CN117310181A - 一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的检测方法，具体涉及一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，包括以下步骤：(1)构建不同位点突变的泛素突变质粒并将其转化到农杆菌感受态中；(2)构建靶蛋白质粒并将其转化到农杆菌感受态中；(3)将步骤(2)中的农杆菌感受态培养后的菌液分别与步骤(1)中的农杆菌感受态培养后的菌液混合，注射烟草叶片，1～3天后提取总蛋白进行WB‑COIP相对定量分析。该方法可以快速的在植物体内进行，操作简单快速，实验周期短，且能同时实现泛素化类型及修饰强弱的确定。
Description
技术领域
本发明涉及靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的检测方法，具体涉及一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法。
背景技术
蛋白质是生命活动的直接体现者，泛素化是一种重要的蛋白质翻译后水平的加工机制，决定靶蛋白的降解/稳定、亚细胞定位或酶的活性。泛素化对靶蛋白的这种影响源于靶蛋白的泛素化修饰类型，目前研究较为广泛深入的主要有7种泛素化修饰类型，即K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63，动物领域的研究结果表面给K48类泛素化修饰主要负责降解靶蛋白，K63类泛素化修饰主要负责保护靶蛋白，因此，对靶蛋白的泛素化修饰类型进行研究具有重要意义。
目前泛素化修饰类型的研究包括体外研究体系和体内研究体系，体外研究体系可以在动植物泛素化类型的研究中通用，但是由于费用昂贵、无法接近真实，因此开展动植物泛素化修饰类型的体内研究很有必要，目前，动物类体内研究体系已相对较为成熟，但尚没有植物体内泛素化修饰类型的研究体系。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，该方法可以快速的在植物体内进行，操作简单快速，实验周期短，且能同时实现泛素化类型及修饰强弱的确定。
本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，包括以下步骤：
(1)构建不同位点突变的泛素突变质粒并将其转化到农杆菌感受态中；
(2)构建靶蛋白质粒并将其转化到农杆菌感受态中；
(3)将步骤(2)中的农杆菌感受态培养后的菌液分别与步骤(1)中的农杆菌感受态培养后的菌液混合，注射烟草叶片，1～3天后提取总蛋白进行WB-COIP相对定量分析。
作为一种优选的实施方式，泛素突变质粒的构建采用的质粒为pH7LIC10.1载体，靶蛋白质粒构建采用的质粒为pH7LIC4.1载体或pH7LIC8.1载体，农杆菌感受态为GV3101。
作为一种优选的实施方式，步骤(1)中的泛素突变为由赖氨酸突变为精氨酸。
作为一种优选的实施方式，提取总蛋白进行WB-COIP相对定量分析的方法如下：收集注射后的烟草叶片并进行蛋白提取，吸取少量蛋白液加入样品缓冲液作为Input样品，将剩余的蛋白液加入磁珠孵育，并洗脱后加入样品缓冲液作为IP样品，将Input样品、IP样品90～110℃金属浴变性后跑胶检测，后经过转膜、封闭、抗体杂交、条带检测获得WB-COIP胶图；
用imageJ对WB-COIP胶图中的蛋白条带进行灰度采集，计算COIP效率及靶蛋白的相对灰度值并判断靶蛋白泛素化类型及修饰强弱。
作为一种优选的实施方式，相对灰度值＝样品中该基因实际灰度值/样品中内参基因实际灰度值，COIP效率＝(RGIP/RGINPUT)M/(RGIP/RGINPUT)W，其中，公式中RGIP，RGINPUT分别指IP样品、Input样品中某基因对应条带的相对灰度值，M、W分别代表突变型基因、野生型基因。
作为一种优选的实施方式，突变前后，靶蛋白的相对灰度值有变化，则判断受到该类型的泛素化修饰；
突变前后，COIP效率值变大，说明该类型突变导致的靶蛋白富集泛素的效率越低，即靶蛋白受到该种类型的泛素化修饰越强。
作为一种优选的实施方式，烟草叶片的蛋白提取液包括150mM NaCl、50mM pH 7.5的Tris-HCl、5mM乙二胺四乙酸、1％m/v聚乙烯吡咯烷酮、10％v/v甘油、2mM二硫苏糖醇、10μL/mL植物蛋白酶抑制剂CPI。
作为一种优选的实施方式，野生型泛素基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
作为一种优选的实施方式，泛素突变类型为K6R、K11R、K27R、K29R、K33R、K48R、K63R。
本发明所建立的在植物体内检测靶蛋白受到泛素化修饰类型及亲和力大小的方法，操作简单、廉价且实验周期短，不需要额外的试验条件及技术，特异性及准确性好，能够同时实现泛素化修饰类型的检测及亲和力大小的判断。
附图说明
图1为BOSS-α的泛素化修饰类型及对蛋白稳定性的影响；
图2为BOSS-β的泛素化修饰类型及对蛋白稳定性的影响；
图3为SFT1的泛素化修饰类型及对蛋白稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本发明实施例提供了一种简单的在植物体内检测靶蛋白泛素化类型的方法，其原理为由泛素分子的突变来进行分析，即哪一种突变能够引起靶蛋白的变化(主要是蛋白丰度)，那么靶蛋白就受到该种泛素化类型的修饰，同时利用COIP技术分析突变前后靶蛋白与泛素蛋白的互作强弱，从而得到靶蛋白受到该种泛素化类型的修饰的强弱，具体方法如下：
(1)泛素突变体质粒的构建
下面以7种泛素突变质粒的构建为例进行详细说明：野生型泛素的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO：1)；野生型泛素的氨基酸序列为：MQIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO:2)；
DNA序列从前到后，下划线为编码赖氨酸的7处密码子(AAG)，分别对应氨基酸序列从前到后有下划线的8个赖氨酸，7种泛素突变质粒的构建，就是分别将这7处的赖氨酸突变为精氨酸。利用重叠PCR技术得到7种突变类型(K6R、K11R、K27R、K29R、K33R、K48R、K63R)的PCR产物之后，将其通过同源重组的方式插入到pH7LIC10.1(N3*MYC)载体上(pH7LIC10.1载体见文献WOOLLY,interacting with MYB transcription factor MYB31,regulatescuticular wax biosynthesis by modulating CER6 expression in tomato)，载体测序正确后转化到GV3101农杆菌感受态中备用。
其中，Ub-K6R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAGGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:3)；
Ub-K11R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAGGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:4)；
Ub-K27R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAGGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:5)；
Ub-K29R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAGGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:6)；
Ub-K33R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGATAGGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:7)。
Ub-K48R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAGGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAAGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:8)；
Ub-K63R的DNA序列为：ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTCACCGGAAAGACTATCACCCTCGAGGTGGAAAGCTCTGACACCATCGACAACGTTAAGGCCAAGATCCAGGATAAGGAAGGTATTCCTCCGGATCAGCAGAGGCTTATCTTCGCCGGAAAGCAGTTGGAGGATGGCCGCACGTTGGCGGATTACAATATCCAGAGGGAATCCACCCTCCACTTGGTCCTCAGGCTCCGTGGTGGTTAA(SEQ ID NO:9)。
(2)靶蛋白质粒的构建
分别将靶蛋白的完整编码框序列构建在pH7LIC4.1(N3*Flag)、pH7LIC8.1(N3*HA)载体上，载体测序正确后转化GV3101农杆菌感受态备用。其中pH7LIC4.1(N3*Flag)、pH7LIC8.1(N3*HA)载体分别见文献TheHD-Zip IV transcription factor SlHDZIV8controls multicellular trichome morphology by regulating the expression ofHairless-2、MAPK11 regulates seed germination and ABA signaling in tomato byphosphorylating SnRKs。
(3)配组设计及烟草注射
将含有靶蛋白质粒的GV3101菌液分别与含有GFP-MYC(载体对照，将GFP基因插入到pH7LIC10.1载体中的StuI位点之间获得)、Ub-N3*MYC(野生型泛素，作为突变型的对照，将野生型泛素基因插入到pH7LIC10.1载体中的StuI位点之间获得)、含有突变型泛素质粒的GV1301菌液按照体积比1:1进行混合后，注射烟草叶片，2天后提取总蛋白进行分析。
(4)WB-COIP相对定量分析
a、蛋白提取及WB-COIP的基本流程：收集相应注射组合的烟草叶片，减去边缘组织，液氮充分研磨，加入烟草蛋白提取液，进行蛋白提取，吸取少量蛋白液加入5×样品缓冲液[Sample buffer，20mL 5×Sample buffer配方：4mL的1.5M Tris-Cl(PH6.8)，1mL的1％溴酚蓝，10mL的50％甘油，5mL的β-巯基乙醇，2g的SDS，用ddH2O定容至20mL]，稀释成1×样品缓冲液作为Input样品，混合液置于冰上，剩余的蛋白液加入磁珠进行孵育经过洗脱(其中，BOSS与SFT1以及BOSS与Ub的互作均采用Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarose(MBL,M185-10R)进行IP，SFT1与Ub的互作采用Anti-HA-tag mAb-Magnetic Agarose(MBL,M180-10)进行IP。详细步骤常规方法：见文献MAPK11 regulates seed germination and ABAsignaling in tomato by phosphorylating SnRKs)以后加入1×样品缓冲液作为IP样品，将Input样品、IP样品置于100℃金属浴中变性即可跑胶检测，后续经过转膜、封闭、抗体杂交、条带检测等过程获得WB-COIP胶图。
其中，烟草蛋白提取液：包括150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、10％(v/v)甘油(glycerol)、2mM二硫苏糖醇(DTT)、10μL/mL植物蛋白酶抑制剂CPI。
b、蛋白条带的灰度值及COIP效率的计算：用imageJ对WB-COIP胶图中的蛋白条带进行灰度值采集，参考文献Co-immunoprecipitation and semiquantitativeimmunoblotting for the analysis of protein-protein interactions，COIP效率计算参考文献The RPAP3-Cterminal domain identifies R2TP-likequaternary chaperones。COIP效率＝(RGIP/RGINPUT)M/(RGIP/RGINPUT)W，RGIP、RGINPUT分别指IP样品，INPUT样品中某基因对应条带的相对灰度值Relative Grey Level(相对灰度值＝样品中该基因实际灰度值/样品中内参基因实际灰度值)，M、W分别代表突变型基因，野生型基因。
(5)靶蛋白的泛素化类型分析
观察Ub突变前后，靶蛋白的相对灰度值变化，如果相对灰度值有变化，则与该种Ub突变有关，受到该类型的泛素化修饰。具体为：观察Ub突变前后，靶蛋白富集Ub的相对COIP效率值(用突变Ub的COIP效率值除以野生Ub的COIP效率值)的变化，相对COIP效率值变大，说明Ub突变导致的靶蛋白富集Ub的效率越低，即靶蛋白受到该种类型的泛素化修饰越强，相反地，相对COIP效率值变小，相对COIP效率值变大，即靶蛋白受到该种类型的泛素化修饰越弱，甚至竞争-抑制其它泛素类型的修饰。
实施例2实施例1中所述方法的稳定性和特异性验证
技术体系的系统假阳性主要源于技术的特异性和稳定性：一是特异性，不管待检测的靶蛋白之间的差异多么巨大，呈现的是完全相同的结果，那么就需要选择两个差异巨大的蛋白，观察结果是否相同；二是稳定性，不管待检测的靶蛋白之间的差异多么微小，呈现的是毫无共同点的结果，那么就需要选择两个差异微小的蛋白，观察结果是否毫无共同点。本实施例中，选择了BOSS-α、BOSS-β、GFP-SFT1三个靶蛋白，其中，BOSS-α(153R)、BOSS-β(153W)只有1个氨基酸的差异，可以互为对照，验证技术体系的稳定性，GFP-SFT1实际是SFT1多肽，为了便于分析在其N端加上GFP，SFT1与BOSS蛋白的结构功能差异较大，可以互为对照，验证该技术体系的特异性。其中内参基因是Actin，相应抗体Anti-Plant ActinMouse Monoclonal Antibody(3T3)(AmyJet,A01050)。
分别将靶蛋白BOSS-α、BOSS-β、GFP-SFT1的完整编码框构建在pH7LIC4.1(N3*Flag)、pH7LIC4.1(N3*Flag)、pH7LIC8.1(N3*HA)载体上，载体测序正确后转化入GV33101农杆菌感受态备用。
其中，靶蛋白BOSS-α序列如下：MPNSSTTKNFKNLSLHRRRRLQRS SDMSPLFAIVSLIILIIIPTIVFAFIYAMKHPDNVFRRSSGETSGESTTGIITQHTDMLSTVKYEKRTSPEKEEDPGNECPVCLTAFIDGEEVRQLMTCKHIFHFSCIDKWLCSKSSCPVCRAAVTVKRPKRPAVNFDDDFRQGLPDAAALV(SEQ ID NO：10)；
靶蛋白BOSS-β序列如下：MPNSSTTKNFKNLSLHRRRRLQRSSDMSP LFAIVSLIILIIIPTIVFAFIYAMKHPDNVFRRSSGETSGESTTGIITQHTDMLS TVKYEKRTSPEKEEDPGNECPVCLTAFIDGEEVRQLMTCKHIFHFSCIDKW LCSKSSCPVCRAAVTVKWPKRPAVNFDDDFRQGLPDAAALV(SEQ ID NO：11)；
靶蛋白GFP-SFT1序列如下：MKLYVMSPRPSKGIHRIVFSLFRQLGRE TVYAPNWRQNFNTRQFAELYNLGLPVAAVYFNCQRENGTGGRRCE(SEQID NO：12)；
将BOSS-α-N3*Flag、BOSS-β-N3*Flag、GFP-SFT1-N3*HA菌液分别与GFP-MYC(载体对照)、Ub-N3*MYC(野生型泛素，作为7种突变型的对照)、UbK6R-N3*MYC、UbK11R-N3*MYC、UbK27R-N3*MYC、UbK29R-N3*MYC、UbK33R-N3*MYC、UbK48R-N3*MYC、KUb63R-N3*MYC按照1:1的菌液比例进行混合，合计3组27种组合；注射烟草2天以后提取总蛋白待分析。
蛋白检测所用的PAGE胶采用上海雅酶生物医药科技有限公司生产的Omni-EasyTMOne-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit(12.5％)。浓缩胶采用85V电压跑50min直到-浓缩胶-分离胶界面，分离胶采用100V电压跑1.5h左右直到溴酚蓝显色带跑至分离胶底部。转膜测所用的PVDF膜采用0.2μm孔径的Immun-PVDF Membrane(Bio-Rad，1620177)。封闭采用TBST-脱脂牛奶封闭液(0.05％吐温-20，5％脱脂干牛奶，用TBSTbuffer定容到30mL)，常温缓慢摇晃孵育2h。将封闭完毕的PVDF膜直接用抗体液进行抗体杂交。利用TBST-脱脂牛奶封闭液(0.05％吐温-20，5％脱脂干牛奶，用TBST buffer定容到30mL)配置响应的抗体液。泛素化检测的一抗使用Anti-ubiqutin mouse mAb(PTM Biolab,PTM-5798)，1:1000配置(30mL缓冲液加30μL抗体)，4℃缓慢摇晃孵育12-15h，二抗使用HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG Heavy Chain(ABclonal Technology，AS064)，1:5000配置，常温缓慢摇晃孵育50min-1h。Actin检测一抗使用Anti-Plant Actin MouseMonoclonal Antibody(3T3)(AmyJet,A01050)，1:1000配置，常温缓慢摇晃孵育1.5-2h；二抗使用HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG Heavy Chain(ABclonal Technology，AS064)，1:5000配置，常温缓慢摇晃孵育50min-1h。泛素和Actin蛋白的化学发光显色剂均采用TransGen Biotech公司的高敏显色剂/>Western Blot Kit(DW101-01)。FLAG检测使用Monoclonal ANTI-FLAG(R)M2-Peroxidase(HRP)antibody produced in mouse(Sigma-Aldrich,A8592)，1:1000配置，常温缓慢摇晃孵育1.5-2h。HA检测使用Anti-HA-Peroxidase High Affinityfrom rat IgG1(ROCHE,12013819001)，1:1000配置，常温缓慢摇晃孵育1.5-2h。MYC检测使用HRP-conjugated Mouse anti Myc-Tag mAb(ABclonalTechnology,AE026)，1:2000配置，常温缓慢摇晃孵育1.5-2h；二抗使用HRP-conjugatedGoat Anti-Mouse IgG Heavy Chain(ABclonal Technology，AS064)，1:5000配置，常温缓慢摇晃孵育50min-1h。
(1)BOSS-α的泛素化修饰类型分析
图1为BOSS-α的泛素化修饰类型及对蛋白稳定性的影响结果，其中，a为泛素化修饰分析COIP胶图，b为泛素突变对BOSS-α蛋白量的影响，c为泛素突变对BOSS-α-Ub富集效率的影响。根据INPUT条带及相对蛋白水平的数据(图1a,b)可以发现：与野生型泛素基因相比，泛素基因的K29突变为R29以后，BOSS-α相对蛋白水平显著降低，几乎消失，这表明BOSS-α主要受到K29类泛素化修饰，按照相对蛋白水平变化的绝对值排序，表示受到某种修饰的程度大小，可以法相BOSS-α还受到K27、K6、K63、K48修饰，受到K11、K133类泛素化修饰并不明显。
结合图中IP条带以及IP效率(图1a、c)的数据可以发现：与野生型及其他突变泛素基因相比，K27突变为R27以后，BOSS-α的IP效率明显下降，这表示BOSS-α与K27类型修饰亲和力最强。此外，BOSS-α与K63、K48类型修饰分别次之。与此相反，K11突变为R11以后，BOSS-α富集多聚泛素链的效率(IP效率)明显升高，这表示BOSS-α与K11类型修饰亲和力最弱。亲和力排序为：K27>K63>K48>K6>K33>K11。
(2)BOSS-β的泛素化修饰类型分析
图2为BOSS-β的泛素化修饰类型及对蛋白稳定性的影响结果，其中，a为泛素化修饰分析COIP胶图，b为泛素突变对BOSS-β蛋白量的影响，c为泛素突变对BOSS-β-Ub富集效率的影响。根据INPUT条带及相对蛋白水平的数据(图2a、b)可以发现：与野生型泛素基因相比，泛素基因的K29突变为R29以后，BOSS-β相对蛋白水平显著降低，几乎消失，这表示BOSS-β主要受到K29类泛素化修饰，按照相对蛋白水平变化的绝对值排序，表示受到某种修饰的程度大小，可以发现BOSS-β还受到K48、K6、K63修饰，受到K11、K27、K33类泛素化修饰并不明显。
结合图中IP条带及IP效率(图2a、c)的数据可以发现：与野生型及其他突变泛素基因相比，K11突变为R11以后，BOSS-β的IP效率明显下降，这表示BOSS-β与K11类型修饰亲和力最强。与此相反，K6突变为R6以后，K27突变为R27以后，BOSS-β的IP效率明显升高，这表示β与K6、K27类型修饰亲和力最弱。亲和力排序为：K11>K63>K48>K33>K29>K6>K27。
(3)SFT1的泛素化修饰类型分析
图3为SFT1的泛素化修饰类型及对蛋白稳定性的影响结果，其中，a为泛素化修饰分析COIP胶图，b为泛素突变对SFT1蛋白量的影响，c为泛素突变对SFT1-Ub富集效率的影响。根据INPUT条带及相对蛋白水平的数据(图3a、b)可以发现：与野生型泛素基因相比，泛素基因的K29突变为R27以后，SFT1相对蛋白水平显著升高，这表示SFT1主要受到K27类泛素化修饰，按照相对蛋白水平变化的绝对值排序，表示受到某种修饰的程度大小，可以发现SFT1还受到K11、K29修饰，受到K6、K33、K48、K63类泛素化修饰并不明显。
结合图中IP条带及IP效率(图3a、c)的数据可以发现：与野生型及其他突变泛素基因相比，K29突变为R29以后，SFT1的IP效率明显下降，这表示SFT1与K29类型修饰亲和力最强。与此相反，K48类泛素突变类型导致SFT1的IP效率明显升高，这表示SFT1与K48类型修饰亲和力最弱。亲和力排序为：K29>K27/K6/K33>K11>K63>K48。
(4)数据汇总及效果评价，将上述数据汇总如下表1所示：
表1泛素化修饰类型及亲和力结果汇总
由上述结果可知：BOSS-α主要受到的泛素化修饰类型与SFT1只有2种相同(K27、K29)，BOSS-β主要受到的泛素化修饰类型与SFT1只有1种相同(K29)，这表明两种差异巨大的蛋白主要受到的泛素化修饰类型是显著不同的。不管是与BOSS-α最亲和的三种泛素化修饰类型
(K27>K63>K48)，还是与BOSS-β最亲和的三种泛素化修饰类型(K11>K63>K48)，SFT1都是完全不同的(K29>K27>K6)，这表明两种差异巨大的蛋白主要亲和的泛素化修饰类型是显著不同的。说明该技术体系是特异的，不会发生待检测蛋白差异巨大而结果相似这类技术问题。
BOSS-α主要受到的泛素化修饰类型与BOSS-β只有1种不同(K27)，表明两种差异微小的蛋白主要受到的泛素化修饰类型没有明显的差异。与BOSS-α和BOSS-β最亲和的三种泛素化修饰类型中有2种是一样的(K63、K48)，表明与两种差异微小的蛋白主要亲和的泛素化修饰类型没有明显的差异。说明该技术体系是稳定的，不会发生检测蛋白相似而结果差异巨大这类技术问题。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建不同位点突变的泛素突变质粒并将其转化到农杆菌感受态中；
(2)构建靶蛋白质粒并将其转化到农杆菌感受态中；
(3)将步骤(2)中的农杆菌感受态培养后的菌液分别与步骤(1)中的农杆菌感受态培养后的菌液混合，注射烟草叶片，1～3天后提取总蛋白进行分析。
2.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，泛素突变质粒的构建采用的质粒为pH7LIC10.1载体，靶蛋白质粒构建采用的质粒为pH7LIC4.1载体或pH7LIC8.1载体，农杆菌感受态为GV3101。
3.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，步骤(1)中的泛素突变为由赖氨酸突变为精氨酸。
4.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，提取总蛋白进行分析的方法如下：
收集注射后的烟草叶片并进行蛋白提取，吸取少量蛋白液加入样品缓冲液作为Input样品，将剩余的蛋白液加入磁珠孵育，并洗脱后加入样品缓冲液作为IP样品，将Input样品、IP样品90～110℃金属浴变性后跑胶检测，后经过转膜、封闭、抗体杂交、条带检测获得WB-COIP胶图；
用imageJ对WB-COIP胶图中的蛋白条带进行灰度采集，计算COIP效率及靶蛋白的相对灰度值并判断靶蛋白泛素化类型及修饰强弱。
5.根据权利要求4所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，
相对灰度值＝样品中该基因实际灰度值/样品中内参基因实际灰度值，
COIP效率＝(RGIP/RGINPUT)M/(RGIP/RGINPUT)W，
其中，公式中RGIP，RGINPUT分别指IP样品、Input样品中某基因对应条带的相对灰度值，M、W分别代表突变型基因、野生型基因。
6.根据权利要求5所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，突变前后，靶蛋白的相对灰度值有变化，则判断受到该类型的泛素化修饰；
突变前后，COIP效率值变大，说明该类型突变导致的靶蛋白富集泛素的效率越低，即靶蛋白受到该种类型的泛素化修饰越强。
7.根据权利要求4～6任一项所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，烟草叶片的蛋白提取液包括150mM NaCl、50mM pH 7.5的Tris-HCl、5mM乙二胺四乙酸、1％m/v聚乙烯吡咯烷酮、10％v/v甘油、2mM二硫苏糖醇、10μL/mL植物蛋白酶抑制剂CPI。
8.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，野生型泛素基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
9.根据权利要求8所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，泛素突变类型为K6R、K11R、K27R、K29R、K33R、K48R、K63R。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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