる組合せで）の、ポリペプチド遺伝子産物（複数可）への付加の効果を、好ましくは小容積発現実験で評価して、より大部分の所望の遺伝子産物（複数可）が続いて、可溶化可能な複合体として発現されるかどうかを決定することができる。
ジスルフィド結合。本発明の方法によって産生される遺伝子産物は、場合によっては、ジスルフィド結合を形成するポリペプチドである。ポリペプチドによって形成されるジスルフィドの数及び位置は、以下の実施例８の方法等の方法によって決定され得る。ポリペプチド等の遺伝子産物に関するジスルフィドの数は、その遺伝子産物が機能性産物中に存在する場合に、その遺伝子産物によって形成される分子内及び分子間結合の総数である。例えば、ヒトＩｇＧ抗体の軽鎖は通常、３個のジスルフィド結合（分子内結合２個及び分子間結合１個）を有し、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖は、７個のジスルフィド結合（分子内結合４個及び分子間結合３個）を有する。本発明の或る特定の実施形態では、本発明の方法によって産生される遺伝子産物は、少なくとも１個及び１２個よりも少ないジスルフィド結合、又は少なくとも２個及び１７個よりも少ないジスルフィド結合、又は少なくとも１７個及び５０個よりも少ないジスルフィド結合、又は少なくとも３個及び１０個よりも少ないジスルフィド結合、又は少なくとも３個及び８個よりも少ないジスルフィド結合を形成するポリペプチドであるか、或いは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、及び９個のジスルフィド結合からなる群から選択されるジスルフィド結合を形成するポリペプチドである。
グリコシル化。本発明によって産生される遺伝子産物は、グリコシル化されてもよく、又はグリコシル化されなくてもよい。本発明の一実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。グリコシル化されたポリペプチドは、共有結合されたグリコシル基を含むポリペプチドであり、そのポリペプチドの特定の残基上に通常結合された全てのグリコシル基（完全にグリコシル化されたポリペプチド）、部分的にグリコシル化されたポリペプチド、グリコシル化が通常起こらない１つ又は複数の残基でグリコシル化を有するポリペプチド（変化されたグリコシル化）、及び１つ又は複数の指定残基に通常結合されるグリコシル基と構造が異なる少なくとも１つのグリコシル基でグリコシル化されたポリペプチド（修飾されたグリコシル化）が挙げられる。修飾されたグリコシル化の例は、ポリペプチドをフコシル化する能力を欠如している宿主細胞におけるポリペプチドの発現によって、フコシル部分に結合されたグリコシル基においてフコシル部分を欠如しているポリペプチドである、「脱フコシル化」又は「フコース欠乏性」ポリペプチドの産生である。グリコシル化されていないポリペプチドは、共有結合されたグリコシル基を含まないポリペプチドである。グリコシル化されていないポリペプチドは、ポリペプチドの脱グリコシル化、又はアグリコシル化ポリペプチドの産生の結果であり得る。脱グリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化されたポリペプチドを酵素的に脱グリコシル化することによって得られ得るのに対して、アグリコシル化ポリペプチドは、原核細胞又は少なくとも１つのグリコシル化酵素の機能が排除若しくは低減されている細胞等の、ポリペプチドをグリコシル化する能力を有さない宿主細胞において、ポリペプチドを発現させることによって産生され得る。特定の実施形態では、発現されたポリペプチドは、アグリコシル化されており、より特定の実施形態では、アグリコシル化ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞において発現される。
遺伝子産物の他の修飾。
本発明の方法によって産生される遺伝子産物は、他のタイプの分子に共有結合されてもよい。本発明の範囲を限定せずに、遺伝子産物に共有結合されてもよい分子の例として、ポリペプチド（例えば、受容体、リガンド、サイトカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、ＤＮＡ結合性ドメイン、ＰＤＺドメイン等のタンパク質相互作用ドメイン、キナーゼドメイン、抗体、及び任意のかかるポリペプチドの断片）；水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド及びその類似した化合物、誘導体、又は混合物）；及び細胞傷害剤（例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、及び放射性同位体）が挙げられる。
シャペロン。幾つかの実施形態では、所望の遺伝子産物は、所望の遺伝子産物の産生に有益であるシャペロン等の他の遺伝子産物と同時発現される。シャペロンは、他の遺伝子産物の非共有結合的なフォールディング若しくはアンフォールディング、及び／又は構築若しくは分解を助長するタンパク質であるが、構造が、それらの通常の生物学的機能（フォールディング及び／又は構築のプロセスを意図している）を実施している場合、得られた単量体又は多量体遺伝子産物構造では見られないタンパク質である。シャペロンは、発現構築物内で誘導性プロモーター又は構成的プロモーターから発現させることができるか、又は宿主細胞染色体から発現させることができ、好ましくは、宿主細胞におけるシャペロンタンパク質（複数可）の発現は、適正にフォールディングされ、及び／又は所望の産物へ構築される同時発現された遺伝子産物を産生するのに十分高レベルである。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中に存在するシャペロンの例は、フォールディング因子ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＤｓｂＣ／ＤｓｂＧ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、ＩｂｐＡ／ＩｂｐＢ、Ｓｋｐ、Ｔｉｇ（誘発因子）、及びＦｋｐＡであり、これらは、細胞質又はペリプラズムタンパク質のタンパク質凝集を防ぐのに使用されている。ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ、及びＣｌｐＢは、タンパク質フォールディングを助長するのに相乗的に機能を果たすことができ、したがって、これらのシャペロンの発現は、組合せで、タンパク質発現に有益であることが示されている（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０：３２）。原核生物宿主細胞において真核生物タンパク質を発現させると、同じか、又は関連する真核生物種由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）等の真核生物シャペロンタンパク質は、本発明の或る特定の実施形態では、所望の遺伝子産物とともに同時発現されるか、又は誘導可能に同時発現される。
宿主細胞において発現され得るシャペロンの１つは、土壌糸状菌類（ｓｏｉｌ ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅ）（軟腐病真菌）であるフミコーラ・イソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである。フミコーラ・イソレンスＰＤＩのアミノ酸配列は、配列番号４０として示され、それは、自然タンパク質のシグナルペプチドを欠如しており、その結果、それは宿主細胞質にとどまる。ＰＤＩをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に関して最適化されており、ＰＤＩに関する発現構築物は、配列番号４１として示される。配列番号４１は、その５’末端にＧＣＴＡＧＣ ＮｈｅＩ制限部位を、ヌクレオチド７〜１２にＡＧＧＡＧＧリボソーム結合部位を、ヌクレオチド２１〜１４７８にＰＤＩコード配列を、及びその３’末端にＧＴＣＧＡＣ ＳａｌＩ制限部位を含有する。配列番号４１のヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター等のプロモーターのすぐ下流に挿入されるよう設計された。配列番号４１におけるＮｈｅＩ及びＳａｌＩ制限部位を使用して、それを、その全体が参照により本発明に組み込まれる米国特許出願ＵＳ２０１５３５３９４０Ａ１号に記載されている、ｐＳＯＬ発現ベクター（配列番号４２）のベクター多重クローニング部位等のベクター多重クローニング部位へ挿入することができる。様々な種（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１７９６７）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０７２３７）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０９１０３）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１７７７０及びＱ１７９６７）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ４８７７３、Ｑ９ＸＩ０１、Ｑ９ＳＲＧ３、Ｑ９ＬＪＵ２、Ｑ９ＭＡＵ６、Ｑ９４Ｆ０９、及びＱ９Ｔ０４２）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１２７３０））由来のＰＤＩポリペプチド、及び同様にかかるＰＤＩポリペプチドの修飾形態を含む他のＰＤＩポリペプチドもまた、宿主細胞において発現され得る。本発明の或る特定の実施形態では、本発明の宿主細胞において発現されるＰＤＩポリペプチドは、配列番号４０の長さの少なくとも５０％（又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）に対して、少なくとも７０％、又は８０％、又は９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を共有し、ここで、アミノ酸配列同一性は、実施例１１に従って決定される。
補因子の細胞輸送。機能にとって補因子を要する遺伝子産物を産生するために本発明の発現系を使用する場合、入手可能な前駆体から補因子を合成することが可能であるか、又は補因子を環境から採取することが可能な宿主細胞を使用することが有用である。一般的な補因子として、ＡＴＰ、補酵素Ａ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、及びヘムが挙げられる。補因子輸送ポリペプチド及び／又は補因子合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞へ導入させることができ、かかるポリペプチドは、本発明の方法によって産生されるべき遺伝子産物とともに、構成的に発現され得るか、又は誘導可能に同時発現され得る。
ＩＩ．発現構築物。
発現構築物は、目的の１つ又は複数の遺伝子産物の発現用に設計されたポリヌクレオチドである。目的の或る特定の遺伝子産物は、それらが発現される宿主細胞の種とは異なる種に由来する「異種」遺伝子産物であり、及び／又は遺伝子構築物内で利用されるプロモーター（複数可）から自然に発現されない異種遺伝子産物であり、及び／又はかかる遺伝子産物の天然に存在する形態との差を含むように設計されている修飾遺伝子産物である。異種及び／又は修飾遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は異なる種の生物に由来したポリヌクレオチドの組合せを含むか、又は天然に存在するポリヌクレオチドとは異なるように修飾されているポリヌクレオチドを含む発現構築物は、天然に存在しない分子である。発現構築物は、宿主細胞染色体へ組み込ませることができるか、又はプラスミド若しくは人工染色体等の、宿主細胞染色体とは無関係に複製するポリヌクレオチド分子として、宿主内に維持され得る。発現構築物の例は、１つ又は複数のポリヌクレオチド配列の、宿主細胞染色体への挿入から得られるポリヌクレオチドであり、ここで、挿入されたポリヌクレオチド配列は、染色体コード配列の発現を変化させる。発現ベクターは、１つ又は複数の遺伝子産物の発現用に具体的に使用されるプラスミド発現構築物である。１つ又は複数の発現構築物は、宿主細胞染色体へ組み込まれ得るか、又はプラスミド若しくは人工染色体等の染色体外ポリヌクレオチド上で維持され得る。本発明の或る特定の実施形態では、発現構築物は、ｐＳＯＬ発現ベクター（配列番号４２）である。
発現構築物は、複製起点、選択可能マーカー、構成的又は誘導性プロモーター（以下で更に記載される）等のプロモーター、リボソーム結合部位、及び多重クローニング部位等の或る特定のポリヌクレオチド要素を含み得る。これらのポリヌクレオチド要素の例は、当該技術分野で周知であり、それらの更なる説明は、下記の特許公報及び出願（複数可）に見出すことができ、それらは全て、参照により本明細書に明らかに組み込まれる：ＵＳ９６１７３３５Ｂ２号及びＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」；ＷＯ２０１６２０５５７０Ａ１号、「Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７０６４号、「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」。
誘導性プロモーター。以下で更に記載されるように、本発明の発現系の一部として発現構築物に含まれ得る幾つかの異なる誘導性プロモーターが存在する。好ましい誘導性プロモーターは、ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号の表１で規定されるようなプロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも３０個（より好ましくは、少なくとも４０個、最も好ましくは少なくとも５０個）の連続塩基に対して、少なくとも８０％ポリヌクレオチド配列同一性（より好ましくは、少なくとも９０％同一性、最も好ましくは、少なくとも９５％同一性）を共有し、ここで、パーセントポリヌクレオチド配列同一性は、実施例１１の方法を使用して決定される。「標準的な」誘導条件（実施例１０を参照）下では、好ましい誘導性プロモーターは、Ｄｅ Ｍｅｙ ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ」，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０ Ｍａｒ ２４； １０： ２６の定量的ＰＣＲ方法を使用して決定される場合に、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２亜株ＭＧ１６５５の相当する「野生型」誘導性プロモーターの強度の少なくとも７５％（より好ましくは、少なくとも１００％、最も好ましくは、少なくとも１１０％）を有する（ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号、実施８Ａを参照）。発現構築物内で、誘導性プロモーターは、誘導可能に発現されるべき遺伝子産物に関するコード配列に対して５’に（又は「その上流に」）配置されて、その結果、誘導性プロモーターの存在が、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのコード鎖に対して５’から３’への方向で、遺伝子産物コード配列の転写を誘導する。発現構築物内の誘導性プロモーターから発現される遺伝子産物は、これらの誘導性プロモーターから自然に発現される遺伝子産物ではなく、むしろ、それらは、異種遺伝子産物であり、誘導性プロモーターから発現される異種遺伝子産物を含む発現構築物は、必然的に自然には見られない人工構築物であるという結果を伴う。
誘導性プロモーター。下記は、遺伝子産物の発現用の発現構築物において、かかる発現構築物を含有する宿主細胞に対して成され得る遺伝子組換えの幾つかと併せて、使用され得る誘導性プロモーターの説明である。これらの誘導性プロモーター及び関連遺伝子の例は、別記しない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託ＡＴＣＣ ７００９２６）、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２亜株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託ＡＴＣＣ １０７９８）に由来するものである。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／５３５６２号（ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号として公開）の表１は、誘導性プロモーター及び関連遺伝子のこれらの例に関するヌクレオチド配列のＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５におけるゲノム位置を列挙しており、ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号公報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号の表１に見られるようなゲノム位置によって言及されるヌクレオチド及び他の遺伝子配列は、参照により本明細書に明らかに組み込まれる。本明細書中に記載されるＥ．ｃｏｌｉプロモーター、遺伝子、及び株に関する更なる情報は、ｅｃｏｌｉｗｉｋｉ．ｎｅｔ．に位置するオンラインＥｃｏｌｉＷｉｋｉリソースを含む多くの公的情報源に見出すことができる。
アラビノースプロモーター。（本明細書中で使用する場合、「アラビノース」は、Ｌ−アラビノースを意味する。）アラビノース利用に関与する幾つかのＥ．ｃｏｌｉオペロンは、アラビノースによって誘導可能である（ａｒａＢＡＤ、ａｒａＣ、ａｒａＥ、及びａｒａＦＧＨ）が、「アラビノースプロモーター」及び「ａｒａプロモーター」という用語は通常、ａｒａＢＡＤプロモーターを指定するのに使用される。Ｐａｒａ、ＰａｒａＢ、ＰａｒａＢＡＤ、及びＰＢＡＤ等の幾つかの更なる用語が、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒａＢＡＤプロモーターを示すのに使用されている。「ａｒａプロモーター」又は上述の代替的用語のいずれかの本明細書中での使用は、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｒａＢＡＤプロモーターを意味する。別の用語「ａｒａＣ−ａｒａＢＡＤプロモーター」の使用から分かるように、ａｒａＢＡＤプロモーターは、双方向性プロモーターの一部であるとみなされ、ａｒａＢＡＤプロモーターは、一方の方向で、ａｒａＢＡＤオペロンの発現を制御し、ａｒａＣプロモーターは、他方の方向で、ａｒａＢＡＤプロモーターに非常に接近して、ａｒａＢＡＤプロモーターとは逆鎖上で、ａｒａＣコード配列の発現を制御している。ＡｒａＣタンパク質は、ａｒａＢＡＤプロモーターの正及び負の両方の転写制御因子である。アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣタンパク質は、ＰＢＡＤからの転写を抑圧するが、アラビノースの存在下では、アラビノースの結合時にそのコンホメーションを変化させるＡｒａＣタンパク質は、ＰＢＡＤからの転写を可能にする正の調節要素となる。ａｒａＢＡＤオペロンは、Ｌ−アラビノースを、中間体Ｌ−リブロース及びＬ−リブロースリン酸塩を通じて、Ｄ−キシルロース−５−リン酸塩に変換することによって、Ｌ−アラビノースを代謝するタンパク質をコードする。アラビノース誘導性プロモーターからの発現の誘導を最大限にする目的で、Ｌ−アラビノースの、Ｌ−リブロースへの変換を触媒するＡｒａＡの機能を排除又は低減すること、また同様に、任意選択で、ＡｒａＢ及びＡｒａＤの少なくとも１つの機能を排除又は低減することが有用である。アラビノースを、他の糖に変換する細胞の能力を排除又は低減することによって、宿主細胞の、細胞におけるアラビノースの有効濃度を減少する能力を排除又は低減することにより、より多くのアラビノースが、アラビノース誘導性プロモーターの誘導に利用可能となる。アラビノースを宿主細胞に移動させるトランスポーターをコードする遺伝子は、低親和性Ｌ−アラビノースプロトン共輸送体をコードするａｒａＥ、及びＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｌ−アラビノーストランスポーターのサブユニットをコードするａｒａＦＧＨオペロンである。Ｌ−アラビノースを細胞に輸送し得る他のタンパク質は、それぞれ、１７７位でアラニンに代わって、システイン又はバリンアミノ酸を有する、ＬａｃＹラクトースパーミアーゼ：ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）及びＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質の或る特定の突然変異体である（Ｍｏｒｇａｎ−Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ａｎｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｒａＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｏｆ ｒｅｌａｘｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００２ Ｍａｙ ２８； ９９（１１）：７３７３−７３７７）。アラビノース誘導性プロモーターの相同的誘導を達成するために、アラビノースによる調節に関係なく、アラビノースの、細胞への輸送を行うことが有用である。これは、ＡｒａＦＧＨトランスポータータンパク質の活性を排除又は低減すること、及びａｒａＥが構成的プロモーターからのみ転写されるようにａｒａＥの発現を変化させることによって遂行することができる。ａｒａＥの構成的発現は、自然ａｒａＥ遺伝子の機能を排除又は低減すること、及び構成的プロモーターから発現されるＡｒａＥタンパク質に関するコード配列を含む発現構築物を、細胞に導入することによって遂行され得る。或いは、ＡｒａＦＧＨ機能を欠如している細胞において、宿主細胞の染色体ａｒａＥ遺伝子の発現を制御するプロモーターは、アラビノース誘導性プロモーターから、構成的プロモーターへ変更させることができる。同様の様式で、アラビノース誘導性プロモーターの相同的誘導に対する更なる代替物として、ＡｒａＥ機能を欠如している宿主細胞は、構成的プロモーターから発現される細胞中に存在する任意の機能的ＡｒａＦＧＨコード配列を有し得る。別の代替物として、自然ａｒａＥ及びａｒａＦＧＨプロモーターを、宿主染色体において構成的プロモーターで置き換えることによって、ａｒａＥ遺伝子及びａｒａＦＧＨオペロンの両方を、構成的プロモーターから発現することが可能である。また、ＡｒａＥ及びＡｒａＦＧＨアラビノーストランスポーターの両方の活性を排除又は低減すること、またその状況で、このタンパク質がアラビノースを輸送することを可能にするＬａｃＹラクトースパーミアーゼにおいて突然変異を使用することが可能である。ｌａｃＹ遺伝子の発現は通常、アラビノースによって調節されないため、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）又はＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）等のＬａｃＹ突然変異体の使用は、アラビノース誘導性プロモーターが、アラビノースの存在によって誘導される場合に「有るか無しか」の誘導現象を引き起こさない。ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質は、アラビノースを細胞に輸送する際により有効であるようであるので、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｃ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用は、ＬａｃＹ（Ａ１７７Ｖ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用にとって好ましい。
プロピオネートプロモーター。「プロピオネートプロモーター」又は「ｐｒｐプロモーター」は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｒｐＢＣＤＥオペロンに関するプロモーターであり、ＰｐｒｐＢとも呼ばれる。ａｒａプロモーターと同様に、ｐｒｐプロモーターは、双方向性プロモーターの一部であり、一方の方向で、ｐｒｐＢＣＤＥオペロンの発現を制御し、ｐｒｐＲプロモーターは、他方の方向で、ｐｒｐＲコード配列の発現を制御している。ＰｒｐＲタンパク質は、ｐｒｐプロモーターの転写調節因子であり、ＰｒｐＲタンパク質が２−メチルクエン酸（「２−ＭＣ」）を結合すると、ｐｒｐプロモーターからの転写を活性化させる。プロピオネート（プロパノエートとも呼ばれる）は、プロピオン酸（又は「プロパン酸」）のイオンＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ−であり、この種の分子の或る特定の特性：水から塩析される場合、油状層を生じるという特性及び石鹸様カリウム塩を有するという特性を共有する一般式Ｈ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨを有する「脂肪」酸の最小である。市販のプロピオネートは概して、プロピオン酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＮａ）等のプロピオン酸の一価陽イオン塩として、又はプロピオン酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ）２）等の二価陽イオン塩として販売されている。プロピオネートは、膜透過性であり、ＰｒｐＥ（プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ）によるプロピオネートの、プロピオニル−ＣｏＡへの変換、続くＰｒｐＣ（２メチルクエン酸シンターゼ）による、プロピオニル−ＣｏＡの、２ＭＣへの変換によって、２ＭＣへ代謝される。ｐｒｐＢＣＤＥオペロンによってコードされる他のタンパク質であるＰｒｐＤ（２−メチルクエン酸デヒドラターゼ）及びＰｒｐＢ（２−メチルイソクエン酸リアーゼ）は、２ＭＣの、ピルビン酸塩及びコハク酸塩等のより小さな産物への更なる代謝に関与している。したがって、細胞増殖培地に添加したプロピオネートによる、プロピオネート誘導性プロモーターの誘導を最大限にするためには、プロピオネートを２ＭＣに変換するためのＰｒｐＣ及びＰｒｐＥ活性を有するが、同様に２ＭＣが代謝されるのを防ぐための排除又は低減されたＰｒｐＤ活性、及び同様に任意選択で排除又は低減されたＰｒｐＢ活性を有する宿主細胞を有することが望ましい。２ＭＣ生合成に関与するタンパク質をコードする別のオペロンは、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨオペロンとも呼ばれる、ｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣオペロンである。これらの遺伝子は、コハク酸塩の、プロピオニル−ＣｏＡへの変換に必要とされるタンパク質をコードして、続いてそれらは、ＰｒｐＣによって２ＭＣに変換され得る。これらのタンパク質の機能の排除又は低減は、２−ＭＣ誘導物質の産生に関する平行経路を除去し、したがって、プロピオネート誘導性プロモーターの発現のバックグラウンドレベルを低減し、外因的に供給されるプロピオネートに対する、プロピオネート誘導性プロモーターの感度を高め得る。株ＪＳＢを創出するためのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入されたｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ−ｙｇｆＩの欠失（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ，「Ａ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｎｔｅｒｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５ Ｎｏｖ； ７１（１１）：６８５６−６８６２）は、外因的に供給される誘導物質の非存在下でバックグラウンド発現を低減させるのに役立ったが、この欠失はまた、株ＪＳＢにおけるｐｒｐプロモーターからの全体的な発現を低減させた。しかしながら、欠失ｓｂｍ−ｙｇｆＤ−ｙｇｆＧ−ｙｇｆＨ−ｙｇｆＩはまた、未知の機能を有する推定上のＬｙｓＲ−ファミリー転写調節因子をコードするｙｇｆＩに影響を及ぼすようであることに留意されるべきである。遺伝子ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨは、１つのオペロンとして転写され、ｙｇｆＩは、逆鎖から転写される。ｙｇｆＨ及びｙｇｆＩコード配列の３’末端は、数個の塩基対で重複しており、したがって、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨオペロンの全てを取り出す欠失は、同様に、ｙｇｆＩコード機能も取り出すようである。ＹｇｆＧ（ＳｃｐＢ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼとも呼ばれる）等のｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ遺伝子産物のサブセットの機能を排除若しくは低減すること、又はｙｇｆＩの発現に影響を及ぼさないようにｙｇｆＨ（又はｓｃｐＣ）遺伝子の十分な３’末端を残しながら、ｓｂｍ−ｙｇｆＤＧＨ（又はｓｃｐＡ−ａｒｇＫ−ｓｃｐＢＣ）オペロンの大部分を欠失させることは、誘導される発現の最大レベルを低減させずに、プロピオネート誘導性プロモーターからバックグラウンド発現を低減させるのに十分であり得る。
ラムノースプロモーター。（本明細書中で使用する場合、「ラムノース」は、Ｌ−ラムノースを意味する。）「ラムノースプロモーター」又は「ｒｈａプロモーター」、又はＰｒｈａＳＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｈａＳＲオペロンに関するプロモーターである。ａｒａ及びｐｒｐプロモーターと同様に、ｒｈａプロモーターは、双方向性プロモーターの一部であり、一方の方向で、ｒｈａＳＲオペロンの発現を制御し、ｒｈａＢＡＤプロモーターは、他方の方向で、ｒｈａＢＡＤオペロンの発現を制御している。しかしながら、ｒｈａプロモーターは、発現の調節に関与する２つの転写調節因子を有する：ＲｈａＲ及びＲｈａＳ。ＲｈａＲタンパク質は、ラムノースの存在下でｒｈａＳＲオペロンの発現を活性化するのに対して、ＲｈａＳタンパク質は、それぞれ、Ｌ−ラムノース異化オペロン及び輸送オペロンであるｒｈａＢＡＤ及びｒｈａＴの発現を活性化する（Ｗｉｃｋｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ ｆａｍｉｌｙ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＲｈａＳ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｒｈａＳＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２０１０ Ｊａｎ；１９２（１）：２２５−２３２）。ＲｈａＳタンパク質はまた、ｒｈａＳＲオペロンの発現も活性化することができるが、事実上、ＲｈａＳは、より高いレベルにまで、サイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）の、ＲｈａＲともに発現を同時活性化する能力を妨害することによって、この発現を負に自己調節する。ｒｈａＢＡＤオペロンは、Ｌ−ラムノースをＬ−ラムヌロースへ変換するラムノース異化タンパク質ＲｈａＡ（Ｌ−ラムノースイソメラーゼ）；Ｌ−ラムヌロースをリン酸化して、Ｌ−ラムヌロース−１−Ｐを形成するＲｈａＢ（ラムヌロキナーゼ）；及びＬ−ラムヌロース−１−ＰをＬ−ラクトアルデヒド及びＤＨＡＰ（ジヒドロキシアセトンリン酸）に変換するＲｈａＤ（ラムヌロース−１−リン酸アドラーゼ）をコードする。ラムノース誘導性プロモーターからの発現の誘導に利用可能な細胞におけるラムノースの量を最大限にするために、ＲｈａＡの機能を、若しくは任意選択で、ＲｈａＡ、並びにＲｈａＢ及びＲｈａＤの少なくとも１つの機能を排除又は低減することによって、触媒により分解されるラムノースの量を低減させることが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞はまた、ｒｍｌＢＤＡＣＸ（又はｒｆｂＢＤＡＣＸ）オペロンによってコードされるタンパク質ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ、及びＲｍｌＤ（それぞれ、ＲｆｂＡ、ＲｆｂＢ、ＲｆｂＣ、及びＲｆｂＤとも呼ばれる）の活性により、アルファ−Ｄ−グルコース−１−ＰからＬ−ラムノースを合成することができる。ラムノース誘導性プロモーターからバックグラウンド発現を低減し、外因的に供給されるラムノースによるラムノース誘導性プロモーターの誘導の感度を高めるために、ＲｍｌＡ、ＲｍｌＢ、ＲｍｌＣ、及びＲｍｌＤタンパク質の１つ又は複数の機能を排除又は低減することが有用であり得る。Ｌ−ラムノースは、ＲｈａＴ、ラムノースパーミアーゼ又はＬ−ラムノース：プロトン共輸送体によって細胞に輸送される。上述するように、ＲｈａＴの発現は、転写調節因子ＲｈａＳによって活性化される。ラムノースによる誘導（ＲｈａＳの発現を誘導する）に関係なく、ＲｈａＴの発現を行うためには、細胞における全ての機能的なＲｈａＴコード配列が、構成的プロモーターから発現されるように、宿主細胞が変化され得る。更に、ＲｈａＳに関するコード配列は、欠失又は不活性化させることができ、その結果、機能的ＲｈａＳは産生されない。細胞におけるＲｈａＳの機能を排除又は低減することによって、ｒｈａＳＲプロモーターからの発現のレベルは、ＲｈａＳによる負の自己調節の非存在に起因して増加し、ラムノース触媒オペロンｒｈａＢＡＤの発現レベルは減少されて、ラムノースの、ｒｈａプロモーターからの発現を誘導する能力が更に高まる。
キシロースプロモーター。（本明細書中で使用する場合、「キシロース」は、Ｄ−キシロースを意味する）「キシロースプロモーター」又は「ｘｙｌプロモーター」、又はＰｘｙｌＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｘｙｌＡＢオペロンに関するプロモーターを意味する。キシロースプロモーター領域は、ｘｙｌＡＢオペロン及びｘｙｌＦＧＨＲオペロンがともに、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体上の反対方向で、隣接するキシロース誘導性プロモーターから発現されるという点で、他の誘導性プロモーターに対する組織が類似している（Ｓｏｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｋ，「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ ｏｐｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２： ＸｙｌＲ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ」，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９７ Ｎｏｖ；１７９（２２）：７０２５−７０３２）。ＰｘｙｌＡ及びＰｘｙｌＦプロモーターの両方の転写調節因子は、キシロースの存在下でこれらのプロモーターの発現を活性化するＸｙｌＲである。ｘｙｌＲ遺伝子は、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンの一部として、又はキシロースによって誘導可能でなく、ｘｙｌＨタンパク質コード配列とｘｙｌＲタンパク質コード配列との間に位置するそれ自身の弱いプロモーターから発現される。Ｄ−キシロースは、Ｄ−キシロースをＤ−キシルロースに変換するＸｙｌＡ（Ｄ−キシロースイソメラーゼ）によって異化されて、続いて、Ｄ−キシルロースが、ＸｙｌＢ（キシルロキナーゼ）によってリン酸化されて、Ｄ−キシルロース−５−Ｐを形成する。キシロース誘導性プロモーターからの発現の誘導に利用可能な細胞におけるキシロースの量を最大限にするために、少なくともＸｙｌＡの機能を、若しくは任意選択で、ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢの両方の機能を排除又は低減することによって、触媒により分解されるキシロースの量を低減させることが望ましい。ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ＡＢＣスーパーファミリー高親和性Ｄ−キシローストランスポーターのサブユニットであるＸｙｌＦ、ＸｙｌＧ、及びＸｙｌＨをコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ低親和性キシローススプロトン共輸送体をコードするｘｙｌＥ遺伝子は、独立したオペロンを表し、その発現もまた、キシロースによって誘導可能である。キシロースによる誘導に関係なく、キシローストランスポーターの発現を行うためには、全ての機能的なキシローストランスポーターが、構成的プロモーターから発現されるように、宿主細胞が変化され得る。例えば、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンは、ｘｙｌＦＧＨコード配列が欠失されるように変化させることができ、キシロース誘導性ＰｘｙｌＦプロモーターから発現される唯一の活性タンパク質としてＸｙｌＲを残し、ｘｙｌＥコード配列は、その自然プロモーターではなく、構成的プロモーターから発現される。別の例として、ｘｙｌＲコード配列は、発現構築物においてＰｘｙｌＡ又はＰｘｙｌＦプロモーターから発現されるのに対して、ｘｙｌＦＧＨＲオペロンはいずれかが欠失されて、ｘｙｌＥが、構成的に発現されるか、或いはｘｙｌＦＧＨオペロン（発現構築物中に存在している間はずっと、ｘｙｌＲコード配列を欠如している）が、構成的プロモーターから発現され、ｘｙｌＥコード配列は、欠失又は変化されて、ｘｙｌＥコード配列は、活性タンパク質を産生しない。
ラクトースプロモーター。「ラクトースプロモーター」という用語は、ｌａｃＺｐ１とも呼ばれるプロモーターであるｌａｃＺＹＡオペロンに関するラクトース誘導性プロモーターを指し、このラクトースプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．２，１１−ＪＡＮ−２０１２）のゲノム配列において、およそ３６５６０３〜３６５５６８（マイナス鎖、およそ３６５６０３〜３６５５９８にＲＮＡポリメラーゼ結合（「−３５」）部位、３６５５７９〜３６５５７３にプリブノーボックス（「−１０」）、及び３６５５６７に転写開始部位を有する）に位置する。幾つかの実施形態では、本発明の発現系は、ｌａｃＺＹＡプロモーター等のラクトース誘導性プロモーターを含み得る。他の実施形態では、本発明の発現系は、ラクトース誘導性プロモーターではない１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む。
アルカリホスファターゼプロモーター。「アルカリホスファターゼプロモーター」及び「ｐｈｏＡプロモーター」という用語は、リン酸飢餓の条件下で誘導されるプロモーターであるｐｈｏＡｐｓｉＦオペロンに関するプロモーターを指す。ｐｈｏＡプロモーター領域は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．３，１６−ＤＥＣ−２０１４）のゲノム配列において、およそ４０１６４７〜４０１７４６（プラス鎖、４０１６９５〜４０１７０１にプリブノーボックス（「−１０」）（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ （ｐｈｏＡ） ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８１ Ｎｏｖ １１；９（２１）：５６７１−５６７８）を有する）に位置する。ｐｈｏＡプロモーターに関する転写活性化因子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてセンサータンパク質ＰｈｏＲとともに、二成分シグナル伝達系を形成する転写調節因子であるｐｈｏＢである。ＰｈｏＢ及びＰｈｏＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００９１３．３， １６−ＤＥＣ−２０１４）のゲノム配列において、およそ４１７０５０〜４１９３００（プラス鎖、４１７，１４２〜４１７，８３１にＰｈｏＢコード配列、及び４１７，８８９〜４１９，１８４にＰｈｏＲを有する）に位置する、ｐｈｏＢＲオペロンから転写される。ｐｈｏＡプロモーターは、それが誘導物質の添加によってではなく、物質−細胞内リン酸−の欠如によって誘導されるという点で、上述の誘導性プロモーターとは異なる。この理由で、ｐｈｏＡプロモーターは概して、発酵の後期段階等の、宿主がリン酸に関して枯渇している段階で産生されるべき遺伝子産物の転写を誘導する。幾つかの実施形態では、本発明の発現系は、ｐｈｏＡプロモーターを含み得る。他の実施形態では、本発明の発現系は、ｐｈｏＡプロモーターではない１つ又は複数の誘導性プロモーターを含む。
ＩＩＩ．宿主細胞。
目的の遺伝子産物をコードする発現構築物は、宿主細胞において発現されて、目的の遺伝子産物を産生する。宿主細胞は、かかる発現構築物を含み、またそれらを発現することが可能な任意の細胞であり得る。特に適切な宿主細胞は、発酵培養において高い細胞密度で増殖可能であり、高度に制御された誘導性遺伝子発現により、酸化している宿主細胞の細胞質において遺伝子産物を産生することができる。これらの品質を備えた宿主細胞は、下記特性の幾つか又は全てを組み合わせることによって産生される。（１）宿主細胞は、細胞質において酸化ポリペプチドの発現又は機能を高めることにより、及び／又は細胞質において還元ポリペプチドの発現又は機能を減少させることによって、酸化している細胞質を有するように遺伝子組換えされる。かかる遺伝子変化の具体例を本明細書中に提供する。任意選択で、宿主細胞はまた、所望の遺伝子産物（複数可）の産生に役立つシャペロン及び／又は補因子を発現するように、及び／又はポリペプチド遺伝子産物をグリコシル化するように遺伝子組換えされ得る。（２）宿主細胞は、目的の１つ又は複数の遺伝子の発現に関して設計された１つ又は複数の発現構築物を含み、或る特定の実施形態では、少なくとも１つの発現構築物は、誘導性プロモーター及び誘導性プロモーターから発現されるべき遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。（３）宿主細胞は、発現構築物（複数可）からの遺伝子産物発現の或る特定の態様を改善するよう設計された更なる遺伝子組換えを含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、（Ａ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質に関するトランスポータータンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能の変化を有し、別の例として、ここで、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子は、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、及びｘｙｌＨからなる群から選択されるか、又は特にａｒａＥであり、或いは遺伝子機能の変化は、より詳細には、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現であり、及び／又は（Ｂ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能のレベルの低減を有し、更なる例として、ここで、少なくとも１つの上記誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする遺伝子は、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、及びｘｙｌＢからなる群から選択され、及び／又は（Ｃ）少なくとも１つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能のレベルの低減を有し、この遺伝子は、更なる実施形態では、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、及びｒｍｌＤからなる群から選択される。
多量体産物を含む、遺伝子産物の効率的且つ費用効果の高い産生を可能にする宿主細胞の例が提供される。宿主細胞として、培養液中の単離細胞の他に、多細胞生物の一部である細胞、又は異なる生物若しくは生物系内で増殖させた細胞を挙げることができる。本発明の或る特定の実施形態では、宿主細胞は、酵母（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等）若しくは細菌等の微生物細胞であるか、又はグラム陽性菌若しくはグラム陰性菌であるか、Ｅ．ｃｏｌｉであるか、又はＥ．ｃｏｌｉＢ株であるか、又はＥ．ｃｏｌｉ（Ｂ株）ＥＢ０００１細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＡＳＥ（ＤＧＨ）細胞とも呼ばれる）であるか、又はＥ．ｃｏｌｉ（Ｂ株）ＥＢ０００２細胞である。酸化している細胞質を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、具体的にはＥ．ｃｏｌｉＢ株ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログＮｏ．Ｃ３０２８Ｈ）及びＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログＮｏ．Ｃ３０２９Ｈ）及びＥ．ｃｏｌｉＫ株ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７（ＮＥＢカタログＮｏ．Ｃ３０２６Ｈ）を用いた増殖実験において、酸化している細胞質を有するこれらのＥ．ｃｏｌｉＢ株は、最も密接に相当するＥ．ｃｏｌｉ Ｋ株よりもはるかに高い細胞密度に増殖することが可能であると、本発明者らは決定した。
原核生物宿主細胞。本発明の幾つかの実施形態では、遺伝子産物の発現用に設計された発現構築物は、原核生物宿主細胞等の宿主細胞において提供される。原核生物宿主細胞として、古細菌（例えば、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ））、グラム陽性菌（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブレビバチルス・コシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブリネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ））、又はアルファプロテオバクテリアを含むグラム陰性菌（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、及びシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、ベータプロテオバクテリア（アリカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））、及びガンマプロテオバクテリア（アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、大腸菌、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））を挙げることができる。好ましい宿主細胞として、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシャリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）を含む）、及シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）等の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のガンマプロテオバクテリアが挙げられる。
真核生物宿主細胞。酵母（カンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、他のクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）としても既知のビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）／ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）種、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））；他の真菌類（アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ））；昆虫細胞系統（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）シュナイダー２細胞及びツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞）；及び不死化細胞系統を含む哺乳動物細胞系統（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ，２９３、又はＨＥＫ−２９３）細胞、及びヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２））等の真核細胞を含む、多くの更なるタイプの宿主細胞が、本発明の発現系で使用され得る。上記宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
宿主細胞遺伝子機能に対する変化。誘導性発現構築物を含む宿主細胞の遺伝子機能に、或る特定の変化を成して、誘導物質による宿主細胞集団の効率的且つ均質な誘導を促進することができる。好ましくは、発現構築物、宿主細胞遺伝子型、及び誘導条件の組合せにより、ＷＯ２０１４０２５６６３Ａ１号の実施例８Ｂに記載されるように、Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ａｒａｂｉｎｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ａｌｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ａ ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２０００ Ｄｅｃ；１８２（２４）： ７０２９−７０３４の方法によって測定されるように、誘導されたプロモーターそれぞれから遺伝子産物を発現する培養液における、少なくとも７５％（より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは９５％）の細胞をもたらす。Ｅ．ｃｏｌｉ以外の宿主細胞に関して、これらの変化には、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子に構造上類似している遺伝子、又はＥ．ｃｏｌｉ遺伝子の機能に類似した宿主細胞内の機能を実行する遺伝子の機能が関与し得る。宿主細胞遺伝子機能に対する変化は、遺伝子タンパク質コード配列を、その全体で欠失すること、又は遺伝子の十分大きな部分を欠失すること、配列を遺伝子に挿入すること、又はそうでなければ、機能的な遺伝子産物のレベルの低減が、その遺伝子から成されるように遺伝子配列を変化させることによって、遺伝子機能を排除又は低減することを含む。宿主細胞遺伝子機能に対する変化はまた、例えば、遺伝子のより高レベルの転写を誘導する、より強力な遺伝子プロモーターを創出するように自然プロモーターを変化させること、又はミスセンス突然変異を、より高活性の遺伝子産物を生じるタンパク質コード配列に導入することによって、遺伝子機能を高めることを包含する。宿主細胞遺伝子機能に対する変化は、任意の方法で遺伝子機能を変更させること、例えば、構成的に活性化されるプロモーターを創出するように自然誘導性プロモーターを変化させることを含む。誘導性プロモーター、及び／又はシャペロンタンパク質の発現の変更に関して本明細書中に記載されるような、誘導物質の輸送及び代謝に関する遺伝子機能における変化の他に、宿主細胞の還元−酸化環境を変化させることも可能である。
宿主細胞還元−酸化環境。Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌細胞において、ジスルフィド結合を必要とするタンパク質は、ジスルフィド結合形成及び異性化が、ＤｓｂＡＢＣＤ及びＤｓｂＧを含むＤｓｂ系によって触媒されるペリプラズムに通常排出される。通常は全てペリプラズムに輸送される、システインオキシダーゼＤｓｂＡ、ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ、又はＤｓｂタンパク質の組合せの発現の増加は、ジスルフィド結合を必要とする異種タンパク質の発現において利用されている（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０： ３２）。シグナルペプチドを欠如している、したがって、ペリプラズムへ輸送されないＤｓｂＡ及び／又はＤｓｂＣ（「ｃＤｓｂＡ」又は「ｃＤｓｂＣ」）の細胞質バージョン等のこれらのＤｓｂタンパク質の細胞質形態を発現することも可能である。ｃＤｓｂＡ及び／又はｃＤｓｂＣ等の細胞質Ｄｓｂタンパク質は、宿主細胞の細胞質を、より酸化している状態に、したがって、細胞質において産生される異種タンパク質におけるジスルフィド結合の形成をより促すようにさせるのに有用である。宿主細胞の細胞質はまた、チオレドキシン及びグルタレドキシン／グルタチオン酵素系を直接変更させることによって、あまり還元状態でなく、したがって、より酸化している状態にさせることができる：グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）又はグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）を欠損している突然変異株は、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）とともに、細胞を酸化させている。これらの株は、リボヌクレオチドを還元することが不可能であり、したがって、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の外因性反応物の非存在下で増殖することができない。ペルオキシレドキシンＡｈｐＣをコードする遺伝子ａｈｐＣにおける、サプレッサー突然変異（例えば、ａｈｐＣ＊及びａｈｐＣΔ、Ｌｏｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，「ＳＨｕｆｆｌｅ，ａ ｎｏｖｅｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｆｏｌｄｉｎｇ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｔｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１２ Ｍａｙ ８；１１：５６；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５−２８５９−１１−５６）は、それを、還元型グルタチオンを生成するジスルフィドレダクターゼに変換して、酵素リボヌクレオチドレダクターゼ上への電子のチャネリングを可能にし、またｇｏｒ及びｔｒｘＢを欠損しているか、又はｇｓｈＢ及びｔｒｘＢを欠損している細胞が、ＤＴＴの非存在下で増殖するのを可能にする。ＡｈｐＣの異なる種類の突然変異形態は、ガンマグルタミルシステインシンテターゼ（ｇｓｈＡ）の活性を欠損しており、且つｔｒｘＢを欠損している株を、ＤＴＴの非存在下で増殖させることができる：これらとして、ＡｈｐＣ Ｖ１６４Ｇ、ＡｈｐＣ Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７１Ｔｅｒ、及びＡｈｐＣ ｄｕｐ１６２−１６９（Ｆａｕｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｌｌｏｗｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８ Ｍａｙ ６；１０５（１８）：６７３５−６７４０，Ｅｐｕｂ ２００８ Ｍａｙ ２）。酸化している細胞質を有するかかる株では、露出されたタンパク質システインが、チオレドキシンによって、それらの生理学的機能を逆転させて触媒されるプロセスで容易に酸化されるようになり、ジスルフィド結合の形成をもたらす。酸化している細胞質の宿主細胞における酸化的ストレス効果を低減するのに有益であり得る他のタンパク質は、ペルオキシドを水及びＯ２へと不均化（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ）を起こさせる、Ｅ．ｃｏｌｉ ｋａｔＧによってコードされるＨＰＩ（ヒドロペルオキシダーゼＩ）及びＥ．ｃｏｌｉｋａｔＥによってコードされるＨＰＩＩ（ヒドロペルオキシダーゼＩＩ）カタラーゼ−ペルオキシダーゼである（Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｋｏｇｏｍａ，「Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． １９９１ Ｄｅｃ；５５（４）：５６１−５８５；Ｒｅｖｉｅｗ）。誘導された同時発現により、又は構成的発現のレベルの上昇により、宿主細胞においてＫａｔＧ及び／又はＫａｔＥタンパク質のレベルを増加させることは、本発明の幾つかの実施形態の態様である。
宿主細胞に対して成され得る別の変化は、スルフヒドリルオキシダーゼＥｒｖ１ｐを、宿主細胞の細胞質における酵母ミトコンドリアの内膜腔からは発現させることであり、これは、ｇｏｒ又はｔｒｘＢにおける突然変異の非存在下でさえ、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質における真核生物起源のジスルフィド結合されたタンパク質の様々な複合体の産生を増加させることがわかっている（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ」Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｊａｎ ７；１０：１）。
発現構築物を含む宿主細胞はまた、好ましくは、ｃＤｓｂＡ及び／又はｃＤｓｂＣ及び／又はＥｒｖ１ｐを発現し、ｔｒｘＢ遺伝子機能を欠損しており、またｇｏｒ、ｇｓｈＢ、及び／又はｇｓｈＡの遺伝子機能も欠損しており、任意選択で、ｋａｔＧ及び／又はｋａｔＥ遺伝子のレベルを増加させ、任意選択で、ＡｈｐＣの適切な突然変異形態を発現し、その結果、宿主細胞は、ＤＴＴの非存在下で増殖され得る。
ポリペプチド遺伝子産物のグリコシル化。宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化する、それらの能力において変化を有し得る。例えば、真核生物宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又はオリゴサッカリルトランスフェラーゼにおいて、排除又は低減された遺伝子機能を有することができ、糖タンパク質を形成するためのポリペプチドの正常な真核細胞グリコシル化を損なう。通常はポリペプチドをグリコシル化しないＥ．ｃｏｌｉ等の原核宿主細胞は、グリコシル化機能を提供する一連の真核生物又は原核生物遺伝子を発現するよう変化され得る（ＤｅＬｉｓａ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ」，ＷＯ２００９０８９１５４Ａ２号，２００９ Ｊｕｌ １６）。
変化した遺伝子機能を有する利用可能な宿主細胞株。本発明の発現系及び方法において使用されるべき宿主細胞の好ましい株を創出するために、所望の遺伝子変化をすでに含む株から開始することは有用であり、これらの例を表２に提供する。
Figure 2022502039
宿主細胞遺伝子機能を変化させる方法。遺伝子機能を排除、低減、又は変更するために宿主細胞遺伝子に対して変化を成す、当該技術分野で既知の多くの方法が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の原核生物等の宿主細胞における遺伝子の標的破壊を行う方法が記載されており（Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｒａｐｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ＥＴ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９９ Ｍａｒ １５；２７（６）：１５５５−１５５７；Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，「Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０００ Ｊｕｎ ６；９７（１２）：６６４０−６６４５）、類似したＲｅｄ／ＥＴ組換え方法を使用するためのキットが市販されている（例えば、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ社、ドイツ、ハイデルベルのｔｈｅ Ｑｕｉｃｋ ＆ Ｅａｓｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。本発明の一実施形態では、宿主細胞の１つ又は複数の遺伝子の機能は、配列のゲノム位置に対する参照によって本明細書に組み込まれるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５コード配列の１つ等の、破壊されるべき遺伝子のコード配列内のヌクレオチド配列を同定することによって、より具体的には、そのコード配列内の５０個のヌクレオチドそれぞれの２つの隣接する一続きを選択することによって、排除又は低減される。続いて、Ｔｈｅ Ｑｕｉｃｋ ＆ Ｅａｓｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者の指示書に従って使用して、コード配列の選択した隣接する一続き間に、選択可能マーカーを含有するポリヌクレオチド構築物を挿入して、遺伝子の正常な機能を排除又は低減する。また、Ｒｅｄ／ＥＴ組換え方法を使用して、プロモーター配列を、異なるプロモーター、例えば、構成的プロモーター、又は或る特定レベルの転写を促進すると予測される人工プロモーターの配列で置き換えることができる（Ｄｅ Ｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ」，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０ Ｍａｒ ２４；１０：２６）。宿主細胞遺伝子の機能はまた、ＲＮＡサイレンシング方法によって、排除又は低減され得る（Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｃｅ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１１ Ａｐｒ；３９（８）：ｅ５０，Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｆｅｂ ３）。更に、宿主細胞遺伝子機能を変化させる既知の突然変異は、伝統的な遺伝的方法により宿主細胞へ導入され得る。
ＩＶ．宿主細胞を増殖させる方法。
小容積増殖。本発明の方法を実行するのに使用される宿主細胞は、増殖又は誘導条件を試験する目的で、又は多重の異なる遺伝子産物の産生のため、などで小容積で増殖させることができる。実施されるべき実験の性質により、１ｍＬ〜最大１リットル、又は５ｍＬ〜５００ｍＬ、又は任意の利便性の高い容積等の、宿主細胞が増殖されるべき容積が決定される。或る特定の実施形態では、増殖培地を攪拌して、したがって、宿主細胞に酸素を供給するために、宿主細胞が増殖される容器は、繰り返し移動される。宿主細胞は、適切な栄養素及び抗生物質耐性を提供する発現構築物の宿主細胞による保持に関して選択するのに必要とされる任意の抗生物質を含有する培地中で増殖される。宿主細胞の小容積増殖の例は、実施例１に提供される。細胞中に存在する誘導性発現構築物の発現を誘導するのに使用されるのに適した、誘導物質の量を決定するために、実施例１０に記載されるような実験は、例えばマルチウェルプレートにおいて小容積で増殖される宿主細胞を用いて、好適に実施することができる。
発酵。組換えタンパク質の産生に関与する発酵プロセスは、下記のカテゴリーの１つに収まる操作モードを使用する：（１）不連続（バッチプロセス）操作、（２）連続操作、及び（３）半連続（フェドバッチ）操作。バッチプロセスは、プロセスの開始時に滅菌培養培地（バッチ培地）に微生物を接種することを特徴とし、特定の反応期間培養される。培養中、細胞濃度、基質濃度（炭素源、栄養素の塩、ビタミン等）、及び産物濃度は変化する。良好な混合により、反応混合物の組成又は温度の著しい局所的な差は、確実に見られない。反応は、非定常性であり、増殖制限基質（一般に、炭素源）が消費されるまで、細胞は増殖される。
連続操作は、新鮮な培養培地（フィード培地）が発酵槽に連続的に添加されること、また消費した培地及び細胞が、同じ速度で発酵槽から連続的に引き出されることを特徴とする。連続操作では、増殖速度は、培地添加の速度によって決定され、増殖収量は、増殖制限基質（即ち、炭素源）の濃度によって決定される。反応変数及び制御パラメーターは全て、時間内で一定のままであり、したがって、時間一定状態は、発酵槽において確立されており、続いて一定の生産性及び出力において確立される。
半連続操作は、バッチ操作及び連続操作の組合せとしてみみなされ得る。発酵は、バッチプロセスとして着手され、増殖制限基質が消費された場合に、グルコース及び無機質を含有する連続フィード培地が、指定された様式で添加される（フェドバッチ）。換言すると、この操作は、バッチ培地及びフィード培地の両方を用いて、細胞増殖及び所望のタンパク質の効率的な産生を達成する。細胞は、培養期間中、添加もされず、また取り去られもせず、したがって、微生物が関連する限りは、発酵槽が、バッチ式で操作する。本発明は、上述するプロセスを含む、様々なプロセスにおいて利用され得る一方で、特定の利用が、フェドバッチプロセスと併用される。
上記プロセスそれぞれにおいて、細胞増殖及び産物蓄積は、代謝産物形成と、培地ｐＨ、光学密度、色彩及び滴定可能な酸性度等の幾つか他の変数との間の相関を活用することによって、間接的にモニタリングすることができる。例えば、光学密度は、不溶性細胞粒子の蓄積の表示を提供し、ディスプレイデバイス又はレコーダーに接続されたマイクロＯＤユニットを使用して稼働させた状態で、或いはサンプリングによってオフラインでモニタリングすることができる。６００ナノメートルでの光学密度の読取り（ＯＤ６００）を、乾燥細胞重量を決定する手段として使用する。
高細胞密度発酵は概して、最低でも細胞乾燥重量３０ｇ／リットルを上回る収量（６０を上回るＯＤ６００）をもたらし、或る特定の実施形態では、細胞乾燥重量４０ｇ／リットルを上回る収量（８０を上回るＯＤ６００）をもたらプロセスとして記載される。高細胞密度発酵プロセスは全て、「フェドバッチ」プロセスで発酵槽へ徐々に計量される濃縮栄養素培地を用いる。供給中の発酵槽内容物の希釈を最低限に抑えるために、濃縮栄養素フィード培地は、高細胞密度プロセスに必要とされる。フェドバッチプロセスは、オペレーターが炭素源供給を制御するのを可能にするので必要とされ、これは、細胞が、高細胞密度を生成するのに十分高い炭素源濃度に曝露される場合に、非常に多くの阻害性副産物である酢酸塩を産生し、その増殖が停止するので、重要である（Ｍａｊｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄｏｍａｃｈ，「Ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ−ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｖｉｅｗ ｏｆ ａｃｅｔａｔｅ ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １９９０ Ｍａｒ ２５；３５（７）：７３２−７３８）。
酢酸及びその脱プロトン化されたイオンである酢酸塩はともに、バイオリアクターにおける細菌増殖及び組換えタンパク質産生の主な阻害性副産物の１つを表す。ｐＨ７にて、酢酸塩は、酢酸の最も一般的な形態である。炭素エネルギー供給源の量が、細菌のプロセシング能力を非常に超過すると、任意の過剰な炭素エネルギー供給源は、酢酸に変換され得る。研究により、トリカルボン酸回路及び／又は電子伝達系の飽和が、酢酸蓄積の最も可能性の高い原因であることがわかっている。増殖培地の選択は、酢酸阻害のレベルに影響を及ぼす可能性があり、限定培地中で増殖させた細胞は、複合培地中で増殖させた細胞によりも、酢酸により影響を及ぼされ得る。グルコースの、グリセロールによる置き換えはまた、産生される酢酸の量を非常に減少させ得る。グリセロールは、細胞への輸送のその速度が、グルコースの速度よりもはるかに遅いので、グルコースよりも少ない酢酸を産生すると考えられている。しかしながら、グリセロールは、グルコースよりも高価であり、細菌をよりゆっくりと増殖させ得る。増殖温度の低減の使用もまた、炭素源の取込みの速度及び増殖速度を減少することができ、したがって、酢酸の産生を減少させる。細菌は、過剰な炭素エネルギー供給源の存在下で、又は高速増殖中に酢酸を産生するだけでなく、嫌気性条件下でも酢酸を産生する。Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌が、非常に高速で増殖されると、細菌は、嫌気性増殖条件を引き起こし得るバイオリアクター系の酸素送達能力を超過し得る。このことが起こるのを防ぐために、よりゆっくりとした一定の増殖速度が、栄養素制限により維持され得る。酢酸蓄積を低減する他の方法として、酢酸産生を防止するための遺伝子組換え、酢酸利用遺伝子の付加、及び酢酸が低減された株の選択が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）は、そのグリオキシル酸シャント回路において、酢酸を使用するその能力のため、より低レベルの酢酸を産生することがわかっている株の１つである。
様々なより大規模なフェドバッチ発酵槽が、組換えタンパク質の産生に利用可能である。より大きな発酵槽は、ヘッドスペース用に十分な余地を残している少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００リットル〜１００，０００リットルの容量（即ち、作業容積）を有する。これらの発酵槽は、撹拌機の羽根車又は酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー供給源）を分配させるための他の適切な手段を使用する。小規模発酵は概して、容積の容量がおよそ１００リットル以下、幾つかの特定の実施形態では、およそ１０リットル以下の発酵槽における発酵を指す。
組換えタンパク質を産生するのに使用される発酵プロセスに関する標準的な反応条件は概して、Ｅ．ｃｏｌｉ等の微生物宿主細胞に関しては、約５．０〜８．０のｐＨの維持及び２０℃〜５０℃の範囲の培養温度の維持を伴う。宿主系としてＥ．ｃｏｌｉを利用する本発明の一実施形態では、発酵は、約７．０の最適ｐＨ及び約３０℃の最適な培養温度で実施される。
これらの発酵プロセスにおける標準的な栄養素培地構成成分としては概して、エネルギー、炭素、窒素、リン、マグネシウム、並びに微量の鉄及びカルシウムが挙げられる。更に、培地は、増殖因子（例えば、ビタミン及びアミノ酸）、無機塩、及び産物形成に必須の任意の他の前駆物質を含有し得る。培地は、グリセロリン酸等の輸送可能な有機リン酸、例えば、アルファ−グリセロリン酸及び／又はベータ−グリセロリン酸を、またより具体的な例として、グリセロール−２−リン酸及び／又はグリセロール−３−リン酸を含有し得る。培養中の宿主細胞の元素組成を使用して、細胞増殖を支持するのに要される構成成分それぞれの比率を算出することができる。構成成分濃度は、プロセスが、低細胞密度でプロセスであるか、又は高細胞密度プロセスであるかに応じて多様である。例えば、低細胞密度バッチ発酵プロセスにおけるグルコース濃度は、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの範囲であるのに対して、高細胞密度バッチプロセスは、４５ｇ／Ｌ〜７５ｇ／Ｌの範囲のグルコース濃度を使用する。更に、増殖培地は、適度な濃度（例えば、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲、又は０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、若しくは２ｍＭ）のベタイン、ジメチスルホニオイソプロピオネート、及び／又は塩素等の保護性オスモライトを含有し得る。
１つ又は複数の誘導物質は、目的の遺伝子産物（複数可）の発現を誘導するように増殖培地へ導入され得る。誘導は、指数増殖期中に、例えば、指数増殖期の終わりに向かうが、培養が最大細胞密度に達する前に、又は発酵中のより初期で、若しくはより後期で開始され得る。目的の遺伝子産物（複数可）を、リン酸塩等の栄養素の枯渇によって誘導可能な１つ又は複数のプロモーターから発現する場合、栄養素が、外因性誘導物質を添加せずに、増殖培地から十分に枯渇されていた場合に、誘導が起きる。
宿主細胞の指数増殖中、代謝速度は、酸素及び炭素／エネルギー供給源の利用可能性に正比例し、したがって、利用可能な酸素又は炭素／エネルギー供給源、又はその両方のレベルを低減すると、代謝速度は低減する。攪拌速度又は背圧等の発酵槽操作パラメーターの操作、又はＯ２圧を低減させることにより、利用可能な酸素レベルが調節され、宿主細胞代謝速度が低減され得る。炭素／エネルギー供給源（複数可）の濃度若しくは送達速度、又はその両方の低減は、類似した効果を有する。更に、発現系の性質に応じて、発現の誘導は、宿主細胞代謝速度の減少を引き起こし得る。最終的に、最大細胞密度に達すると、増殖速度は、停止するか、又は劇的に減少する。宿主細胞代謝速度の低減は、タンパク質フォールディング及び構築のプロセスを含む、目的の遺伝子産物（複数可）のより制御された発現をもたらし得る。宿主細胞代謝速度は、比増殖速度又は瞬間増殖速度のいずれかの細胞増殖速度を測定することによって（ＯＤ６００等の光学密度（ＯＤ）を測定することによって、及び／又は任意選択で、ＯＤをバイオマスに換算することによって）評価され得る。アッセイした時点それぞれでのおおよそのバイオマス（細胞乾燥重量）を算出する：おおよそのバイオマス（ｇ）＝（ＯＤ６００÷２）×容積（Ｌ）。望ましい増殖速度は、本発明の或る特定の実施形態では、０．０１〜０．７の範囲であるか、又は０．０５〜０．３の範囲であるか、又は０．１〜０．２の範囲であるか、又はおよそ０．１５（０．１５＋又は−１０％）であるか、又は０．１５である。
発酵設備。下記は、宿主細胞を増殖させるのに使用され得る設備の例である；発酵系の多くの他の構造が市販されている。宿主細胞は、２Ｘ Ｒｕｓｈｔｏｎインペラー及びＢｉｏＦｌｏ／ＣｅｌｌｉＧｅｎ １１５発酵槽／バイオリアクターコントローラを備えた１Ｌ容器サイズのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ／ＣｅｌｌｉＧｅｎ １１５ウォータージャケット付発酵槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州、ホーポージ）において増殖させることができ、温度、ｐＨ及び溶解酸素（ＤＯ）がモニタリングされる。また、それぞれが２Ｘ Ｒｕｓｈｔｏｎインペラー、ＤＡＳｂｏｘ排気型冷却器、並びにＤＡＳｂｏｘ供給及びモニタリングモジュール（これには、温度センサー、ｐＨ／酸化還元センサー、及び溶解酸素センサーが含まれる）を備えた４個の６０ｍｌ〜２５０ｍｌのＤＡＳｂｏｘ発酵容器を含む４倍設計可能なＤＳＡＧＩＰ系（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州、ホーポージ）において宿主細胞を増殖させることも可能である。また、適切な発酵設備として、ステンレス鋼容器中に容量３０Ｌ及び最大作業容積２０Ｌ、空気のみでスパージャされる２個のＲｕｓｈｔｏｎインペラー、並びにｐＨ、ＤＯ、排気Ｏ２、排気ＣＯ２、温度、及び圧力を含む全ての関連パラメーターの追跡及び制御を可能にするＢｉｏＳＣＡＤＡソフトウェアを実行する制御システムを備えたＮＬＦ ２２ ３０Ｌ ｌａｂ発酵槽（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、マサチューセッツ州、サマービル）も挙げられる。
Ｖ．可溶化及び精製方法。
本明細書中に記載する方法によって発現される遺伝子産物は、様々な精製方法を使用して精製することができる。遺伝子産物が、本明細書中に記載されるように、特に実施例１及び実施例２に記載される特定の実施形態で見られるように、可溶化可能な複合体を産生するように発現される場合、非常に好適な精製方法を使用して、更なるリフォールディングステップを必要とせずに、適切にフォールディングされた活性な遺伝子産物を効率的に産生することができる。実施例３は、可溶性画分及び不溶性画分を分離するための溶解後の遠心分離の必要性なく、また還元剤を使用せずに、ジスルフィド結合を形成する遺伝子産物を含む、可溶化可能な複合体として発現される遺伝子産物を精製する、更なる「直接的な可溶化」方法について記載している。これらの方法で可溶化可能な遺伝子酸産物複合体を精製する方法を図１に図で概略しており、以下でより詳細に記載している。
遠心分離による宿主細胞の収集。発現構築物を含む宿主細胞は増殖され、目的の遺伝子産物の発現は、本明細書中で更に記載されるように誘導されて、宿主細胞内での、目的の遺伝子産物の可溶化可能な複合体の産生をもたらす。増殖及び誘導期間が完了した後、宿主細胞は、例えば、４℃で４，０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって収集される。宿主細胞は、この時点で凍結させて、後の精製用に保管することができる。
宿主細胞の溶解。幾つかの代替的な方法の１つを使用して、無傷の宿主細胞の得られたペレットを溶解させる。宿主細胞のペレットは、０ｍＭ〜３００ｍＭのＮａＣｌ若しくは２．５ｍＭのＬ−システイン、ｐＨ９．５を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）等の非変性溶解緩衝液中に再懸濁される。溶解緩衝液中に再懸濁した後、宿主細胞は、酵素的又は化学的溶解、機械的溶解、及び／又は凍結融解法を含む方法によって溶解され得る。酵素的溶解に関して、溶解は、組換えリゾチーム、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）、及びオクチルグルコシドを、溶解緩衝液に添加することによって達成され得る。機械的溶解に関して、再懸濁させた宿主細胞を、最大６０ｍｌの容積に関してはＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓモデルＬＶ１マイクロフルダイザー、若しくは６０ｍＬを超える容積に関してはＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓモデルＭ−１１０Ｙ１マイクロフルダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、マサチューセッツ州、ウェストウッド）等のマイクロフルダイザーに、又はＰａｎｄａＰＬＵＳ ２０００卓上型ホモジナイザー若しくはＧＥＯ Ｎｉｒｏ（ＧＥＡ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、メリーランド州、コロンビア）に１回又は複数回通す。凍結融解法に関しては、細胞懸濁液を−８０℃で凍結させて、２５℃〜３７℃の温度で融解させる。
溶解後、溶解した細胞混合物を任意選択で遠心分離して、可溶化可能な遺伝子産物複合体をペレット化する。この遠心分離ステップの速度及び時間は、３，３００〜２０，０００×ｇ及び３０分〜６０分で多様であり得る。より高速を使用すると、再懸濁させるのがより困難である可溶化可能な遺伝子産物複合体のペレットを生じ得る。この遠心分離ステップにおいて使用される速度が小さいほど、可溶化可能な遺伝子産物複合体と、上清との分離を完了させるのに必要とされる遠心分離の持続期間はより長い。塩濃度及び／又は細胞溶解物のｐＨを変更して、可溶化可能な遺伝子産物複合体を、細胞溶解物中の他の構成成分と分離するのに必要な遠心分離又は他の条件を変化させることが可能である。
このように目的の遺伝子産物を収集する重要な利点の１つは、潜在的に混入している宿主細胞タンパク質及び他の分子の大部分が、上清中に残存し、ペレット化された可溶化遺伝子産物複合体から除去されることであり、したがって、可溶化遺伝子産物複合体は、目的の遺伝子産物が非常に富化された調製物である。或いは、可溶化可能な複合体のペレット化後に残存する上清が、十分な遺伝子産物を保持する場合、この上清中の遺伝子産物は、直接的な可溶化方法に関して記載されるように可溶化させることができ、及び／又は更に精製され得る。ペレット化された材料の分析により、相当数の細胞が溶解されずに生き残り、可溶化可能な遺伝子産物複合体をともに遠心沈降されて（ｓｐｕｎ−ｄｏｗｎ）いることが示される場合、無傷細胞を、可溶化可能な遺伝子産物複合体と分離させる遠心分離手順における「クッション」として、高濃度スクロース溶液等の濃い、及び／又は粘性の溶液を使用することが可能である。機械的溶解が使用される場合、溶解された細胞混合物は、マイクロフルダイザーに多重回（例えば、４回又は５回）通すことができる。以下で記載されるように、上記遠心分離手順が、直接的に可溶化方法では省略される場合、細胞溶解物を試薬と混合して、可溶化可能な遺伝子産物複合体の可溶化に関する条件を作り出す。
遺伝子産物は、可溶化溶液中に配置することによって可溶化可能な複合体から放出され、可溶化された遺伝子産物を生じる。遠心分離から生じたペレット中の、又は細胞溶解物中のいずれかの遺伝子産物は、下記の通りに可溶化される。可溶化溶液は好ましくは、１つ又は複数のｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、塩酸グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、又は尿素等の１つ又は複数のカオトロピック剤を含有する。例示的な可溶化溶液は、任意選択で２．５ｍＭ Ｌ−システインを有するｐＨ９．５のＰＢＳ若しくはＴＲＩＳ中の７Ｍ〜８Ｍの尿素、又はｐＨ７．５でのＰＢＳ中の６Ｍのグアニジン塩酸塩を含有することができ、有効な可溶化実験は、６．５〜１１．０の範囲のｐＨ値で、可溶化緩衝液を使用してきた。可溶化に使用されるべき代替的な緩衝液組成を決定するための実験は、実施例５に記載されている。ペレットは、再懸濁に先立って、任意選択で洗浄されてもよい。可溶化緩衝液の、ペレットへの添加後、ペレットを手で再懸濁するよりも、ピペットチップを使用して、例えばプレートボルテキサーを用いて少なくとも１０分間、ペレットを含有するチューブを機械的に攪拌することは、より効率的である。遺伝子産物の可逆的化学修飾、例えば、遊離リジン残基及び第１級アミノ基のシトラコニル化は、遺伝子産物の溶解度を変化させることができる。
遠心分離による、可溶化された遺伝子産物の任意選択の浄化。図１に示されるように、可溶化された遺伝子産物の溶液は、任意選択で、例えば、１６℃で、７，０００×ｇにて１時間の遠心分離によって浄化され得る。可溶化された遺伝子産物を含有する上清は、遠心分離後に保持される。浄化手順は、以下に記載されるように、可溶化された遺伝子産物を、可溶化溶液よりも濃度が低い溶液へ配置させる前及び／又は後に実施され得る。
可溶化された遺伝子産物の、可溶化溶液よりも濃度が低い溶液への配置。ペプチドマッピングによって分析されるべきタンパク質遺伝子産物の試料に関して、７Ｍ〜８Ｍ尿素又は６Ｍグアニジン塩酸塩が、多数のプロテアーゼの切断効率を阻害するため、可溶化された遺伝子産物は通常、透析、希釈、又はダイアフィルトレーション等の方法を使用して、２倍〜１０倍低減させた濃度の変性剤を有する溶液中に配置させる。例えば、任意選択で２．５ｍＭ Ｌ−システインを有する、ＰＢＳ又はＴＲＩＳ、ｐＨ６．５〜９．５中の７Ｍ〜８Ｍ尿素中での可溶化後、遺伝子産物を含有する試料を、任意選択で２．５ｍＭ Ｌ−システインを有する、ＰＢＳ又はＴＲＩＳ、ｐＨ６．５〜９．５中の２Ｍ〜４Ｍ尿素中に配置させて、例えば１６℃で振盪しながら、１０時間〜１２０時間インキュベートさせることができる。
より高濃度の遺伝子産物を有する溶液の任意選択の形成。保管、更なる精製、又は特性決定等の目的で、可溶化された遺伝子産物の溶液を再構成させて、より高濃度の遺伝子産物を有する溶液を生じることができる。これは、以下に記載するように、溶液をクロマトグラフィーカラムに流すことと、所望の緩衝液に溶出させることとによって、又は以下に記載するようにスピン脱塩若しくはダイアフィルトレーションによって、又は他の既知の方法によって達成され得る。別の代替法は、遺伝子産物を沈殿させるための、硫酸アンモニウム沈殿等の沈殿方法の使用であり、遺伝子産物は、任意選択で、所望の濃度で所望の緩衝液中にペレットを再懸濁させる前に洗浄され得る。
切断配列を有する遺伝子産物は、任意選択で、化学的処理又は酵素的処理によって切断され得る。例えば、トリプシン等の酵素によって切断される配列、及び／又は上述の、また実施例２の「ＤＰ」（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）化学的切断配列等の配列を含む遺伝子産物は、使用又は更なる精製に先立って、適切な酵素的又は化学的処理によって切断され得る。
可溶化された遺伝子産物は、任意選択で、更に精製され得る。例えば、６×Ｈｉｓタグを含む遺伝子産物は、他の分子を流しながら、目的の６×Ｈｉｓでタグ付けした遺伝子産物を特異的に保持するニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラムの使用等の固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製され得る。ＩＭＡＣは、ヒスチジン残基と、二価金属イオン、最も一般的にはＮｉ２＋との間の相互作用を利用し、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、及びＺｎ２＋を含む他の金属イオンもまた、Ｈｉｓ残基に対して親和性を有することがわかっている。金属イオンは通常、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、より一般的に使用されるニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む各種金属−キレーター系によりマトリクスに固定化されている。ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）、Ｎｉセファロース、及び銅−カルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＯ−ＣＭＡ）等の多種多様なマトリクスが市販されている。カラムは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０等の緩衝液で平衡化され得る。６×Ｈｉｓでタグ付けした遺伝子産物の結合後、低濃度のイミダゾール（０ｍＭ、又は１０ｍＭ〜５０ｍＭ）を含有する緩衝液、又は結合緩衝液のｐＨよりも高いか、若しくは低いｐＨを有する緩衝液を用いた洗浄ステップを含み、試料の負荷中にカラムに弱く結合される非特異的なタンパク質を除去することができる。例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１０の洗浄緩衝液を使用することができる。６×Ｈｉｓでタグ付けした遺伝子産物は、少なくとも１００ｍＭイミダゾール、又は２５０ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾール、又は５００ｍＭイミダゾールの濃度でイミダゾールを含有する緩衝液を使用して、マトリックスから溶出され得る。また、緩衝液ｐＨを下げることによって、及び／又は溶出緩衝液中にＥＤＴＡ等のキレート剤（５０ｍＭ〜２００ｍＭ、又は１００ｍＭの濃度で）を含むことによって、目的の遺伝子産物を溶出することが可能である。例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ１０の溶出緩衝液を使用することができる。ポリヒスチジンタグを含む遺伝子産物に関する精製方法は、Ｂｏｒｎｈｏｒｓｔ ａｎｄ Ｆａｌｋｅ，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０００；３２６：２４５−２５４に更に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡｇｅｎ社、メリーランド州、ジャーマンタウン）又はＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ Ｎｉセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を使用した、可溶化可能な複合体からの６×Ｈｉｓでタグ付けされたＣＰＢｐｒｏプロインスリンタンパク質のＩＭＡＣによる精製において、この方法は、プロインスリン遺伝子産物の、９０％を上回る純度への精製を可能にした。
６×Ｈｉｓタグを欠如している試料に関して、又はかかるタグの使用が必要ではない手順に関して、ＤＥＡＥ樹脂の使用等の陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフ、及び／又は逆相若しくは高速液体クロマトグラフィー（ＰＲＬＣ又はＨＰＬＣ）を用いて、目的の遺伝子産物を、他の混入物と、又は化学的若しくは酵素的処理の望ましくない産物（複数可）と更に分離することができる。
化学的又は酵素的手順は、任意選択で、カラム等の固体基板によって保持されている遺伝子産物に対して実施することができる：例えば、実施例３Ｃにおいて以下に記載されるような、プロインスリンの、成熟インスリンへのトランスバージョンとも呼ばれる、分取又は分析目的でのプロインスリン遺伝子産物のトリプシン切断。
また、ＩＭＡＣ等のクロマトグラフィー手段を使用して、可溶化された複合体を、複合体を可溶化するのに使用される緩衝液以外の緩衝液に、例えば、ＰＢＳ ｐＨ７．５中の２５０ｍＭ〜最大５００ｍＭイミダゾールに溶出させることができ、続いて、実施例２Ｄに記載されるように、スピン脱塩を行って、溶出緩衝液を、より好ましい緩衝液に交換する。塩等の望ましくない緩衝液構成成分を除去する方法として、透析、ダイアフィルトレーション（例えば、遠心濃縮器又はタンジェンシャルフロー濾過を使用して）、並びに例えば、ポリアクリルアミドビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）、セファデックス樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）、及び／又はサイズ排除樹脂（Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）等の他のクロマトグラフィー樹脂を使用したゲル濾過が挙げられる。
可溶化された遺伝子産物は、化学的に及び／又は構造的に特性決定され得る。ジスルフィド結合を含有するタンパク質遺伝子産物に関して、本発明の方法によって産生されるタンパク質の適正なフォールディングは、正確に形成されたジスルフィド結合の存在から推測することができる。ジスルフィド結合の同定及び特性決定は、タンパク質の化学的又は酵素的処理を使用して、ペプチド断片を産生するペプチドマッピング方法を使用して達成され得る。これらの断片の分離及び同定は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析によって遂行され、ペプチドマッピング及びＬＣ−ＭＳ方法は、以下の実施例８に更に記載される。ペプチドマッピング及びＬＣ−ＭＳ分析はまた、点突然変異及び翻訳後修飾（ＰＴＭ）等のタンパク質一次構造の差を同定することができる。
酸化されたジスルフィド結合の数及び存在は、無処置（ｉｎｔａｃｔ）のタンパク質試料に関して検証され得る。タンパク質遺伝子産物は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤、及び／又はヨードアセトアミド（ＩＡＡ）等のスルフヒドリル反応性試薬で処理され得る。還元された試料及び／又はアルキル化された試料のＬＣ−ＭＳ分析は、ジスルフィド結合還元１つにつき２Ｄａの質量増加及び各遊離チオールのアルキル化１つにつき５７Ｄａの質量増加をもたらす。タンパク質遺伝子産物は、ジスルフィドの正確な数の形成のみに関してではなく、正確な架橋配置又は「ジスルフィド構造」に関しても特性決定され得る。この手順は、タンパク質分解、得られたペプチドの、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分離、及びＨＰＬＣピークによって表されるペプチドの質量分析（ＭＳ）の分析からなる。タンパク質分解性のペプチド産物を生成するために、タンパク質遺伝子産物は、臭化シアン等の化学的作用物質、及び／又はトリプシン、ペプシン、リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｇｌｕ−Ｃ）、及びペプチジル−Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（Ａｓｐ−Ｎ）等の酵素的作用物質により断片化され得る。タンパク質遺伝子産物プロインスリンに関して、Ｇｌｕ−Ｃ及びトリプシンを使用して、逐次タンパク質切断反応を実施することができ、ここで、プロテアーゼの添加の順序は交換することができる（即ち、Ｇｌｕ−Ｃ、続いて、トリプシン、又はトリプシン、続いてＧｌｕ−Ｃ）。プロテアーゼ消化反応は、温度範囲２５〜３７℃で４〜１６時間実行させることができ、酵素に対する基質の比は、プロテアーゼ１マイクログラムにつきプロインスリン１２〜２００マイクログラムの範囲である。タンパク質分解効率及び特異性は、ＰｒｏｔｅａｓｅＭａｘ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、マディソン）及びＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦ（Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ州、ミルフォード）等の市販の界面活性剤、及び／又は１０％〜２０％アセトニトリル等の低濃度の有機溶媒の添加により改善され得る。
実施例２Ｃにおいて更に記載されるように、また図５に示されるように、ＬＣ−ＭＳ分析により、可溶化後に更なるリフォールディング又は精製ステップなしで、可溶化されたタンパク質遺伝子産物のおよそ９３％が、適正に形成されたジスルフィド結合を有することが実証された。可溶化された遺伝子産物の特性決定に使用され得る他の方法として、ゲル電気泳動、活性アッセイ、及び分析用逆相による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が挙げられる。
実施例１
リスプロプロインスリンの産生におけるＣＰＢｐｒｏ変異プロペプチドの使用
Ａ．ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンに関する発現構築物の調製
これらの実験では、或る特定のＣＰＢｐｒｏ変異体を、リスプロプロインスリンポリペプチドの小規模発現におけるプロペプチドとして使用した。表３に示されるＣＰＢｐｒｏプロインスリンポリペプチドをコードし、且つＥ．ｃｏｌｉにおける発現に関して最適化されたポリヌクレオチドを含む発現構築物は、ＡＴＵＭ社（カリフォルニア州、ニューアーク）によって合成された。表３の第１の欄は、各完全ＣＰＢｐｒｏプロインスリンポリペプチドアミノ酸配列に関するタンパク質番号（ＰＮ）及び配列番号を提供する。ＲＢＳ配列から終結コドンに至るまでの提示されるＣＰＢｐｒｏプロインスリンポリペプチドそれぞれをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、及び配列番号５４を有する。表３の第２の欄〜第５の欄は、各ＣＰＢｐｒｏプロインスリンポリペプチドの各部分のアミノ酸配列：Ｎ末端ＣＰＢｐｒｏプロペプチド配列、続いて下記のＮからＣへの順序での、リスプロインスリンＢ鎖（表１に示されるような）、Ｃ−ペプチド、及びリスプロインスリンＡ鎖（表１に示されるような）を示す。
Figure 2022502039
ＣＰＢｐｒｏプロインスリンポリペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドは、ｐＳＯＬ発現ベクター（配列番号４２）におけるａｒａＢＡＤプロモーターの下流に位置させた。また、これらの発現構築物はそれぞれ、ｐＳＯＬ発現ベクター内のｐｒｐＢＣＤＥプロモーターの下流にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関するコード配列（ＰＤＩ、配列番号４１）を含有した。
Ｂ．ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの宿主細胞の形質転換及び発現
ｐＳＯＬ：ＣＰＢｐｒｏ−リスプロ／ＰＤＩ発現構築物は、下記の通り、ＥＢ０００１細胞に形質転換された；ＥＢ０００１細胞の遺伝子型は、表２に示される。化学的にコンピテントな（ＣａＣｌ処理した）ＥＢ０００１細胞を、氷上で１０分間解凍した。ＤＮＡ（各発現構築物ＤＮＡストックから１マイクロリットル）を、冷滅菌エッペンドルフチューブに添加した。ＥＢ０００１細胞（１００マイクロリットル）を、ＤＮＡの各チューブに添加して、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。チューブに、４２℃で２０秒間、熱ショックを与えて、氷上で５分間静置させた。形質転換した細胞は、ＳＯＣ増殖培地（ＮＥＷ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社カタログ番号Ｂ９０２０Ｓ）９００マイクロリットル中で、３７℃で１時間、２７５ＲＰＭで振盪しながら回復させた。回復期間後、細胞を、３．８ｋ×ｇで２分間ペレット化して、上清由来の残存している回復培地約１００マイクロリットル容積中に再懸濁させた後、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを含有する寒天プレート上に蒔いた。形質転換して蒔いた細胞を、３７℃で１８時間増殖させた。各形質転換に関して、３つのコロニーをプレートから採取して、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを有するＬＢ培地中で、３０℃にて、２７５ＲＰＭで振盪しながら一晩、定常期（２．０を超えるＯＤ６００）に達するまで培養した。一晩の培養液７５０マイクロリットルに、４０％グリセロール７５０マイクロリットルを添加することによって、グリセロールストックを作製した。グリセロールストックは、−８０℃で保管した。
ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの発現用の宿主細胞培養は、グリセロールストックを穿刺することと、０．５Ｌのバッフルなしのフラスコ中で５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地０．１Ｌを接種することとによって開始された。細胞を３０℃で一晩、２７５ＲＰＭで振盪しながら、ＯＤ６００が２に達するまで増殖させた。宿主細胞培養液を、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地中に、ＯＤ６００が０．２になるように希釈して、０．５Ｌのバッフル付きフラスコ中で総容積０．１Ｌにて、３０℃にて、２７５ＲＰＭで振盪しながら、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで増殖させた。この時点で、適切な容積をペレット化して（３８００×ｇ、１０分）、その結果、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを含有するＭ９最小培地中の再懸濁により、ＯＤ６００ ０．７〜０．７５が得られた。
Ｍ９最小培地。容積１．２Ｌ中で、オートクレーブする：
リン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物 １５．３６ｇ
リン酸カリウム、一塩基性 ３．６ｇ
塩化ナトリウム ０．６ｇ
塩化アンモニウム １．２ｇ
カザミノ酸 ２．４ｇ
ＫＯＨでｐＨを７．２に調節して、１２１℃で４５分間、オートクレーブして、室温に冷却させる；これにより、不完全Ｍ９最小培地が創出される。培地を完成するために、不完全培地それぞれ１０ｍＬに関して、下記の容積の濾過滅菌した塩：１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２０マイクロリットル、１Ｍ ＣａＣｌ２ １マイクロリットル、５ｍｇ／ｍＬのＦｅＳＯ４ １マイクロリットルを添加する。
培養液を、２４ウェルのディープウェルプレートに移行した。下記の誘導条件それぞれに関して、宿主細胞培養液の試料３ｍＬを、各ウェルに添加した：１５マイクロモルのアラビノースを有する各発現構築物に関しては６つのウェル、及び４５マイクロモルのアラビノースを有する各構築物に関しては６つのウェル。宿主細胞を、２７℃又は３０℃で６時間、２７５ＲＰＭで振盪しながら誘導させた。宿主細胞の光学密度を、誘導期間後に測定して、ＯＤ６００は、全てのウェルにおいて１．０〜１．２であった。各発現構築物に関する各誘導条件用の反復試料（３×１ｍＬ、２×５ｍＬのペレット）を、３８００×ｇで７分間、室温での遠心分離によって収集した。
ＰＮ２．５、ＰＮ２．７、及びＰＮ２．９発現構築物の誘導の成功が、クマシーブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して確認された。各発現構築物に関する各誘導条件用の５ｍＬペレットを、氷上で１０分間解凍した。宿主細胞を、ＧＬＢ−ＯＧ溶解緩衝液、ｐＨ７．４（１％オクチルグルコシド、１Ｘプロテアーゼ阻害剤、培養液１ｍＬ当たり２Ｕベンゾナーゼ（ＥＭＤ＃７０７４６）及び培養液１ｍＬ当たり２．２５ｋＵ ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＥＭＤ＃７１１１０）を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ）中に収集時の培養濃度よりも６倍濃度で溶解させた。溶解は、氷上で１０分間インキュベートすることによって進行させた。溶解後、試料を２つのプールに分けて、そのうちの一方に、総溶解物調製物を入れ、他方には、可溶性溶解物調製物を入れた。総溶解物調製物に関して、溶解後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中の８Ｍ尿素を、各試料に１：１の比で添加して、室温で２０分間インキュベートした後、ゲル上に試料を流すよう準備した。可溶性溶解物調製物に関しては、試料を、２０ｋ×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、上清（可溶性画分）を取り出して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中の８Ｍ尿素に、１：１の比で添加して、室温で２０分間インキュベートした後、ゲル上に試料を流すよう準備した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、ＳＤＳ−ＭＥＳ緩衝液中の還元性１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上の試料で実施し、ゲルをクマシーブルー染色で染色した。総溶解物調製物を用いた場合のレーンではＰＮ２．５（配列番号４３）、ＰＮ２．７（配列番号４７）、及びＰＮ２．９（配列番号５１）試料のみに関して、予想サイズの相当なバンドが見られた：これらの試料中のＣＰＢｐｒｏポリペプチドは全て、Ｎ末端メチオニン残基の直後に６×Ｈｉｓ配列を有する。しかしながら、ＰＮ２．５、ＰＮ２．７、及びＰＮ２．９に関するバンドは、可溶性溶解物調製物では観察されず、相当する発現構築物から産生されたタンパク質の相当量が、不溶性（且つ可溶化可能な）形態で産生されることを示した。ＰＮ２．６、ＰＮ２．８、及びＰＮ２．１０発現に関する発現は、いかなる調製物においても観察されず、また追跡実験でも、ＰＮ２．６発現構築物からの発現は検出されなかった。ＰＮ２．６、ＰＮ２．８、及びＰＮ２．１０をコードする発現構築物からの発現の非存在の原因が確定されていないが、これらの発現構築物は、ＰＮ２．５、ＰＮ２．７、及びＰＮ２．９をコードする発現構築物におけるものとは異なる翻訳開始部位周辺に共通のヌクレオチド配列を共有しており、ＰＮ２．６、ＰＮ２．８、及びＰＮ２．１０発現構築物から転写されるメッセージが、効率的に翻訳されない可能性がある。
Ｃ．ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの可溶化及び特性決定
２Ｍ〜６Ｍ尿素による可溶化。ＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン（配列番号４３）の可溶化に関する条件を決定するために、実施例１．Ｂで産生したＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンを含有する宿主細胞の５ｍＬペレットを、氷上で１０分間解凍した。宿主細胞を、ＧＬＢ−ＯＧ溶解緩衝液ｐＨ７．４中に、収集時の培養濃度よりも２倍濃度で、氷上で１０分間溶解させた。続いて、溶解物を１２個の試料に分けて、下記の通りに処理した；総溶解物試料を除く下記試料は全て、２０ｋ×ｇで、４℃で３０分間、遠心分離した：
総溶解物： スピンなし、可溶化添加剤なし
処理なし： 可溶化添加剤なし
６Ｍ尿素： ＧＬＢ中の８Ｍ尿素の添加
４Ｍ尿素： ＧＬＢ中の５．３Ｍ尿素の添加
２Ｍ尿素： ＧＬＢ中の２．６６Ｍ尿素の添加
１Ｍ尿素： ＧＬＢ中の１．３３Ｍ尿素の添加
０．５Ｍ尿素： ＧＬＢ中の０．６６Ｍ尿素の添加
４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００： ＧＬＢ中の５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の添加
２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００： ＧＬＢ中の２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の添加
１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００： ＧＬＢ中の１．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の添加
０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００： ＧＬＢ中の０．６２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の添加
０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００：ＧＬＢ中の０．３１２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の添加
各試料中に存在するＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの量は、ＷＥＳ機器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社、カリフォルニア州、サンノゼ）を使用して、製造業者のプロトコールに倣って、また一般に実施例６に記載されるように、自動キャピラリー電気泳動「ウェスタンブロット」によって決定した。還元性条件下での分析用の調製物において、上記に示すように総溶解物、処理なし、及び可溶化された試料を、ＤＴＴを添加した（４８ｍＭ）０．１×ＷＥＳ緩衝液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社）に１：３００で希釈して、試料を最終濃度０．００３３Ｘにした。ＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンは、５、１５、３０、６０、１２０、２４０、及び４８０秒の曝露で（５秒の曝露のみを定量化に使用する）、マウス抗リスプロ一次抗体及びＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体を使用して、ＷＥＳ機器でのキャピラリー電気泳動によって検出された。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘのみの可溶化処理は概して、この実験では成功せず、総溶解物中で検出されるＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの量によって示されるように、試料中に存在する総ＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンのほんのおよそ１０％又はそれ未満を溶解したに過ぎなかった。少なくとも２Ｍの濃度での尿素による可溶化は、より成功した：可溶化されたＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの量は、尿素濃度を増加させるとともに増加し、６Ｍ尿素は、試料中に存在するＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの約７０％を可溶化させた。
可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン複合体のサイズの特性決定。可溶化可能なＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン複合体を含有する宿主細胞を、下記の通りに溶解させた。宿主細胞溶解によって生成されるタンパク質の総量を表す対照「グアニジン溶解」試料を創出するために、実施例１．Ｂで産生されたＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンを含有する宿主細胞の１ｍＬペレットを、氷上で１０分間解凍して、６ＭグアニジンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８（６ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１０ｍＭイミダゾール、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８に調節）５００マイクロリットル中に再懸濁した。宿主細胞を、−８０℃で１時間凍結させることによって溶解させた後、室温で、３０分間又は完全に解凍するまで解凍させた。また、上述するように、宿主細胞をＧＬＢ−ＯＧ溶解緩衝液中に溶解して、溶解物を、９００×ｇで、４℃にて１５分間遠心分離して、ペレット画分（「Ｐ１」）及び上清（「Ｓ１」）画分を創出した。Ｓ１上清画分の一部を保持して、残りを７０００×ｇで、４℃にて３０分間遠心分離して、ペレット画分（「Ｐ２」）及び上清（「Ｓ２」）画分を創出した。Ｓ２上清画分の一部を保持して、残りを２０Ｋ×ｇで、４℃にて３０分間遠心分離して、ペレット画分（「Ｐ３」）及び上清（「Ｓ３」）画分を創出した。Ｐ１ペレットを、６ＭグアニジンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８中に可溶化した。グアニジン溶解、可溶化されたＰ１、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３試料を、ＷＥＳ機器でのキャピラリー電気泳動によって、上述するような還元性条件下で分析した。９００×ｇのスピン後、Ｓ１可溶性画分中に検出されたＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの量は、グアニジン溶解試料中に検出された「総溶解」量の約４２％であった。可溶化されたＰ１ペレットから検出されたＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの量は、予想の５８％ではなく、グアニジン溶解試料中の「総溶解」量の約３５％であり、ＧＬＢ−ＯＧ溶解、遠心分離、及び可溶化手順の幾つかの段階で、潜在的に回収可能なＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの損失が起きることが示唆された。より高速の７０００×ｇ及び２０Ｋ×ｇのスピン後、ほんの少量（約７％）のＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンが、Ｓ２及びＳ３可溶性画分で検出され、タンパク質の大部分が、Ｐ２ペレット及びＰ３ペレットになった。これらの結果は、Ｎ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの相当部分、おそらく宿主細胞中に存在していたそのおよそ半分が、溶解細胞由来の細胞片をペレット化することができるが可溶性タンパク質をペレット化することができない比較的低い遠心分離速度である９００×ｇ（２０１７年３月２９日のＣｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，２０１３，ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｗｗ．ｃｕｂｅ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ．ｐｄｆを参照）で遠心沈降させるのに十分大きな複合体中に存在することと整合する。９００×ｇのスピン中に可溶性のままである宿主細胞中に存在するＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンのうち、その大部分が７０００×ｇの中間的な遠心分離速度でペレット化された。これは、残存するＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンも宿主中に大きな可溶化可能な複合体の形態で存在することと整合する。
８Ｍ尿素及び３．５Ｍ尿素／５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中での可溶化。ＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン（配列番号４３）の調製に関する可溶化条件を更に評価するために、実施例１Ｂに記載されるように、ＰＮ２．５ ｐＳＯＬ：ＣＰＢｐｒｏ−リスプロ／ＰＤＩ発現構築物を含むＥＢ０００１宿主細胞を増殖させて、１５マイクロモルのアラビノースを用いて誘導させた。誘導後、宿主細胞培養液の１ｍＬ試料を、３８００×ｇで、４℃にて１０分間の遠心分離によって収集した。溶解のために、宿主細胞ペレットを、ＧＬＢ−ＯＧ溶解緩衝液ｐＨ７．４中に再溶解させて、溶解は、氷上で１５分間進行させた。宿主細胞溶解物を、２０Ｋ×ｇで、４℃にて１５分間遠心分離して、得られたペレットを、１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ８．０中の８Ｍ尿素、又は１×ＴＢＳ ｐＨ８．０中の３．５Ｍ尿素／５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘのいずれか中に再懸濁させた。可溶化されたタンパク質の試料は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＳＤＳ ＰＡＧＥ Ｐｒｅｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）を使用して、３．５Ｍ尿素／５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ試料からｔｒｉｔｏｎ−Ｘを除去することによって、及び非還元型（ＬＤＳ試料緩衝液中、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び還元型試料（ＬＤＳ試料緩衝液＋１００ｍＭ ＤＴＴ中）の両方を調製することによって、ＰＡＧＥ用に調製して、各可溶化条件に関してＰＡＧＥによって分析した。各試料中の可溶化されたＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの量を、ＳＤＳ−ＭＥＳ緩衝液中の１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でＰＡＧＥによって評価し、ゲルをクマシーブルー染色で染色した。ＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンの分子量（１２．２５ｋＤ）に関して予想されるようなバンド移動が明らかに見られ、８Ｍ尿素中に可溶化された試料は、３．５Ｍ尿素／５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中に可溶化された試料よりも非常に濃いバンドを生じた。この結果により、これらの条件下で、８Ｍ尿素は、プロインスリン複合体を可溶化する際に、３．５Ｍ尿素／５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘよりも有効であることが示される。
可溶化可能な複合体由来のＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンは、ジスルフィド結合を有し、高度に精製される。可溶化可能な複合体由来のＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンが、ジスルフィド結合又は遊離チオール残基を有するかどうかを決定するために、８Ｍ尿素中に可溶化され、上述されるように調製した試料を、ＳＤＳ−ＭＥＳ緩衝液中の１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上でＰＡＧＥによって分析し、試料の非還元型及び還元型の対は、隣接するレーンに流した。ゲルは、クマシーブルーで染色されて、図２に示される。ＤＴＴによる処理により、還元型試料（レーン４及びレーン６）は、相当する非還元型試料（レーン３及びレーン５）よりもわずかにゆっくりと流れ、非還元型ＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン中のジスルフィド結合の存在を示した。還元型ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンと、非還元型ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンとの間の移動速度の差は、分析用逆相クロマトグラフィーによって確認された。図２はまた、可溶化されたＰＮ２．５ ＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン（レーン３〜レーン６）が、総宿主細胞溶解物（レーン１及びレーン２）中の可溶性タンパク質の、可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンペレットからの除去の結果として非常に精製されたことを示す。
誘導全体にわたる可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン複合体形態。可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン複合体の形成を更に特性決定するために、ＰＮ２．５ ｐＳＯＬ：ＣＰＢｐｒｏ−リスプロ／ＰＤＩ発現構築物を含むＥＢ０００１宿主細胞を用いて、経時的な誘導を実施して、一般的に実施例１Ｂに記載されるように、それらを増殖及び誘導させた。この実験では、１Ｌのバッフル付きフラスコ中にそれぞれ２００ｍＬの３つの容積において、誘導物質として１５マイクロモルのアラビノースを用いて、誘導を宿主細胞培養液で実施して、誘導の開始後の０時間、２時間後、４時間、及び６時間の時点で、試料１ｍＬを採取した。宿主細胞を収集して、溶解を実施して、可溶化可能なペレットを、上述されるように、１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ８．０中の８Ｍ尿素中に再懸濁させ、ＰＡＧＥによって分析した。可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリン複合体は、予想される位置にある各レーンにおけるバンドによって示されるように、２時間、４時間、及び６時間の時点それぞれにて、宿主細胞中に存在した。この結果により、可溶化可能な複合体は、誘導期間全体にわたって、宿主細胞において形成されており、誘導のほんの２時間後に可溶化可能な複合体を形成するのに十分なＣＰＢｐｒｏ＿リスプロプロインスリンが、宿主細胞内に存在することが示される。
実施例２
グラルギンプロインスリンの産生におけるＣＰＢｐｒｏ変異体プロペプチドの使用
Ａ．ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロプロインスリンの発現用の宿主細胞
これらの実験では、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＰＢｐｒｏプロペプチド（「Ｈｉｓ−ＣＰＢ１」）を、グラルギンプロインスリンポリペプチドの発酵規模の発現において使用した。Ｈｉｓ−ＣＰＢ１プロペプチドをコードし、且つＥ．ｃｏｌｉにおける発現に関して最適化されたポリヌクレオチドは、これまでに合成されている（実施例１Ａ）。Ｈｉｓ−ＣＰＢ１プロペプチドをコードする配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に関して同様に最適化され、同様にＡＴＵＭ社（カリフォルニア州、ニューアーク）によって合成されているグラルギンプロインスリンをコードするポリヌクレオチド配列を含む既存の発現構築物にクローニングした。ＰＮ３．１３ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンポリペプチド（配列番号５５）は、そのＮ末端にＨｉｓ−ＣＰＢ１プロペプチド（配列番号２７）を、続いてグラルギンインスリンＢ鎖（配列番号７）、ＲＲＹＰＧＤＶＫＲに相当するＣ−ペプチド（配列番号１１）を有するが、但し、Ｃ−ペプチドの初期アルギニン（ＲＲ）は、この場合、配列番号７のＢ鎖の末端、及びグラルギンインスリンＡ鎖（配列番号６）に存在するとして示される。インスリングラルギン中に見られるジスルフィド結合を含む、ＰＮ３．１３ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンポリペプチドの構造は、図３に模式的に示される。ＰＮ３．１３ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンポリペプチド（配列番号５６）をコードするポリヌクレオチドは、ｐＳＯＬ発現ベクター（配列番号４２）中のａｒａＢＡＤプロモーターの下流に挿入された。この発現構築物はまた、Ｅ．ｃｏｌｉ（配列番号５７）における発現に関して最適化され、ｐＳＯＬ発現ベクター内のｐｒｐＢＣＤＥプロモーターの下流にあるＥｒｖ１ｐ（配列番号３８）を含有した。実施例１Ｂに記載される方法を使用して、ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１３−ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギン／Ｅｒｖ１ｐ発現構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＢ０００１細胞に形質添加して、形質転換された宿主細胞のグリセロールストックを調製して、−８０℃で保管した。
Ｂ．ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの宿主細胞増殖及びその発現の誘導
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１３−ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギン／Ｅｒｖ１ｐ）宿主細胞を、２５０ｍｌのＤＡＳｂｏｘ発酵容器の１つであるバイオリアクター１（「ＢＲ１」）（上記の「発酵設備」を参照）においてＤＳＡＧＩＰ発酵系（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州、ホーポージ）中で増殖させた。バイオリアクターは、下記通りに較正した：ｐＨオフセット０．８０ｐＨ、ｐＨスロープ１０４．１５％、ＤＯオフセット０．０１ｎＡ；ＤＯスロープ６６．７２ｎＡ。
発酵培地。発酵培地、並びに増殖及び誘導フィードの総容積１００ｍＬは、下記の通りに調製した。
発酵培地；滅菌前構成成分、各バイオリアクターに添加した容積９０ｍＬ当たりのｇ／Ｌでの濃度
・リン酸カリウム（一塩基性） １４．８
・クエン酸カリウム三塩基性（一水和物） ３．３
・硫酸アンモニウム ４．４
・塩化ナトリウム ２．２
・酵母抽出物 １１．１
修飾Ｋｏｒｚ微量金属（１００倍ストック）；以下の構成成分（ここで、最終濃度は、ｇ／Ｌで示される）を組み合わせて、フィルター濾過する：
・ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５
・ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １．５
・ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．２２
・Ｈ３ＢＯ３ ０．３
・Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２５
・ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．７
発酵培地；滅菌後構成成分（滅菌ストック濃度）、バイオリアクター中に総容積約１００ｍＬに達するように添加したｍＬでの量：
・グルコース（７００ｇ／Ｌ） １．４
・ＥＤＴＡ（１００×ストック、０．８４ｇ／Ｌ） １．０
・修飾Ｋｏｒｚ微量金属（１００×ストック） １．０
・硫酸アンモニウム第一鉄（４０ｇ／Ｌ） ０．８
・１：５希釈した硫酸マグネシウム七水和物（５００ｇ／Ｌ） １．３
・７０％エタノール／３０％Ｈ２Ｏ中に１０％溶解された滅菌Ａｎｔｉｆｏｒｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、セントルイス） ０．３
・１：１０希釈したカナマイシン（５０ｇ／Ｌ） １．０
・塩化カルシウム（２００ｇ／Ｌ） １．０
増殖フィード；構成成分（滅菌ストック濃度）、１つのバイオリアクター用に調製され得るｍＬでの量：
・グルコース（７００ｇ／Ｌ） ８０
・ＥＤＴＡ（１００×ストック、０．８４ｇ／Ｌ） １．３６
・修飾Ｋｏｒｚ微量金属（１００×ストック） １．４４
・硫酸アンモニウム第一鉄（４０ｇ／Ｌ） １．４０
・硫酸マグネシウム七水和物（５００ｇ／Ｌ） ４．０
・カナマイシン（５０ｇ／Ｌ） ０．０８
・酵母抽出物（２５０ｇ／Ｌ） ２．８
誘導フィード；構成成分（滅菌ストック濃度）、１つのバイオリアクター用に調製され得るｍＬでの量：
・グリセロール（７００ｇ／Ｌ） ８０
・ＥＤＴＡ（１００×ストック、０．８４ｇ／Ｌ） １．３６
・修飾Ｋｏｒｚ微量金属（１００×ストック） １．４４
・硫酸アンモニウム第一鉄（４０ｇ／Ｌ） １．４０
・硫酸マグネシウム七水和物（５００ｇ／Ｌ） ４．０
・カナマイシン（５０ｇ／Ｌ） ０．０８
・アラビノース（５００ｇ／Ｌ） ０．９７
１０×Ｔｒｅｍｅｎｄｏｕｓブロス（「１０×ＴＢ」）：
蒸留Ｈ２Ｏ ９０ｍＬに下記を添加する：ソイトン１２ｇ、酵母抽出物２４ｇ。蒸留Ｈ２Ｏで１００ｍＬに調節する。オートクレーブすることによって滅菌する。室温にまで冷却させる。
発酵手順。
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１３−ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギン／Ｅｒｖ１ｐ）宿主細胞のフィーダー培養液を、一般に実施例１Ｂに記載される方法に従って増殖させたが、但し、ＯＤ６００が約３に達するまで一晩増殖させ、増殖の５．５時間後に最終細胞密度ＯＤ６００ ２．４０に達するように、１％グルコースを有するＬＢ培地へのより大きな２日目の接種材料を用いた。このフィーダー培養液を使用して、バイオリアクターにおいて発酵培地を接種し、４．２ｍＬ分取量を、培地約１００ｍＬに添加して、その結果、初期の光学密度の読取り（ＯＤ６００）は、約０．１である。
増殖段階条件（１時間当たり３．２ｍＬの最大フィード速度を用いた場合の設定増殖速度０．１５／時間に関して、３０．０℃、ＤＯ３０％、ｐＨ７．０、初期フィード速度０．６ｍＬ／時間での７０％グルコースを含有する増殖フィード）下で、細胞を２９時間増殖させた。誘導の開始の直前に、１０×Ｔｒｅｍｅｎｄｏｕｓブロ５ｍＬをバイオリアクターに添加した。誘導を開始させて、発酵条件を、誘導段階条件に設定した：３０．０℃、ＤＯ３０％、ｐＨ７．０、及び１時間当たり誘導フィード係数２．１ｍＬでの７０％グリセロールを含有する誘導フィード。誘導フィードはまた、誘導フィードを作成するように添加した構成成分の総容積から下記の通りに算出される濃度で、誘導物質Ｌ−アラビノースを含有した：
誘導フィードにおける［Ｌ−アラビノース］：（０．９７ｍＬ×５００ｇ／Ｌ）／８９．２５ｍＬ＝５．４ｇ／Ｌ
バイオリアクター中の宿主細胞を、発酵及び誘導中の幾つかの時点で試料採取し、経過発酵時間（ＥＦＴ（時間））及び経過誘導時間（ＥＩＴ（時間））に関して表したこれらの時点での増殖培養液の光学密度を以下に示す。
Figure 2022502039
誘導後の９時間又はそれ以上で、光学密度測定用に採取した２ｍＬ試料中の宿主細胞、及びＰＢＳ緩衝液中に１：２０希釈した宿主細胞１２５マイクロリットルを、４３００ＲＰＭで、４℃にて７分間の遠心分離によって収集し、乾燥凍結ペレットとして、−８０℃で保管した。
Ｃ．ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの可溶化及び特性決定
可溶化可能なＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン複合体中に存在するジスルフィド結合が、正しい残基間で形成されるかどうかを検討するために、可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン複合体を、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって分析した。実施例２Ｂに記載されるように、増殖させ、誘導し、培養液１ｍＬから収集した宿主細胞のペレットを、ＧＬＢ−ＯＧ溶解緩衝液ｐＨ７．４ １５ｍＬ中に再懸濁させて、溶解は、氷上で１５分間進行させた。宿主細胞溶解物を、２０Ｋ×ｇで、４℃にて３０分間遠心分離して、得られたペレットを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素５ｍＬ中に再懸濁させた。
下記手順は、ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの酵素消化及非還元型ジスルフィドマッピングにおいて実施されて、図４に模式的に示される。出発試料は、８Ｍ尿素、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に、濃度０．６３ｍｇ／ｍＬで、可溶化されたＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンを含有した。酵素消化用に試料を調製するために、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ ２５マイクロリットル、脱イオン水１６５マイクロリットル、及びＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン試料６０マイクロリットルを、各試料に関して１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに添加して、０．１５ｍｇ／ｍＬ（及びＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン総計３７．５マイクログラム）のＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン試料の最終濃度を生成し、尿素の濃度を約１．９Ｍに下げた。シーケンシング等級のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、マディソン）を、５０ｍＭ酢酸中に０．１ｍｇ／ｍＬで再構成した。トリプシン１０マイクロロットル容積（又は１マイクログラム）を各試料チューブに添加して、３７℃で４時間、２７５ＲＰＭで振盪しながらインキュベートした。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）グルタミルエンドペプチダーゼ（「Ｇｌｕ−Ｃ」）ＭＳ Ｇｒａｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）を、０．０４ｍｇ／ｍＬで脱イオン水中に再構成させて、Ｇｌｕ−Ｃ ５マイクロリットル（又は０．２マイクログラム）を各試料チューブに添加した。試料を、３７℃で１６時間、２７５ＲＰＭで振盪しながらインキュベートした。１０％酢酸５マイクロリットル容積を各チューブに添加して、プロテアーゼを不活性化した。この時点で、試料を、任意選択で、分析前に−８０℃で凍結させた。試料はまた、任意選択で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は逆相ＬＣによって分析して、消化が行われたことを決定することができる。酵素消化後、試料を１４×ｇで、４℃にて５分間遠心分離して、上清２０マイクロリットルを、下記のＭＳ分析における使用のために適切なオートサンプラーバイアルに移行した。
Ｎａｎｏ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析を、最近較正したＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計及びＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で６０分メソッドを用いて行った。Ａｃｃｌａｉｍ（商標）Ｐｅｐｍａｐ（商標）１００ Ｃ１８ ７５マイクロメートル×２５ｃｍ×２マイクロメートル分析カラムを、Ａｃｃｌａｉｍ（商標）Ｐｅｐｍａｐ（商標）１００ Ｃ１８ １００マイクロメートル×２ｃｍ×５マイクロメートルトラッピングカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とともに使用した。緩衝液Ａは、ＬＣ−ＭＳ等級の水中の０．１％ギ酸からなり、緩衝液Ｂは、ＬＣ−ＭＳ等級のアセトニトリル中の０．１％ギ酸からなった。試料２００ｎｇをトラップ上に注入した。勾配は、下記の通りに実行した：０分〜５分２％緩衝液Ｂ；５分〜５．１分２％〜７．５％緩衝液Ｂ；５．１分〜３５分７．５％〜３０％緩衝液Ｂ；３６分〜４１分３０％〜９８％緩衝液Ｂ、及び４２分〜６０分２％緩衝液Ｂ。試料は、ポジティブイオンモードで、イオン移動管温度２７５℃でＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ（商標）供給源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、２４００Ｖで分析した。ＭＳ１スキャンは、分解１２０ＫでＡＧＣ（自動利得制御）４００，０００及び最大注入時間５０ｍｓで、４００ｍ／ｚ〜１６００ｍ／ｚから獲得された。ターゲットＭＳ／ＭＳを７４２．８３３０ｍ／ｚ（ｚ＝４）で行い、鎖間ジスルフィド１つ及び鎖内ジスルフィド１つを有する下記配列ＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥ（配列番号５８）及びＦＶＮＱＨＬＧＳＨＬＶＥ（配列番号５９）を表した。質量は、計算に関して小数点４桁で算出した（例えば、Ｈ＋＝１．００７３）。ターゲットＭＳ／ＭＳ設定には、３ｍ／ｚ四重極単離、３０％でのＨＣＤ活性化、並びに最大注入時間２５０ｍｓ及びＡＧＣターゲット５０，０００で１００ｍ／ｚ〜２０００ｍ／ｚから分解能１５ＫでのＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計における検出が含まれた。更なるデータ依存又はターゲットＭＳ／ＭＳ事象は、任意選択で、所望の通りに予定することができるか、但し、ＭＳ１サーベイスキャンは、少なくとも２秒ごとに行われる。この液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析の結果を図５に示す。
Ｄ．ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの更なる精製及び溶解度
それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に相当するプロペプチド部分をそれぞれが有し、１つ又は複数の酸切断可能なＤＰ（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）配列がプロペプチドのＣ末端に存在するアルギニンの前に挿入された、更なる変異体ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンを調製した（ＰＮ３．１５、ＰＮ３．１６、及びＰＮ３．１７）。ＰＮ３．１３ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号５５）をコードする発現構築物（配列番号５６）に対して修飾を行って、ＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６２）、ＰＮ３．１６ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６４）、及びＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６６）をコードする発現構築物（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）から終結コドンまで示される、それぞれ、配列番号６３、配列番号６５、及び配列番号６７、＋１８ｂｐの下流ヌクレオチド配列）を産生し、各発現構築物は、実施例２Ａに記載されるように、ｐＳＯＬ発現ベクターにおけるａｒａＢＡＤプロモーターの下流に位置するＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンをコードするポリヌクレオチド、及びｐｒｐＢＣＤＥプロモーターの下流のＥｒｖ１ｐ（配列番号３８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５７）を有した。これらのｐＳＯＬ：ＰＮ３．１５−ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギン／Ｅｒｖ１Ｐ、ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１６−ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギン／Ｅｒｖ１Ｐ、及びｐＳＯＬ：ＰＮ３．１７−ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギン／Ｅｒｖ１Ｐ発現構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＢ０００１細胞に形質転換した。ＰＮ３．１５、ＰＮ３．１６、及びＰＮ３．１７ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンは、本質的に実施例２Ｂに記載されるような発酵によって産生され、宿主細胞の溶解、続く２０Ｋ×ｇで、４℃にて３０分間の遠心分離を行った。ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの可溶化可能な複合体を含む、得られたペレットを、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素中に可溶化させた。
可溶化可能な複合体から調製されたＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６２）の一部を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素及び１０ｍＭイミダゾールで洗浄した５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラム上に負荷して、続いて、１×ＰＢＳ ｐＨ７．５中の５００ｍＭイミダゾール中で溶出させた。ＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンは、Ｎｉ−ＮＴＡカラム精製及び中性ｐＨ７．５での１×ＰＢＳ中の５００ｍＭイミダゾールへの溶出の非変性条件で、安定且つ可溶性であった。Ｎｉ−ＮＴＡカラムからの溶出後、１×ＰＢＳ ｐＨ７．５中の５００ｍＭイミダゾール中のＰＮ３．１５、ＰＮ３．１６、及びＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン試料をそれぞれ、ギ酸を用いてｐＨ６に調節して、精製したＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンを１６Ｋ×ｇで、４℃にて１０分間沈殿させて、ペレットを、ｐＨ２で０．１Ｍ酢酸中に再懸濁して、６５℃で１２時間インキュベートして、ＰＮ３．１５、ＰＮ３．１６、及びＰＮ３．１７プロペプチドそれぞれに存在するＤＰ（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）配列で各プロペプチドを切断した。インキュベーション後、試料を２Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（炭酸水素アンモニウム）で、最終ｐＨ７．０〜８．０に中和した。プロペプチドの切断は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって観察された。
ＰＮ３．１７プロペプチドの切断されたＮ末端部分と、ＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６６）の残部との分離は、Ｃａｐｔｏ Ｓ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）を使用した陽イオン交換クロマトグラフィー（「ＣＥＸ」）によって達成された。ＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンが、ｐＨ２の０．１Ｍ酢酸で処理されて、６０℃で２４時間、２７５ＲＰＭで振盪しながらインキュベートされる切断反応を、１Ｍ塩酸でｐＨ４に調節して、陽イオン交換カラム上に負荷して、続いて、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ６．５中の８Ｍ尿素で平衡化して、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ６．５中の８Ｍ尿素中の０Ｍ〜０．３５Ｍ ＮａＣｌの増加塩濃度で溶出させた。ＣＥＸで精製したグラルギンプロインスリン断片のＬＣ−ＭＳ分析により、断片の質量が、その二重結合が全て無傷であるグラルギンプロインスリンに関して予想される通りであることが確定された。ＣＥＸで精製したグラルギンプロインスリンのトリプシン消化により、ＬＣ−ＭＳ分析によって示されるように、無傷のジスルフィド結合を有する成熟グラルギンインスリン分子が生じた。
酸性条件によってＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６２）の沈殿を更に検討するために、上述するように、可溶化可能な複合体の可溶化及び１×ＰＢＳ ｐＨ７．８中の５００ｍＭイミダゾールによるＮｉ−ＮＴＡカラムからの溶出によって調製されるＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの試料を、１０％ギ酸を使用して、下記ｐＨ値に調節した：ｐＨ７．５、７．２、７．０、６．７、６．５、６．０、５．５、及び５．０。次に、試料を１４Ｋ×ｇで、４℃にて１５分間遠心分離して、上清を除去して、遠心蒸発によって乾燥させた。ペレット及び乾燥させた上清を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素中に再懸濁させ、変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。７．８〜７．２のｐＨ値で、ＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの大部分は、可溶性のままであった。ｐＨ７．０では、上清及びペレットにおいて、ほぼ等量のＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンが観察された。ｐＨが減少するにつれ、ｐＨ５．０でほぼ全てが沈殿するまで、ＰＮ３．１５ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの増加部分が、ペレット中に存在した。タンパク質溶液のｐＨを変化させることによってタンパク質を沈殿させる能力は、例えば、より小さく、より濃縮された容積での、及び／又は種々の緩衝液中でのタンパク質の再懸濁に有用である。溶解度に対するｐＨのこの効果はまた、ＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンに関しても観察され、可溶化可能な複合体を形成する他のポリペプチド遺伝子産物に特徴的である可能性が高いと考えられる。
更なる分析用に精製されたＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン（配列番号６６）を得るために、ＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンは、本質的に実施例２Ｂに記載されるような発酵によって産生され、宿主細胞の溶解、続く２０Ｋ×ｇで、４℃にて３０分間の遠心分離を行った。ペレット化された材料を、回収した宿主細胞重量の湿細胞重量１ｇにつき再懸濁緩衝液１０ｍＬで、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素中に可溶化させ、ボルテックスして、室温で２０分〜３０分間インキュベーションして、続いて、４０００×ｇで、４℃にて５分間、浄化スピンさせた。可溶化されたＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンを、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラムに流した。ＰＢＳ ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素の５倍カラム容積（ＣＶ）を使用して、カラムを平衡化して、試料を負荷して、洗浄１（５ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．５中の８Ｍ尿素及び２０ｍＭイミダゾール）、洗浄２（１．２５ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．５中の２０ｍＭイミダゾール）、溶出（５ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．５中の５００ｍＭイミダゾール）、及びクリーニング（１．２５ＣＶ ０．２Ｎ ＮａＯＨ、６ＣＶ２０％ＥｔＯＨ）。各種緩衝液中のＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの溶解度を検討するために、収集された宿主細胞の湿細胞重量０．５ｇに相当する、Ｎｉ−ＮＴＡで精製したＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの試料を、７Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する５ｍＬのＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）に流した。試料がその中へスピンされる緩衝液は、ＰＢＳ ｐＨ７．５中の５００ｍＭイミダゾール、ＰＢＳ ｐＨ７．５中の２００ｍＭイミダゾール、ＰＢＳ ｐＨ７．５、ＰＢＳ ｐＨ７．５中の５０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１０ｍＭリン酸Ｋ ｐＨ７．５中の２５ｍＭ Ｌ−アルギニンであった。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して、ＰＢＳ ＰＨ７．５中の５００ｍＭイミダゾール中に溶出させた場合のＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン溶液のタンパク質濃度、及び各種緩衝液へのスピン脱塩後のＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン溶液のタンパク質濃度を測定した。出発緩衝液であるＰＢＳ ｐＨ７．５中の５００ｍＭイミダゾールを同じ緩衝液で置き換えた実験におけるＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの収率は、スピン脱塩手順の効率を表し、およそ８０％であった。種々の緩衝液へスピン脱塩によってそれぞれ移行される他の試料の収率は、７７％〜９１％の範囲であり、スピン脱塩手順自体から予想される収率と有意に異ならず、異なる緩衝液に移された場合、沈殿からのＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンの更なる損失が見られないことを示唆した。脱塩されたＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリン試料もまた、還元性条件及び非還元性条件下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され、還元性条件に曝露した場合のＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンバンドの電気泳動移動度のシフトにより、Ｎｉ−ＮＴＡカラムから溶出されて、脱塩された場合のＰＮ３．１７ ＣＰＢｐｒｏ＿グラルギンプロインスリンが、ジスルフィド結合を含有したことが示される。
実施例３
グラルギンプロインスリンの産生における変異体プロペプチド及びＣ−ペプチドの使用
Ａ．グラルギンプロインスリンの調製
配列番号３６又は配列番号３７のいずれかに相当する変異体プロペプチド部分、並びに配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４のうちの１つに相当する変異体Ｃ−ペプチドをそれぞれ有する、更なるグラルギンプロインスリンを調製した（ＰＮ３．６２、ＰＮ３．１１６、ＰＮ３．１６５、ＰＮ３．１７２、及びＰＮ３．１８５）（表４を参照）。
Figure 2022502039
グラルギンプロインスリンポリペプチドそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、ｐＳＯＬ発現ベクター（配列番号４２）におけるａｒａＢＡＤプロモーターの下流に挿入した。これらの発現構築物はそれぞれ、ｐＳＯＬ発現ベクター内のｐｒｐＢＣＤＥプロモーターの下流にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、配列番号４１）に関するコード配列を含有した。
グラルギンプロインスリンポリペプチドをコードする発現ベクターそれぞれを使用して、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＥＢ０００１宿主細胞を形質転換して、下記を形成した。
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．６２プログラルギン／ＰＤＩ）、
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１１６プログラルギン／ＰＤＩ）、
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１６５プログラルギン／ＰＤＩ）、
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１７２プログラルギン／ＰＤＩ）、及び
ＥＢ０００１（ｐＳＯＬ：ＰＮ３．１８５プログラルギン／ＰＤＩ）。
上記宿主細胞の５つのタイプそれぞれを、一般に実施例２Ｂに記載されるように、発酵培養で増殖させて、タンパク質発現に関して誘導させた後、収集した。発酵プロセス中の試料間で変化した２つの要素は、発酵が、ＤＡＳｂｏｘ装置中で実行されたか、又はＮＬＦ装置で実行されたかどうか、及びＫｏｒｚ微量金属の構成成分として、ＭｎＣｌ２が発酵に添加されたか、又は添加されなかったかであった（実施例２Ｂを参照）。これらの要素は、実施例３Ｂに記載されるように、精製及び分析されたグラルギンプロインスリン試料それぞれに関して示されている。
Ｂ．直接的な可溶化によるグラルギンプロインスリンの精製
実施例３Ｃに記載されるように、成熟グラルギンインスリンへのトランスバージョンの目的で、正確に配置されたジスルフィド結合を有する、適正にフォールディングされたグラルギンプロインスリンの非常に精製された試料を調製するために、上記で収集された宿主細胞を、可溶化可能な複合体の形態でグラルギンプロインスリンを収集するために可溶性画分と不溶性画分を分離する初期遠心分離ステップを使用しない溶解後に、直接的な可溶化処理に付した。
精製された収集宿主細胞の試料は、発酵装置、及び発酵中に、ＭｎＣｌ２が添加された（＋）か、又は存在しなかった（−）かどうかに留意して、下記のリストにおいて示されるように言及される。
ＰＮ３．６２Ａ ＤＡＳｂｏｘ ＭｎＣｌ２を添加（＋）
ＰＮ３．６２Ｂ ＮＬＦ ＭｎＣｌ２が非存在（−）
ＰＮ３．６２Ｃ ＮＬＦ ＭｎＣｌ２が非存在（−）
ＰＮ３．１１６ ＤＡＳｂｏｘ ＭｎＣｌ２が非存在（−）
ＰＮ３．１６５Ａ ＤＡＳｂｏｘ ＭｎＣｌ２が非存在（−）
ＰＮ３．１６５Ｂ ＮＬＦ ＭｎＣｌ２を添加（＋）
ＰＮ３．１６５Ｃ ＮＬＦ ＭｎＣｌ２を添加（＋）
ＰＮ３．１７２ ＤＡＳｂｏｘ ＭｎＣｌ２が非存在（−）
ＰＮ３．１８５Ａ ＤＡＳｂｏｘ ＭｎＣｌ２を添加（＋）
ＰＮ３．１８５Ｂ ＮＬＦ ＭｎＣｌ２を添加（＋）
ＰＮ３．１８５Ｃ ＮＬＦ ＭｎＣｌ２を添加（＋）
溶解に関して、「主な試料群」として、ＰＮ３．６２Ａ、ＰＮ３．６２Ｂ、及びＰＮ３．６２Ｃ；ＰＮ３．１１６；ＰＮ３．１６５Ａ；ＰＮ３．１７２；並びにＰＮ３．１８５Ａが挙げられる。主な試料群に関して、収集された宿主細胞を、発酵培養容積に関して１０倍希釈で、７Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中に再懸濁させた。更なる試料（ＰＮ３．１６５Ｂ及びＰＮ３．１６５Ｃ、並びにＰＮ３．１８５Ｂ及び３．１８５Ｃ）を、発酵培養容積に関して２倍希釈で、７Ｍ尿素、２．５ｍＭ Ｌ−Ｃｙｓ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５中に再懸濁させた。試料は全て、８，０００ｐｓｉで総計５回均質化して、細胞を溶解させた。溶解物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８（主な試料群）、又は２．５ｍＬ Ｌ−Ｃｙｓ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５（ＰＮ３．１６５Ｂ及びＰＮ３．１６５Ｃ、並びにＰＮ３．１８５Ｂ及び３．１８５Ｃ）中に３．５倍希釈して、その結果、試料は全て、２Ｍ尿素溶液中に存在していた。ＰＮ３．１６５Ｃ及びＰＮ３．１８５Ｃを除く全ての試料を、１６℃で、１２０ＲＰＭで振盪しながら、４８時間〜７２時間、又はＰＮ３．１６５Ｃ及びＰＮ３．１８５Ｃに関しては２４時間、インキュベートした。
インキュベーション後、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用した精製用に、溶解物試料は全て、３３００×ｇでの遠心分離によって浄化して、可溶性溶解物を、０．４５マイクロリットルのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜に通して濾過して、収集して、最終濃度１０ｍＭのために、イミダゾールを溶解物に添加した。浄化における遠心分離ステップはまた、７０００〜２０，０００×ｇで、３０分〜６０分間実施することができ、可溶性溶解物はまた、グラスファイバー濾過（液体中で０．７マイクロメートル粒子の保持）によって濾過することもできる。ＩＭＡＣ中の非特異的な結合を防止するための浄化された溶解物への添加剤には、１０ｍＭ〜２０ｍＭイミダゾール及び／又は０ｍＭ〜３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれ得る。
ＩＭＡＣカラムを、２倍〜４倍カラム容積（ＣＶ）の７Ｍ尿素、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で平衡化して、続いて、２倍〜４倍のＣＶの０．１Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ１０で洗浄した。１つの試料群（ＰＮ３．６２Ａ及びＰＮ３．６２Ｂ、ＰＮ３．１６５Ａ、ＰＮ３．１７２、並びにＰＮ３．１８５Ａ）に関して、各試料を、Ｎｉセファロース高速流カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）上に負荷した。第２の試料群（ＰＮ３．６２Ｃ、ＰＮ３．１１６、ＰＮ３．１６５Ｂ及びＰＮ３．１６５Ｃ、並びにＰＮ３．１８５Ｂ及びＰＮ３．１８５Ｃ）に関して、各試料を、Ｎｉ ＨｉｓＴｒａｐ高速カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州、ピッツバーグ）上に負荷した。試料は、樹脂１ｍＬ当たり０．５ｍＬ〜１ｍＬの発酵培養容積の等価量で負荷した。試料は全て、２倍〜４倍のＣＶの０．５Ｍイミダゾール、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ１０を使用して溶出させた。カラムを２倍のＣＶの０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて適所でクリーニングされ、７Ｍ尿素、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール、及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で取り除いた。
ＩＭＡＣ後、試料を濃縮及び脱塩した。１つの試料群（ＰＮ３．６２Ａ、ＰＮ３．１６５Ａ、ＰＮ３．１７２、及びＰＮ３．１８５Ａ）に関して、各試料を、３ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心濃縮器（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、セントルイス）を使用して濃縮し、蒸留水を添加して、各試料をその出発容積に戻して、同じ遠心濃縮器を使用して２回〜３回交換した。他の試料群（ＰＮ３．６２Ｂ及びＰＮ３．６２Ｃ、ＰＮ３．１１６、ＰＮ３．１６５Ｂ及びＰＮ３．１６５Ｃ、並びにＰＮ３．１８５Ｂ及び３．１８５Ｃ）に関しては、各試料を、３−ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０タンジェンシャル濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、ドイツ、ゲッティンゲン）でタンジェンシャルフロー濾過及び不連続なダイアフィルトレーションによって濃縮し、フィードリザーバ中の容積は、出発容積の約十分の一に濃縮され、続いて、蒸留水を添加して、各試料をその出発容積に戻して、そのプロセスを２回〜３回繰り返した。
Ｃ．グラルギンプロインスリンの、成熟グラルギンインスリンへのトランスバージョン
様々な形態のグラルギンプロインスリンの、成熟グラルギンインスリン（「Ｂ３２グラルギン」）への、トリプシンを用いた消化によるトランスバージョンに最適な条件を同定するための実験を実施した。処理プロトコールに倣って、結果を、固相抽出質量分析（ＳＰＥ−ＭＳ）によって分析した。
ＳＰＥ−ＭＳパラメーターは下記の通りであった：
Figure 2022502039
ＳＰＥ−ＭＳの結果に従って、最適なＢ３２グラルギンを産生する各グラルギンプロインスリンに関する条件を選択し、相当する試料を、四重極飛行時間型質量分析（ＱＴＯＦ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）によって流した。ＵＳＰグラルギンの真正標準物質を、外部標準曲線に使用して、トランスバージョンを受けた材料のパーセントを定量化した。トランスバージョンのパーセント（トランスバージョン％）は、ＵＳＰグラルギン標準物質に対するＡ２８０ ＬＣ積分により決定される場合のＢ３２グラルギンの濃度を、アミノ酸分析標準物質に対するＡ２８０ ＬＣ積分により決定される場合のグラルギンプロインスリンの出発濃度で除算して、１００％を乗じたものに等しい。同じグラルギン外部標準曲線に対するＡ２１４での、且つ抽出イオンクロマトグラムによる積分は、Ａ２８０での積分と一致した。
ＱＴＯＦ−ＬＣＭＳパラメーターは、下記の通りであり：
Figure 2022502039
下記の勾配表を用いた：
Figure 2022502039
実験１では、各グラルギンプロインスリン試料１．５マイクロリットルを、様々な濃度のＮｉＣｌ２溶液５マイクロリットル、及びトリプシン溶液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ９、１５ｍＭ ＣａＣｌ２中の４．５ｇ／Ｌのトリプシン）５マイクロリットルと混合した。組み合わせた容積を、５００×ｇで１分間スピンさせた後、室温で、１００ＲＰＭで振盪しながら、可変量の時間でインキュベートし、続いて１％ギ酸を有する８Ｍ尿素（ｐＨ３〜３．５）の添加によって、反応を停止させた。
実験２では、様々な濃度のＮｉＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＮａＣｌ、及びＣａＣｌ２を、トリプシン反応混合物に添加し、反応は、様々な量の時間で実行されたが、その他の点では、一般に上述の通りであった。
実験３では、様々な濃度のＮａＣｌ又はＴｒｉｓ緩衝液を、一定量の１．５ｇ／Ｌのトリプシン、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び７マイクロモルのＮｉＣｌ２を有したトリプシン反応混合物に添加し、トリプシン混合物は、反応は、様々な量の時間で実行されたが、その他の点では、一般に実験１に記載される通りであった。
実験４では、１．５ｇ／Ｌのトリプシン、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮｉＣｌ２を含有するトリプシン反応混合物において、様々な濃度のＮａＣｌ及び反応時間を試験した。
実験５では、１．５ｇ／Ｌのトリプシンを含有する２つのトリプシン反応条件を、様々な長さの反応時間で試験した。以下の表に示されるように、条件はそれぞれ、匹敵する最大の結果をもたらした。
実験６では、１．５ｇ／Ｌのトリプシン及び７マイクロモルのＮｉＣｌ２を含有するトリプシン反応混合物において、様々な濃度のＮａＣｌ及びｐＨを、様々な量の時間で試験した。
各実験に関して、試験した目的のグラルギンプロインスリンそれぞれに関する最良の反応条件を、トランスバージョンのパーセントとともに以下に示す。
Figure 2022502039
これらの結果により、高いトランスバージョン頻度が、本明細書中に開示される方法を使用して、本発明の変異体グラルギンプロインスリンポリペプチドに関して得ることができることが実証される。
実施例４
発現産物の溶解度の決定：封入体を検出する方法
本発明の方法を使用して、宿主細胞の細胞質において遺伝子産物を発現する場合、下記の手順を使用して、遺伝子産物が、可溶性形態で細胞において産生される度合いを決定することができる。
最も分かりやすいアプローチは、実施例１でより詳細に記載されるように、リゾチームを用いた酵素的溶解等の、又はマイクロフルイダイザーを用いた細胞破壊による、任意の有効な方法を使用して、細胞を溶解することである。細胞溶解物の試料は、宿主細胞によって産生される可溶性及び不溶性の総遺伝子産物の尺度として保持され得る。続いて、溶解した細胞を、２０，０００×ｇで、室温にて１５分間遠心分離して、不溶性画分をペレットとして分離して除き、可溶性画分（上清）を収集する。細胞溶解物中に存在する総遺伝子産物の量から、上清中で回収された可溶性遺伝子発現の量を減じたものが、ペレット中に存在する不溶性遺伝子産物の総量を表す。本明細書中に記載される可溶化に関する方法を使用して、ペレット中の不溶性画分のどの部分が、可溶化可能であるかを決定することができる。遺伝子産物を検出するのに、好ましくは各画分中の遺伝子産物を特異的且つ定量化可能に検出するのに使用することができる、ＥＬＩＳＡ又はキャピラリー電気泳動ウェスタンブロット等の任意の方法を用いて、可溶性画分及び不溶性画分中に存在する量を比較する。このアプローチの有効性を試験するために、可溶性であり、且つ宿主細胞の細胞質のみに存在すると知られている内因性宿主細胞タンパク質を、可溶性画分及び不溶性画分の両方において検出して、溶解及び分画方法が、不溶性画分中に、検出可能な量の可溶性の細胞質産物を捕捉しているかどうかを決定する。
細胞が封入体を含有するかどうかを直接評価することも可能である。封入体は、溶解した宿主細胞の遠心分離によって収集して、コンゴレッド等の色素で染色して、明視野又は交差偏光顕微鏡法を使用して、中程度（１０倍）の倍率で可視化させることができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ ｃｏｎｔａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００８ Ａｕｇ ５；６（８）：ｅ１９５； ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．００６０１９５）。かかる封入体はまた、再度可溶化させることもでき（Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｐａｎｄａ，「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ２００５ Ａｐｒ；９９（４）：３０３−３１０；Ｒｅｖｉｅｗ）、タンパク質同定の特異的な結合アッセイ又は他の方法を使用して、例えば、それらが特定の遺伝子産物を含むかどうかを決定することができる。封入体は、可溶化によって封入体から回収される遺伝子産物の大部分が、活性ではなく、又は適正にフォールディングされた形態でもなく、活性であり、及び／又は適正にフォールディングされている遺伝子産物の大部分を得るのに、少なくとも１つの更なるリフォールディングステップを要するという点で、本明細書中に記載される可溶化可能な複合体と区別することができる。
実施例５
可溶化可能な遺伝子産物複合体の可溶化に関する更なる方法の決定
本発明の方法によって産生される遺伝子産物複合体の可溶化に使用される緩衝液は、以下に記載されるように、幾つか異なるタイプの構成成分を含み得る。目的の任意の遺伝子産物の可溶化を最適化するために、可溶化緩衝液構成成分の最も有効な組合せを同定するための実験に取りかかることができる。市販の化合物を使用して、緩衝液構成成分のどの組合せが、研究室で容易に調製することができるかどうかを同定するために、初期実験を実施する。試験緩衝液が調製されたら、目的の遺伝子産物複合体を用いた、及び任意選択で、参照可溶化緩衝液中で異なる程度に可溶化可能であることが既知である対照遺伝子産物複合体を用いた可溶化実験で、試験緩衝液を使用することができる。実施例１及び実施例２において記載されるような、遺伝子産物複合体を用いた使用のための可溶化プロトコールの例が、本明細書中に提供されている。
可溶化緩衝液の構成成分：
表５に概要される緩衝液構成成分の下記の説明は、考え得る緩衝液構成成分又はそれらの組合せに対して制限なく、可溶化緩衝液において組合せで使用することができる種々のタイプの構成成分の例を提供すると意図される。例えば、カオトロピック剤として、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、塩酸グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、及び／又は尿素が挙げられる。緩衝液構成成分の各タイプの１つ又は複数の化合物は、可溶化緩衝液の調製において、いずれかの、又は全ての他の構成成分タイプの１つ又は複数の化合物と組み合わせて使用して、遺伝子産物複合体を可溶化する際の有効性に関して検査され得る。表５に示される緩衝液の濃度には、有効性に関して検査され得る濃度の範囲、またその濃度の特定の例が含まれる。
適正にフォールディングされた遺伝子産物のコンホメーションを保持し、適正に形成されたジスルフィド結合を保持し、及び／又はタンパク質活性を保持するような、目的の遺伝子産物の調製では、還元剤は、可溶化緩衝液中に含まれない。しかしながら、キャピラリー電気泳動ウェスタンブロット（実施例６を参照）等の或る特定の分析アッセイは、好ましくは、還元型状態の可溶化された遺伝子産物試料を用いて実施される。かかるアッセイ用に試料を調製する目的で、還元剤（例えば、ＤＴＥ（ジチオエリスリトール）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、及び／又はＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン））は、例えば１０ｍＭの濃度で、又は最大１００ｍＭの濃度で、緩衝液に含まれ得る。
Figure 2022502039
実施例６
キャピラリー電気泳動ウェスタンブロットによる特性決定
以下に記載するように、例として可溶性又は可溶化されたタンパク質遺伝子産物を使用して、製造業者の指示書に従ってＷＥＳシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社、カリフォルニア州、サンノゼ）でのキャピラリー電気泳動ウェスタンブロットによって、遺伝子産物を検出及び定量化することができる。可溶性タンパク質抽出物を、キャピラリーセットに負荷し、タンパク質は、サイズによって電気泳動的に分離される。試料中の目的のタンパク質を、そのタンパク質に特異的な一次抗体で検出し、一次抗体の重及び／又は軽鎖を認識する、ヤギ抗ヒト又は抗マウス二次抗体等のＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートする。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体の存在の検出は、化学発光基質の、キャピラリーへの付加、及び酵素を触媒とする反応中に放出される光の直接的な捕捉によって達成される。分子量の概算は、各実行に関して１２ｋ〜２３０ｋＤａの範囲の６つのビオチン化タンパク質を使用して作成した標準曲線を使用して算出される。蛍光標準物質は、試料ローディング緩衝液中に含まれ、各試料を、分子量標準物質と並べるのに使用される内部標準物質を、各試料に与える。
所与の分子量で存在するタンパク質の量を決定するために、既知の量の目的のタンパク質標準物質調製物を、キャピラリーの幾つかに流して、実験試料に関するのと同じ一次抗体及び二次抗体を使用して検出する。市販のタンパク質標準物質等の、既知の濃度を有する目的のタンパク質に関する標準物質の段階希釈物を、例えば、１０マイクログラム／ｍＬから出発し１．０ナノグラム／ｍＬまで希釈して調製する。およそ５つのＷＥＳシステムキャピラリーを使用して、段階希釈物を流した。実験キャピラリー及び段階希釈物キャピラリーの両方における各タンパク質バンドに関して、タンパク質のバンドの化学発光強度を表すＷＥＳシステムソフトウェアによって、曲線を作成し、各曲線下面積を評価して、これらの面積の標準曲線を、段階希釈物キャピラリーにおけるタンパク質バンドに関してプロットする。実験試料の濃度を決定するために、実験試料の化学発酵強度を表す各曲線下面積を、既知の濃度の試料に関して作成した標準曲線と比較することができる。
実施例７
本発明の可溶化及び精製方法を使用して産生される遺伝子産物の収量及び回収率の決定
下記の方法を使用して、細胞溶解物中に存在する総量と比較した場合に、可溶化及び精製プロセスの種々の段階で回収される遺伝子産物の量を算出することができる。
遺伝子産物の標準試料が必要とされる。これは、既知の濃度を有する遺伝子産物の市販の試料、又は遺伝子産物のアミノ酸分析された（ＡＡＡ）完全精製試料であり得る。
発酵培養液等の宿主細胞培養液由来の細胞溶解物は、既知レベルの希釈で、宿主細胞培養液から調製される。４％〜１２％ゲル等のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製して、遺伝子産物の細胞溶解物及び標準試料の両方の試料の段階希釈物セットを、還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）で染色する。還元性条件の使用は、細胞溶解物中の遺伝子産物の総量を測定するのを可能にするのに必要である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の遺伝子産物バンドのデンシトメトリー測定は、試料それぞれに関して実施され、デンシトメトリーデータに基づく曲線を下記の通りにプロットする。
遺伝子産物の標準試料に関して、ゲル上での各標準試料の遺伝子産物バンドのバンド強度をｙ軸にプロットし、試料容積（マイクロリットルで）をｘ軸にプロットする。試料容積に関して、最低希釈した試料（例えば、６マイクロリットル）中に存在する標準試料溶液の容積をプロットする。各段階希釈した標準試料に関して、その容積を、最低希釈した試料（例えば、６マイクロリットル）中の標準の容積を各希釈計数（例えば、２）で除算したものとしてプロットする。これらの値に関して、試料容積（マイクロリットルで）は、６、３、１．５、０．７５等である。ベストフィット線形標準曲線は、プロットしたデータに基づいて作成され、これは、式ｙ＝ｍ（標準）ｘ＋ｋ（式中、ｍは、標準曲線の傾きであり、ｋは、ｙ切片である）で表すことができる。
細胞溶解物中に存在する遺伝子産物の収量（又は力価、ｇ／Ｌで）を決定するために、上述の標準試料に関するのと同じ様式で、各細胞溶解物試料に関する遺伝子産物バンドのバンド強度を、ｘ軸上の試料容積に対してｙ軸にプロットする。細胞溶解物試料に関するベストフィット線形曲線もまた、ｙ＝ｍ（実験）ｘ＋ｋの形式で作成される。細胞溶解物中の遺伝子産物の収量を算出するために、細胞溶解物試料に関する傾きを、標準試料に関する傾きで除算した後、標準試料溶液の濃度を乗じて、また細胞溶解物試料が宿主細胞培養液に対して希釈された度合い（例えば、１００倍希釈に関しては１００）を乗じる。
この方法の使用を説明するために、下記実施例は、発酵プロセスからのＰＮ３．１７２プログラルギンの総遺伝子産物収量の決定である。ＰＮ３．１７２の非常に精製され、アミノ酸分析された（ＡＡＡ）標準試料が精製され、それは、０．２６６マイクログラム／マイクロリットルの濃度を有し、これは、０．２６６ｇ／Ｌに等しい。ＰＮ３．１７２プログラルギンポリペプチドを、一般に上記実施例２Ｂ及び実施例３Ａに記載される方法に従って、宿主細胞発酵培養液において発現させて、溶解させた。分析された細胞溶解物は、宿主細胞発酵培養液に対して８０倍に希釈され、したがって、希釈因子は、８０である。ＡＡＡ ＰＮ３．１７２標準及びＰＮ３．１７２細胞溶解物両方の試料は、容積６．０、４．８、３．８、３．１、及び２．５マイクロリットルを有する、１．２５倍で段階希釈した試料セットとして調製され、これらの試料を、還元性条件下で４％〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）で染色した。バンドデンシトメトリーを、ＡＡＡ ＰＮ３．１７２標準及びＰＮ３．１７２細胞溶解物試料それぞれに関して実施し、ベストフィット線形曲線をプロットした。ＡＡＡ ＰＮ３．１７２標準に関しては、曲線は、ｙ＝９３，８９９ｘ−１２９，９１７であり、傾き又はｍ（標準）は、９３，８９９に等しかった。ＰＮ３．１７２細胞溶解物に関しては、曲線は、ｙ＝７２，６１４ｘ−２２８，７６３であり、傾き又はｍ（実験）は、７２，６１４に等しかった。細胞溶解物におけるＰＮ３．１７２の収量の計算は：
（ｍ（実験）／ｍ（標準））×希釈因子×標準の濃度＝（７２，６１４／９３，８９９）×８０×０．２６６ｇ／Ｌ＝１６．５ｇ／Ｌ。更なる実験では、細胞溶解物におけるプロインスリン遺伝子産物の収量は、５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌの範囲であった。
宿主細胞増殖培養液の光学密度（例えば、ＯＤ６００）が、溶解時に測定される場合、上記で算出されるようなｇ／Ｌでの収量を、光学密度で除算することによって、ｇ／Ｌ／ＯＤとして遺伝子産物の収量を算出することも可能である。
収量を算出するこの方法はまた、可溶化及び精製プロセスにおける後期ステップでも使用することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、標準試料を、また本明細書中に記載される方法の１つによって可溶化された実験試料を流し、実験試料の可溶化後の収量を決定することができる。また、この収量算出方法を使用して、Ｎｉ−ＩＭＡＣ精製等のカラムクロマトグラフィーによる精製後に、好ましくは標準試料ピーク及び実験試料ピークのＲＰ−ＵＰＬＣ分析を使用して、遺伝子産物の収量を決定することができる。ＲＰ−ＵＰＬＣ分析を使用する場合、所望の遺伝子産物に関する予想保持時間（秒）でのクロマトグラムピーク（複数可）下の算出面積は、上述の収量算出方法におけるバンド密度とほぼ同じように使用される。標準試料の段階希釈物を作製して、既知の遺伝子産物の量の試料を、１度に１つずつクロマトグラフィーカラムに流して、遺伝子産物ピーク下面積を算出して、標準曲線プロットする。実験試料に関して、ＲＰ−ＵＰＬＣに通した任意の単回の実行からの予想保持時間（秒）でのクロマトグラムピーク（複数可）下の算出面積を、標準試料の段階希釈物から算出される標準曲線と比較して、実験試料中の遺伝子産物の量を得ることができる。
連続的なプロセスステップ間で回収される遺伝子産物のパーセントは、後期ステップでの収量を、初期のプロセスステップでの収量で除算することと、１００％を乗じることとによって決定することができる。精製プロセスは、ＰＮ３．１７２プログラルギンに対して実施され、ここで、細胞溶解段階での収量は、上記方法を使用して決定され、ＰＮ３．１７２プログラルギンは、可溶化可能な複合体を遠心分離して、ペレットを形成することと、続いてＰＮ３．１７２プログラルギンを、ペレットから可溶化させること（実施例１及び実施例２に見られるような）とによって、或いは直接的な可溶化方法（実施例３に見られるような）によって可溶化された。可溶性ＰＮ３．１７２プログラルギンの収量は、上記方法を使用して決定され、可溶性ＰＮ３．１７２プログラルギンの回収パーセントは、各可溶化方法に関して算出された。実施例１及び実施例２の「ペレット化及び可溶化」方法は、回収率８４．７％でＰＮ３．１７２プログラルギンをもたらし、回収された材料は、ＢＥＨ ３００Ａ １．７μｍの２．１×１５０ｍｍＣ４タンパク質カラム（製品番号１８６００６５４９、Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ州、ミルフォード）を使用して、ＲＰ−ＵＰＬＣ分析によって決定された場合、７５．３％純粋なＰＮ３．１７２プログラルギンタンパク質であった。実施例３の「直接的な可溶化」方法は、匹敵する回収率８１．４％で、ＰＮ３．１７２プログラルギンを生じたが、回収された材料は、ＲＰ−ＵＰＬＣ分析によって決定された場合、３０．４％純粋なＰＮ３．１７２プログラルギンタンパク質であった。Ｎｉ−ＩＭＡＣカラム及び緩衝液交換ステップを使用した、各可溶化方法によって調製されるＰＮ３．１７２プログラルギンの続く精製は、純度９８．２％で、「ペレット化及び可溶化」ＰＮ３．１７２プログラルギンに関して、総回収率７０．８％を、また純度９４．７％で、「直接的な可溶化」ＰＮ３．１７２プログラルギンに関して、総回収率７１．０％をもたらした。この実験により、実施例１及び実施例２の「ペレット化及び可溶化」方法が、実施例３の直接的な可溶化方法と同程度に多い遺伝子産物を回収し、続くクロマトグラフィーステップの前及び後の両方で、より高い純度の材料を生じることが実証された。
実施例８
発現産物中に存在するジスルフィド結合の特性決定
タンパク質発現産物中のジスルフィド結合の数及び位置は、非還元性条件下で、トリプシン等のプロテアーゼによるタンパク質の消化と、得られたペプチド断片を、一連の電子移動解離（ＥＴＤ）及び衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳステップ（ＭＳ２、ＭＳ３）を組み合わせる質量分析（ＭＳ）に付すこととによって決定することができる（Ｎｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−５ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２ Ｊａｎ ６；２８７（２）：１５１０−１５１９；Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｎｏｖ ２２）。
発現されたタンパク質の消化。ジスルフィド結合の転位を防ぐために、任意の遊離システイン残基をまず、アルキル化でブロックする：発現されたタンパク質を、遮光下で、アルキル化剤ヨードアセトアミド（５ｍＭ）とともに、振盪しながら、２０℃にて３０分間、４Ｍ尿素を有する緩衝液中でインキュベートする。或いは、また好ましくは、ＮＥＭをアルキル化剤として使用し、トリプシンのタンパク質分解を、還元／アルキル化と組み合わせて、変性条件（６Ｍ ＧｕａＨＣｌ）下で行う。アルキル化後、発現されたタンパク質を、ｐｒｅｃａｓｔゲルを使用して非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離する。或いは、発現されたタンパク質を、電気泳動後に、ヨードアセトアミド又はＮＥＭとともに、又は対照としてそれを伴わずに、ゲルにおいてインキュベートする。タンパク質バンドを染色して、二重脱イオン水で脱染して、切り取って、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル５００マイクロリットル中で二度、振盪しながら、２０℃で３０分間インキュベートする。タンパク質試料を、２分間１００％アセトニトリル中で脱水して、真空遠心分離によって乾燥させて、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム及び５ｍＭ塩化カルシウムを含有する緩衝液中で、１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン又はキモトリプシンを用いて、氷上で１５分間再水和する。過剰な緩衝液を除去して、酵素を有さない同じ緩衝液５０マイクロリットルと取り換えて、続いて、それぞれ、トリプシン及びキモトリプシンに関して、３７℃又は２０℃で１６時間、振盪しながらインキュベートする。消化は、８８％ギ酸３マイクロリットルの添加によって停止させて、短くボルテックスした後、上清を除去して、分析するまで−２０℃で保管する。トリプシン分解（ｔｒｙｐｓｉｎｏｌｙｓｉｓ）が不十分な配列カバレッジ（７５％未満）を提供する場合に、代替的なタンパク質断片化方法（ＬｙｓＣ、Ｇｌｕ−Ｃ、又はＣＮＢｒ）が使用される。酸性条件下でＮＥＭの存在下で還元剤ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を使用することにより、部分的に無傷のジスルフィド結合を有する断片を入手する機会が提供される。ジスルフィドが無傷の消化マップは、還元型（ＤＴＴ又はＴＣＥＰ）消化マップと比較される。
質量分析によるジスルフィド結合の局在性。ペプチドを、０．１％ギ酸を含有する移動相にて、２０マイクロリットル／分で、１ｍｍ×８ｍｍのトラップカラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社、カリフォルニア州、オーバーン）に注入する。続いて、トラップカートリッジを、５ｍｍのＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８固定相を含有する、０．５ｍｍ×２５０ｍｍカラムに沿って配置し（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州、サンタクララ）、１１００シリーズのキャピラリーＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、１０マイクロリットル／分で９０分にわたる２％〜３０％アセトニトリル勾配により、ペプチドを分離し、或いは、ＵＰＬＣに適したＣ１８カラムを使用する。ＥＴＤソースによりＬＴＱ Ｖｅｌｏｓリニアイオントラップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州、ウォルサム）を使用して、ペプチドを分析する。Ｃａｐｔｉｖｅ Ｓｐｒａｙソース（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社）、又は好ましくは、３．０ｋＶのコーティングされていない引き抜き溶融石英エミッタ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社、マサチューセッツ州、ウォーバーン）を使用して、エレクトロスプレーイオン化を実施する。或いは、中程度のサイズのタンパク質分解断片の分析を、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ（７ Ｔｅｓｌａ）機器、又はＳｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓｉ四重極進行波イオン移動度飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析計（ＷＡＴＥＲＳ社、マサチューセッツ州、ミルフォード）を使用して実施する。好ましくは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、ペプチドを分析する。ジスルフィド結合されたペプチドは、２つのＮ末端及びカルボキシ末端にある２つの塩基性残基（アルギニン又はリジン）の存在に起因して、トリプシン処理後に＋４又はそれよりも多い電荷状態を有する。これらのジスルフィド結合されたペプチドを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）機器によって優先的に単離し、その結果、ジスルフィド結合は、ＥＴＤ断片化を使用して破壊され得る。サーベイＭＳスキャン後に、サーベイスキャンにおいて最も強いイオンに対して、ＣＩＤ及びＥＴＤ ＭＳ２スキャンからなる７つのデータ依存性スキャンを行い、続いて、ＥＴＤ ＭＳ２スキャンにおいて１番目から５番目に強いイオンに対して、５つのＭＳ３ ＣＩＤスキャンを行う。ＣＩＤスキャンは、正規化された衝突エネルギー３５を使用し、ＥＴＤスキャンは、追加の活性化を有効にして、１００ｍｓの活性化時間を使用する。ＭＳ２ ＣＩＤ及びＥＴＤスキャンを開始するための最小シグナルは、１０，０００であり、ＭＳ３ ＣＩＤスキャンの開始のための最小シグナルは、１０００であり、ＭＳ２及びＭＳ３スキャン全てに関する単離幅は、３．０ｍ／ｚである。ソフトウェアの動的排除（ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）機能は、繰り返し回数１、排除リストサイズ１００、及びエクスクルージョン持続期間３０秒で有効化する。ＥＴＤ ＭＳ２スキャンの収集のための標的特異的架橋種に対する包含リストを使用する。ＭＳ２及びＭＳ３スキャンに関する分離データファイルは、ＺＳＡ電荷状態分析を使用してＢｉｏｗｏｒｋｓ ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって作成される。ＭＳ２及びＭＳ３のスキャンの、ペプチド配列に対するマッチングは、Ｓｅｑｕｅｓｔ（Ｖ２７，Ｒｅｖ １２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって実施される。分析は、酵素特異性、２．５の親イオン質量許容差、１．０の断片質量許容差、及び酸化されたメチオニン残基についての＋１６の変動質量なしで実施される。続いて、結果を、最小のペプチド及びタンパク質の蓋然性９５％及び９９％を使用するプログラムＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｖ３＿００＿０８、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、オレゴン州、ポートランド）を使用して分析する。データ解釈用ソフトウェアツールは、Ｄｉｓｕｌｆｉｎａｔｏｒノード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を伴うＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）２．０も含む。ＭＳ３結果からのペプチドをスキャン数によってソートし、ペプチドを含有するシステインを、ＥＴＤ ＭＳ２スキャンにおいて観察される５つの最も強いイオンから産生されるＭＳ３スキャンの群から同定する。ジスルフィド結合種に関与するシステインペプチドの同一性を、サーベイスキャン及びＥＴＤ ＭＳ２スキャンで観察される親イオン質量を手動で検査することによって更に確認する。
実施例９
細菌細胞ペリプラズムからの、スフェロプラストからの、及び細胞全体からの、発現産物の可溶化及び精製
本発明の可溶化及び精製方法は、細胞質又はペリプラズム等の、細胞の異なるコンパートメントに蓄積する遺伝子産物の産生において使用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ又はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）等の宿主細胞は、外側の細胞膜又は細胞壁を有し、外側の膜又は壁が除去される場合にスフェロプラストを形成し得る。かかる宿主において作製される発現されたタンパク質は、下記方法を使用して、具体的には、ペリプラズムから、又はスフェロプラストから、又は細胞全体から精製され得る（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，「Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｒａｐｉｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｗＰｅｒｉＰｒｅｐｓ（商標）Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ Ｋｉｔ」，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒｕｍ １９９８ ５（１）：５；ｅｐｉｂｉｏ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／ｄｅｆａｕｌｔ−ｓｏｕｒｃｅ／ｆｏｒｕｍ−ａｒｃｈｉｖｅ／ｆｏｒｕｍ−０５−１−−−ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ−ｒａｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ−ｏｆ−ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ−ａｎｄ−ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｍｉｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒａｃｔｉｏｎｓ−ｕｓｉｎｇ−ｔｈｅ−ｎｅｗ−ｐｅｒｉｐｒｅｐｓ−ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ−ｋｉｔ．ｐｄｆで入手可能）。この方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他のグラム陰性菌に関して設計されるが、一般的なアプローチは、Ｓ．セレビシエ等の他の宿主細胞に関して変更することができる。
１．細菌宿主細胞培養液は、固定相におけるより古い細胞培養液が、通常リゾチーム処理に幾らかの耐性を示すため、後期の対数期までしか増殖させない。組換えタンパク質の発現が過剰である場合、細胞が早期に溶解することがあり、したがって、細胞培養液は、過剰なタンパク質合成を誘導し得る富栄養培地又はより高い増殖温度では増殖されない。続いて、タンパク質発現は誘導され、細胞は、対数期又は早期の固定期に存在すべきである。
２．細胞培養液を、最低１，０００×ｇで、室温にて１０分間、遠心分離によってペレット化する。注記：細胞は、新鮮でなければならず、凍結してはならない。このプロトコールに必要とされる試薬の量を計算するために、細胞ペレットの湿重量を決定する。
３．細胞を、細胞１グラムにつき最低２ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０％スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び３０Ｕ／マイクロリットルのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）中で、細胞懸濁液が均質になるまでボルテックスミキシング又はピペッティングして、完全に再懸濁させる。注記：過剰な撹拌は、スフェロプラストの早期の溶解を引き起こす場合があり、細胞質タンパク質によりペリプラズム画分の汚染をもたらす。
４．室温で５分間インキュベートする。Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ Ｌｙｓｏｚｙｍｅを、室温で最適に活性化する。より低温（０℃〜４℃）での溶解には、更なるインキュベーション時間が必要とされ、かかる温度では、インキュベーション時間は、２倍〜４倍に延びる。
５．元の細胞のペレット重量１グラムにつき３ｍｌの精製水を、４℃で添加し（ステップ２）、倒置により混合する。
６．氷上で、１０分間インキュベートする。
７．溶解された細胞を、最低４，０００×ｇで、室温にて１５分間、遠心分離によってペレット化する。
８．ペリプラズム画分を含有する上清を、きれいな試験管に移す。
９．混入している核酸を分解するために、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅを、任意選択で、ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに添加する。ヌクレアーゼを含めると、概して、タンパク質の収量及び溶解物の取り扱いの容易性が改善されるが、ヌクレアーゼの添加は、場合によっては望ましくなく、例えば、残留するヌクレアーゼ活性又はマグネシウム補因子に対する一過性の曝露が、続くアッセイ又は精製されたタンパク質の使用を妨害する場合には、ヌクレアーゼの使用を避けるべきである。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅを不活化するための溶解物へのＥＤＴＡの添加は、同様に、続くアッセイ又は精製されたタンパク質の使用を妨害し得る。ヌクレアーゼが添加されるべきである場合、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ２マイクロリットル及び１．０Ｍ ＭｇＣｌ２ １０マイクロリットルを、ステップ１０で必要とされるＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ １ミリリットル当たり最大１ｍｌまで、ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１％デオキシコール酸塩）で希釈する。
１０．ペレットを、元の細胞ペレット重量１グラムにつき５ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。
１１．ペレットを、室温で１０分間インキュベートする（含まれる場合には、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性により、粘度の著しい減少が引き起こされ、細胞懸濁液が水の稠度になるまで、インキュベーションを継続する）。
１２．細胞片を、最低４，０００×ｇで、４℃にて１５分間、遠心分離によってペレット化する。
１３．スフェロプラスト画分を含む上清を、きれいな試験管に移す。
１４．ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼを、ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに添加した場合、結果として得られるスフェロプラスト画分１ミリリットル当たり２０マイクロリットルの５００ｍＭ ＥＤＴＡを添加して、マグネシウムをキレート化する（溶解物中のＥＤＴＡの最終濃度は、１０ｍＭである）。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅによる核酸の加水分解後、溶解物は、相当量のモノ又はオリゴヌクレオチドを含有し得る。これらの分解産物の存在は、溶解物の更なるプロセシングに影響を及ぼし得る：例えば、ヌクレオチドは、樹脂と相互作用することによって、陰イオン交換樹脂の結合能力を減少させ得る。
上記のプロトコールは、下記変更を伴って、総細胞タンパク質を調製するのに使用することができる。ステップ２でペレット化した細胞は、新鮮であってもよく、又は凍結させてもよく、ステップ４では、細胞を１５分間インキュベートし、ステップ５〜８を省略し、ステップ１０では、元の細胞ペレット重量１グラムにつき３ｍｌのＰｅｒｉＰｒｅｐｓ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加する。
ペリプラズム、又はスフェロプラスト、又は細胞全体のタンパク質試料の調製後、試料を、多数のタンパク質特性決定及び／又は定量化方法のいずれかによって分析し得る。一例では、ペリプラズム及びスフェロプラストタンパク質の首尾よい分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペリプラズム画分及びスフェロプラスト画分の両方のアリコートを分析することによって確認される（各画分２マイクロリットルは、概して、クーマシーブリリアントブルーで染色することによる可視化に十分である）。所与の画分における特有のタンパク質の存在又は特定のタンパク質の濃縮は、首尾よい分画を示す。例えば、宿主細胞が、アンピシリン耐性マーカーを有する高コピー数のプラスミドを含有する場合には、主にペリプラズム画分におけるβ−ラクタマーゼ（３１．５ｋＤａ）の存在が、首尾よい分画を示す。ペリプラズム腔で見られる他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質として、アルカリホスファターゼ（５０ｋＤａ）及び伸長因子Ｔｕ（４３ｋＤａ）が挙げられる。所与の画分で見られるタンパク質の量は、多数の方法のいずれか（例えば、数ある方法の中でもとりわけ、染色若しくは標識されたタンパク質バンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びデンシトメトリー分析、放射標識されたタンパク質のシンチレーション測定、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はシンチレーション近接アッセイ）を使用して定量化することができる。スフェロプラスト画分と比較した場合に、ペリプラズム画分で見られるタンパク質の量を比較することで、タンパク質が細胞質からペリプラズム内に排出された程度が示される。
実施例１０
誘導物質濃度を変化させることによる発現の滴定
本発明の発現系を使用して遺伝子産物の産生を最適化するために、誘導物質の濃度を独立して調節又は滴定することが可能である。誘導性プロモーター（Ｌ−アラビノース誘導性、プロピオネート誘導性、Ｌ−ラムノース誘導性、又はＤ−キシロース誘導性プロモーター等）を含む発現構築物を含有する宿主細胞を、適切な抗生物質を含有するＭ９最小培地で、少容積滴定に所望の密度（例えば、ＯＤ６００およそ０．５）にまで増殖させた後、細胞を、グリセロール等の炭素源なしで、適切な抗生物質、及び様々な濃度の各誘導物質を用いて、任意選択で調製した小容積のＭ９最小培地にアリコートする。小容積滴定を、２００ｍｌ〜５００ｍｌの振盪フラスコ中で実施することができる。発現を誘導するのに必要なＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、又はＤ−キシロースの濃度は、典型的には、細胞のＯＤ単位当たり、０．０２％未満である（多くの場合、０．０２％を大きく下回る）。滴定実験では、Ｌ−アラビノースの試験濃度は、全て細胞のＯＤ単位当たり、２％〜１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、０．００１％、０．０００５％、０．０００２％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００２％、０．００００１％、０．０００００５％、０．０００００２％、０．０００００１％、０．００００００５％、０．００００００２％、０．００００００１％、０．０００００００５％、０．０００００００２％、及び０．０００００００１％の範囲であり得る。６６．６１マイクロモルのＬ−アラビノースの濃度は、０．００１％のＬ−アラビノースに相当する。Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、又はＤ−キシロースに関する代替的な滴定実験は、モル濃度に関して表される、下記濃度を試験することである：全て細胞のＯＤ単位当たり、２５０ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５００マイクロモル、２５０マイクロモル、１００マイクロモル、７５マイクロモル、５０マイクロモル、２５マイクロモル、１０マイクロモル、５．０マイクロモル、２．５マイクロモル、１．０マイクロモル、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５．０ｎＭ、２．５ｎＭ、１．０ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭ、５．０ｐＭ、２．５ｐＭ、及び１．０ｐＭ。プロピオネートに関しては、試験されるべき濃度は、全て細胞のＯＤ単位当たり、１Ｍ〜７５０ｍＭ、５００ｍＭ、２５０ｍＭ、１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、７５０マイクロモル、５００マイクロモル、２５０マイクロモル、１００マイクロモル、５０マイクロモル、２５マイクロモル、１０マイクロモル、５．０マイクロモル、２．５マイクロモル、１．０マイクロモル、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５．０ｎＭ、２．５ｎＭ、及び１．０ｎＭの範囲であり得る。
試験されるＬ−アラビノース（又はＬ−ラムノース又はＤ−キシロース）の各濃度「ｘ」について、濃度「ｘ」の第１の誘導物質を含有するチューブそれぞれに添加される、プロピオネート等の異なる誘導物質の濃度は、一連の試料それぞれで変化される。或いは、滴定実験は、誘導物質濃度の「標準的」組合せで開始することができ、これは、誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子機能の低減されたレベルを有する宿主細胞に関しては、細胞のＯＤ単位当たり、０．００１５％（１００マイクロモル）のＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、若しくはＤ−キシロースのうちのいずれか、及び／又は細胞のＯＤ単位当たり、１００マイクロモルのプロピオネートである。誘導物質を代謝するタンパク質が機能性である宿主細胞に関しては、誘導物質濃度の「標準的」組合せは、細胞のＯＤ単位当たり、０．００３３％（２２０マイクロモル）のＬ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、若しくはＤ−キシロースのいずれか、及び／又は細胞のＯＤ単位当たり、８３ｍＭのプロピオネートである。「標準的」組合せの濃度とは異なる誘導物質濃度の更なる組合せを試験し、一連の滴定実験において、初期の実験からの結果を使用して、後期の実験で使用される誘導物質濃度を「微調整する」ことができる。類似の滴定実験は、Ｌ−アラビノース、プロピオネート、Ｌ−ラムノース、及びＤ−キシロースを含むがこれらに限定されない、本発明の発現系において使用される誘導物質の任意の組合せで実施することができる。誘導物質の存在下で、６時間増殖させた後、細胞をペレット化し、所望の産物を細胞から抽出し、細胞の質量値当たりの産物の収量は、ＥＬＩＳＡ等の定量的免疫学的アッセイによって、又は産物の精製及び２８０ｎｍでのＵＶ吸光度による定量化によって決定される。
また、ハイスループットアッセイを使用して、誘導物質濃度を滴定することも可能であり、ここで、発現されるべきタンパク質は、ｍＫａｔｅ２赤色蛍光タンパク質（Ｅｖｒｏｇｅｎ社、ロシア、モスクワ）又はオワンクラゲ及びバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来の増強緑色蛍光タンパク質によって提供されるもの等の、蛍光タンパク質部分を含むように操作される。ハイスループット滴定実験における異なる濃度の誘導物質によって産生される遺伝子産物の量及び活性を決定するための別のアプローチは、表面プラズモン共鳴を検出するセンサー又はバイオレイヤー干渉法を用いるセンサー（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ）（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫシステム、ｆｏｒｔｅＢＩＯ社、カリフォルニア州、メンローパークから）等の、生体分子の結合相互作用を測定することが可能なセンサーを用いることである。発現される遺伝子産物に十分な特異性で結合する抗体が利用可能である場合、遺伝子産物は、実施例６に記載されるようなＷＥＳ系で実行されるもの等の、キャピラリー電気泳動ウェスタンブロットを使用して、検出及び定量化することができる。
実施例１１
ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列類似性の決定
ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列同一性のパーセントは、整列させた配列両方において同一である、整列させたシンボル、即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸の数を、ギャップを含む、２つの配列のアラインメントにおけるシンボルの総数で除算したものとして定義される。２つの配列間の類似性の度合い（同一性パーセント）は、ウェブサイトのｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを通じて利用可能である、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバル配列アライメントツールにおいて国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によって実行されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメント方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）を使用して、配列を整列させることによって決定され得る。一実施形態では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアライメントパラメーターをデフォルト値に設定する（それぞれ、マッチ／ミスマッチスコア２及び−３、並びにそれぞれ、Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎに関するギャップコスト５及び２）。例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ ウェブサイトに記載されるデフォルトパラメーター設定を使用して、ＮＣＢＩによって実行されるような、ベーシックローカルアライメントサーチツール又はＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３−４１０）等の、配列比較の当業者によって使用される他のプログラムを使用して、配列を整列させてもよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、下記の通りに使用され得る２つを含む、多重の任意選択のパラメーターを有する：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント又は好ましくは利用されないか、若しくは「オフ」に設定される短周期性の内部反復からなるセグメントをマスクするためのフィルターを含めること、及び（Ｂ）「Ｅｘｐｅｃｔ」又はＥスコアと呼ばれる、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値（単に偶然に見出されるマッチの期待される蓋然性；マッチに帰される統計学的有意性がこのＥスコア閾値よりも大きい場合、マッチは報告されないことになる）。この「Ｅｘｐｅｃｔ」又はＥスコア値が、デフォルト値（１０）から調節される場合、好ましい閾値は、０．５であるか、又は０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、及び０．０００００１の順で優先性が増加する。
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術における多くの従来技法が、任意選択で使用される。かかる従来技法は、ベクター、宿主細胞、及び組換え方法に関する。これらの技法は、周知であり、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００６年を通して追補）で説明されている。例えば、細胞単離及び培養に関する、並びに続く核酸又はタンパク質単離にする、他の有用な参照文献として、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及び本書で引用されている参照文献；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｅｄｓ．）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；並びにＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（Ｅｄｓ．）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。核酸を作製する方法（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅、細胞からの精製、又は化学合成による）、核酸を操作する方法（例えば、部位特異的突然変異誘発、制限酵素消化、ライゲーション等による）、並びに核酸を操作及び作製する際に有用な種々のベクター、細胞株等が、上記参照文献に記載されている。更に、本質的に任意のポリヌクレオチド（標識又はビオチン化されたポリヌクレオチドを含む）は、様々な市販ソースのいずれかから、特別注文又は標準注文することができる。
本発明は、本発明の実施に関して或る特定の様式を含むことが見出されるか、又は提唱される特定の実施形態の見地から記載されている。本開示を鑑みて、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、多数の修正及び変更が、例証される特定の実施形態において成され得ることは、当業者に理解されよう。
特許公報を含む、引用した参照文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。公開されている遺伝子位置又は他の記述によって言及される、ヌクレオチド及び他の遺伝子配列もまた、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
配列表において提示される配列
Figure 2022502039
Figure 2022502039
Figure 2022502039
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Claims (29)

  1. １つ又は複数の遺伝子産物を産生する方法であって、
    宿主細胞において発現された少なくとも１つの遺伝子産物を含む第１の溶液を提供するステップであって、前記第１の溶液における少なくとも１つの前記遺伝子産物の少なくとも幾つかを、７０００×ｇで遠心分離によって沈降させて、可溶化可能なペレットを形成することができる、ステップと、
    少なくとも１つの前記遺伝子産物の少なくとも幾つかを、可溶化溶液中に配置するステップと、
    少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、前記可溶化溶液から回収するステップであって、前記可溶化溶液から回収された前記少なくとも１つの遺伝子産物の量が、前記第１の溶液中に存在する前記少なくとも１つの遺伝子産物の総量の少なくとも５０％である、ステップと
    を含み、前記少なくとも１つの遺伝子産物が、還元剤と接触されない、上記方法。
  2. 前記第１の溶液を、遠心分離に付すステップであって、前記第１の溶液が、可溶性画分及びペレットに分離される、ステップと、
    前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、前記ペレットから回収するステップであって、前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかが、前記可溶化溶液に配置される、ステップ
    を更に含む、請求項２に記載の方法。
  3. １つ又は複数の遺伝子産物を産生する方法であって、
    宿主細胞において発現された少なくとも１つの遺伝子産物を含む第１の溶液を提供するステップと、
    前記第１の溶液を、遠心分離に付すステップであって、前記第１の溶液が、可溶性画分及びペレットに分離される、ステップと、
    前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、前記ペレットから回収するステップと、
    前記ペレットから回収された前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、可溶化溶液中に配置するステップと、
    前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかを、前記可溶化溶液から回収するステップであって、前記可溶化溶液から回収された前記少なくとも１つの遺伝子産物の量が、前記第１の溶液中に存在する前記少なくとも１つの遺伝子産物の総量の少なくとも５０％である、ステップと
    を含み、前記少なくとも１つの遺伝子産物が、還元剤と接触されない、上記方法。
  4. 前記少なくとも１つの遺伝子産物が、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成するポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つの遺伝子産物が、シグナルペプチドを欠如しているポリペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの前記遺伝子産物が、（ａ）レプチン、メトレレプチン、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、インスリンの成熟鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び（ｂ）（ａ）のポリペプチドのいずれかの断片からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 第１の溶液が、前記宿主細胞の溶解物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記宿主細胞の溶解物が、宿主細胞をリゾチームと接触させることによって産生された、請求項７に記載の方法。
  9. 前記宿主細胞の溶解物が、機械的溶解によって産生された、請求項７に記載の方法。
  10. 宿主細胞が、原核細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記宿主細胞が、より酸化している細胞質を有するように修飾されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記宿主細胞に対する修飾が、ｔｒｘＢ、ｇｏｒ、ｇｓｈＡ、及びｇｓｈＢからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の欠損をもたらす、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記宿主細胞が、ａｈｐＣ遺伝子において突然変異を更に含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 宿主細胞が、１つ又は複数の発現構築物を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 少なくとも１つの前記発現構築物が、少なくとも１つの誘導性プロモーターを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記宿主細胞が、前記少なくとも１つの誘導性プロモーターの少なくとも１つの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の遺伝子機能のレベルの低減を有する、請求項１６に記載の方法。
  18. 遠心分離が、９００×ｇ〜２５，０００×ｇの力で行われる、請求項２〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記可溶化溶液が、少なくとも１つのカオトロピック剤を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つのカオトロピック剤が、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジウム、塩酸グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、及び尿素からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記少なくとも１つのカオトロピック剤が、２Ｍ〜１０Ｍの濃度の尿素及び２Ｍ〜８Ｍの濃度の塩酸グアニジンからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 可溶化溶液中の前記少なくとも１つのカオトロピック剤の濃度を低減させるステップを更に含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記可溶化溶液を希釈するステップが、前記少なくとも１つのカオトロピック剤の濃度を、前記可溶化溶液中のその初期濃度の５０％又はそれ未満に低減させる、請求項２２に記載の方法。
  24. 低減された濃度の前記少なくとも１つのカオトロピック剤を含む前記可溶化溶液を、少なくとも１時間インキュベートするステップを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 前記可溶化溶液から回収された前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも幾つかが、適正に形成されたジスルフィド結合及び遺伝子産物活性からなる群から選択される特性を有する、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記可溶化溶液から回収された前記少なくとも１つの遺伝子産物の少なくとも５０％が、適正に形成されたジスルフィド結合を有する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記少なくとも１つの遺伝子産物のクロマトグラフィー精製を更に含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
  28. クロマトグラフィー精製が、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である、請求項２７に記載の方法。
  29. クロマトグラフィー精製が、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを利用する、請求項２８に記載の方法。
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