JP2023514045A - 活性特異的な細胞濃縮 - Google Patents

Abstract

発現ベクターを含むことができる宿主細胞の遺伝的に多様なプールから、高性能宿主細胞および／または発現ベクターを選択することができる、活性特異的な細胞濃縮方法が提供される。一部の実施形態では、複数の遺伝的バリアントを含む遺伝的多様性を有する宿主細胞集団から、発現された宿主細胞を選択する方法であって、宿主細胞の少なくとも一部は、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含むものである、当該方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／９６１，３９２号の利益を主張するものであり、当該仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

分野
本開示は、分子生物学およびバイオテクノロジー製造の全般的な技術分野におけるものである。より具体的には、本開示は、遺伝子産物発現のための宿主細胞工学の技術分野にある。

背景
バイオテクノロジー物質の産生は複雑なプロセスであり、宿主細胞によって発現されるタンパク質などの遺伝子産物の質と量に影響を及ぼす複数の因子次第である。宿主細胞ゲノムおよび／または発現構築物間で変動（多様性）があるものである発現構築物を含む宿主細胞の集団を考慮すると、細胞当たり所望の量の活性遺伝子産物を産生することができる宿主細胞および／または発現構築物は、その多様な集団から選択することが有利であろう。これを達成するための技術的課題は、遺伝子産物が宿主細胞の細胞質内で完全に発現される、すなわち遺伝子産物に特異的な検出試薬が容易に接触することができない場合に克服がより困難であり。

概要
高性能宿主細胞および／または発現構築物を選択するための改善された方法が明らかに要望されている。本開示は、発現構築物を含むことができる宿主細胞の遺伝的に多様な集団からの高性能細胞の活性特異的な濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための方法を提供する。

したがって、一部の実施形態では、複数の遺伝的バリアントを含む遺伝的多様性を有する宿主細胞集団から、発現された宿主細胞を選択する方法であって、宿主細胞の少なくとも一部は、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含むものである、当該方法を提供する。いくつかの実施例では、この方法は、宿主細胞の集団を培養することであって、それにより対象となる遺伝子産物は、当該集団のうち宿主細胞の亜集団によって発現され、それによって亜集団が、発現された宿主細胞を含むものであり、当該発現宿主細胞からの対象となる遺伝子産物の発現のレベルが、遺伝的バリアントに基づいて変動するものである、培養することと、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することであって、標識化することが、対象となる遺伝子産物を検出可能部分と結合させることを含み、当該標識の量が、発現宿主細胞中の対象となる遺伝子産物の発現レベルに比例し、それによって標識された発現宿主細胞を産生するものである、標識化することと、標識された発現宿主細胞のサブセットを選択することであって、当該選択することは、細胞選別装置により、検出可能部分および標識の量を検出することを含むものである、選択することとを含む。一部の実施例では、発現宿主細胞は、遺伝的バリアントごとに対象となる遺伝子産物の相対的な発現レベルを測定することにより決定される。

他の実施形態では、複数の遺伝的バリアントを含む遺伝的多様性を有する宿主細胞集団から、発現宿主細胞を選択する方法であって、宿主細胞の少なくとも一部は、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含むものである、当該方法を提供する。一部の実施例では、この方法は、宿主細胞の集団を培養することであって、それにより対象となる遺伝子産物は、当該集団のうちの宿主細胞の亜集団によって発現され、それによって亜集団が、発現された宿主細胞を含むものであり、当該発現宿主細胞の所定の特性が、遺伝的バリアントに基づいて変動するものである、培養することと、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することであって、当該標識化することが、対象となる遺伝子産物を検出可能部分と結合させることを含み、当該標識の量が、発現宿主細胞中の対象となる遺伝子産物の所定の特性に比例し、それによって標識された発現宿主細胞を産生するものである、標識化することと、標識された発現宿主細胞のサブセットを選択することであって、当該選択することは、細胞選別装置により、検出可能部分および当該所定のものを検出することを含むものである、選択することとを含む。特定の実施例では、発現宿主細胞の所定の特性は、対象となる活性遺伝子産物の発現レベル、対象となる遺伝子産物の発現レベル、対象となる遺伝子産物の適切なタンパク質フォールディング、対象となる遺伝子産物の適切に折り畳まれたタンパク質の発現レベル、細胞生存率、および／またはバイオマスの量を含む。追加の実施例では、発現宿主細胞は、遺伝的バリアントごとに対象となる遺伝子産物の相対発現レベルを測定することにより決定される。

また、少なくとも１０００の遺伝的多様性を有する宿主細胞の集団から宿主細胞を選択するための方法であって、宿主細胞の少なくとも一部が、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施例では、この方法は、宿主細胞の集団を培養することであって、それにより対象となる遺伝子産物が、当該集団のうちの宿主細胞の亜集団によって発現され、それによって亜集団が発現された宿主細胞を含むものである、培養することと、亜集団の当該発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することであって、当該標識化することが、対象となる遺伝子産物が検出可能部分と結合し、それによって、標識された発現宿主細胞を産生するものである、標識化することと、標識された発現宿主細胞のサブセットを選択することであって、当該選択することは、細胞選別装置により検出可能部分を検出することを含むものである、選択することとを含む。一部の実施例では、発現宿主細胞は、遺伝的バリアントごとに対象となる遺伝子産物の相対的な発現レベルを測定することにより決定される。

本開示の方法の実施形態では、宿主細胞集団の遺伝的多様性は、宿主細胞集団のうちの宿主細胞の少なくとも一部で構成される、宿主細胞ゲノム変異、一つもしくは複数の発現構築物のポリヌクレオチド配列変異、またはそれらの組み合わせである。特定の実施例では、宿主細胞の集団の遺伝的多様性が、２００，０００～１，０００，０００である。

本方法の実施形態では、選択することが、蛍光により活性化される細胞の選別である。一部の実施例では、検出可能部分は蛍光部分であり、選択することは、最も高い蛍光放射である細胞の０．０１％～５％を選択することを含む。特定の非限定的な実施例では、選択することが、最も高い蛍光放射である細胞の０．５％を選択することを含む。

本方法の追加の実施形態では、対象となる遺伝子産物が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドを含む。他の実施形態では、対象となる遺伝子産物は、蛍光ポリペプチドおよび生物発光ポリペプチドからなる群から選択される第二のポリペプチドにインフレームで融合した第一のポリペプチドを含む。一部の実施例では、対象となる遺伝子産物に結合する検出可能部分は、蛍光ポリペプチドおよび生物発光ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む。他の実施形態では、対象となる遺伝子産物は、酵素活性を有する第二のポリペプチドにインフレームで融合した第一のポリペプチドを含む。一部の実施例では、対象となる遺伝子産物と結合する検出可能部分は、酵素活性を有するポリペプチドの活性部位に結合する。

本方法の一部の実施形態では、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターである。一部の実施例では、発現ベクターは、染色体外発現ベクターである。

追加の実施形態では、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することは、発現宿主細胞の亜集団を固定することを含む。発現宿主細胞の亜集団を固定することは、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を、アルデヒドと、例えばパラホルムアルデヒドと接触させることを含み得る。

他の実施形態では、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することは、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を透過化処理すること、例えば亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部をリゾチームと接触させること、を含む。

さらなる実施形態では、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することは、亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を、例えばヨウ化プロピジウムである、ＤＮＡを標識する化合物と接触させることをさらに含む。

一部の実施形態では、宿主細胞の集団が、原核細胞である。一実施例では、宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）５２１細胞などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。

一部の実施形態では、本方法はまた、標識された発現宿主細胞のサブセットからポリヌクレオチドを回収することを含み、それによって回収されたポリヌクレオチドを産生する。いくつかの実施例では、方法はまた、回収されたポリヌクレオチドからＤＮＡ配列情報を取得することも含む。方法はまた、ＤＮＡ配列情報に基づいて宿主細胞のゲノムを改変すること、例えばＤＮＡ配列情報に基づいて発現ベクターのライブラリーを構築すること、を含んでもよい。一部の実施例では、親宿主細胞株は、発現ベクターのライブラリーを用いてさらに形質転換される。他の実施例では、回収されたポリヌクレオチドが発現ベクターであり、本方法は、一つまたは複数の回収された発現ベクターを用いて親宿主細胞株を形質転換することをさらに含み得る。方法は、形質転換された宿主細胞を培養することをさらに含み、形質転換された宿主細胞の少なくとも一部が、対象となる遺伝子産物を発現する。一部の実施例では、例えばゲル電気泳動、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ－ＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、固相抽出・質量分析法（ＳＰＥ－ＭＳ）、または増幅発光近接均質アッセイにより、対象となる遺伝子産物の発現レベルが決定される。

本開示の前述のおよび他の特徴は、以下の詳細な説明からより明らかになり、これは添付図面を参照しながら進められる。

図１Ａ～１Ｆは、活性特異的な細胞濃縮プロセスの実施形態の概略図である。下向き矢印が、宿主細胞の遺伝的に多様な大型の集団（図１Ａ）から始まり、水平の破線で表した選択プロセスの適用を経る、高性能宿主細胞の選択を表している。図１Ｂは、例えば活性特異的細胞選別による、細胞選別装置を使用した高性能宿主細胞の選択を示す。図１Ｃは、宿主細胞の選択された集団を示し、一部の実施形態では、選択された高性能宿主細胞から回収された染色体外発現ベクターを用いて、または選択された高性能宿主細胞からの配列情報を使用して作成した「高性能」発現ベクターライブラリーを用いて行った、親宿主細胞株の形質転換についての結果であり得る。図１Ｄおよび１Ｅは、例えばＳＰＥ－ＭＳなどの高処理アッセイ（図１Ｄ）および／または例えば抗原結合アッセイなどの活性に基づくアッセイ（図１Ｅ）を利用する、高性能宿主細胞のさらなる選択を示している。図１Ｆで示すように、最も高性能の宿主細胞は、発酵プロセスにおいて力価および産物品質の両方に対して最適化されて、スケーラビリティを確保することができる。図１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆに示す各選択プロセスは、必要に応じて、高性能宿主細胞をさらに選択するために反復することができる。 図２Ａ～２Ｃは、三つのＦＡＣＳプロットを示し、これらは「低ＤＮＡ」ゲーティングパラメータ内に該当する検出イベントを示している。各パネルで、標識した宿主細胞のＤＮＡ蛍光（６７５ｎｍ／２０フィルターでのＦＳＣ－Ａ）を、蛍光標識されたＨＥＲ２タンパク質を使用してＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現に関して標識した宿主細胞の蛍光（５３０ｎｍ／３０フィルターでのＦＳＣ－Ａ）に対してプロットしている。図２Ａは、陰性対照サンプルＡ１であり、これは空ベクターを含む宿主細胞集団である。図２Ｂは、陽性対照サンプルＡ３であり、これはｃＤｓｂＣ共発現によりバイシストロニック配置でＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖およびＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖を発現する宿主細胞集団である（表１を参照）。図２Ｃは実験サンプルＢ１であり、これは宿主細胞集団中に存在するＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂに関する発現ベクターの１７０万の異なる形態をもつ、バイシストロニック配置でのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖およびＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖を発現する宿主細胞集団である。 図３は、高レベルのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現のためＦＡＣＳにより選択された宿主細胞から回収した発現ベクターのＮＧＳ（次世代シーケンシング）分析の結果を示すヒストグラムである。結果は、宿主細胞のＢ１集団について示されており（表１を参照）、このＢ１集団は、プロピオン酸誘導性（ｐｒｐ）プロモーターからＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂと共発現した１３７種類の異なる遺伝子産物をコードする発現ベクターを含んだ。ＦＡＣＳ選別前のＢ１宿主細胞のサンプルは、ＮＧＳ分析のために保存され、これら選別前の細胞およびＦＡＣＳで選別した（「選別後」）細胞からのプラスミドＤＮＡは、回収されてＮＧＳにより配列決定した。ｐｒｐプロモーターから共発現されたコード配列の同一性は、配列データから決定され、１３７種類の異なる遺伝子産物の各々が、選別前および選別後のＢ１宿主細胞集団中に存在した頻度がヒストグラムに示される。 図４Ａ～４Ｂは、二つのＦＡＣＳプロットを示し、これは「低ＤＮＡ」ゲーティングパラメータ内に該当する検出イベントを示している。各パネルで、標識した宿主細胞のＤＮＡ蛍光（６７５ｎｍ／２０フィルターでのＦＳＣ－Ａ）を、蛍光標識されたＨＥＲ２タンパク質を使用してＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現に関して標識した宿主細胞の蛍光（５３０ｎｍ／３０フィルターでのＦＳＣ－Ａ）に対してプロットしている。図４ＡはＦＡＣＳによる選別前の宿主細胞集団Ｂ１であり、これは宿主細胞集団中に存在するＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂに関する発現ベクターの１７０万の異なる形態をもつ、バイシストロニック配置でのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖およびＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖を発現する宿主細胞集団である。図４Ｂは、Ｂ１宿主細胞集団から回収した発現ベクターを使用して再構築した宿主細胞集団Ｂ１＊であり、これは高レベルのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現する宿主細胞を選択するためにＦＡＣＳにより選別された。 図５は、固相抽出・質量分析法（ＳＰＥ－ＭＳ）により測定された、６００ｎｍでの宿主細胞培養光学密度（「ＯＤ」）当たりのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖（「ＨＣ」）の産生を、ＯＤ当たりのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖（「ＬＣ」）の産生に対してプロットしたグラフである。高レベルのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現した宿主細胞を特定するために、多様な宿主細胞集団Ｂ１をＦＡＣＳにより選別して、それら高性能宿主細胞からの発現ベクターを使用して、選択された宿主細胞集団Ｂ１＊を再構築した。次いで、個々のＢ１＊宿主細胞をＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現について試験し、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－ＦａｂのＨＣペプチドおよびＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－ＦａｂのＬＣペプチドの産生をＳＰＥ－ＭＳにより測定した。 図６は、三つの未感作ライブラリーの、選別前（ＡＣＥ前）と、選別、プラスミドベクターの単離、および再形質転換後（ＡＣＥ後）とである、トラスツズマブＦａｂ’の高発現ベクターの濃縮を実証するＦＡＣＳプロットを示す。ＡＣＥ前およびＡＣＥ後の両方で同一の選別ゲート（＜０．５％）を適用した。 図７Ａ～７Ｂは、陰性対照および陽性対照によりゲーティングを確立した場合（図７Ａ）、および選別後のトラスツズマブＦａｂ’の発現が増加した場合（図７Ｂ）のＦＡＣＳプロットを示す。

配列表
本明細書または添付の配列表に列挙されるあらゆる核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許規則連邦規則法典第３７巻（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）セクション１．８２２で規定されるヌクレオチド塩基およびアミノ酸に関する標準の略語を用いて示す。少なくとも一部の事例では、各核酸配列のうちの一つの鎖のみを示しているが、相補鎖は、表示された鎖への任意の参照により含まれているとして理解される。

配列番号１は、例示的な二重プロモーター発現ベクターの核酸配列である。

配列番号２は、トラスツズマブ－Ｆａｂ重鎖Ａ２のアミノ酸配列である。

配列番号３は、トラスツズマブ－Ｆａｂ軽鎖Ａ２のアミノ酸配列である。

配列番号４は、細胞質に局在する、ジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質ＤｓｂＣのアミノ酸配列（ｃＤｓｂＣ）である。

配列番号５は、バイシストロニックなトラスツズマブ－Ｆａｂ重鎖Ａ３のアミノ酸配列である。

配列番号６は、バイシストロニックなトラスツズマブ－Ｆａｂ軽鎖Ａ３のアミノ酸配列である。

配列番号７は、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｙｓｔｉｓ ｓｐ）に由来するＮ末端アミノ酸配列ＤｎａＢを伴うトラスツズマブ－Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列である。

配列番号８は、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｙｓｔｉｓ ｓｐ）に由来するＮ末端アミノ酸配列ＤｎａＢを伴うトラスツズマブ－Ｆａｂ軽鎖のアミノ酸配列である。

配列番号９は、６ｘＨｉｓ配列を含む、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｙｓｔｉｓ ｓｐ）に由来するＮ末端アミノ酸配列ＤｎａＢのアミノ酸配列である。

詳細な説明
遺伝的に多様な宿主細胞集団から発現構築物を含み得る高性能宿主細胞を選択することについての課題は、本明細書に提供される細胞濃縮方法により対処される。これら方法は、高性能宿主細胞の迅速な同定および単離のために、例えば遺伝的に多様な宿主細胞集団に存在する他の宿主細胞よりも多く、対象となる遺伝子産物を発現する方法を提供する。「高性能」とは、例えばプロテアーゼ、毒素、またはアレルゲン遺伝子産物の発現が少ない宿主細胞を特定することが望ましい場合のように、対象となる遺伝子産物の発現が少ないことも意味し得る。

提供される活性特異的な細胞濃縮方法では、不活性物質ではなく、対象となる活性遺伝子産物を発現する宿主細胞を特定する。活性遺伝子産物は、例として、結合パートナー分子に特異的に結合する活性遺伝子産物の能力により、または化学反応もしくは酵素反応に関与する遺伝子産物の能力により、不活性物質と区別することができる。ポリペプチド遺伝子産物中に適切に形成されたジスルフィド結合の存在は、それが正確に折り畳まれており推定的に活性であるということの兆候である。ポリペプチド遺伝子産物中のジスルフィド結合の位置を決定する方法については、実施例１を参照されたい。この細胞濃縮方法では、例として、例えば対象となる遺伝子産物が抗体もしくはＦａｂである場合には、例えば標識された抗原などの対象となる活性遺伝子産物に特異的に結合する適切な標識複合体を利用することにより、または対象となる遺伝子産物が受容体もしくは受容体断片である場合には、標識されたリガンドであって当該受容体の活性なコンホメーションに特異的に結合するものである当該リガンドを利用することにより、または例えば対象となる遺伝子産物が酵素である場合には、標識された基質もしくは標識された基質類似体を利用することにより、対象となる活性遺伝子産物を検出する。任意の対象となる遺伝子産物について、活性遺伝子産物に特異的に結合するが不活性遺伝子産物には特異的に結合しない、利用可能な抗体または抗体断片が存在する場合、その抗体または抗体断片は、以下に記載されるように、検出可能部分に結合したときに対象となる活性遺伝子産物を標識するために使用することができる。

宿主細胞の集団における遺伝的多様性は、例えば宿主細胞間のゲノム変異から、および／または宿主細胞により構成される発現構築物のポリヌクレオチド配列における相違から生じ得る。宿主細胞間でゲノム多様性が存在する場合、高性能宿主細胞を選択し、それらから回収したゲノムＤＮＡを配列決定することを用いて、選択した宿主細胞の優れた性能に関連する、変異などのゲノム的な相違を特定することができる。宿主細胞集団内において発現構築物間に多様性が存在する場合、選択された宿主細胞から例えば発現ベクターなどの発現構築物を回収し、発現構築物を配列決定することにより、高性能宿主細胞と関連するそれらの発現構築物成分を含む発現構築物のライブラリー（「高性能ライブラリー」）を作成することが可能になり得る。高性能ライブラリーを用いて、または回収された高性能発現構築物自体を用いて親宿主細胞株を形質転換することにより、高性能宿主生細胞の集団を再構築することができる。親宿主細胞株は、高性能宿主細胞についてスクリーニングした宿主細胞集団、または発現構築物を用いて遺伝子改変または形質転換され得る別の株を作製して、対象となる遺伝子産物を発現することができる宿主細胞株を作製するために使用される株であり得る。

提供される活性特異的な細胞濃縮方法は、フローサイトメーターのサンプル分析速度を最大限に活用して、例えば対象となる遺伝子産物をより多く発現する宿主細胞などの高性能宿主細胞を単離する。一部の実施形態では、多様性が１００万を超える宿主細胞の集団を数分以内に分析して、より高性能のサブセット集団が存在するかどうかを判断することができる。その場合、およびフローサイトメーターがＦＡＣＳ機器である場合、希少な（１００万に一つ）亜集団由来の数百個のより高性能な宿主細胞を１時間以内に単離して、その後の分析を可能にすることができる。宿主細胞の亜集団を規定する基準は、規定された亜集団内の集団のうちの宿主細胞を何も含まない、一部の宿主細胞を含む、またはすべての宿主細胞を含むことが可能であり、一部の例では、亜集団は、集団と共存し得る。例えば宿主細胞の亜集団は、フローサイトメトリーにより検出可能なレベルで標識した対象となる遺伝子産物の発現により規定されるが、当該集団の宿主細胞のすべて、または実質的に大部分を含み得る。

一部の実施形態では、活性特異的な細胞濃縮方法は、以下の態様を含む：（１）発現構築物を含むことができる宿主細胞の遺伝的に多様な集団を提供すること、（２）対象となる遺伝子産物を検出可能融合タンパク質として発現することにより、または対象となる遺伝子産物を、対象となる活性遺伝子産物に特異的に結合する標識複合体と接触させることにより、宿主細胞内で対象となる遺伝子産物を標識すること、（３）フローサイトメトリーまたは同等の方法を用いる選別装置を使用して、高性能宿主細胞を選択すること、（４）選択した宿主細胞および／または発現ベクターを分析すること、（５）宿主細胞株を再構築すること、（６）任意で、再構築した宿主細胞株を、特に対象となる遺伝子産物の活性と比較してさらに分析すること、および（７）任意で、上記（１）～（６）のいずれかまたはすべてを反復すること。この方法のこれらの態様は、図１Ａ～１Ｆに概略的に示し、以下にさらに詳細に記載される。

Ｉ．宿主細胞および／または発現構築物の遺伝的に多様な集団
Ａ．宿主細胞
本明細書に開示される細胞濃縮方法は、所望のレベルの活性遺伝子産物を発現する宿主細胞を選択するように設計される。本明細書に記載される細胞濃縮方法での使用するために、宿主細胞は、遺伝子産物を発現してフローサイトメトリーまたは同等の方法により選別することができる、例えば単一細胞生物体、培養で増殖した単離細胞、もしくは多細胞生物体に由来する単離細胞などの任意の細胞であり得る。ジスルフィド結合を含む、例えばポリペプチド遺伝子産物などである遺伝子産物の効率的な誘導性発現を可能にする宿主細胞の例が提供される。

特に適切な宿主細胞は、発酵培養で高細胞密度で増殖することができ、そして高度に制御された誘導性遺伝子発現を介して宿主細胞の細胞質を酸化する中で遺伝子産物を産生することができる。これら品質を有する宿主細胞は、以下の特徴の一部またはすべてを組み合わせることによって産生される。（１）宿主細胞は、細胞質中の酸化ポリペプチドの発現または機能を増加させることによって、および／または細胞質中の還元ポリペプチドの発現または機能を減少させることによって、酸化細胞質を有するように遺伝子改変される。システインオキシダーゼＤｓｂＡ、ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ、またはＤｓｂタンパク質の組み合わせの発現を増加させることは、これらすべてが通常ペリプラズム中に輸送されるものであるが、ジスルフィド結合を必要とする異種タンパク質の発現に利用されてきた（Ｍａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１ Ｍａｙ １４；１０：３２）。例えば２０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する、細胞質型ＤｓｂＣ（「ｃＤｓｂＣ」）などであるこれらＤｓｂタンパク質の細胞質型を発現することも可能であり、これらはシグナルペプチドを欠いているために細胞質内には輸送されない。ｃＤｓｂＣなどの細胞質Ｄｓｂタンパク質は、宿主細胞の細胞質をより酸化させるのに有用であり、したがって細胞質で産生される異種タンパク質におけるジスルフィド結合の形成にさらに役立つ。宿主細胞の細胞質はまた、チオレドキシン酵素系およびグルタレドキシン／グルタチオン酵素系を直接改変することによって、より酸化させることができ、すなわち、グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）またはグルタチオンシンテターゼ（ｇｓｈＢ）において欠損がある変異株が、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）と一緒になって、細胞質酸化を与える。これらの株はリボヌクレオチドを減少させることができないため、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの外因性還元剤の不在下では増殖することができない。ペルオキシレドキシンＡｈｐＣをコードする遺伝子ａｈｐＣの抑制遺伝子変異（ａｈｐＣ＊またはａｈｐＣ^Δ）は、それを還元型グルタチオンを生成するジスルフィド還元酵素に変換し、それにより酵素リボヌクレオチドレダクターゼへの電子のチャネリングを可能にし、ｇｏｒおよびｔｒｘＢにおいて欠損がある細胞またはｇｓｈＢおよびｔｒｘＢにおいて欠損がある細胞が、ＤＴＴ不在下で増殖することができるようにさせる。異なる種類の変異型ＡｈｐＣが、ガンマ－グルタミルシステインシンテターゼ（ｇｓｈＡ）の活性において欠損してｔｒｘＢにおいて欠損している株が、ＤＴＴの不在下で増殖することを可能にさせ得、これらには、ＡｈｐＣ Ｖ１６４Ｇ、ＡｈｐＣ Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７３／Ｓ７１Ｆ、ＡｈｐＣ Ｅ１７１Ｔｅｒ、およびＡｈｐＣ ｄｕｐ１６２～１６９が含まれる（Ｆａｕｌｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｌｌｏｗｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８ Ｍａｙ ６；１０５（１８）：６７３５－６７４０，Ｅｐｕｂ ２００８ Ｍａｙ ２）。（２）任意で、宿主細胞はまた、所望の遺伝子産物の産生を補助するシャペロンおよび／もしくは補因子を発現するように、ならびに／またはポリペプチド遺伝子産物をグリコシル化するように、遺伝子改変されてもよい。（３）宿主細胞は、発現構築物からの遺伝子産物発現の特定の態様を改善するように設計された追加の遺伝子改変を含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、（Ａ）少なくとも一つの誘導性プロモーターの誘導物質のためのトランスポータータンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子の遺伝子機能の改変を有し、別の例として、トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＥ、ａｒａＦ、ａｒａＧ、ａｒａＨ、ｒｈａＴ、ｘｙｌＦ、ｘｙｌＧ、およびｘｙｌＨからなる群から選択され、もしくは特にａｒａＥであり、またはより具体的には、遺伝子機能の改変が、構成的プロモーターからのａｒａＥの発現であり、および／または（Ｂ）少なくとも一つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子の遺伝子機能のレベルが低下しており、またさらなる例として、少なくとも一つの誘導性プロモーターの誘導物質を代謝するタンパク質をコードする遺伝子が、ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ｐｒｐＢ、ｐｒｐＤ、ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、ｒｈａＤ、ｘｙｌＡ、およびｘｙｌＢからなる群から選択され、および／または（Ｃ）少なくとも一つの誘導性プロモーターの誘導物質の生合成に関与するタンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子の遺伝子機能のレベルが低下しており、さらなる実施形態では、当該遺伝子は、ｓｃｐＡ／ｓｂｍ、ａｒｇＫ／ｙｇｆＤ、ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ、ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ、ｒｍｌＡ、ｒｍｌＢ、ｒｍｌＣ、およびｒｍｌＤからなる群から選択される。

特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば酵母（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）など）などの微生物細胞もしくは細菌細胞であるか、またはグラム陽性細菌もしくはグラム陰性細菌であるか、または大腸菌であるか、または大腸菌Ｂ株であるか、または大腸菌Ｂ株５２１細胞であるか、または大腸菌Ｂ株５２２細胞である。大腸菌５２１細胞および大腸菌５２２細胞は、以下の遺伝子型を有する：
大腸菌５２１：ΔａｒａＢＡＤ ｆｈｕＡ２ ［ｌｏｎ］ ｏｍｐＴ ａｈｐＣ^Δ ｇａｌ λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３－ｒ１－ｃＤｓｂＣ（Ｓｐｅｃ，ｌａｃＩ）ΔｔｒｘＢ ｓｕｌＡ１１ Ｒ（ｍｃｒ－７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０－－Ｔｅｔ^Ｓ）２ ［ｄｃｍ］ Ｒ（ｚｇｂ－２１０：：Ｔｎ１０－－Ｔｅｔ^Ｓ）ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４ ΔｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣ ｅｎｄＡ１ ｒｐｓＬ－Ａｒｇ４３ Δｇｏｒ Δ（ｍｃｒＣ－ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０
大腸菌５２２：ΔａｒａＢＡＤ ｆｈｕＡ２ ｐｒｐＤ ［ｌｏｎ］ ｏｍｐＴ ａｈｐＣ^Δ ｇａｌ λａｔｔ：：ｐＮＥＢ３－ｒ１－ｃＤｓｂＣ（Ｓｐｅｃ，ｌａｃＩ）ΔｔｒｘＢ ｓｕｌＡ１１ Ｒ（ｍｃｒ－７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０－－Ｔｅｔ^Ｓ）２ ［ｄｃｍ］ Ｒ（ｚｇｂ－２１０：：Ｔｎ１０－－Ｔｅｔ^Ｓ）ΔａｒａＥｐ：：Ｊ２３１０４ ΔｓｃｐＡ－ａｒｇＫ－ｓｃｐＢＣ ｅｎｄＡ１ ｒｐｓＬ－Ａｒｇ４３ Δｇｏｒ Δ（ｍｃｒＣ－ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０。

酸化細胞質を有する大腸菌宿主細胞を用いた増殖実験において、酸化細胞質を有する大腸菌Ｂ株は、対応する大腸菌Ｋ株よりもはるかに高い細胞密度まで増殖することができることが確認された。他の適切な株としては、大腸菌Ｂ株ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２８Ｈ）およびＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２９Ｈ）、ならびに大腸菌Ｋ株ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７（ＮＥＢカタログ番号Ｃ３０２６Ｈ）が挙げられる。

一部の実施形態では、宿主細胞は、原核宿主細胞である。原核宿主細胞としては、古細菌（例えば、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ））、グラム陽性細菌（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ブレビバチルス菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ））、またはグラム陰性細菌、例えばアルファプロテオバクテリア（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ－ｆａｃｉｅｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、およびアルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏ－ｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、ベータプロテオバクテリア（アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））など、およびガンマプロテオバクテリア（アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アゾトバクター・ビネランジー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ－ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））が挙げられ得る。好ましい宿主細胞としては、腸内細菌科ファミリーのガンマプロテオバクテリアが挙げられ、例えばエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌類（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）を含む）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などが挙げられる。

多くのさらなるタイプの宿主細胞が、本明細書に提供される方法において使用することができ、例えば酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、他のクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏ－ｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）としても知られるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｄｅｋｋｅｒａ／Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの真核細胞、他の真菌類（アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ））、昆虫細胞株（キイロショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞およびヨトウガＳｆ９細胞）、および例えば不死化細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ，２９３、またはＨＥＫ－２９３）細胞、およびヒト肝細胞がん細胞（Ｈｅｐ Ｇ２））などの哺乳動物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である。

Ｂ．発現構築物
発現構築物は、一または複数の対象となる遺伝子産物の発現のために設計されたポリヌクレオチドである。対象となる特定の遺伝子産物は、それらが発現される宿主細胞のものとは異なる種に由来するという点で異種遺伝子産物であり、および／または発現構築物内で利用されるプロモーターから自然に発現されない異種遺伝子産物である。対象となる遺伝子産物には、かかる遺伝子産物の天然型との相違を含むよう設計された改変遺伝子産物が含まれる。異種および／または改変された遺伝子産物の例としては、シグナルペプチドを欠くポリペプチド遺伝子産物が挙げられるが、このポリペプチド遺伝子産物は、すなわち宿主細胞の細胞質内で発現および保持される。異種および／もしくは改変された遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む、または異なる種の生物に由来するポリヌクレオチドの組み合わせを含む、または天然のポリヌクレオチドとは異なるように改変されているポリヌクレオチドを含む発現構築物は、天然分子ではない。発現構築物は、宿主細胞染色体内に組み込むことができ、または例えばプラスミドもしくは人工染色体などの宿主細胞染色体から独立して複製するポリヌクレオチド分子として宿主細胞内に維持することができる。発現構築物の例としては、宿主細胞染色体に一つまたは複数のポリヌクレオチド配列を挿入することにより得られるポリヌクレオチドがあり、当該挿入されたポリヌクレオチド配列は、染色体コード配列の発現を変化させる。発現ベクターは、一つまたは複数の遺伝子産物の発現に特に使用されるプラスミド発現構築物である。一つまたは複数の発現構築物は、宿主細胞染色体に組み込むことができるか、または例えばプラスミドもしくは人工染色体などの染色体外ポリヌクレオチド上に維持することができる。適切な発現構築物としては、参照により本明細書で援用される米国特許出願公開第２０１６０３７６６０２Ａ１号に記載される二重プロモーター発現ベクターが挙げられる。

例えば染色体外発現ベクターなどの発現構築物は、例えばｃｏｌＥ１、ｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２０）、改変ｐＭＢ１（ｐＵＣ９）、Ｒ１（ｔｓ）（ｐＭＯＢ４５）、ｐ１５Ａ（ｐＰＲＯ３３）、ｐＳＣ１０１、ＲＫ２、ＣｌｏＤＦ１３（ｐＣＤＦＤｕｅｔ（商標）－１）、ＣｏｌＡ（ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ（商標）－１）、およびＲＳＦ１０３０／ＮＴＰ１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１）などの複製起点を含み得る。発現構築物はまた、例えばアンピシリン（Ａｍｐ^Ｒ）、クロラムフェニコール（Ｃｍｌ^ＲまたはＣｍ^Ｒ）、カナマイシン（Ｋａｎ^Ｒ）、スペクチノマイシン（Ｓｐｃ^Ｒ）、ストレプトマイシン（Ｓｔｒ^Ｒ）、およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ^Ｒ）などの、抗生物質抵抗性を付与する少なくとも一つの選択マーカも含み得る。さらに、発現構築物は、ポリリンカーとも呼ばれる複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができるが、これは互いに近接または重複して複数の制限部位を含有するポリヌクレオチドである。ＭＣＳの制限部位は、通常、ＭＣＳ配列内で一回発生し、好ましくは、プラスミドまたは他のポリヌクレオチド構築物の残りの部分内では発生せず、それにより制限酵素に対して、ＭＣＳ内でのみプラスミドまたは他のポリヌクレオチド構築物を切断できるようにさせる。ＭＣＳ配列の例としては、例えばｐＢＡＤ２４およびｐＢＡＤ３３などの一連のｐＢＡＤ発現ベクターの中のもの（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＰＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ”，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９５ Ｊｕｌ；１７７（１４）：４１２１－４１３０）、および例えばｐＰＲＯ３３などのｐＢＡＤベクター由来の一連のｐＰＲＯ発現ベクターの中のもの（米国特許第８１７８３３８号）が挙げられる。

少なくとも一つのポリペプチド遺伝子産物をコードする発現構築物については、発現しようとするポリペプチド遺伝子産物のコード配列の転写開始部位と開始コドンとの間のポリヌクレオチド領域が、そのポリペプチド遺伝子産物のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）に相当する。好ましくは、５’ＵＴＲに対応する発現構築物の領域は、宿主細胞の種に見られるコンセンサスのリボソーム結合部位（ＲＢＳ、シャイン－ダルガーノ配列とも呼ばれる）と類似したヌクレオチド配列を含む。原核生物（古細菌および細菌）では、ＲＢＳコンセンサス配列はヌクレオチド配列ＧＧＡＧＧまたはＧＧＡＧＧＵを含み、また例えば大腸菌などの細菌では、ＲＢＳコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧまたはＡＧＧＡＧＧＵである。ＲＢＳは、典型的には、５～１０個の介在ヌクレオチドだけ開始コドンから分離しており、また発現構築物内のＭＣＳの非常に近接した５’（または「その上流」）に位置することが多い。

一つまたは複数の遺伝子産物の効率的な発現のために、発現構築物は、好ましくは、例えば恒常性プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの少なくとも一つのプロモーターを含み、好ましくは誘導性プロモーターを含む。発現構築物内で、プロモーターは、任意のＲＢＳ配列の上流、および発現しようとする遺伝子産物のコード配列の上流に配置され、その結果、プロモーターの存在が、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドのコード鎖に対して５’から３’方向に遺伝子産物コード配列の転写を方向付けることとなる。発現構築物に使用され得る誘導性プロモーターの例としては、例えばＬ－アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢＡＤなどである周知の大腸菌糖誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーターＰｌａｃＺＹＡ、ラムノース誘導性プロモーターＰｒｈａＢＡＤ、およびキシロース誘導性プロモーターＰｘｙｌＡＢおよびＰｘｙｌＦＧＨＲ；大腸菌プロピオン酸誘導性プロモーターＰｐｒｐＢＣＤＥ、およびリン酸欠乏により誘導されるプロモーターＰｐｈｏＡが挙げられ、それらすべては、ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０１６２０５５７０Ａ１号に詳述されており、これは参照により本明細書に援用される。例えばＪ２３１０４プロモーターなどの構成的プロモーターは、ｉＧＥＭ（マサチューセッツ州ボストン）が維持する標準生物学的部分のレジストリ（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ）から得ることができ、ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇを参照されたい。

Ｃ．宿主細胞集団の遺伝的多様性
提供される方法は、宿主細胞の遺伝的に多様な集団から高性能の宿主細胞を選択するために有利に使用され、当該方法において、宿主細胞集団内の多様性または変動は、例えば宿主細胞ゲノム間の相違から、または宿主細胞により構成される発現構築物間の相違から生じ得る。宿主細胞集団の遺伝的多様性は、例えば突然変異などのプロセスによって無作為に生じてもよく、または宿主細胞ゲノム中または発現構築物中で変化させる標的化方法によって特異的に導入されてもよく、これはその後宿主細胞株内に導入される。

宿主細胞集団は、複数の遺伝的バリアントを含む。多くの実施形態において、本発明の一態様は、宿主細胞の所定の特性に基づいて宿主細胞集団を選別することを含むものであり、その所定の特性は、宿主細胞集団内の遺伝的バリアントに基づいて変動する。多くの実施形態では、所定の特性は、対象となる遺伝子産物の発現レベルであり、当該方法は、複数の遺伝的バリアントの各々において対象となる活性遺伝子産物の発現レベルを検出することを含む。宿主細胞のさらなる所定の特性としては、対象となる活性遺伝子産物の発現レベル、対象となる遺伝子産物の適切なフォールディング、適切に折り畳まれたタンパク質の発現レベル、細胞生存率、および／またはバイオマスが挙げられる。したがって、宿主細胞集団の遺伝的多様性は、複数の遺伝的バリアントを含むべきであり、その遺伝的バリアントは、遺伝的に多様な集団内での発現レベルまたは他の所定の特性の変動を提供するのに十分多数である。一部の実施形態では、対象となる遺伝子産物を実質的に発現することができる遺伝的バリアントの数は、非常に小さくてもよく、これは遺伝的多様性が増加することを必要とし得る。多くの実施形態では、宿主細胞集団の遺伝的多様性は、適切な遺伝的多様性が達成されるまで、本明細書に記載されるように増加させることができる。

本開示の方法の実施形態では、宿主細胞集団の遺伝的多様性は、宿主細胞集団中に存在する異なる遺伝的バリアントの数、陰性対照と比較した異なる遺伝的バリアントの数、および／または参照細胞株と比較した異なる遺伝的バリアントの数として規定される。遺伝的バリアントの数は、宿主細胞集団中の実際のバリアント数または遺伝的バリアントの計算された（「目標の」）数であってもよい。これらバリアントは、細胞間での宿主細胞ゲノム内の一つまたは複数の遺伝的（例えば、核酸配列）相違、宿主細胞間での発現構築物内の一つまたは複数の遺伝的（例えば、核酸配列）相違、またはそれらの組み合わせの結果であってもよい。一部の実施例では、遺伝的相違には、ある配列のうちの一つもしくは複数のヌクレオチドの改変、欠失、もしくは挿入、または一つもしくは複数の成分（一つまたは複数のタグ、ドメイン、発現制御配列、および／または関連タンパク質など）の挿入もしくは欠失が含まれる。

一部の実施形態では、宿主細胞集団の遺伝的多様性は、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、および少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００、少なくとも５００，０００，０００、または少なくとも１，０００，０００，０００である。他の例では、遺伝的多様性は、約１０００～１，０００，０００，０００であり、例えば約１０００～１０，０００、約５０００～５０，０００、約５０，０００～２００，０００、約１００，０００～５００，０００、約２００，０００～１，０００，０００、約５００，０００～２，０００，０００、約１，０００，０００～５，０００，０００、約５，０００，０００～５０，０００，０００、約２０，０００，０００～１００，０００，０００、約５０，０００，０００～５００，０００，０００、または約５００，０００，０００～１，０００，０００，０００などである。

任意のタイプの遺伝的多様性を、本明細書に提供される方法を使用して探索することができる。一部の実施形態では、遺伝的多様性は、対象となる遺伝子産物（コード配列バリアントおよびコドン最適化を含むがこれらに限定されない）、プロモーター（恒常性プロモーターおよび／または誘導性プロモーターを含む）、シャペロン、リボソーム結合配列、タグ、核局在化シグナル、シグナルペプチド、一つまたは複数の遺伝子のノックアウトまたはノックイン、一つまたは複数（例えば１、２、３、またはそれ以上）のプラスミドの存在、またはそれらの任意の組み合わせの間の一つまたは複数の相違（改変または存在または不在を含む）を含む。一部の実施例では、遺伝的多様性は、遺伝子改変に向けた標準的な技術により生成される。他の実施例では、遺伝的多様性は、ランダム変異誘発、誤りがちのＰＣＲ変異誘発、またはトランスポゾン変異誘発（例えば、Ｔｎ５）により生じる。技術の組み合わせを使用して、さらなるレベルの遺伝的多様性を生じることもできる。

ヌクレオチド配列を変化させるため、および／または遺伝子機能を削除、低減、または変化させるために、宿主細胞ゲノムまたは発現構築物に対して改変を行うための当技術分野で公知の多くの方法がある。大腸菌および他の原核生物などの宿主細胞中の遺伝子の標的破壊を行う方法が記述され（Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ＥＴ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９９ Ｍａｒ １５；２７（６）：１５５５－１５５７；Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，“Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０００ Ｊｕｎ ６；９７（１２）：６６４０－６６４５）、また類似のＲｅｄ／ＥＴ組み換え法を使用するキットが市販されている（例えば、独国ハイデルベルクのＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社よりのＱｕｉｃｋ ＆ Ｅａｓｙ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。Ｒｅｄ／ＥＴ組み換え法は、プロモーター配列を、構成的プロモーターなどの異なるプロモーターの配列と、または一定のレベルの転写を促進すると予測される人工プロモーターの配列と置換するためにも使用することができる（Ｄｅ Ｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｒａｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ”，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０ Ｍａｒ ２４；１０：２６）。宿主細胞のゲノムまたは発現構築物の機能はまた、ＲＮＡサイレンシング法により削除または低減することもできる（Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｃｅ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１１ Ａｐｒ；３９（８）：ｅ５０，Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｆｅｂ ３）。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ法（Ｇｉｂｓｏｎ，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｏｖｅｒ－ｌａｐｐｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０１１；４９８：３４９－３６１；ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－３８５１２０－８．０００１５－２）を使用して、宿主細胞のゲノムまたは発現構築物において目標とする変化、例えば挿入、欠失、および点変異、を行うこともできる。宿主細胞のゲノムまたは発現構築物に目的の改変を行うための別の方法では、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート））ヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ配列に相補的なヌクレオチド配列を認識して開裂するＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）を利用する。さらに、宿主細胞ゲノムに対する変化は、従来の遺伝的方法により導入され得る。

ＩＩ．宿主細胞内の遺伝子産物の標識化
対象となる遺伝子産物の標識化は、対象となる遺伝子産物と検出可能部分とを結合させることを伴う。対象となる遺伝子産物を検出可能部分と結合させることは、異なる方法で発生させることができるが、例えば、対象となる遺伝子産物が、検出可能な蛍光ポリペプチドまたは発光ポリペプチドを有する融合ポリペプチドとして発現されるポリペプチドである場合であるように、対象となる遺伝子産物と検出可能部分との間の共有結合、対象である抗体遺伝子産物と抗原との間であるように、非共有結合性相互作用、または対象となる遺伝子産物の発現と宿主細胞中の検出可能な変化との間の結合であって、例えば当該変化は対象となる遺伝子産物の発現により引き起こされる細胞内カルシウム濃度の変化などであるがこれに限定されない。

細胞選別により宿主生細胞を選択するために、宿主細胞が細胞質内で対象となる遺伝子産物を発現している場合に、検出可能なシグナルがその特定の宿主細胞と関連するように細胞質内の遺伝子産物を標識する必要がある。一部の実施例では、対象となる遺伝子産物が酵素活性を有する場合、その酵素のための細胞透過性発色基質を細胞に導入することが可能である。他の実施例では、例えばエクオリンのような蛍光レポータータンパク質を使用して細胞内カルシウム濃度を測定することなどのように、対象となる活性遺伝子産物の存在が、宿主細胞を死滅させることなく検出され得る宿主細胞の別の属性と相関する場合、宿主細胞は、レポータータンパク質または他の分子を含むように遺伝子改変され得る。

別の実施例として、宿主細胞は、融合タンパク質として対象となるポリペプチドをコードする発現構築物を含み、その少なくとも一つは、そのＮ末端またはＣ末端に、好ましくはそのＣ末端に、フレーム内で発現される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質を有する。こうした融合タンパク質はまた、対象となる各ポリペプチドのアミノ酸配列と蛍光タンパク質との間にリンカーポリペプチドも含み得る。好ましくは、対象となるポリペプチドの蛍光部分をコードするポリヌクレオチド配列は、一つまたは複数の制限酵素で消化することにより、発現ベクターから容易に除去することができる。対象となる遺伝子産物が、例えば重鎖および軽鎖を含む抗体などである複数のポリペプチド鎖を含む場合、二つ以上の構成ポリペプチドが、各々、ＢＲＥＴ（生体発光共鳴エネルギー転移）またはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）のドナー／アクセプターペアのうちの一つの成分に融合することができ、それにより、構成ポリペプチドの発現およびアセンブリ、ならびにＢＲＥＴまたはＦＲＥＴのドナーおよびアクセプターの会合により蛍光シグナルが生成され、構成ポリペプチドの発現量と、構成ポリペプチドがもつ対象となる遺伝子産物を形成する能力との両方の測定がもたらされる。

一部の実例では、蛍光タンパク質または発光タンパク質との融合としての一つまたは複数の対象となるポリペプチドの発現は、対象となるポリペプチドのフォールディング、立体配置、および／または活性に影響を与える可能性があるが、この場合でさえ、蛍光または発光の量に基づいたＦＡＣＳ選択により、対象となるポリペプチドの所望の量を発現する宿主生細胞を特定することができる。例えばＢＲＥＴドナーおよびアクセプターが、対象となる遺伝子産物のポリペプチド成分を有する融合ポリペプチドとして発現されているが、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプターにより、ＢＲＥＴアクセプターがシグナルを生じるために必要な近接が達成できない場合、ＦＡＣＳ選択は、ＢＲＥＴドナーの生物発光を検出することにより実施することができる。

一部の実施形態では、活性特異的な細胞濃縮方法はまた、対象となる活性遺伝子産物と特異的に相互作用する標識複合体による宿主細胞の標識化を伴うこともできる。標識複合体はまた、標識複合体の成分を互いに連結するか、または標識複合体を細胞構造に連結するか、またはビーズへのもしくは検出もしくは精製に有用な他の媒体への付着のために細胞表面へもしくは該細胞表面を越えて延在するための、ポリペプチドリンカーまたは他の化学リンカーも含み得る。宿主細胞の細胞質中に発現および保持される対象となる遺伝子産物については、標識化手順には、宿主細胞により産生される対象となる遺伝子産物が、それを産生した特定の宿主細胞と結合したままになるように、固定化と、標識複合体が対象となる遺伝子産物に接近できることとなるように、宿主細胞の透過化処理とを含んでもよい。

標識複合体。活性特異的な細胞濃縮方法で使用するために、標識複合体は、対象となる活性遺伝子産物に対する特異性と、検出可能部分の存在とを提供する成分を含み得る。検出可能部分は、選別装置により検出可能な光、電磁放射、および／または粒子を発生し、高性能宿主細胞の選択を可能にする。

活性遺伝子産物に対する標識複合体の特異性は、その遺伝子産物を標識するために、例えば抗体もしくは抗体断片を標識するための抗原、受容体もしくは受容体断片を標識するためのリガンド（活性受容体に対して特異的）、酵素を標識するための基質もしくは基質類似体分子、または活性遺伝子産物に対して特異的な抗体もしくは抗体断片などの活性遺伝子産物にのみ結合する結合パートナー（または「特異性成分」）を使用することにより確立され得る。一例として、対象となる遺伝子産物が抗体である場合、三つの別個の標識複合体を、独立にまたは任意の組み合わせで使用して、活性抗体遺伝子産物を検出することができる。すなわち、抗原結合ドメインに特異的に結合する標識された抗原、適切に折り畳まれたおよび／または組み立てられたＦｃ領域に特異的に結合する標識された抗Ｆｃ抗体、ならびに適切に折り畳まれたおよび／または組み立てられた軽鎖に特異的に結合する標識された抗軽鎖抗体である。追加の例として、遺伝子産物がポリリボヌクレオチドを含む場合、標識複合体の特異性は、標識化反応の条件下でポリリボヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドにより提供され得る。

標識複合体の検出可能部分は、発色団、蛍光団、および／またはルミノフォアを含んでもよく、それぞれの場合において、一定の条件下で光の吸光度、または光放射において検出可能な変化が生じる。適切な蛍光検出可能部分の例としては、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州ウォルサム）がある。標識複合体の検出可能部分はまた、標識された宿主細胞を選別するために使用する装置が放射性放出を検出および利用する能力を有する場合には、シンチレーションまたは直接のベータ線もしくはガンマ線の検出によって検出可能な放出を生成する放射性同位体を含むこともできる。検出可能部分のさらなるタイプは、重金属（例えば、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ルテニウム、銀、カドミウム、インジウム、スズ、ハフニウム、白金、金、水銀、タリウム、または鉛）の一つまたは複数の原子を含むことができ、これにより検出可能部分の存在または不在が質量分析計により検出できる。検出可能部分の別の例は、選別装置により検出され得る磁場と関連するものである。対象となる遺伝子産物が酵素である場合、検出可能部分は、酵素の活性部位に特異的に結合することとなる基質類似体に結合する蛍光分子を含み得る。別の例として、対象となる遺伝子産物が酵素であり、検出可能部分が酵素の基質と結合する場合、標識化宿主細胞を選別するために使用される装置は、検出可能部分により生じる、吸光度、蛍光または発光の以下の変化を検出するよう設定されてもよく、すなわち基質が酵素に置換されるときに検出可能部分からのシグナルが減少する場合における減少、または基質の酵素置換の結果として検出可能部分からのシグナルが検出可能になる場合における増加のいずれかである。特定の例として、発色酵素基質は、酵素の活性部位と特異的に相互作用するという点で、標識複合体として特異性を提供することができ、また対象となる酵素遺伝子産物との相互作用の結果として光の吸光度の検出可能な変化を生じるという点で、標識複合体の検出可能部分でもある。そのような発色酵素基質の一つは、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｓ－２２２２（商標）（Ｄｉａｐｈａｒｍａ社、オハイオ州ウェストチェスター）であり、これはセリンエンドペプチダーゼ因子Ｘａに結合してそれにより切断され、発色団パラ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）を活性化させる。

一部の場合では、標識複合体の特異性成分－抗原、リガンド、基質、基質類似体、抗体など－は、発色団または他のタイプの検出可能部分との複合体として市販されている。他の場合では、特異性成分は、ビオチンなどの共有結合した結合部分との複合体として市販されており、この複合体は、ストレプトアビジンなどの結合部分の結合パートナーに共有結合した検出可能部分に結合することができる。結合部分および検出可能部分を含む適切な複合体の例としては、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州ウォルサム）がある。そのような複合体が市販されていない場合、ビオチンなどの結合部分を、標識複合体の特異性成分にコンジュゲートさせることができる。使用され得る他の結合部分－結合パートナーのペアとしては、標識複合体のポリペプチド特異性成分への、ポリヒスチジンアミノ酸配列、一続きの６個以上のヒスチジン、好ましくは６～１０個のヒスチジン残基、の取込みと、それをニッケルまたはコバルトをコンジュゲートした検出可能部分に結合することとが挙げられる。結合部分－結合パートナーのペアの別の例としては、ＳｐｙＴａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペアがある。ＳｐｙＴａｇは、１２．３ｋＤａのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質によって結合される１３個のアミノ酸のペプチドであり、これは共有結合性の分子間イソペプチド結合を形成する。

追加の例として、特異性成分（例えば、ＨＥＲ２抗原）は、検出部分にコンジュゲートされる結合部分として抗体（例えば、抗－ＨＥＲ２二次抗体）により結合され得、当該抗体は、特異性成分と対象となる遺伝子産物との間の結合を干渉しない様式で特異性成分を特異的に認識する。この構成のさらなる変形体では、検出部分は、例えば鎖内の各抗体がその結合標的に特異的である限り、特異性成分などを特異的に認識する抗体を特異的に認識する抗体にコンジュゲートされ得る。

また、いくつかの「分割タンパク質」または「タンパク質断片相補」結合ペアも存在し、タンパク質の別個の発現ドメインが互いに対して親和性を有し、そしてドメイン同士が結合すると、分割タンパク質の活性が回復する。例えば、結合部分としてベータラクタマーゼ、ベータガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼの一つのドメインと、結合パートナーと同一のタンパク質の相補ドメインとを使用することで、その基質が存在する場合に検出可能なシグナルを生成することができる酵素を再構築することとなり、いくつかの特定の例では、当該基質は、一つまたは複数の結合ドメインを有する融合タンパク質の一部として提供され得る。別の例では、二分子蛍光相補（ＢｉＦＣ）と称される、「分割」タンパク質が、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質であり、これは、抗－平行ロイシンジッパーモチーフなどの相補的結合対のメンバーにリンカーによってそれぞれ結合されるタンパク質断片に分割され得るものである。ロイシンジッパーモチーフの相互作用を介して再結合する場合、蛍光タンパク質活性が回復し、これにより検出可能部分を生成する。

特定の標識化および検出にも使用できる方法の一つには、Ａｌｐｈａ（増幅発光近接均質アッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ））技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）があり、これは二つの結合パートナーの結合－例えば対象となる遺伝子産物と特異性成分－が、ドナービーズ（一方の結合パートナーに結合）およびアクセプタービーズ（もう一方の結合パートナーに結合）を近接させ、それにより一波長（６８０ｎｍ）でのドナービーズの励起が、アクセプタービーズへの化学エネルギー遷移および異なる波長（５２０～６２０ｎｍ）での放射をもたらすこととなる。この技術では、ドナービーズおよびアクセプタービーズが、近接させたときに検出可能部分を生成する。

固定。対象となる遺伝子産物は、溶液中に加えられる一つまたは複数のアルデヒド（パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド）などの架橋試薬で宿主細胞を固定することによって、宿主細胞内に保持することができる。一つまたは複数のアルデヒドを使用して宿主細胞内に対象となる遺伝子産物を固定することは、求電子試薬／求核試薬の化学の一例であり、ここでアルデヒドは求電子試薬であり、また対象となる遺伝子産物が、例えばポリペプチド内のアミン基およびポリヌクレオチドのグアニン残基のＮ７位などの求核中心を供給する。架橋試薬は、典型的には二官能性であり、一方の末端において対象となる遺伝子産物と、他方の末端において宿主細胞の成分（ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞骨格、細胞膜、細胞壁、またはこれらの成分のうちの一つに複合体化されたタンパク質）と反応することができる。多数の様々な種類の架橋試薬が市販されている（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州ウォルサム）。宿主細胞内に対象となる遺伝子産物を保持する別の方法は、対象となる遺伝子産物のコード配列内に、例えば細胞骨格成分または他の細胞質構造などの宿主細胞の構造と結合するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むことを伴う。例えば、特に原核宿主細胞において、細胞骨格ＭｒｅＢタンパク質またはその類似体のすべてまたは一部を、対象となる遺伝子産物に付着させることで、ＭｒｅＢとＭｒｅＣまたは類似体タンパク質との相互作用を介して、対象となる遺伝子産物を、内側細胞膜と結合するようにさせることができる。

透過化処理。宿主細胞は、リゾチームおよびＥＤＴＡを用いた処理、またはリゾチームおよび例えばオクチルグルコシドなどの界面活性剤を用いた処理により透過化処理され、リゾチームの浸透が促進される。

宿主細胞の核酸の標識化。宿主生細胞のＤＮＡおよび他の核酸を、非荷電色素（例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２など）で、または任意の電荷が分布する共役系を含有する色素で標識化することができ、これによりそれらが細胞に浸透することができるようになる。しかしながら、宿主生細胞は、細胞の外に色素を輸送し返すことができる。宿主細胞は、ＤＮＡ標識化合物が宿主細胞内に入り、かつ残ることを可能にするように固定および／または透過化処理され得る。固定された細胞においてＤＮＡを標識する化合物としては、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、７－アミノアクチノマイシン－Ｄ（７－ＡＡＤ）、および４’６’－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）が挙げられる。したがって、一部の例では、ＤＮＡ染色を利用して、集団内の生細胞を特定する。

ＩＩＩ．高性能宿主細胞の選択
標識された宿主細胞集団は、各標識された宿主細胞によって生成される放射（光、電磁放射など）を検出し、その細胞に対して検出された発光の量などの因子に基づいて各宿主細胞を選別することができる装置を使用して選別する。選別装置は、フローサイトメトリーまたはマイクロ流体細胞選別などの任意のタイプの細胞選別技術を利用することができ、これは、レーザー検出器の使用によって一度に一つずつ細胞を選別することができる。ＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）では、宿主細胞は、磁気粒子で標識され、親和性に基づく細胞選別では、宿主細胞は、例えば樹脂などの固体媒体との親和性による相互作用のために、細胞表面までまたは細胞表面を越えて延在する標識複合体で標識される。ＭＡＣＳおよび親和性による細胞選別の技術は、単一細胞を単離しないが、宿主細胞内の対象となる遺伝子産物への標識複合体の特異的結合のレベルに基づいて宿主細胞をグループ化することができる。

いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２００個の細胞を含む宿主細胞集団を選別することを含む。例えば、宿主細胞の集団は、少なくとも２００個の細胞、少なくとも５００個の細胞、少なくとも１０００個の細胞、少なくとも２０００個の細胞、少なくとも５０００個の細胞、少なくとも１０，０００個の細胞、少なくとも２０，０００個の細胞、少なくとも４０，０００個の細胞、少なくとも５０，０００個の細胞、少なくとも７５，０００個の細胞、少なくとも１００，０００個の細胞、少なくとも２００，０００個の細胞、少なくとも５００，０００個の細胞、またはそれ以上を含み得る。一実施例では、選別される宿主細胞の集団は、２００～４０，０００個の細胞を含む。しかしながら、当業者であれば、十分な時間と装置性能があれば、任意の数の細胞を選別することができ、選択された当該任意の数の細胞は、その後のステップに十分なＤＮＡを提供するということを理解するであろう。

一実施形態では、選別装置は、フローサイトメトリーを利用する。フローサイトメトリーは、細胞集団の分析のための強力な技術であり、単一細胞レベルで高速（毎秒１００，０００以上のイベント（細胞））で同時に複数のパラメータを測定する能力を有する。フローサイトメーターは、典型的には、（１）集団内の各個々の細胞を分離すること、（２）各細胞に一以上のレーザーを順次照射（または「インタロゲートする」）すること、および（３）その照射された細胞と関連する放射光を記録することによって動作する。所与の細胞と関連付けられた放射光に基づいて、細胞を、一度に一細胞ずつ、二つ以上の容器に選別する能力を備えたフローサイトメーターを、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）と呼ぶ。ＦＡＣＳ機器により、その後の分析のために、一または複数の特定の細胞型を複合体集団から単離することができる。適切なＦＡＣＳ機器の例としては、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）－ＩＩｕ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）がある。

ＦＡＣＳ機器では、例えば標識された宿主細胞などの細胞集団が、単一細胞ストリームを生成するノズルを通過するが、当該ストリームはその後、一度に一細胞ずつ、レーザー光源のセットを通過して流れる。蛍光団などの適切な検出可能部分で標識された宿主細胞は、励起または発光またはその両方により生じる別個の蛍光シグナルにより検出される。レーザーがインタロゲートされると、細胞は、二つの光学検出器により測定される光を散乱する。一方の検出器では、レーザーの経路に沿った散乱を測定する。このパラメータは、前方散乱（ＦＳＣ）と呼ばれる。前方散乱の測定により、サイズでの細胞の区別が可能になるが、これはＦＳＣ強度が細胞の直径に比例し、主に細胞の周辺の光回折に起因するためである。もう一方の検出器は、レーザーに対して９０度の角度で散乱を測定する。このパラメータは、側方散乱（ＳＳＣ）と呼ばれる。側方散乱測定は、細胞の内部の複雑性（「粒度」）に関する情報を提供する。レーザーと細胞内構造との間の相互作用により、光の屈折または反射が引き起こされる。各細胞について、ＦＡＣＳ機器は、ＦＳＣおよびＳＳＣのそれぞれを、幅（Ｗ）、高さ（Ｈ）、および曲線下の面積（Ａ）を有する曲線として視覚化できる「パルス」として測定する。合わせて測定する場合、各細胞ごとにＦＳＣおよびＳＳＣを測定することにより、不均一な集団内の細胞間のある程度の区別を可能にする。共通して測定される細胞のパラメータには、上述の細胞のサイズおよび粒度、ならびに標的タンパク質および／またはＤＮＡが検出可能に標識された場合の標的タンパク質存在量および／またはＤＮＡ含量が含まれる場合がある。

蛍光測定の比較のためのベンチマークを提供するために、対象となる遺伝子産物の発現レベル、好ましくは対象となる活性遺伝子産物のレベルについて特徴決定された対照宿主細胞株由来の標識宿主細胞を、ＦＡＣＳによってスキャンすることができる。対照宿主細胞株のＦＳＣおよび／またはＳＳＣは、ＦＡＣＳ装置の特定の設定で、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）用の特定の電圧で、測定することができる。対象となる遺伝子産物を発現する高度に遺伝的に多様な宿主細胞集団などである実験サンプルが、対照宿主細胞株に使用されたのと同じＦＡＣＳ装置設定を使用してＦＡＣＳによってスキャンされる場合、得られたＦＳＣおよび／またはＳＳＣの読取値を、対照宿主細胞株について得られた読取値と比較して、実験サンプルが、「ベンチマーク」である対照宿主細胞株よりも高性能の宿主細胞を産生する可能性が高いかどうかを調べることができる。一部の実施形態では、対照宿主細胞株は、例えば実験サンプル中の対象となる遺伝子産物を発現しない宿主細胞株などである陰性対照である。

ゲーティング。ゲーティングは、測定のために選択されたパラメータの範囲内に選択範囲を設定するプロセスであり、該選択範囲内において特徴を呈する細胞が選択され、選択されない細胞とは離して選別される。ゲーティングパラメータは、多くの場合、一つ、二つ、三つ、またはそれ以上の次元を有するＦＡＣＳプロット上の規定された領域として視覚化することができる。例えば、ゲーティングパラメータは、ＦＳＣ－Ｈとして測定された蛍光に対してＳＳＣ－Ｗとして測定された蛍光の二次元プロット上の規定された領域として視覚化されて、単一細胞からの蛍光と一致するＳＳＣ－Ｗ値の範囲において、その規定された領域内に該当する検出イベントを選択することができる。特定の実施例では、ゲーティングパラメータはまた、実質的に単一細胞のみからのシグナルを測定するために、凝集細胞または非細胞性破片を特定し、除去する。これにより、細胞の特定の遺伝的多様性に起因する実際の増加ではない、細胞「凝集」に起因する対象となる産物の発現の増加についての人為的結果が減少する。

ＩＶ．選択された宿主細胞および／または発現ベクターの分析
高性能宿主細胞として細胞選別することにより選択された宿主細胞、またはこれら宿主細胞により構成される発現構築物の特徴を決定するために、ＤＮＡを、選別された細胞から取得し、ＤＮＡシーケンシングによる分析または高性能宿主細胞の遺伝的特徴を有する宿主生細胞（以下を参照）の再構築に使用することができる。例えば、宿主細胞がプラスミド発現ベクターを含む場合、これらは選択した高性能宿主細胞から回収され、ＮＧＳにより配列決定され得る。ゲノムＤＮＡもまた、選択した宿主細胞から回収され、配列決定することができるが、プラスミド発現ベクターの回収から得られた結果と同等の結果を達成するためには、より大量のゲノムＤＮＡが必要となる場合がある。ＲＮＡもまた、選択された宿主細胞から回収され、ＤＮＡに逆転写され、その後、ＮＧＳにより分析され、および／または他の方法によって利用することができる。

ＮＧＳによる回収されたＤＮＡの分析は、遺伝的に多様な宿主細胞集団のどの遺伝的属性が、高性能宿主細胞の選択により濃縮されたかを示唆し得る。例えば、対象となる遺伝子産物と共発現し、対象となる活性遺伝子産物の発現レベルを増強する遺伝子産物は、共発現遺伝子産物の大規模なプールから特定することができる。別の例として、高性能宿主細胞から回収された核酸の分析により、標識複合体に結合し、かつ／または標識複合体に作用する能力の増加と関連する、対象となる遺伝子産物自体における任意の遺伝的変異を検出することができる。

ＦＡＣＳによって遺伝的に多様な宿主細胞集団に関して生成された蛍光プロットは、個々の宿主細胞がもつ、対象となる遺伝子産物を、好ましくは対象となる活性遺伝子産物を発現する能力を表すものであるが、複数の異なるセクターに分割することができる。一部の実施形態では、カットオフを使用して単一のセクターを選択し、最も高い蛍光放射である細胞が特定される。一部の実施例では、カットオフは、最も高い蛍光放射である細胞の０．０５％～５％、例えば、当該細胞の上位０．０５％～０．２％、０．１～０．５％、０．２５～０．７５％、０．５～１％、０．７５～１．５％、１％～２．５％、２％～４％、または３％～５％である。一実施例では、カットオフは、最も高い蛍光放射である細胞の０．５％である。しかしながら、当業者であれば、使用する細胞選別装置の性能およびタイプに応じて、より高いカットオフ値またはより低いカットオフ値を使用してもよいということを認識するであろう。カットオフは、スクリーニングのラウンド間および／もしくはプロジェクト間に均一性を提供するように、ならびに／または濃縮された宿主細胞集団における多様性の量を低減するように選択される。さらに、カットオフは選別する細胞の数に依存し得るので、例えばその後のステップのための十分なＤＮＡの単離を可能にするのに十分な数の細胞など、選択される細胞集団には十分な数の細胞が含まれる。したがって、非限定的な一実施例では、カットオフは、最も高い蛍光放射である細胞の０．５％であり、また選別する細胞の最小数は２００である。

宿主細胞をＦＡＣＳにより選別し、各セクターに対応する宿主細胞を収集する。次いで、ＮＧＳを使用して、様々なセクターの宿主細胞において、および宿主細胞の選別されていない遺伝的に多様な集団において発現構築物のヌクレオチド配列を決定してもよく、これが好ましくは、選別されていない集団および選別された各セクターにおける固有の配列の少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも５０倍の反復のカバレッジを提供する。

収集されたセクターからの各固有の配列の相対存在量は、選別されていない宿主細胞集団の相対存在量と比較される。選別された宿主細胞中の固有の配列の相対存在量を、選別されていない宿主細胞集団中のその配列の相対存在量で除算することにより計算される、相対存在量の倍率変化は、対象となる遺伝子産物の発現に対するその寄与の尺度として、各配列を順位付けするために使用される。高性能を呈するセクターにおいて濃縮し、また低性能を呈するセクターからは枯渇するヌクレオチド配列は、対象となる遺伝子産物の発現を改善する配列の最良の候補である。

特定のヌクレオチド配列（「対照ヌクレオチド配列」）を含む、特徴決定された対照株由来の宿主細胞を用いて宿主細胞集団を「固定（ｓｐｉｋｅ）」することも可能である。これら遺伝的に均質な対照宿主細胞は、ＦＡＣＳプロットの一つまたはいくつかのセクターに選別される可能性が高く、また対照宿主細胞により構成される対照ヌクレオチド配列のＮＧＳ解析は、これらの配列が、ＦＡＣＳプロットのいくつかのセクターから得た選別された宿主細胞における相対的存在量の最も高い倍率変化を有することを示すはずであり、これにより対照宿主細胞により実証される蛍光レベルが特定される。この任意の「固定」処置は、対照宿主細胞株の蛍光プロファイルに関する内部ベンチマークを提供し、これは対象となる遺伝子産物の発現について特徴決定されたものであり、これが遺伝的に多様な宿主細胞集団の蛍光レベルと対照宿主細胞の蛍光レベルとの比較を可能にする。

ＦＡＣＳなどの細胞選別方法によって選択された高性能宿主細胞、例えば発現の最高レベルを示す宿主細胞集団のうちの０．１％、１％、または１０％が、選択された宿主細胞集団により生成された蛍光または他の検出可能な特徴のさらなるＦＡＣＳスクリーニングによって特徴決定され、それにより細胞選別および選択手順が、所望の特性を有する宿主細胞に対して濃縮された宿主細胞の集団をもたらしたか否かを判断することができる。上述の生細胞または固定細胞を用いて、ＦＡＣＳ選別のさらなるラウンドを実施して、高性能宿主細胞の宿主細胞集団をさらに濃縮することができる。

宿主生細胞を使用してＦＡＣＳ選別を実施する場合、特に生細胞ＦＡＣＳ選別の複数のラウンドを用いる場合、選択された宿主生細胞集団は、典型的には、ＦＡＣＳ手順に従って培養される。選択された宿主細胞集団の組成物の培養中の変化を試験するために、比較的少量の宿主細胞（例えば、当該集団の５～１０％）を培養前に取り出し、ＮＧＳ分析のために保存する。宿主細胞の別のサンプル（例えば２０～５０％）を、上述のように、対照宿主細胞株と比較して選択された宿主細胞集団の性能を決定するなどの目的で、培養（例えば、一回の細胞分裂と一致する時間の間）後に取り出すことができる。

複数の細胞の塊を形成する可能性が低い生細胞を用いて高度に遺伝的に多様な宿主細胞集団をスクリーニングする方がより効果的であるため、生細胞を用いてＦＡＣＳスクリーニングの一回以上の初期ラウンドを実施することが有利であり得る。生細胞を用いたＦＡＣＳ選択の十分なラウンドが実施されると、対照宿主細胞の「固定された」量と比較してより高性能な特徴を有する選択細胞の割合が示すとおり、その後ＦＡＣＳは、固定および標識された宿主細胞を用いて実施され、対象となる活性遺伝子産物の産生のための所望の特性を有する宿主細胞をさらに濃縮することができる。

Ｖ．宿主細胞株の再構築
特定の実施例では、細胞選別により選択した固定宿主細胞内の発現構築物を採取し、ＮＧＳにより配列決定した。発現構築物内の各変異点における配列を定量化し、また選別していない集団と比較して、相対的存在量の最大の倍率変化で存在する配列が、選択した宿主細胞の高性能な特徴と相関しているとみなされる。しかしながら、ＮＧＳによる配列決定は、発現ベクター上の変異点間の連鎖を不明瞭にするため、例えば、２位で最も優勢な配列が、通常、１位および３位の特定の配列と結合するか否かを特定することは不可能である。発現ベクターの「高性能」ライブラリーは、各変異点において最も優勢な配列を含み、かつ発現ベクターのライブラリーを作成するように生成されて、特定の配列の組み合わせによって生成された相加特性または相乗特性を呈し得るものを含めて、優勢な配列の全ての組み合わせを含むことができる。次に、この「高性能」ライブラリーを、上述の大腸菌株５２１などの宿主細胞の親株に形質転換して、選択された高性能宿主細胞を反映する遺伝的特徴を有する宿主生細胞集団を「再構築」する。

遺伝的に多様な宿主細胞集団のＦＡＣＳスキャンを、上述のような「ベンチマーク」である対照宿主細胞株のＦＡＣＳスキャンと比較するが、遺伝的に多様な集団の性能（ＦＡＣＳによって測定される）が、対照宿主細胞株の性能よりも著しく高くない場合、上述のようにＮＧＳ配列データを使用して「高性能」ライブラリーを作成して、ＦＡＣＳスクリーニングのさらなるラウンドにおいて、ライブラリー内で最も高性能の遺伝子配列間の相加性または相乗性を試験することが有利であり得る。高性能宿主細胞の濃縮が実証された後、その性能がさらに改善できるかを判定するために、「高性能」ライブラリーの作成も行うことができる。

高性能として標識および選別された宿主細胞からプラスミド発現ベクターを回収することも可能である。次いで、回収されたプラスミドを使用して、親宿主細胞株を形質転換し、高性能宿主細胞集団を再構築することができる。

選択された高性能宿主細胞からのゲノムＤＮＡの分析はまた、所望の高性能に関連する遺伝的特徴についての情報を提供することができ、これら遺伝的特徴はその後、セクションＩの「宿主細胞集団の遺伝的多様性」に記載した方法を使用して、親宿主細胞株に再導入することができる。

ＶＩ．再構築した宿主細胞株のさらなる分析
選択された高性能宿主細胞を反映する遺伝的特徴を有する再構築された宿主細胞株は、対象となる遺伝子産物を発現する細胞集団に適用可能な任意の方法によって分析することができる。個々の宿主細胞に由来する遺伝的に均質なクローン性集団の性能を評価するために、ＦＡＣＳ選別によって、または宿主細胞をプレートアウトして個々のコロニーを選び取って培養することによって、再構築された宿主細胞集団から単一宿主細胞を最初に単離することは有用であり得る。

どの宿主細胞集団または培養物が、対象となる遺伝子産物の産生に関連する最高レベルの性能を呈するかを決定する方法には、ゲル電気泳動、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ－ＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、固相抽出・質量分析法（ＳＰＥ－ＭＳ）、およびＬＣ－ＭＳ（実施例１）による、対象となる単離された遺伝子産物を定量することが含まれ得る。

対象となる遺伝子産物を宿主細胞から単離する方法であって、その量および活性のさらなる評価のために対象となる遺伝子産物を得る目的のための当該方法は、例えば抗体の捕捉のためにプロテインＡによるまたはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州マールボロ）の固体培地を用いるものなどである、高処理のプレートベースの捕捉方法を含む。

ジスルフィド結合を含む対象となる遺伝子産物については、以下の実施例１に記載されるように、遺伝子産物内のこれらの結合の位置を質量分析により決定することができる。対象となる活性遺伝子産物の量を決定するアッセイには、抗原結合アッセイ、リガンド結合アッセイ、発色基質または発色基質類似体の切断などの酵素活性アッセイ、およびその活性形態に特異的な抗体による対象となる遺伝子産物の結合が含まれ得る。これらのタイプのアッセイはまた、フローサイトメトリーで使用される標識複合体に結合および／または作用するバリアントの能力の増加の結果として、宿主細胞濃縮プロセスで特定された対象となる遺伝子産物のバリアントを特徴決定するためにも使用され得る。

対象となる遺伝子産物の産生に関連する所望の高性能な特徴を呈する宿主細胞は、実施例２に記載されるように、より大きな発酵培養物中で増殖させ、対象となる遺伝子産物を大規模に産生する能力を実証することができる。

以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を説明するために提供する。これら実施例は、本開示を、記載される特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。

実施例１
ジスルフィド結合の特徴決定
ポリペプチド遺伝子産物中のジスルフィド結合の数および位置は、ポリペプチド遺伝子産物を非還元条件下で、例えばトリプシンなどのプロテアーゼで消化することと、得られたペプチド断片を、連続的な電子移動解離（ＥＴＤ）および衝突誘起解離（ＣＩＤ）のＭＳステップ（ＭＳ２、ＭＳ３）を組み合わせた質量分析法（ＭＳ）に供することとにより特定することができる（Ｎｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－５ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ”，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２ Ｊａｎ ６；２８７（２）：１５１０－１５１９；Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｎｏｖ ２２）。

共発現したタンパク質の消化。ジスルフィド結合の再配列を防止するために、遊離システイン残基がアルキル化により遮断される。すなわち、ポリペプチド遺伝子産物は、遮光状態で、アルキル化剤ヨードアセトアミド（５ｍＭ）と共に４Ｍの尿素を含む緩衝液中で振とうしながら２０℃で３０分間インキュベートし、次いでプレキャストゲルを使用して非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離する。あるいは、ポリペプチド遺伝子産物を、ヨードアセトアミドを含む電気泳動後、または対照なしで、当該ゲル中でインキュベートする。タンパク質のバンドを染色し、二重脱イオン水で脱染色し、切り取り、０．５ｍＬの５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中で、２０℃で３０分間振とうしながら、２回インキュベートする。タンパク質サンプルを、１００％アセトニトリル中で２分間脱水し、真空遠心分離により乾燥し、そして５０ｍＭの重炭酸アンモニウムおよび５ｍＭの塩化カルシウムを含有する緩衝液中で、氷上で１５分間、１０ｍｇ／ｍｌのトリプシンまたはキモトリプシンで再水和する。過剰な緩衝液を除去し、酵素を含まない同一の緩衝液０．０５ｍＬで置換し、その後、振とうしながら、トリプシンおよびキモトリプシンそれぞれに関して、３７℃または２０℃で１６時間インキュベーションする。消化は、３マイクロリットルの８８％のギ酸を加えることにより停止し、短時間ボルテックスにかけた後、上清を除去し、分析まで－２０℃で保存する。

質量分析によるジスルフィド結合の位置決定。ペプチドを、０．１％のギ酸を含有する移動相で２０マイクロリットル／分で、１ｍｍ×８ｍｍのトラップカラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州オーバーン）上に注入する。次いでトラップカートリッジを、５ｍｍのＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８固定相（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州サンタクララ）を含有する０．５ｍｍ×２５０ｍｍのカラムとインラインで配置し、そしてペプチドを、１１００シリーズキャピラリーＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、１０マイクロリットル／分で９０分間かけて２～３０％のアセトニトリル勾配で分離した。ペプチドは、ＥＴＤ源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いたＬＴＱ Ｖｅｌｏｓ線形イオントラップを使用して分析する。エレクトロスプレーイオン化は、キャプティブスプレー源（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．社）を使用して実施する。サーベイＭＳスキャンに続いて、７回のデータ依存的なスキャンが続くが、これはサーベイスキャンで最も強い強度のイオンに対するＣＩＤおよびＥＴＤ ＭＳ２スキャンと、その後のＥＴＤ ＭＳ２スキャン中の１番目から５番目に強い強度のイオンに対する５回のＭＳ３のＣＩＤスキャンとからなる。ＣＩＤスキャンでは、正規化された衝突エネルギーを３５とし、またＥＴＤスキャンでは、１００ミリ秒のアクティベーション時間を使用し、補足的なアクティベーションが有効化されている。ＭＳ２のＣＩＤおよびＥＴＤスキャンを開始するための最小信号は１０，０００であり、ＭＳ３のＣＩＤスキャンを開始するための最小信号は１０００であり、またすべてのＭＳ２およびＭＳ３スキャンの選択幅（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ）は３．０ｍ／ｚである。ソフトウェアのダイナミック排除機能は、繰り返し数１、排除リストサイズ１００、および排除持続時間３０秒で有効化される。ＥＴＤ ＭＳ２スキャンの収集に関して、特異的に架橋する種を標的とするインクルージョンリスト（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｌｉｓｔ）を使用する。ＭＳ２およびＭＳ３スキャン用の別個のデータファイルは、ＺＳＡ電荷状態分析を使用してＢｉｏｗｏｒｋｓ ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって作成される。ペプチド配列に対するＭＳ２およびＭＳ３スキャンの照合は、Ｓｅｑｕｅｓｔ（Ｖ２７、Ｒｅｖ １２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により実施する。分析は、酵素特異性はなしで、親イオンの質量誤差範囲を２．５、フラグメントの質量誤差範囲を１．０、および酸化メチオニン残基に対する可変質量を＋１６で実施する。次いで、最小ペプチドおよびタンパク質の確率として９５％および９９％を用いて、プログラムＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｖ３＿００＿０８、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、オレゴン州ポートランド）を使用して、結果を解析する。ＭＳ３の結果からのペプチドはスキャン数で選別され、またペプチドを含むシステインは、ＥＴＤのＭＳ２スキャンで観察された五つの最も強度の高いイオンから生じたＭＳ３スキャンの群から特定される。ジスルフィド結合種に関与するシステインペプチドの同一性は、サーベイスキャンとＥＴＤのＭＳ２スキャンとで観察された親イオン質量の手動による実験でさらに確認される。

実施例２
発酵
対象となる遺伝子産物の産生に関与する発酵プロセスは、（１）不連続（バッチ処理）の操作、（２）連続の操作、および（３）半連続（供給－バッチ）の操作のカテゴリのうちの一つに該当する操作モードを使用することができる。バッチ処理は、特定の反応期間にわたって培養される、処理の開始時点で滅菌培養培地（バッチ培地）に微生物を播種することにより特徴付けられる。培養中、細胞濃度、基質濃度（炭素源、栄養塩類、ビタミンなど）、および産物濃度が変化する。良好に混合することで、反応混合物の組成または温度に有意な局所的差がないことが確実になる。反応は非定常であり、増殖制限基質（概して炭素源）が消費されるまで細胞は増殖する。

連続の操作は、新鮮な培養培地（供給培地）が発酵槽に連続的に添加され、また使用済み培地および細胞が発酵槽から同じ速度で連続的に引き出されることを特徴とする。連続の操作では、増殖速度は培地添加の速度によって決定され、そして増殖収率は増殖制限基質（すなわち、炭素源）の濃度によって決定される。すべての反応変数および制御パラメータは、時間的に一定であり続け、従って、発酵槽内で時間が一定の状態が確立され、次いで一定の生産性および出力が続く。

半連続の操作は、バッチ操作および連続の操作の組み合わせとみなすことができる。発酵がバッチ処理として開始され、そして増殖制限基質が消費されると、グルコースおよびミネラルを含む連続供給培地が特定の様式で添加される（供給－バッチ）。言い換えれば、この操作は、バッチ培地および供給培地の両方を使用して、細胞の増殖および所望の遺伝子産物の効率的な産生を達成する。培養期間中、細胞が添加または取り出されることはなく、したがって、発酵槽は微生物が関与する限りバッチで動作する。本方法は、上述のものを含む様々な処理で利用することができるが、特定の利用は、供給－バッチの処理と併せて行われる。

上記の各処理において、代謝産物形成と、例えば培地ｐＨ、光学密度、色、および滴定酸度などのいくつかの他の変数との間の相関を利用することによって、細胞増殖および産物の蓄積を間接的にモニターすることができる。例えば、光学密度は、不溶性細胞粒子の蓄積の指標を提供し、また表示装置もしくはレコーダーに接続されたマイクロＯＤユニットを使用して稼働中に、またはサンプリングによってオフラインで、モニターすることができる。乾燥細胞重量を決定する手段として、６００ナノメートルでの光学密度の読取値（ＯＤ６００）を使用する。

高細胞密度の発酵は、概して、少なくとも＞３０ｇの細胞乾燥重量／リットル（ＯＤ_６００＞６０）の収量で得られ、また特定の実施形態では＞４０ｇの細胞乾燥重量／リットル（ＯＤ_６００＞８０）の収量で得られるそれら処理として記述される。すべての高細胞密度発酵プロセスは、濃縮された栄養培地を使用し、当該培地は「供給－バッチ」処理において段階的に計量されて発酵槽内に入る。濃縮された栄養供給培地は、供給中の発酵槽内容物の希釈を最小化するために、高細胞密度処理に必要とされる。供給－バッチ処理が必要とされるが、操作者が炭素源の供給を制御することができるためであり、これは細胞が高細胞密度を生成するのに十分高い炭素源の濃度に曝露されると、細胞が阻害性二生成物、酢酸イオンを非常に多く産生することとなり、その増殖が停止することとなるという理由で重要である（Ｍａｊｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄｏｍａｃｈ，“Ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｖｉｅｗ ｏｆ ａｃｅｔａｔｅ ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １９９０ Ｍａｒ ２５；３５（７）：７３２－７３８）。

酢酸およびその脱プロトン化イオンである酢酸イオンは共に、バイオリアクターでの大規模なタンパク質産生における細菌増殖の主な阻害性副生成物の一つを意味する。ｐＨ７では、酢酸イオンが酢酸の最もよく見られる形態である。炭素エネルギー源の量が細菌の処理能力を大幅に上回る場合、任意の過剰な炭素エネルギー源が酢酸に変換され得る。トリカルボン酸回路および／または電子伝達系の飽和が、酢酸蓄積の最も可能性の高い原因である。増殖培地の選択は、酢酸阻害のレベルに影響を与える可能性があり、規定された培地中で増殖した細胞は、複合培地中で増殖したものよりも酢酸の影響を受け得る。グルコースをグリセリンで置換することもまた、生じる酢酸の量を大幅に減少させ得る。グリセリンは、細胞へのその輸送速度がグルコースの速度よりもはるかに遅いため、グルコースよりも酢酸の生成が少ないと考えられる。しかしながら、グリセリンはグルコースよりも高価であり、また細菌の増殖をより遅くさせる可能性がある。増殖温度を低下させることで、炭素源取り込みの速度および増殖速度が低下し、それにより酢酸の生成を減少させることもできる。細菌は、過剰な炭素エネルギー源の存在下または急速な増殖の間だけでなく、嫌気性条件下でも酢酸を生じる。大腸菌などの細菌があまりにも速く増殖できる場合、バイオリアクターシステムの酸素送達能力を超えて、それが嫌気性増殖の条件を招く可能性がある。これを防ぐために、栄養制限を通して、より遅い一定の増殖速度を維持してもよい。酢酸の蓄積を低減するための他の方法には、酢酸の生成を防止するための遺伝子改変、酢酸利用遺伝子の添加、および酢酸が軽減される株の選択が含まれる。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、酢酸の生成がより低レベルであることがわかっている株の一つであるが、これは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）がそのグリオキシル酸シャント経路内で酢酸を使用できるためである。

対象となる遺伝子産物の産生には、より大規模な供給－バッチ発酵槽が利用可能である。より大きな発酵槽は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００～１００，０００リットルの容量（すなわち、作業容量）を有し、ヘッドスペースに十分なスペースを残している。これらの発酵槽は、酸素および栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配するために、攪拌器インペラまたは他の適切な手段を使用する。小規模発酵とは、概して、容積が約１００リットル以下、一部の特定の実施形態では約１０リットル以下である、発酵槽での発酵を指す。

対象となる遺伝子産物を産生するために使用される発酵処理の標準的な反応条件には、概して、例えば大腸菌などの微生物宿主細胞では、約５．０～８．０のｐＨおよび２０～５０℃の範囲の培養温度を維持することを伴う。一実施形態では、宿主系として大腸菌を利用するが、発酵は約７．０である最適ｐＨおよび約３０℃である最適培養温度で実施する。

これら発酵プロセスにおける標準的な栄養素培地成分は、概して、エネルギー、炭素、窒素、リン、マグネシウム、および微量の鉄およびカルシウムの源を含む。さらに培地は、増殖因子（ビタミンおよびアミノ酸など）、無機塩、および産物形成に必要不可欠な任意の他の前駆体を含有してもよい。培地は、例えばアルファ－グリセロリン酸および／またはベータ－グリセロリン酸などのグリセロリン酸などである輸送可能な有機リン酸を、より具体的な例として、グリセロール－２－リン酸および／またはグリセロール－３－リン酸を、含有してもよい。培養される宿主細胞の成分組成を使用して、細胞増殖をサポートするために必要な各成分の割合を計算することができる。成分濃度は、処理が低細胞密度の処理か高細胞密度の処理かのいずれかによって変動することとなる。例えば、低細胞密度バッチ発酵処理におけるグルコース濃度は、１～５ｇ／Ｌの範囲であり、一方で高細胞密度バッチ処理では、４５ｇ／Ｌ～７５ｇ／Ｌの範囲のグルコース濃度が使用される。さらに増殖培地は、例えばベタイン、ジメチルスルホニオプロピオン酸および／またはコリンなどの保護的なオスモライトを、中程度の濃度（例えば０．１～５ｍＭ、または０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、または２ｍＭの範囲で）で含有してもよい。

一つまたは複数の誘導物質を増殖培地に導入して、対象となる遺伝子産物の発現を誘導することができる。誘導は、例えば指数関数的な増殖期の終わりに向かっているが培養が最大細胞密度に到達する前などの指数関数的な増殖期の間に、または発酵中の早期の時点もしくは後期時点に開始され得る。リン酸などの栄養素の枯渇によって誘導可能な一つまたは複数のプロモーターから対象となる遺伝子産物を発現する場合は、誘導は、その栄養素が増殖培地から十分に枯渇したときに、外因性誘導物質を添加することなく、生じることとなる。

宿主細胞の指数関数的な増殖の間、代謝速度は、酸素および炭素／エネルギー源の有効性に正比例し、したがって、有効な酸素または炭素／エネルギー源のレベルまたはその両方を減少させることで、代謝速度が低下することとなる。例えば攪拌速度または背圧、またはＯ_２圧力の低減などの発酵槽の動作パラメータの操作により、有効な酸素レベルを調節し、また宿主細胞の代謝速度を低下させることができる。炭素／エネルギー源の濃度または送達速度またはその両方を低減することで、同様の効果がある。さらに、発現系の性質に応じて、発現の誘導が、宿主細胞代謝速度の低下を招く可能性がある。最後に、最大細胞密度に達すると、増殖速度は劇的に停止または低下する。宿主細胞の代謝速度の低下が、タンパク質のフォールディングおよびアセンブリのプロセスをはじめとする対象となる遺伝子産物のより制御された発現をもたらし得る。宿主細胞代謝速度は、細胞増殖速度であって、特異的増殖速度または瞬時増殖速度のいずれかを測定することによって（例えばＯＤ６００などの光学密度（ＯＤ）を測定することによって、および／または任意でＯＤをバイオマスに変換することによって）評価することができる。各アッセイ点における概算のバイオマス（細胞乾燥重量）は以下のとおり計算する。すなわち、概算のバイオマス（ｇ）＝（ＯＤ_６００÷２）×体積（Ｌ）。望ましい増殖速度は、特定の実施形態では、０．０１～０．７の範囲内に、または０．０５～０．３の範囲内にあり、または０．１～０．２の範囲内にあり、またはおよそ０．１５（０．１５プラスまたはマイナス１０％）であり、または０．１５である。

発酵装置。以下は、宿主細胞を増殖させるために使用できる装置の例であり、発酵システムの多数の他の構成が市販されている。宿主細胞は、２Ｘ ＲｕｓｈｔｏｎインペラおよびＢｉｏＦｌｏ／ＣｅｌｌｉＧｅｎ １１５発酵槽／バイオリアクタコントローラを備えた１Ｌ容器サイズの、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ／ＣｅｌｌｉＧｅｎ １１５水ジャケット式発酵槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州ホーポージ）で増殖させることができ、温度、ｐＨ、および溶存酸素（ＤＯ）がモニターされる。また、四つの６０～２５０ｍｌのＤＡＳｂｏｘ発酵容器を含む４倍で構成可能なＤＡＳＧＩＰシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ社、ニューヨーク州ホーポージ）で宿主細胞を増殖させることも可能であり、各容器には２Ｘ Ｒｕｓｈｔｏｎインペラ、ＤＡＳｂｏｘ排気コンデンサ、およびＤＡＳｂｏｘ供給・モニターモジュール（温度センサ、ｐＨ／酸化還元センサ、および溶存酸素センサを含む）が含まれる。適切な発酵装置には、ＮＬＦ ２２ ３０Ｌ実験室発酵槽（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州サマービル）であって、ステンレス鋼容器中に３０－Ｌ容量および２０－Ｌ最大作業容量、二つのＲｕｓｈｔｏｎインペラ、空気のみでのスパージ、およびｐＨ、ＤＯ、排気Ｏ_２、排気ＣＯ_２、温度、および圧力を含むすべての関連パラメータの追跡および制御を可能にするＢｉｏＳＣＡＤＡソフトウェアを実行する制御システムを有する、当該発酵槽も含まれる。

実施例３
ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現する宿主細胞の活性特異的濃縮
ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂは、ＨＥＲ２－結合モノクローナル抗体トラスツズマブの抗原結合断片である。ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖（「ＨＣ」）およびＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ軽鎖（「ＬＣ」）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号３で表す。この実施例では、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの重鎖および軽鎖は、発現構築物であって、アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤ（「ａｒａ」）プロモーターおよびプロピオン酸誘導性ｐｒｐＢＣＤＥ（「ｐｒｐ」）プロモーターを含む二重プロモーター発現ベクターから、共発現された。二重プロモーター発現ベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１で表す。以下の活性特異的細胞濃縮手順では、宿主細胞は、上記したセクションＩで示す遺伝子型を有する大腸菌５２１細胞であった。

選択および活性特異的濃縮のために宿主細胞集団を作製するため、大腸菌５２１細胞を、以下の表１に記載するように、任意の追加のポリヌクレオチド配列を挿入しないか（「ｅｍｐｔｙ（空）」、表１のサンプルＡ１）またはＴＲＡＳＴ－Ｆａｂをコードするものをはじめとする様々なポリヌクレオチド配列を含むかいずれかである二重プロモーター発現ベクター（配列番号１）で形質転換した。追加的な遺伝子産物をｐｒｐプロモーターから発現させるために、特定のサンプルでは、ＴＲＡＳＴ－ＦａｂのＨＣおよびＬＣを、ＨＣ－ＬＣ配置またはＬＣ－ＨＣ配置のいずれかで、ａｒａプロモーターからバイシストロニックな配置で発現させた。これらのサンプルの一部において、ｐｒｐプロモーターは、ジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質ＤｓｂＣの形態をコードするポリヌクレオチドを発現したが、これは見かけ上シグナルペプチドを欠いており、したがって細胞質に局在しているものであり、これを「ｃＤｓｂＣ」（配列番号４）と称することとする。配列番号７および配列番号８であるＴＲＡＳＴ－ＦａｂのＨＣポリペプチドおよびＬＣポリペプチドは、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｈｙｓｔｉｓ ｓｐ．）由来のＮ末端アミノ酸配列ＤｎａＢを有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ５５４１８）。このＤｎａＢに関連するアミノ酸配列は、６ｘＨｉｓ配列を含むと配列番号９として表す。

サンプルＡ１～Ａ４は、本手順のための対照サンプルであり、Ａ１は、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ遺伝子産物を発現しない陰性対照宿主細胞集団であり、またＡ２～Ａ４は、発現ベクターの単一形態から各々、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現する対照宿主細胞集団である。サンプルＢ１～Ｂ４およびＣ１～Ｃ４では、宿主細胞集団は、ｐｒｐプロモーターから発現された１３７種類の異なる遺伝子産物を有する発現ベクターの多様な形態を含んだ。サンプルＢ１～Ｂ６およびＣ１～Ｃ４では、宿主細胞によって構成される発現ベクターはさらに、集団内の発現ベクターの様々な形態の合計数を１２，７６９、１９，７２８、または１，７４９，３５３に増加させる変異源を有していた。

発現ベクターを用いた形質転換後、宿主細胞サンプルを、カナマイシン（５０マイクログラム／ｍＬ）を含有する固体培地上に播種し、カナマイシン抵抗性の遺伝子を担持する発現ベクターを備えた良好な形質転換体を選択した。３７℃で一晩増殖させた後、宿主細胞コロニーを、固体培地から掻き取りＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、および１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に入れ、また６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）を、ＬＢ培地で希釈することにより３に調整した。宿主細胞集団を、誘導培地（８ｍＭのＭｇＳＯ４、１×Ｋｏｒｚ微量金属、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシン、および以下に説明される誘導物質を有する発酵産生培地）中で、発現ベクター上に存在するＴＲＡＳＴ－ＦａｂのＨＣおよびＬＣ、ならびに任意の他の遺伝子産物の発現のために誘導した。

発酵産生培地は、ＫＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、酵母抽出物、グリセリン、クエン酸、および１×Ｋｏｒｚ微量金属を含み、ＮＨ４ＯＨでｐＨ６．８に導いた。

サンプルＡ１、Ａ３、Ａ４、およびＢ１～Ｂ６は、１ｍＭのプロピオン酸および２５０マイクロモルのアラビノースを含有する培地中で誘導し、サンプルＡ２およびＣ１～Ｃ４は、２０ｍＭのプロピオン酸および２５０マイクロモルのアラビノースを含有する培地中で誘導した。

各宿主細胞集団（上記したＯＤ６００を３とした）のうち二つの複製を、Ａｅｒａｓｅａｌ（商標）プレートカバー（Ｅｘｃｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州ヴィクタービル）で覆われた２４ウェルのディープウェルプレート中の誘導培地に入れ、インキュベートし、次いで各サンプルのＯＤ６００を決定した。各サンプル中の残りの宿主細胞培養物は、さらなる分析のために、遠心分離し、続いて上清を吸引して回収し、ペレットとして保存した。

その後、サンプルを固定して標識化した。宿主細胞は、各サンプルに０．５ｍＬの冷却した固定溶液（脱イオン水中の０．６５％パラホルムアルデヒド、０．０２％グルタルアルデヒド、および３２．２５ｍＭのリン酸三ナトリウム）を添加することにより固定し、そしてペレットを再懸濁し、インキュベートし、遠心分離して、吸引により上清を除去した。０．２ｍＬの体積の透過化緩衝液（５０ｍＭのグルコース、２０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．２、および脱イオン水中の緩衝液１０ｍＬ当たり１単位のリゾチーム）を洗浄したペレットそれぞれに添加し、そしてサンプルを氷上でインキュベートした。透過化緩衝液中でのインキュベーション後、サンプルを冷却しながら遠心分離し、そして上清を吸引により除去した。透過化処理した宿主細胞ペレットを、０．５ｍＬの１Ｘイムノアッセイ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１％カゼイン、１ｍｇ／ｍＬのＤｅｘｔｒａｎ－５００、０．５％トリトンＸ－１００および０．０５％のＰｒｏｃｌｉｎ－３００、および１ｍＭのＥＤＴＡ）を混合することなくペレットに添加することにより固定し、サンプルを遠心分離し、そして吸引により上清を除去した。

透過化および固定した宿主細胞内のＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを標識するために、ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ抗体断片に特異的に結合されるものであるＨＥＲ２抗原が、蛍光標識ストレプトアビジンの存在下でビオチンに最初にコンジュゲートし、ＨＥＲ２－ビオチン－ストレプトアビジン－蛍光団の複合体を調製した。１０マイクロモルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）および１．７５マイクロモルのＨＥＲ２（約１：２０ｖ／ｖ）の混合物を、１ｍＭのＥＤＴＡを含むイムノアッセイ緩衝液（上記を参照）を添加することにより、１０ｍＬまで調製した。この溶液を含有するチューブを、回転ミキサー上で４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ビオチンをＨＥＲ２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ストレプトアビジン溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのビオチン最終濃度）に添加し、インキュベートした。

宿主細胞サンプルを、各サンプルにＨＥＲ２－ビオチン－ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８溶液を添加することにより標識し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離して、吸引により上清を除去した。宿主細胞ペレットを、ＦＡＣＳ選択手順のために０．５ｍＬの１×ＰＢＳ ｐＨ８中に再懸濁した。

ＦＡＣＳ機器、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）－ＩＩｕ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を、サンプル中の標識した宿主細胞の選別に使用した。ヨウ化プロピジウム（１ｍｇ／ｍＬ）を各０．５ｍＬサンプルに添加し、宿主細胞中に存在するＤＮＡを染色した。サンプル中の宿主細胞を固定して、透過化処理したため、ヨウ化プロピジウムは宿主細胞に侵入し、細胞のＤＮＡに接近することができた。表１に示す宿主細胞サンプルＡ１～Ａ４、Ｂ１～Ｂ６およびＣ１～Ｃ４は、選別なしで、実験中に使用される光電子増倍管（ＰＭＴ）用に電圧をセットアップするようにＦＡＣＳ機器にかけた。宿主細胞サンプルをＦＡＣＳ機器を通して実行し、各Ａ１～Ａ４対照サンプルに対して５０，０００イベント、およびＢ１～Ｂ６サンプルおよびＣ１～Ｃ４サンプルのそれぞれに対して１００万イベントを記録し、Ａ４を除いて各サンプルに対してデュプリケートで実行を行った。サンプルから生成された実験データに基づいて、標識された宿主細胞の選別を行うこととなるパラメータを決定したＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．社、ニュージャージー州フランクリンレイク）を使用して、選別ゲートをセットアップした。

第一のゲーティング基準は、ＦＳＣ－Ａ（細胞サイズの指標としての総細胞蛍光）に対するＳＳＣ－Ａ（総細胞粒度）としてプロットされた、６７５／２０ｎｍ波長フィルターを使用するＤＮＡ蛍光検出を基準とした。この実験で使用される固定および標識された大腸菌宿主細胞については、サイズおよび粒度の増加は、複数の細胞の凝集から生じる可能性が高い。この初期ゲート（「Ｐ２」）は、インタロゲートされた検出イベントのうち９９．９％以上を保持するように、また予想されるＳＳＣ－ＡからＦＳＣ－Ａへの分布と比較した場合に極端な外れ値であったイベントのみを除外するように、設定された。第二のゲートもまた、ＦＳＣ－Ｈに対するＳＳＣ－Ｗとしてプロットされた、６７５／２０のＤＮＡ蛍光を基準としており、選択されたイベントは、複数の細胞の凝集を除去するためにＳＳＣ－Ｗ値３８，０００～６３，０００の間の値－単一細胞に期待される範囲－であり、かつ２０以上のＦＳＣ－Ｈ値をもつイベントに設定された。第二のゲートは、サンプルに応じて、約３０％～５０％の検出イベントの保持をもたらした。

最終選別ゲートは、ＦＳＣ－Ａとして測定された、ＨＥＲ２－標識ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂタンパク質またはＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの５３０／３０蛍光に対してプロットされ、ＦＳＣ－Ａとして測定された、６７５／２０のＤＮＡ蛍光の比較を基準とした。図２に示すように、「低ＤＮＡ」ゲートが複雑な境界を伴って生成された。このゲートは、より少量のＤＮＡ蛍光、およびより多量のＨＥＲ２－標識Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光に関連する検出イベントを選択し、ＴＲＡＳＴ－ＦａｂまたはＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂのより多量の産生を伴う個々の細胞が選択される。この「低ＤＮＡ」ゲートを、対照サンプルＡ１～Ａ４に対して記録された５０，０００のイベントに適用した場合、Ａ１の「空ベクター」対照サンプルに関してこのゲートで選択されたイベントはゼロであり、Ａ４対照サンプルに関しては１イベント、およびサンプルＡ２およびＡ３に関してはそれぞれ２４３４イベントおよび１４７１イベント（二回のランの平均）であった。Ｂ１～Ｂ６サンプルおよびＣ１～Ｃ４サンプルについて記録された１００万のイベントへの「低ＤＮＡ」ゲートの適用により、結果として、各サンプルについて平均で８２～６６２のイベントが選択された。

細胞選別操作を開始する前に、ＥＤＴＡを含まない５０マイクロリットルの１Ｘイムノアッセイ緩衝液（上記を参照）を採取チューブに入れた。細胞選別を、サンプルＢ１～Ｂ６およびサンプルＣ１～Ｃ４に対して実施し、２７０万～１０９０万イベントが記録され、サンプル当たり１０００イベントが収集された。

高レベルのＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現を呈する宿主細胞を含むＦＡＣＳ選別サンプルは、製造業者の説明書に従ってＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社、オランダ国フェンロー）を使用して、選択された細胞集団からプラスミドＤＮＡを単離することによるさらなる分析のため、宿主細胞を再構築するため（下記）および高処理の次世代ＤＮＡシーケンシング（「ＮＧＳ」）のために調製された。またＮＧＳ分析のために調製されたのは、対応する選別前のサンプルであった。ＮＧＳ用のＤＮＡサンプルを、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘビーズ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ）との混合物により調製した。次に、「タグ付き（ｔａｇｍｅｎｔｅｄ）」ＤＮＡサンプルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅して、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ）にかけた。

対応する選別後サンプルと比較すると、図３に示すように、ＦＡＣＳ選別でより高いＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現として選択された宿主細胞集団が、特定の発現ベクターポリヌクレオチド成分の存在に関しておよびｐｒｐプロモーターからＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂと共発現された一定の遺伝子産物に関して濃縮されるとしてＮＧＳにより確認された。

高発現宿主細胞から回収されたプラスミドＤＮＡを使用して、親宿主細胞株である大腸菌５２１細胞を形質転換し、ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの高レベルの発現を誘導する発現ベクターに関して濃縮された宿主細胞集団を再構築した。

上記の表１のサンプルＢ１～Ｂ６およびサンプルＣ１～Ｃ４から選択される宿主細胞に対応する、再構築された宿主細胞集団を、それらがＦＡＣＳで選択された宿主細胞から再構築されたことを示すようにＢ１＊～Ｂ６＊およびＣ１＊～Ｃ４＊と呼んだ。これらのＢ１＊～Ｂ６＊およびＣ１＊～Ｃ４＊宿主細胞集団、ならびに表１に記載される以前に選別されていない宿主細胞集団Ｂ１～Ｂ６およびＣ１～Ｃ４は、２２時間にわたる誘導培地でのインキュベーションによって増殖され、誘導され、回収され、標識され、また上述のようにゲーティングされたＦＡＣＳスクリーンにより分析された。図４に示すように、ＦＡＣＳ選別から生じたＢ１＊～Ｂ６＊およびＣ１＊～Ｃ４＊の宿主細胞集団は、より高いレベルでＴＲＡＳＴ－Ｆａｂを発現する宿主細胞に関して有意に濃縮された。

ＦＡＣＳで選択された宿主細胞集団Ｂ１＊～Ｂ４＊を、上記の実施例１Ｅに記載されるように再構築した。すなわち、各サンプルから回収されたプラスミドを、大腸菌５２１親宿主細胞株に形質転換し、５０マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを含有する固体培地上に播種した。宿主細胞の個々のコロニーを選び取り、各９６ウェルプレートに、Ｂ１＊を８８ウェル、Ｂ２＊を１６３ウェル、Ｂ３＊を８８ウェル、またＢ４＊を１８９ウェルに入れ、個々の細胞に由来する宿主細胞培養物によるＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの発現を決定するようにした。対照宿主細胞Ａ３およびＡ４（表１を参照）も、各９６ウェルプレート上の複数のウェルに含まれた。これら宿主細胞サンプルを増殖させ、概して実施例１Ａに記載される手順を使用して、誘導培地中でのインキュベーションによりＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現を誘導した。アリコートされたこれらサンプルのＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ発現レベルをＳＰＥ－ＭＳにより決定する目的で、各誘導宿主細胞培養液から所定の体積（２００マイクロリットル）を新しい９６ウェルプレートに取り出した。

回収した宿主細胞サンプル（Ａ３、Ａ４、およびＢ１＊～Ｂ４＊）を溶解し、サンプルを遠心分離した。各サンプルを消化緩衝液（８Ｍの尿素、２００ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．００、１：１ｖ／ｖ）に移し、次いでタンパク質のアンフォールディングを助けるために加熱した。加熱後、トリプシン／ｌｙｓＣプロテアーゼ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を各ウェルに添加した。次いで、サンプルをインキュベートした。インキュベーション後、サンプルにギ酸を添加してクエンチした。

次いで、サンプルＡ３、Ａ４、およびＢ１＊～Ｂ４＊由来の宿主細胞タンパク質の消化およびクエンチされたサンプルを、ペプチド多重反応モニタリング（ＭＲＭ）検出のためにＳＰＥ－ＭＳに供した。ＭＲＭは、サンプルのうちＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂポリペプチドからの三つのペプチド、すなわち重鎖（ＨＣ）からのペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号２のアミノ酸１２６～１３７）、軽鎖（ＬＣ）からのペプチドＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ（配列番号３のアミノ酸１７１～１８４）、およびＤｎａＢ関連Ｎ末端アミノ酸配列からのペプチドＥＨＩＡＬＰＲ（配列番号９のアミノ酸９２～９８）をモニターするようにセットアップされた。これらペプチドは、最適な脱クラスター電位および衝突エネルギーをもたらすように選択された。これら基準に基づき、以下の表２に示すように、ペプチド当たり二つのトランジションをモニタリングした。

ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ標準は、当該標準を「ｅｍｐｔｙ（空）」（発現ベクターなし）の宿主細胞から調製された細胞溶解産物で希釈することにより調製した連続希釈サンプルで消化した。本手順により生成した標準曲線を、インタロゲートしたすべてのサンプルの定量に使用した。

候補宿主細胞集団は、表１に示されるＡ３対照サンプルと比較して、ＨＣおよびＬＣの両方を高量（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００）で発現すること、ならびに対照サンプルＡ３よりも高い総タンパク質産生量に相当する、少なくとも２．５倍高いレベルのＤｎａＢインテインを呈することに基づいて選択された（図５を参照）。以下に詳述するように、プロテインＡによる精製および機能的ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの抗原結合アッセイによるさらなる分析のために、サンプルＢ１＊＿Ｇ５、Ｂ１＊＿Ｈ１１、Ｂ１＊＿Ｈ６、Ｂ２＊＿Ａ１０、およびＢ４＊＿Ｈ１１を選択した。

サンプルＢ１＊＿Ｇ５、Ｂ１＊＿Ｈ１１、Ｂ１＊＿Ｈ６、Ｂ２＊＿Ａ１０、およびＢ４＊＿Ｈ１１からの宿主細胞、ならびに対照サンプルＡ３を、概して実施例１Ａに記載されるように２０ｍＬの振とうフラスコ培養液中で増殖させ、各培養液のＯＤ６００を測定し、次いでそれらを遠心分離して、宿主細胞のペレットを形成した。宿主細胞を溶解し、そして氷上で３０分間インキュベーションした。宿主細胞溶解産物を遠心分離して、上清を濾過した。濾過した細胞溶解産物は、プロテインＡがＦａｂ重鎖に結合することによる、サンプルからの宿主細胞溶解産物中のＴＲＡＳＴ－ＦａｂまたはＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂ重鎖／軽鎖ヘテロ二量体（総称してＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体）のプロテインＡによる精製のために、ＡＫＴＡ（商標）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）１ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州マールボロ）にロードした。ＡＫＴＡ（商標）デバイスで、２８０ｎｍでの溶出画分の吸光度を測定し、各サンプルの結果を統合して、溶出ピーク中に存在するタンパク質の総量を求めた。さらに、ＨＰ－ＬＣを使用して、ヘテロ二量体の予測される質量に対応する２８０ｎｍにおける吸光度のピークに基づいて、溶出画分中に存在するＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の量を定量した。以下の表３に結果を示すが、タンパク質の量は、誘導宿主細胞培養の体積および細胞密度（ＯＤ６００）の観点で表現する。この分析から、Ｂ４＊＿Ｈ１１サンプルが、対照Ａ３サンプルの約１．５倍の量の総タンパク質およびＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体を一貫して産生したことが分かる。

サンプルＢ１＊＿Ｇ５、Ｂ１＊＿Ｈ１１、Ｂ１＊＿Ｈ６、Ｂ２＊＿Ａ１０、およびＢ４＊＿Ｈ１１により産生される活性ＤｎａＢ－ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの量ならびに対照サンプルＡ３による活性ＴＲＡＳＴ－Ｆａｂの量は、抗原結合活性を有するＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体の存在を特異的に測定する抗原結合アッセイにより評価した。このアッセイにより、サンプルＢ２＊＿Ａ１０およびＢ４＊＿Ｈ１１が、それぞれ対照Ａ３サンプルの約１．５倍の量のＴＲＡＳＴ－Ｆａｂヘテロ二量体を産生することが示された。

高発現ベクターの濃縮レベルを評価した。ＡＣＥアッセイを使用して、未感作ライブラリーを固定し、透過化処理し、そしてＨＥＲ２でプローブして、トラスツズマブＦａｂ’の産生を検出した。標的産生細胞のうち、上位＜０．５％をＡＣＥアッセイを介して選別した。その後、ベクタープラスミドを単離し、細胞に再形質転換して発現を評価した。同じ選別ゲートを適用すると、再変換後に、高発現ベクターに対して、＞１０倍の濃縮が実証される（図６）。ＡＣＥアッセイ後のトラスツズマブＦａｂ’の産生の完全な増加を評価するために、陰性対照サンプルおよび陽性対照サンプルによりゲーティングを確立した。未感作ライブラリーは、典型的には低レベルの発現であり、これはＡＣＥアッセイ後に大幅に増加した（図７Ａ～７Ｂ）。

本開示を実践する際、分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術における多数の従来の技術が使用されてもよい。こうした従来の技術は、ベクター、宿主細胞、および組み換え法に関する。これら技術は周知であり、例えばＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２００６）において説明される。例えば、細胞の単離および培養、ならびにその後の核酸またはタンパク質の単離のための他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびそこで引用される文献；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｅｄｓ．）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－ Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；および、Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（Ｅｄｓ．）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。核酸の操作および作製に有用な、核酸を作製する方法（例えば、インビトロ増幅、細胞からの精製、または化学合成による）、核酸を操作する方法（例えば、部位特異的変異誘発、制限酵素での消化、ライゲーションなどによる）、ならびに様々なベクター、細胞株、などが、上記の参考文献に記載されている。さらに、本質的に任意のポリヌクレオチド（標識した、またはビオチン化したポリヌクレオチドを含む）は、様々な商業的な供給源のいずれかから注文されたカスタムまたは標準であってもよい。

本発明は、本発明の実施のための特定の様式を含むことが見出された、または提案された特定の実施形態に関して説明されている。当業者であれば、本開示に照らして、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態において、数多くの変形および変更を行うことができることを理解するであろう。

特許刊行物を含む引用されたすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。公開されたゲノム位置または他の記載によって言及されるヌクレオチドおよび他の遺伝子配列もまた、参照により本明細書に明示的に援用される。

Claims (37)

1. 少なくとも１０００の遺伝的多様性を有する宿主細胞の集団から宿主細胞を選択するための方法であって、前記宿主細胞の少なくとも一部が、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、当該方法は、
   前記宿主細胞の集団を培養することであって、それにより前記対象となる遺伝子産物が、前記集団の宿主細胞の亜集団によって発現され、それによって前記亜集団が発現された宿主細胞含むものである、培養することと、
   前記亜集団の当該発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することであって、前記標識化することが、前記対象となる遺伝子産物が検出可能部分と結合し、それによって、標識された発現宿主細胞を産生することを含むものである、標識化することと、
   標識された発現宿主細胞のサブセットを選択することであって、前記選択することは、細胞選別装置により前記検出可能部分を検出することを含むものである、選択することとを含む、方法。
2. 前記宿主細胞の集団の遺伝的多様性は、当該宿主細胞集団のうちの宿主細胞の少なくとも一部で構成される、宿主細胞ゲノム変異、一つもしくは複数の発現構築物のポリヌクレオチド配列変異、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
3. 前記宿主細胞集団の遺伝的多様性が、２００，０００～１，０００，０００である、請求項２に記載の方法。
4. 複数の遺伝的バリアントを含む遺伝的多様性を有する宿主細胞集団から、発現された宿主細胞を選択する方法であって、当該宿主細胞の少なくとも一部は、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含むものであり、当該方法は、
   前記宿主細胞集団を培養することであって、前記対象となる遺伝子産物が、当該集団の宿主細胞の亜集団によって発現され、それにより前記亜集団が発現された宿主細胞を含むものであり、当該発現宿主細胞からの対象となる遺伝子産物の発現のレベルは、遺伝的バリアントに基づいて変動するものである、培養することと、
   前記亜集団の前記発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することであって、前記標識化することが、前記対象となる遺伝子産物が検出可能部分と結合することを含むものであり、当該標識の量は、前記発現宿主細胞における対象となる遺伝子産物の発現レベルに比例するものであり、それによって、標識された発現宿主細胞を産生することを含むものである、標識化することと、
   標識された発現宿主細胞のサブセットを選択することであって、前記選択することは、細胞選別装置により前記検出可能部分および標識の量を検出することを含むものである、選択することとを含む、方法。
5. 複数の遺伝的バリアントを含む遺伝的多様性を有する宿主細胞集団から、発現された宿主細胞を選択する方法であって、当該宿主細胞の少なくとも一部は、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含むものであり、当該方法は、
   前記宿主細胞の集団を培養することであって、前記対象となる遺伝子産物が、前記集団の宿主細胞の亜集団によって発現され、それにより前記亜集団が発現された宿主細胞を含むものであり、当該発現宿主細胞の所定の特性は、遺伝的バリアントに基づいて変動するものである、培養することと、
   前記亜集団の前記発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することであって、前記標識化することが、前記対象となる遺伝子産物が検出可能部分と結合することを含むものであり、当該標識の量は、前記発現宿主細胞における対象となる遺伝子産物の所定の特性に比例するものであり、それによって、標識された発現宿主細胞を産生することを含むものである、標識化することと、
   標識された発現宿主細胞のサブセットを選択することであって、前記選択することは、細胞選別装置により前記検出可能部分および所定のものを検出することを含むものである、選択することとを含む、方法。
6. 前記発現宿主細胞の前記所定の特性は、対象となる活性遺伝子産物の発現レベル、対象となる遺伝子産物の発現レベル、対象となる遺伝子産物の適切なタンパク質フォールディング、対象となる遺伝子産物の適切に折り畳まれたタンパク質の発現レベル、細胞生存率、および／またはバイオマスの量を含む、請求項５に記載の方法。
7. 遺伝的バリアントごとに前記対象となる遺伝子産物の相対的な発現レベルを測定することをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記選択することが、蛍光により活性化される細胞の選別を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記検出可能部分は蛍光部分を含み、また前記選択することは、最も高い蛍光放射である細胞の０．０１％～５％を選択することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記選択することが、最も高い蛍光放射である細胞の０．５％を選択することを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記対象となる遺伝子産物が、シグナルペプチドを欠くポリペプチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
12. 対象となる遺伝子産物は、蛍光ポリペプチドおよび生物発光ポリペプチドからなる群から選択される第二のポリペプチドにインフレームで融合した第一のポリペプチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
13. 対象となる遺伝子産物に結合する検出可能部分は、蛍光ポリペプチドおよび生物発光ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 対象となる遺伝子産物は、酵素活性を有する第二のポリペプチドにインフレームで融合した第一のポリペプチドを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
15. 対象となる遺伝子産物と結合する検出可能部分は、酵素活性を有するポリペプチドの活性部位に結合する、請求項１４に記載の方法。
16. 対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記発現ベクターが、染色体外発現ベクターである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記亜集団の前記発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することは、前記発現宿主細胞の亜集団を固定することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記発現宿主細胞の亜集団を固定することは、前記亜集団の前記発現宿主細胞の少なくとも一部をアルデヒドと接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記アルデヒドがパラホルムアルデヒドである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することは、前記亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を透過化処理することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を透過化処理することは、前記亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部をリゾチームと接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部を標識化することは、前記亜集団の発現宿主細胞の少なくとも一部をＤＮＡを標識する化合物と接触させることをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＤＮＡを標識する化合物がヨウ化プロピジウムである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記宿主細胞集団の前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記宿主細胞集団の前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記宿主細胞集団の前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）５２１細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 標識された発現宿主細胞のサブセットからポリヌクレオチドを回収することをさらに含み、それによって回収されたポリヌクレオチドを産生する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記回収されたポリヌクレオチドからＤＮＡ配列情報を取得することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＤＮＡ配列情報に基づいて宿主細胞のゲノムを改変することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ＤＮＡ配列情報に基づいて発現ベクターのライブラリーを構築することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記発現ベクターのライブラリーを用いて親宿主細胞株を形質転換することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
33. 前記回収されたポリヌクレオチドが発現ベクターである、請求項２８に記載の方法。
34. 一つまたは複数の前記発現ベクターを用いて親宿主細胞株を形質転換することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
35. 形質転換された宿主細胞を培養することをさらに含む、請求項３２または請求項３４に記載の方法。
36. 前記形質転換された宿主細胞の少なくとも一部が、前記対象となる遺伝子産物を発現する、請求項３５に記載の方法。
37. ゲル電気泳動、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ－ＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、固相抽出・質量分析法（ＳＰＥ－ＭＳ）、および増幅発光近接均質アッセイからなる群から選択される方法により、対象となる遺伝子産物の発現レベルを決定することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。

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