CN104662161A - 用于防止正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于防止在细菌中重组蛋白质的生产期间正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物。本发明还提供了用于本文提供的方法和组合物的微生物宿主细胞和核酸分子。

Description

用于防止正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物
相关申请
本申请要求2013年3月12日提交的美国临时申请No 61/777,700的权益，以及2012年9月19日提交的美国临时申请No 61/703,142的权益，这两个申请都通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2013年9月17日，命名为P4967R1_WO_序列表.txt，并且大小45,847字节。
技术领域
本发明涉及用于防止在细菌中重组蛋白质的生产期间正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物。本发明还提供了用于本文提供的方法和组合物的微生物宿主细胞和核酸分子。
背景技术
正亮氨酸，氨基酸甲硫氨酸的类似物，可代替甲硫氨酸残基被错误地掺入蛋白质中。当在大肠杆菌(Escherichia coli)表达时，许多异源蛋白质在甲硫氨酸残基应出现的位置被错误地掺入正亮氨酸。正亮氨酸在蛋白质中的错误掺入，特别是在通过重组方法生产的异源蛋白质中的错误掺入，通常被认为是不希望的，部分原因是产生了具有不希望的特性的改变的蛋白质。
在大肠杆菌中生产重组蛋白质期间，在甲硫氨酸的位置错误地掺入正亮氨酸已经观察到了50多年(见，例如，Munier和Cohen(1959)Biochim Biophys Acta 31:378-391；Cohen和Munier(1956)BiochimBiophys Acta 21:592-593；Cohen和Munier(1959)Biochim BiophysActa 31:347-356；和Cowie等人,(1959)Biochim Biophys Acta34:39-46)。例如，在大肠杆菌中重组生产甲硫氨酰牛生长激素(MBS)蛋白质期间，该蛋白质中约14％甲硫氨酸残基表现出正亮氨酸错误掺入，在天然大肠杆菌蛋白质中约6％甲硫氨酸残基也被正亮氨酸取代。(参见Bogosian等人,(1989)J Biol Chem 264:531-9)。在另一实例中，在基本培养基大肠杆菌发酵中生产白细胞介素2导致了在重组蛋白中约19％的甲硫氨酸残基被正亮氨酸取代(参见Tsai等人,(1988)BiochemBiophys Res Commun 156:733-739)。其它的研究表明，正亮氨酸残基错误地掺入到蛋白质可以发生在内部的甲硫氨酸残基，还可以发生在氨基末端的甲硫氨酸残基(参见Brown(1973)Biochim Biophys Acta294:527-529；和Barker和Bruton(1979)J Mol Biol 133:217-231)。
由于酶甲硫氨酰tRNA合成酶(MetG)的泛化性质，正亮氨酸与甲硫氨酸竞争掺入蛋白质中(参见Trupin等人,(1966)Biochem BiophysRes Commun 24:50-55；和Fersht和Dingwall(1979)Biochemistry18:1250-1256)。用大肠杆菌MetG酶的动力学研究表明，与正亮氨酸相比，使用甲硫氨酸的MetG酰化约是使用正亮氨酸的4倍高(参见v vanHest等人,(2000)Am Chem Soc 122:1282-1288)。由于MetG的不严格的底物特异性，正亮氨酸可以在酰化反应中取代甲硫氨酸，导致正亮氨酸代替甲硫氨酸错误地掺入蛋白质中。
在重组蛋白生产中正亮氨酸残基取代甲硫氨酸残基的错误掺入通常被认为是不希望的。含有错误地掺入的正亮氨酸残基的重组蛋白或多肽可表现出改变的结构和功能特征，诸如，例如，改变的对蛋白水解的灵敏度，减少的生物活性，或增加的免疫原性。
已经开发了各种减少或防止重组蛋白质生产期间正亮氨酸错误地掺入的策略。例如，已通过在发酵过程中补充具有甲硫氨酸的细胞培养基(通过连续或浓注进料(bolus feed)/添加甲硫氨酸)确保细胞可获得过量甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率(见，例如，美国专利号5,599,690)。虽然连续或浓注进料/添加甲硫氨酸降低了重组蛋白质中错误地掺入正亮氨酸的程度，但是其可能增加发酵过程的操作复杂性和成本。另外，发酵过程中连续或浓注进料/添加甲硫氨酸可导致不希望的发酵罐中内容物的稀释，导致较低的细胞密度和较低的产品产量。
已经通过删除参与正亮氨酸生物合成途径的基因，例如，删除亮氨酸操纵子(leuA，leuB，LeuC和leuD)的基因或删除转氨酶编码基因如ilvE或tyrB，来减少正亮氨酸错误地掺入蛋白质中(参见Bogosian等人,(1989)J Biol Chem 264:531-539；Tsai等人,(1989)BiochemBiophys Res Commun 156:733-739；和Randhawa等人,(1994)Biochemistry 33:4352-4362)。然而，为了防止正亮氨酸错误掺入的生物合成途径的基因的删除，可能需要在发酵过程中向培养基中添加其它氨基酸(如亮氨酸或异亮氨酸)，因为涉及正亮氨酸生物合成的许多基因也参与支链氨基酸的生物合成(参见Bogosian等人,(1989)J BiolChem 264:531-539；见本说明书的图8)。
用于防止正亮氨酸错误掺入的另一策略包括降解正亮氨酸的酶的共表达，包括，例如，氨基酸脱氢酶和氨基酸氧化酶。然而，这种方法需要这些酶的过表达，这在重组蛋白的生产过程中可能是不希望的，并可能导致较低的重组蛋白产量(见，例如，美国专利申请公开号US2007/0009995)。另外，这些酶的过表达可能导致发酵过程中其他类似氨基酸的降解。也通过进行用其他密码子取代甲硫氨酸密码子来改变待表达多肽的一级氨基酸序列，以防止正亮氨酸的错误掺入(见例如，美国专利号5,698,418)。但是，这样的取代可导致所得蛋白质的活性降低或结构改变，这对于生物技术产业中重组的蛋白生产是一个非常不希望的结果。
如以上所指出的，目前使用的在微生物中生产重组蛋白期间防止正亮氨酸错误掺入的方法伴有各种缺点；因此，需要一种新的方法，其用于防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质，特别是在微生物(如大肠杆菌)中的重组蛋白质生产期间。
本发明通过提供有效防止在微生物中生产重组蛋白质期间的正亮氨酸错误掺入的工程化的微生物宿主细胞满足了这一需要，例如，细菌。除其他外，本发明提供包含突变的metA和metK等位基因(即，改变的metA和metK核酸序列)的大肠杆菌宿主细胞，其导致由该微生物生产的甲硫氨酸至足以减少或防止正亮氨酸错误掺入蛋白质中和多肽的程度或范围。利用这样的宿主细胞产生的重组蛋白质的分析表明，消除了代替甲硫氨酸残基的正亮氨酸残基的错误掺入。本发明还表明，使用这样的大肠杆菌宿主细胞的发酵工艺性能，包括宿主细胞的生长，利用这样的大肠杆菌宿主细胞的重组蛋白质产物滴度，比得上对照宿主细胞中所观察到的。
发明内容
本发明的一部分提供了用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中和多肽中的方法和组合物。本发明的方法和组合物可用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入由微生物表达的异源(例如重组)蛋白质和多肽中，所述微生物如细菌(例如，大肠杆菌)。
在一些实施方案中，本发明提供了用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入到由微生物表达的蛋白质或多肽中的方法，其中微生物产生足以防止或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质或多肽的程度或范围的甲硫氨酸。在一些实施方案中，微生物是反馈抗性或反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶微生物。在其它实施方案中，微生物是包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代的核酸序列，所述MetA氨基酸取代选自在氨基酸位置27的精氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置64的谷氨酰胺至谷氨酸的取代、在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代的核酸序列，所述MetA中的氨基酸取代包括在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代。在本文说明书中描述的MetA氨基酸位置参照示于图7A和SEQ ID NO：29的野生型MetA氨基酸序列。
在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包括选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。
如上所述，本发明提供了用于防止或减少正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的方法，其中微生物产生足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围的甲硫氨酸。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些实施方案中，微生物是由于部分损失S-腺苷甲硫氨酸合成酶功能而解除甲硫氨酸生产抑制。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metK等位基因。在一些实施方案中，突变的metK等位基因导致部分损失MetK功能。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含编码MetK中氨基酸取代的核酸序列，所述MetK中氨基酸取代包括在氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸的取代。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基位置1132上包含胞嘧啶碱基缺失的核酸序列。在本说明书中描述的MetK氨基酸位置参照示于图8A和SEQ IDNO：30中的野生型MetK氨基酸序列。在本说明书中描述的metK核酸位置参照如图8B和SEQ ID NO：32所示的野生型metK核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包括选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。
在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和metK等位基因。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含编码在MetA氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸取代的核酸序列，以及所述突变的metK等位基因包含编码在MetK氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸取代的核酸序列。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和metK等位基因，其中突变的metA等位基因包含编码在MetA氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸取代的核酸序列，以及其中所述突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基位置1132上包含胞嘧啶碱基缺失的核酸序列。
在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，并且其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO：24的核酸序列，和突变的metK等位基因包含SEQ ID NO：27的核酸序列。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO：24的核酸序列，以及突变的metK等位基因包含SEQ ID NO：28的核酸序列。
本发明还提供了对于防止或减少正亮氨酸错误地掺入到由微生物宿主细胞表达的蛋白质和多肽是有用的微生物宿主细胞。本发明还提供了用于由微生物宿主细胞表达蛋白质或多肽的微生物宿主细胞，其中所述表达的蛋白质中或多肽中不含正亮氨酸的错误掺入。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
本发明提供了微生物(例如，微生物宿主细胞)，其中该微生物产生足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的程度或范围的甲硫氨酸。在一些实施方案中，本发明提供了微生物，其中所述微生物是反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶微生物。在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物。在一些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因包含编码在MetA中的氨基酸取代的核酸序列，所述在MetA中的氨基酸取代选自在氨基酸位置27的精氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置64的谷氨酰胺至谷氨酸的取代、氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代。在一些实施方案中，所述微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
在一些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA中一个以上氨基酸取代的核酸序列。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含编码MetA氨基酸位置296上异亮氨酸至丝氨酸取代和MetA氨基酸位置298上脯氨酸至亮氨酸的取代的核酸序列。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
在一些实施方案中，本发明提供微生物，其中所述微生物包括突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含选自SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
本发明提供了微生物(例如，微生物宿主细胞)，其中，所述微生物产生甲硫氨酸至足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到由微生物表达的蛋白质中或多肽中的程度或范围。在一些实施方案中，本发明提供微生物，其中所述微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些方面，所述解除甲硫氨酸生产抑制的微生物产生于S腺苷甲硫氨酸合成酶的部分功能损失。在其他实施方案中，本发明提供包含突变的metK等位基因的微生物。在一些实施方案中，本发明提供包含突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metK等位基因包含编码MetK中氨基酸取代的核酸序列，所述MetK中氨基酸取代包括在氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸的取代。在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基位置1132上包含胞嘧啶碱基缺失的核酸序列。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
在一些实施方案中，本发明提供微生物，其中所述微生物包括突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含选自SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
本发明还提供了包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因不同组合的微生物宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA氨基酸取代的核酸序列，所述MetA氨基酸取代包括在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代，以及其中所述突变的metK等位基因包含编码MetK氨基酸取代的核酸序列，所述MetK氨基酸取代含有在氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸的取代。在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA中的氨基酸取代的核酸序列，所述MetA中的氨基酸取代包括在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代，并且其中所述突变的metK等位基因包括metK等位基因的核酸残基1132上的核酸胞嘧啶的缺失。在一些实施方案中，本发明提供微生物，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO：24的核酸序列，以及其中所述突变的metK等位基因包括SEQ ID NO：27的核酸序列。在其他实施方案中，本发明提供微生物，其中所述微生物包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO：24的核酸序列，以及其中所述突变的metK等位基因包括SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是细菌。在其它实施方案中，微生物宿主细胞是大肠杆菌。
本发明还提供了用于本发明方法中的分离的核酸分子。在一些方面，本发明提供了分离的metA核酸分子(即，编码MetA的分离的核酸分子)。在一些实施方案中，本发明提供了分离的metA核酸分子，其中所述metA核酸分子包含编码MetA中的氨基酸取代的核酸序列，所述MetA中的氨基酸取代选自在氨基酸位置27的精氨酸至半胱氨酸的替代、在氨基酸位置64的谷氨酰胺至谷氨酸的取代、在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代。在其他实施方案中，通过本发明提供的分离的metA核酸分子包含选自SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。特别是本发明在此提供了这些分离的metA核酸分子和其序列用于生产微生物的用途，其中所述微生物用于防止或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中或多肽中。
本发明还提供了分离的metK核酸分子(即，编码MetK的分离的核酸分子)。在一些实施方案中，本发明提供了metK核酸分子，其中所述metK核酸分子包含编码在MetK中的氨基酸取代的核酸序列，所述MetK中的氨基酸取代包括在氨基酸位置185的缬氨酸至谷氨酸的取代。在其他实施方案，本发明提供了metK核酸分子，其中所述metK核酸分子包含在metK等位基因的核酸残基1132上的核酸胞嘧啶的缺失。在其他实施方案中，由本发明提供的metK核酸分子包含选自SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。特别是本发明在此提供了这些分离的metK核酸分子和其序列用于生产微生物的用途，所述微生物用于防止或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中或多肽中。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸是SEQ IDNO：33的核酸序列。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸是SEQ ID NO：34的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含具有对应于SEQ ID NO：33的核酸序列的核酸和具有对应于SEQ ID NO：34的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸是SEQ IDNO：33的核酸序列。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸序列是SEQ ID NO：34的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含具有对应于SEQ ID NO：33的核酸序列的核酸和具有对应于SEQ ID NO：34的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸是SEQ ID NO：33的核酸序列。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸序列是SEQID NO：34的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含具有对应于SEQ ID NO：33的核酸序列的核酸和具有对应于SEQ ID NO：34的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸，以及突变的metK等位基因包括选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：48的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：49核酸。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：48的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：49的核酸。在一些实施方案中，突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：48的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：49的核酸。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:26的核酸序列，以及突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metA等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：50的核酸、编码氨基酸序列SEQ ID NO：51的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：52的核酸。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：50的核酸、编码氨基酸序列SEQ ID NO：51的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：52的核酸。在一些实施方案中，突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明提供了包含核酸的微生物，所述核酸包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸的微生物，所述核酸包括突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中该微生物进一步包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：50的核酸、编码氨基酸序列SEQ ID NO：51的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO：52的核酸。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的核酸序列，以及突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些方面中，所述微生物是细菌，例如，大肠杆菌。
本发明进一步提供了用于在细菌宿主细胞中生产不含正亮氨酸错误掺入的蛋白质或多肽的方法，所述方法包括在细菌宿主细胞中表达编码蛋白质或多肽的核酸，其中所述细菌宿主细胞包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，从而产生不含正亮氨酸错误掺入的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列，以及突变的metK等位基因包括选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。
本发明还提供了用于在细菌宿主细胞中生产抗体或抗体片段的方法，其中所述抗体或抗体片段不含正亮氨酸的错误掺入，所述方法包括在细菌宿主细胞中表达编码抗体或抗体片段的核酸，其中所述细菌宿主细胞包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，由此产生不含正亮氨酸错误掺入的抗体或抗体片段。在一些方面中，用于在细菌宿主细胞中产生根据本发明的不含正亮氨酸错误掺入的抗体或抗体片段的方法在包括细菌宿主细胞中表达编码抗体重链多肽的核酸和编码抗体轻链多肽的核酸。在一些方面中，抗体重链多肽是抗体Fab片段重链多肽，抗体轻链多肽是抗体Fab片段轻链多肽。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列，突变的metK等位基因包括选自SEQ ID NO：27和SEQID NO：28的核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在细菌宿主细胞中产生抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的方法，其中所述抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段不含正亮氨酸的错误掺入，所述方法包括在细菌宿主细胞中表达编码抗VEGF抗体或抗-VEGF抗体片段的核酸，其中所述细菌宿主细胞包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，由此产生不含正亮氨酸错误掺入的抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段。在一些实施方案中，该方法包括在细菌宿主细胞中表达编码抗VEGF抗体重链多肽或抗VEGF抗体片段重链多肽或其片段的核酸，和编码抗VEGF抗体轻链多肽或抗VEGF抗体片段轻链多肽或其片段的核酸。在一些方面中，所述抗VEGF抗体重链和抗VEGF抗体轻链是全长重链和轻链的抗VEGF抗体多肽。在其它方面中，抗VEGF抗体重链是抗体Fab片段的重链多肽，和抗VEGF抗体轻链是抗体Fab片段的轻链多肽。在一些实施方案中，抗VEGF抗体重链包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列，以及抗VEGF抗体轻链包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：47的核酸是SEQ ID NO：34的核酸序列。在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：46的核酸序列是SEQID NO：33的核酸序列。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26的核酸序列。在一些实施方案中，突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。
本发明还提供通过本文所述的任何方法生产的抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段，其中所述抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段不含正亮氨酸的错误掺入。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在细菌宿主细胞中生产抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的方法，其中所述抗因子D抗体或抗因子D抗体片段不含正亮氨酸错误掺入，所述方法包括在细菌宿主细胞中表达编码所述抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸，其中所述细菌宿主细胞包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因，或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，由此产生不含正亮氨酸错误掺入的抗因子D抗体或抗因子D抗体片段。在一些实施方案中，该方法包括在细菌宿主细胞中表达编码抗因子D抗体重链多肽或抗因子抗体片段重链多肽或其片段的核酸和编码抗因子D抗体轻链多肽或抗因子D抗体片段轻链多肽或其片段的核酸。在一些方面中，抗因子D抗体重链和抗因子D抗体轻链是全长的重链和轻链抗因子D抗体多肽。在其它方面中，抗因子D抗体重链是抗体Fab片段重链多肽，和抗因子D抗体轻链是抗体Fab片段轻链多肽。在一些实施方案中，抗因子D抗体的重链包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列，和抗因子D抗体的轻链包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。在一些实施方案中，突变的metK等位基因包含选自SEQID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。
本发明进一步提供了通过本文所述的任何方法生产的抗因子D抗体或抗因子D抗体片段，其中所述抗因子D抗体或抗因子D抗体片段不含正亮氨酸的错误掺入。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在细菌宿主细胞产生抗MET抗体或抗MET抗体片段的方法，其中所述抗Met抗体或抗MET抗体片段不含正亮氨酸的错误掺入，该方法包括在细菌宿主细胞中表达编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸，其中所述细菌宿主细胞包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因或突变的metA等位基因和突变metK等位基因，由此产生不含正亮氨酸错误掺入的抗MET抗体或抗MET抗体片段。在一些实施方案中，该方法包括在细菌宿主细胞中表达编码抗MET抗体重链多肽或抗MET抗体片段重链多肽或其片段的核酸和编码抗MET抗体轻链多肽或抗MET抗体片段轻链多肽或其片段的核酸。在一些方面中，所述抗MET抗体重链和抗MET抗体轻链是全长重链和轻链的抗MET抗体多肽。在其它方面，抗MET抗体重链是抗体Fab片段的重链多肽，和抗MET抗体轻链是抗体Fab片段的轻链多肽。在一些实施方案中，抗MET抗体重链包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列，抗MET抗体重链片段包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列，和抗MET抗体轻链包括SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变的metA等位基因包含选自SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。在一些实施方案中，突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。
本发明进一步提供了通过本文所述的任何方法生产的抗MET抗体或抗MET抗体片段，其中所述抗MET抗体或抗MET抗体片段不含正亮氨酸的错误掺入。
在各个方面，包含任何一种或多种本发明提供的核酸序列的突变微生物是细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别提供了本文所描述的突变微生物用于生产异源的(例如，重组的)多肽和异源的(例如重组的)蛋白质的用途，其中，降低、基本上降低、基本上消除或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽中和异源蛋白质中。
附图说明
图1显示对应于SEQ ID NO：23的核酸序列metA(R27C)。
图2显示对应于SEQ ID NO：24的核酸序列metA(Y294C)。
图3显示对应于SEQ ID NO：25的核酸序列metA(I296S/P298L)。
图4显示对应于SEQ ID NO：26的核酸序列metA(Q64E)。
图5显示对应于SEQ ID NO：27的核酸序列metK(V185E)。
图6显示对应于SEQ ID NO：28的核酸序列metK(c1132del)。
图7A和7B显示分别对应于SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31的野生型MetA的氨基酸序列和核酸序列。
图8A和8B显示分别对应于SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32的野生型MetK的氨基酸序列和核酸序列。
图9显示正亮氨酸和正亮氨酸类似物的结构。正亮氨酸是甲硫氨酸的结构类似物，其中硫(S)原子被亚甲基(即，-CH2)所取代。
图10显示了在大肠杆菌中正亮氨酸生物合成途径的示意图。虚线箭头表示涉及多个步骤。通过由亮氨酸操纵子leuABCD所编码的酶催化的酮酸链延伸过程的三步，丙酮酸被转化为α-酮己酸(α-ketocaproate)。通过转氨酶IlvE或TyrB，中间产物α-酮己酸被转氨基化为正亮氨酸。
图11显示了大肠杆菌中甲硫氨酸的生物合成和调控。虚线箭头指示反馈抑制和开放的箭头指示阻遏。甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是酶MetA的反馈抑制剂。阻遏剂MetJ和其共阻遏剂SAM抑制甲硫氨酸调节子中酶的转录。
图12A、12B和12C阐述生长趋势，如通过10L大肠杆菌发酵测定的OD550(图12A)和iOD550(图12B)。对照宿主(60E4)发酵用连续甲硫氨酸(■)或连续水进料(□)进行(图12A)。用连续水进料(Δ)或无进料(▲)进行60E4metA(Y294C)宿主发酵(图12A)。图12C显示了对照宿主60E4无进料(正方形)、对照宿主60E4甲硫氨酸进料(圆圈)和宿主60E4metA(Y294C)无进料(三角形)的生长趋势。用连续水进料进行使用所有其他突变体的发酵。
图13A和13B显示用连续水进料进行的对照宿主(□)和60E4metA(Y294C)(Δ)宿主细胞发酵的细胞外(图13A)和细胞内(图13B)甲硫氨酸水平。进行连续水进料的对照宿主细胞(□)和60E4metA宿主细胞(Y294C)(Δ)发酵的细胞外培养基中的磷酸盐水平也示于虚线曲线(图13A)和(图13B)。
图14A和14B显示本发明突变的宿主细胞株的细胞外(图14A)和细胞内(图14B)甲硫氨酸水平。也分别显示了用连续甲硫氨酸(■)或连续水进料(□)进行的两个对照宿主细胞发酵的细胞外和细胞内甲硫氨酸水平。
图15显示了在发酵期间细胞外磷酸盐的水平。
图16A和16B显示大肠杆菌宿主细胞发酵的运行末端滴度(图16A)和时间过程滴度(图16B)。用连续甲硫氨酸(■)或连续水进料(□)进行对照宿主细胞(60E4)发酵。用连续水进料(Δ)或无进料(▲)进行60E4metA宿主细胞(Y294C)发酵。使用所有其他的突变宿主细胞的发酵用连续水进料进行。
图17A和17B分别阐述对60E4宿主细胞(对照宿主细胞)和60E4metA宿主细胞(Y294C)发酵期间获得的全细胞培养液样品进行的蛋白质印迹的结果。
图18A和18B显示了分别对应于SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的抗血管内皮生长因子(抗VEGF)抗体Fab片段轻链和重链的核酸序列。
图19A和19B阐述了如通过OD550测量的10升大肠杆菌发酵的生长趋势。分别用无进料(正方形)或连续甲硫氨酸进料(圆圈)进行对照宿主(66F8或64B4)发酵步骤AF2或AF3。用无进料进行66F8metA(Y294C)和64B4metA(Y294C)宿主发酵(三角形)。
图20A、20B和20C阐述分别使用宿主菌株60E4(对照宿主)和60E4metA(Y294C)、66F8(对照宿主)和66F8metA(Y294C)、和64B4(对照宿主)和64B4metA(Y294C)的重组蛋白质产物的产率。
图21A和21B显示了分别对应于SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的抗血管内皮生长因子(抗VEGF)抗体Fab片段轻链和重链的氨基酸序列。
图22A和22B显示了分别对应于SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49的抗因子D抗体Fab片段轻链和重链的氨基酸序列。
图23A、23B和23C显示了抗MET抗体轻链(SEQ ID NO：50)、重链(SEQ ID NO：51)和重链片段(SEQ ID NO：52)的氨基酸序列。
发明的详细描述
除其他外，本发明提供了用于防止正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中和多肽中的方法和组合物，特别是在微生物中的重组蛋白生产期间。本发明还提供了用于本发明方法中的微生物宿主细胞和核酸分子。
一般方法
除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术对于本领域技术人员是已知的并且是可获得的。这些技术在文献中描述，如，Molecular Cloning:A laboratory Manual,third edition(Sambrook等人,2001)Cold Spring Harbor Press；OligonucleotideSynthesis(P.Herdewijn编辑,2004)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑,1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编辑,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；以及ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)。抗体片段和多肽在细菌中的表达描述于，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
定义
术语“异源蛋白质”或“异源多肽”是指不是由感兴趣的细胞或生物体(如微生物)天然合成或产生的蛋白质或多肽。例如，大肠杆菌细胞可产生人蛋白质或人多肽，由此产生的人蛋白质或人多肽是异源蛋白质或异源多肽。在本发明的上下文中特别感兴趣的是那些含有甲硫氨酸的异源蛋白质或异源多肽。如本文所用的异源蛋白质或异源多肽也指重组蛋白质或重组多肽。
术语“正亮氨酸错误掺入”是指正亮氨酸残基掺入到蛋白质或多肽中，而对于所述蛋白质或多肽，相应的编码该蛋白质或多肽的核酸编码的却是甲硫氨酸残基。
术语“突变的等位基因”或“突变等位基因”指具有不同于野生型等位基因的核酸序列的等位基因，或具有从野生型等位基因的核酸序列改变的核酸序列的等位基因(野生型等位基因，即，如感兴趣的细胞或微生物中天然发现的)。
术语“突变的微生物”或“突变微生物”指包含一个或多个突变的等位基因或突变等位基因的微生物。
如本文所用的短语“基本上降低”或“基本上不同”，指的是两个数值(通常一个与分子相关，另一个与参照/比较分子相关)间的差异至足够高的程度，使得本领域技术人员将认为在通过所述值测得的生物学特征的背景中，这两个值之间的差异是统计学上显著的(例如，蛋白质或多肽中的正亮氨酸含量)。
“分离的”核酸是指从其天然环境的成分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“分离的metA核酸分子”或“分离的metK核酸分子”是指一种或多种分别编码MetA或MetK的核酸分子，在单一的载体或不同的载体中包含的这样的核酸分子(多个核酸分子)，以及存在于宿主细胞的一个或多个位置上的这样的核酸分子(多个核酸分子)。“分离的metA核酸分子”或“分离的metK核酸分子”还指突变的metA等位基因或突变的metK等位基因。
短语“不含正亮氨酸错误掺入的蛋白质或多肽”是指不包含可检测水平的正亮氨酸残基的蛋白质或多肽。
如本文所用，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数的引用，除非另有说明。
本文所提到的“约”某个值或“约”某个参数是指在本技术领域中的本领域技术人员已知的相应值的通常的误差范围。本文所提到的“约”某个值或“约”某个参数包括(和描述)涉及该值或参数本身。例如，描述提到“约X”包括“X”的描述。
防止或减少正亮氨酸错误掺入的方法
本发明部分地涉及用于防止或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中和多肽中的方法和组合物，特别是在微生物中生产重组蛋白的期间。
之前已经描述了在大肠杆菌中重组蛋白质的生产期间正亮氨酸残基代替甲硫氨酸残基错误地掺入。目前用于防止或减少正亮氨酸错误掺入的一种方法是在发酵过程中向培养基中连续或浓注进料甲硫氨酸。尽管这种策略在减少正亮氨酸错误掺入中是有效，但是存在几个与发酵过程中连续或浓注进料或加入甲硫氨酸相关的操作缺点。例如，向培养基的连续或浓注进料增加了操作的复杂性和发酵过程的总成本。此外，甲硫氨酸进料导致了不希望的发酵培养基的稀释，导致较低的细胞密度，并可能降低产物的收率。
为了克服这些缺点，本发明的发明人提供了连续或浓注甲硫氨酸进料的替代法，以防止或减少在异源蛋白质或多肽生产中的正亮氨酸的错误掺入。特别是，本发明提供了工程化的微生物(如大肠杆菌)宿主细胞以生产足以防止或减少在重组蛋白生产期间正亮氨酸错误掺入的程度或范围的甲硫氨酸，其中包括在高的宿主细胞密度下进行的重组蛋白质生产。
先前已经报道了用于大规模生产甲硫氨酸的大肠杆菌宿主细胞突变体(见，例如，Chattopadhyay等人,(1991)J Gen Microbiol 137:685-691；Nakamori等人,(1999)Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185；Usuda和Kurahashi(2005)Appl Environ Microbiol 71:3228-3234；国际专利申请公开号WO2005/1112022005年；和美国专利申请公开号US2009/0298135)。这些突变的大肠杆菌菌株中的许多在与甲硫氨酸生物合成的调控相关的以下三个基因中含有突变：metJ、metA和metK。
在大肠杆菌中甲硫氨酸生物合成的转录调控涉及酶MetJ(metJ基因产物)。MetJ是转录阻遏剂，当与其共阻遏剂S腺苷甲硫氨酸(SAM)结合时，抑制甲硫氨酸调节子中基因的转录，从而调节细胞中甲硫氨酸的水平。(见，例如，Marincs(2006)等人,Biochem J 396:227-234)。如先前报道的，大肠杆菌的化学诱变后通过选择在乙硫氨酸上(一种毒性甲硫氨酸类似物)的生长，导致分离出在MetJ的氨基酸位置54上的丝氨酸至天冬酰胺的突变(S54N)，该突变导致解除甲硫氨酸生物合成酶的抑制并增加甲硫氨酸生产(参见Nakamori等人,(1999)ApplMicrobiol Biotechnol 52:179-185)。metJ基因的完全破坏也导致涉及甲硫氨酸生物合成途径的酶的抑制解除和甲硫氨酸的过度生产(见Usuda和Kurahashi(2005)Appl Environ Microbiol 71:3228-3234)。
大肠杆菌中的甲硫氨酸生物合成也受高丝氨酸琥珀酰转移酶(metA基因产物)反馈抑制(通过甲硫氨酸和SAM)的调控，该酶参与甲硫氨酸生物合成的第一个步骤。(见，例如，Born和Blanchard(1999)Biochemistry 38:14416-14423)。之前通过选择在毒性甲硫氨酸类似物α甲基甲硫氨酸的生长分离在大肠杆菌中导致甲硫氨酸合成去调节的反馈抗性MetA(metA基因产物)突变体。(见Usuda和Kurahashi(2005)Appl Environ Microbiol 71:3228-3234；和国际专利申请公开号WO2005/111202)。
metK基因编码酶S-腺苷甲硫氨酸合成酶，其将甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸。(见Markham等人,(1980)J Biol Chem 255:9082-9092)。以前通过选择在毒性甲硫氨酸类似物，正亮氨酸，和乙硫氨酸上的生长分离了部分丧失功能的MetK突变体，其导致SAM的低水平，因此解除甲硫氨酸生物合成酶的抑制(SAM是MetJ的共阻遏剂)。(参见Chattopadhyay等人,(1991)Gen Microbiol 137:685-691；Usuda和Kurahashi(2005)Appl Environ Microbiol 71:3228-3234；和国际专利申请公开号WO2005/111202)。
在本发明中，使野生型metA基因中特定的核酸残基突变，从而导致以下的MetA中的氨基酸取代(参见图7A和SEQ ID NO：29的野生型MetA氨基酸序列)：在氨基酸位置27上的精氨酸至半胱氨酸的取代(R27C)；在氨基酸位置64上的谷氨酰胺至谷氨酸的取代(Q64E)；在氨基酸位置294上的酪氨酸至半胱氨酸的取代(Y294C)；在氨基酸位置296上的异亮氨酸至丝氨酸的取代(I296S)；和在氨基酸位置298上的脯氨酸至亮氨酸的取代(P298L)。包括一个或多个这些MetA氨基酸取代的大肠杆菌宿主细胞产生足以导致防止正亮氨酸错误掺入到表达的异源蛋白质中的程度或范围的甲硫氨酸。
在一些实施方案中，本发明提供了各种突变的metA等位基因，其编码MetA中的氨基酸取代R27C、Q64E、Y294C、I296S和P298L(与野生型MetA氨基酸序列相比；图7和SEQ ID NO：29)。这样的突变的metA等位基因导致反馈抗性的MetA酶。使用等位基因交换方法将突变的metA等位基因引入大肠杆菌宿主细胞(60E4)中(见以下的材料和方法)，以获得突变的大肠杆菌宿主细胞菌株66H6(60E4metA(R27C))、66H8(60E4metA(Y294C))、67B8(60E4metA(Q64E))和67B9(60E4metA(I296S P298L))。评估获得的所得突变的大肠杆菌宿主细胞在没有连续的甲硫氨酸进料下进行的重组蛋白生产期间的正亮氨酸错误掺入(见以下实施例4)。
所有提及的MetA中氨基酸的位置由大肠杆菌metA基因(示于图7A和7B，对应于SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31)编码的高丝氨酸琥珀酰转移酶为基础制作。提及的氨基酸位置以将第一氨基酸甲硫氨酸计数为氨基酸位置编号1制作。来自其它生物体的高丝氨酸琥珀酰转移酶中对应区域的相应位置可由本领域技术人员通过例如，简单的序列比对识别。
在本发明中，野生型metK基因中的核酸被突变，导致MetK中氨基酸位置185上缬氨酸至谷氨酸的氨基酸取代(V185E))。(参见图8A和为野生型MetK氨基酸序列的SEQ ID NO：30)。另外，在metK基因中胞嘧啶碱基位置1132上一个特定的核酸被删除(c1132del)。包括一个或多个这些突变的metK等位基因的大肠杆菌宿主细胞产生足以导致防止正亮氨酸错误掺入到表达的异源蛋白质的程度或范围的甲硫氨酸。
在一些实施方案中，本发明还提供了多种突变的metK等位基因，其编码氨基酸取代V185E或metK等位基因中的在位置1132上的胞嘧啶碱基缺失(c1132del)。这样的突变metK等位基因导致MetK酶部分丧失功能。使用等位基因交换方法将突变的metK等位基因引入各种大肠杆菌宿主细胞(66H8；60E4metA(Y294C)，见上文)(参见以下的材料和方法)，以分别获得大肠杆菌宿主细胞菌株67C2(66H8metK(V185E))和67C3(66H8metK(c1132del))。评估获得的所得突变的大肠杆菌宿主细胞在没有连续的甲硫氨酸进料下进行的重组蛋白生产期间的正亮氨酸错误掺入(见以下实施例4)。
所有提及的MetK中氨基酸的位置由大肠杆菌metK基因编码的S-腺苷甲硫氨酸合成酶为基础制作，示于图8A和8B，对应于SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32。提及的氨基酸位置以将第一氨基酸甲硫氨酸计数为氨基酸位置编号1制作。来自其它生物体的S-腺苷甲硫氨酸合成酶中对应区域的相应位置可由本领域技术人员通过例如，简单的序列比对识别。
metA和metKde的核酸分子
以举例的方式，本发明使用包含metA和metK核酸序列的分离的核酸分子，所述metA和metK核酸序列不同于野生型metA和metK核酸序列。由本发明提供的metA和metK核酸序列编码多种对野生型metA编码的氨基酸的取代(在氨基酸位置27用半胱氨酸取代精氨酸(R27C)；在氨基酸位置64用谷氨酸取代谷氨酰胺(Q64E)；在氨基酸位置294用半胱氨酸取代酪氨酸(Y294C)；在氨基酸位置296用丝氨酸取代异亮氨酸(I296S)；在氨基酸位置298用亮氨酸取代脯氨酸(P298L)；以及在氨基酸位置296用丝氨酸取代异亮氨酸(I296S)和在氨基酸位置298用亮氨酸取代脯氨酸(P298L))；和对野生型metK编码的氨基酸的取代(在氨基酸位置185用谷氨酸取代缬氨酸(V185E)和包含位置1132上胞嘧啶碱基缺失的核酸序列(cdel1132del))。编码导致这些氨基酸取代的metA等位基因或metK等位基因的任何核酸序列的用途被特别考虑用于本发明的方法中。
本发明还提供了分离的metA核酸分子，其编码多种改变的MetA酶(即，编码多种突变的高丝氨酸琥珀酰转移酶的酶)。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。
本发明还提供了分离的metK核酸分子，其编码多种改变的MetK酶(即，编码多种突变的S-腺苷甲硫氨酸酶)。在一些实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。
以举例的方式，本发明还提供突变的metA等位基因的多种组合和相应的分离的核酸分子，其包含编码以下MetA中氨基酸取代的核酸序列：在氨基酸位置27用半胱氨酸取代精氨酸(R27C)；在氨基酸位置64用谷氨酸取代谷氨酰胺(Q64E)；在氨基酸位置294用半胱氨酸取代酪氨酸(Y294C)；在氨基酸位置296用丝氨酸取代异亮氨酸(I296S)；在氨基酸位置298用亮氨酸取代脯氨酸(P298L)；以及在氨基酸位置296用丝氨酸取代异亮氨酸(I296S)和在氨基酸位置298用亮氨酸取代脯氨酸(P298L)。在一些方面中，由本发明提供的突变的metA等位基因导致反馈抗性(即，反馈不敏感的)MetA酶。氨基酸位置是参照示于图7A和SEQ ID NO：29的野生型MetA氨基酸序列。
以举例的方式，本发明还提供突变的metK等位基因的多种组合和包含编码以下MetK中氨基酸取代的核酸序列的相应的分离的核酸分子：在氨基酸位置185用谷氨酸取代缬氨酸(V185E)。本发明还提供在metK等位基因位置1132含有胞嘧啶碱基缺失(c1132del)的核酸序列。在一些方面，由本发明提供的突变的metK等位基因导致MetK酶部分功能丧失。氨基酸位置参照野生型MetK氨基酸序列，如图8A和SEQ ID NO：30所示。
用于本发明方法的微生物
如本文和以举例的方式描述的，对大肠杆菌宿主细胞进行工程化，以使细菌产生足以用于防止或减少重组蛋白质生产期间正亮氨酸错误掺入程度或范围的甲硫氨酸，包括以高的宿主细胞密度进行的重组蛋白生产。因此，在本文提供的一些实施方案中，本发明提供了突变的微生物菌株(即，突变的微生物宿主细胞)，其产生甲硫氨酸至足以减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围(例如，至足以减少或防止正亮氨酸错误掺入到重组蛋白或重组多肽的程度或范围，或至足以减少或防止正亮氨酸错误掺入到异源蛋白质或异源多肽的程度或范围)。
适于在本方法的中使用的起始大肠杆菌宿主细胞包括，例如，(但不限于)大肠杆菌W3110、大肠杆菌294、大肠杆菌X1776等。大肠杆菌宿主细胞的这些实例是说明性的而不是限制性的。大肠杆菌菌株W3110是一个常见的用于重组DNA产物发酵的宿主菌株。任何上述大肠杆菌宿主细胞株的突变的大肠杆菌宿主细胞也可以用作起始的宿主细胞，然后进一步修饰以含有本文所述的突变的metA和/或metK等位基因。
本发明表明，在重组蛋白质生产期间使用含有多种metA和metK突变的等位基因和metA和metK突变的等位基因的组合的大肠杆菌宿主细胞，有效地防止正亮氨酸错误地掺入到表达的重组蛋白质(见下实施例4)。
本发明提供微生物，其中所述微生物产生甲硫氨酸至足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围。在一些方面中，本发明提供微生物，其中所述微生物是反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶的微生物。在一些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物。在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因编码MetA中的R27C氨基酸取代、MetA中的Q64E氨基酸取代、MetA中的Y294C氨基酸取代、MetA中的I296S氨基酸取代、或MetA中的P298L氨基酸取代。在一些实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因的微生物，所述突变的metA等位基因编码一种以上上述氨基酸取代，包括，例如，编码MetA中的I296S氨基酸取代和P298L氨基酸取代的突变的metA等位基因。在多各方面中，包含任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物是细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于生产异源(例如，重组)多肽和异源(例如重组)蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽和异源蛋白质。
如上所述，本发明提供包含一种或多种突变的metA等位基因的微生物。在一些实施方案中，编码MetA中的R27C氨基酸取代、编码在MetA中的Q64E氨基酸取代、编码MetA中的Y294C氨基酸取代、或编码MetA中的I296S氨基酸取代和P298L氨基酸取代的突变的metA等位基因，分别被包含SEQ ID NO：23(R27C)、SEQ ID NO：26(Q64E)、SEQ ID NO：24(Y294C)或SEQ ID NO：25(I296S和P298L)的核酸序列编码。在其他实施方案中，由本发明提供的微生物包含突变的metA等位基因，所述突变的metA等位基因由包含SEQ ID NO：23(R27C)、SEQ ID NO：26(Q64E)、SEQ ID NO：24(Y294C)或SEQ ID NO：25(I296S和P298L)的核酸序列编码。在多个方面，包括任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物为细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于生产异源(例如，重组)多肽和异源(例如重组)蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽和异源蛋白质。
如上所述，本发明提供了用于防止或减少正亮氨酸掺入到由微生物表达的蛋白质和多肽中的方法，其中所述微生物是生产甲硫氨酸至足以防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围的微生物。在一些方面中，本发明提供微生物，其中，微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些实施方案中，本发明提供包含突变的metK等位基因的微生物。在其他实施方案中，本发明提供包含突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metK等位基因编码MetK中的V185E氨基酸取代。在一些实施方案中，本发明提供包含突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基1132上核酸胞嘧啶的缺失。在各个方面，包括任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物为细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于生产异源(例如，重组)多肽和异源(例如重组)蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽和异源蛋白质。
如上所述，本发明提供包含一种或多种突变的metK等位基因的微生物。在一些实施方案中，编码MetK中的V185E氨基酸取代或在metK等位基因的核酸残基1132上包含核酸胞嘧啶缺失的突变的metK等位基因，分别由包含SEQ ID NO：27(V185E)的核酸序列或包含SEQ ID NO：28(c1132del)的核酸序列编码。在其他实施方案中，由本发明提供的微生物包含由包含SEQ ID NO：27(V185E)或SEQ ID NO：28(c1132del)的核酸序列编码的突变的metK等位基因。在各方面中，包含任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物是细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的微生物用于生产异源(例如，重组)多肽和异源(例如重组)蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽中和异源蛋白质中。
导致本文所述的氨基酸取代的任何编码metA或metK等位基因的核酸序列的用途特别考虑用于本发明的方法中。
在其他实施方案中，本发明提供了包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物。在一些实施方案中，由本发明提供的微生物是包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物，其中突变的metA等位基因编码MetA中的Y294C氨基酸取代，和突变的metK等位基因编码MetK中的V185E氨基酸取代。在由本发明提供的一些实施方案中，微生物是包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的微生物，其中所述突变的metA等位基因编码MetA中的Y294C氨基酸取代，和突变的metK等位基因包含在metK等位基因的核酸残基1132上核酸胞嘧啶的缺失。在各个方面，包括任何一种或多种由本发明提供的核酸序列的微生物为细菌；在其它方面，所述微生物是大肠杆菌。本发明特别地提供了本文中描述的任何微生物用于生产异源(例如，重组)多肽和异源(例如重组)蛋白质的用途，其中，减少或防止了正亮氨酸错误地掺入到异源多肽中和异源蛋白质中。
微生物菌株的生产
本发明提供用于生产微生物(例如大肠杆菌的宿主细胞)的方法，其中，该微生物产生甲硫氨酸至足以减少或防止正亮氨酸错误地掺入到多肽和蛋白质的程度或范围。以举例的方式，使用如本领域已知的和先前所描述的等位基因交换方法生成包含突变的metA等位基因和/或突变的metK等位基因的大肠杆菌宿主细胞(参见Metcalf等人,(1994)Gene138:1-7；和Bass等人,(1996)J Bacteriol 178:1154-61；参见本说明书的材料和方法部分)。本发明并不限于产生包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因的大肠杆菌宿主细胞的方法。用于引入突变的等位基因的各种方法或以其他方式产生包含突变的等位基因的微生物菌株(例如，细菌，大肠杆菌)的各种方法，对本领域技术人员是公知的。
防止或减少正亮氨酸的错误掺入
本发明的方法和组合物可用于生产异源或重组蛋白质或多肽，并且可用于大规模和小规模的蛋白质或多肽的生产。本发明的方法和组合物特别地对微生物高密度发酵是有用的，例如，大肠杆菌宿主细胞用于生产重组蛋白质和多肽。由本发明提供的方法和组合物对重组生产蛋白质和多肽是有用的，特别是用于其中正亮氨酸的错误掺入是不希望的重组蛋白质和多肽生产中，例如，用于各种研究和治疗应用的重组蛋白质和多肽中。
在一些实施方案中，本发明提供了用于防止或减少正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达所述蛋白质或多肽，其中所述微生物是反馈抗性或反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶的微生物。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。在一些实施方案中，反馈抗性或反馈不敏感的高丝氨酸琥珀酰转移酶的微生物是包含突变的metA等位基因的微生物。在一些实施方案中，解除甲硫氨酸生产抑制的微生物是包含突变的metK等位基因的微生物。在其他实施方案中，用于防止或减少正亮氨酸错误掺入的微生物包含突变的metA等位基因和突变metK等位基因。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含选自：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核酸序列。在其他实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自R27C、Q64E、Y294C、I296S和P298L的MetA中的氨基酸取代。在其他实施方案中，所述核酸序列编码由I296S和P298L二者组成的MetA中的氨基酸取代。氨基酸位置参照野生型MetA氨基酸序列，如图7A和SEQ ID NO：29所示。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含编码MetK的核酸序列，其中所述核酸序列编码MetK中的V185E氨基酸取代。在其他实施方案中，所述核酸序列包含在metK等位基因的核酸残基位置1132上的胞嘧啶碱基缺失。氨基酸位置参照野生型MetK氨基酸序列，如图8A和SEQ ID NO：30所示。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达所述蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，并且进一步地，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ IDNO：24的核酸序列，和突变的metK等位基因包含SEQ ID NO：27的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达所述蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含SEQ ID NO：24的核酸序列，和突变的metK等位基因包含SEQ ID NO：28的核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因和metK等位基因，其中突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代Y294C的核酸序列，并且突变的metK等位基因包含编码MetK中氨基酸取代V185E的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物包含突变的metA等位基因和metK等位基因，其中突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代Y294C的核酸序列，并且突变的metK等位基因包含核酸序列，所述核酸序列包含在metK等位基因的核酸残基位置1132上的胞嘧啶碱基缺失。氨基酸位置参照示于图7A和SEQ ID NO：29的野生型MetA氨基酸序列和参照示于图8A和SEQ ID NO：30的野生型MetK氨基酸序列。
在通过本发明提供的微生物用于减少或防止正亮氨酸错误掺入到蛋白质中或多肽中的方法的某些方面，所述微生物是细菌，尤其是大肠杆菌。在其它方面中，所述蛋白质或多肽是异源蛋白质或异源多肽，或重组蛋白质或重组多肽。例如，所述微生物可以包括编码对所述微生物是异源的蛋白质或多肽的核酸；例如，如通过使用重组表达载体，用编码对所述微生物是异源的蛋白质或多肽的核酸转化该微生物，这样的核酸可以是，例如DNA(例如，cDNA或基因组DNA)。在其它方面，该方法进一步包括在适宜表达蛋白质或多肽的条件下培养微生物。在一些实施方案中，在培养基中培养微生物，其中所述培养基包含低浓度甲硫氨酸。然后所述蛋白或多肽可以被回收、纯化等；回收可以是从，例如，微生物的周质或培养基中回收。在一些方面中，所述培养发生在发酵罐中，例如，在高的细胞密度发酵条件下培养。
编码异源蛋白质或多肽的异源核酸在合适的启动子控制下被适当地插入到可复制载体中用于在微生物中表达。许多载体可用于这一目的，并且合适载体的选择将取决于，例如，要插入到载体的核酸大小或要用该载体转化的特定微生物宿主细胞。合适的载体是本领域普通技术人员公知的。
由本发明提供的方法和组合物对于其中正亮氨酸错误掺入是不希望的重组蛋白质和多肽的生产特别有用，例如，在用于各种治疗、医疗、研究和诊断应用的重组蛋白质和多肽的生产中特别有用。例如，本发明的方法和组合物可应用于重组生产治疗性抗体，例如，生产用于医疗和药物应用的多克隆和单克隆抗体。用于医疗和药物用途的多克隆和单克隆抗体的实例包括，但不限于，抗VEGF抗体、抗因子D抗体、抗肝细胞生长因子受体抗体(例如，抗Met抗体)等。
本发明的方法和组合物还对生产抗体片段是有用的。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。由本发明的方法、组合物和微生物所提供的重组抗体的生产，可以通过在上述微生物(例如，细菌宿主细胞，大肠杆菌)中表达编码抗体重链多肽的核酸和表达编码抗体轻链多肽的核酸进行。在一些方面中，所述抗体重链和抗体轻链是全长重链和轻链抗体多肽。在其它方面中，所述抗体重链是抗体Fab片段的重链，所述抗体轻链是抗体Fab片段的轻链。
本发明的方法和组合物还对生产多特异性抗体是有用的，例如，对生产双特异性抗体是有用的。多特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的多特异性抗体可结合蛋白质的两个不同表位，或者可以结合两种不同蛋白质的两个不同表位。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)；国际申请公开号WO 93/08829；Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991)；和“knob-in-hole”工程化(见，例如，美国专利号5,731,168)。
另外，本发明的方法和组合物对于生产用于治疗和研究应用的其它生物分子是有用的，例如，对于生产人生长激素(生长激素)、胰岛素等是有用的。
实施例
以下是本发明的方法和组合物例子。应该理解的是结合上文提供的一般描述，可实施各种其它实施例。
材料和方法
细菌菌株、质粒和生长条件
本文中所描述的实施例中使用的细菌菌株是大肠杆菌菌株W3110的衍生物。(见Bachmann(1972)Bacteriol Rev 36:525-557)。以下列浓度对所有标记物维持抗生素选择：羧苄青霉素(质粒或染色体)，50μg/ml；卡那霉素(染色体)，30μg/ml；四环素(质粒或染色体)，10μg/ml。
菌株和质粒的构建
在质粒和细菌菌株(即，大肠杆菌)构建中使用的寡核苷酸列于下表1中。使用标准技术进行克隆、DNA分析、PCR扩增、转化、电穿孔和P1转导。染色体等位基因是由P1转导移动的。metJ::KanR等位基因来源于细菌菌株JW3909-1，该菌株从Coli Genetic Stock Center(CGSC，耶鲁大学)获得。所有的等位基因置换经PCR分析证实。
表1
引物名称 序列(5’-3’)a
SacI-metAflank-F CACACGAGCTCCTCATTTTGCTCATTAACGTTGG SEQ ID NO：1
SalI-metAflank-R CACACGTCGACGCGAATGGAAGCTG SEQ ID NO：2
SacI-metKflank-F CACACGAGCTCGTATGCAAAGCAGAGATGC SEQ ID NO：3
SalI-metKflank-R CACACGTCGACCGTCATTGCCTTGTTTG SEQ ID NO：4
metAflankmid-F GTTCTGATCCTTAACCTGATGCCGAAGAAG SEQ ID NO：5
metAflankmid-R CCAGCGTTTGCGCATCATATTCGG SEQ ID NO：6
metKflankmid-F GGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCC SEQ ID NO：7
metKflankmid-R GAACTCACGTACCAGCAGGGTCAGTTG SEQ ID NO：8
pS1080-P CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG SEQ ID NO：9
pS1080-T AGTGAACGGCAGGTATATGTGATGG SEQ ID NO：10
QC-metAR27C-F GTGATGACAACTTCTtGTGCGTCTGGTCAGG SEQ ID NO：11
QC-metAR27C-R CCTGACCAGACGCACaAGAAGTTGTCATCAC SEQ ID NO：12
QC-metAQ64E-F CAAACTCACCTTTGgAGGTCGATATTCAGC SEQ ID NO：13
QC-metAQ64E-R GCTGAATATCGACCTcCAAAGGTGAGTTTG SEQ ID NO：14
QC-metAY294C-F GCTCAACTATTACGTCTgCCAGATCACGCCATACG SEQ ID NO：15
QC-metAY294C-R CGTATGGCGTGATCTGGcAGACGTAATAGTTGAGC SEQ ID NO：16
QC-metAI296SP298L-F CGTCTACCAGAgCACGCtATACGATCTACG SEQ ID NO：17
QC-metAI296SP298L-R CGTAGATCGTATaGCGTGcTCTGGTAGACG SEQ ID NO：18
QC-metKV185E-F ATCGATGCTGTCGaGCTTTCCACTCAG SEQ ID NO：19
QC-metKV185E-R CTGAGTGGAAAGCtCGACAGCATCGAT SEQ ID NO：20
QC-metKc1 132del-F GCGCAGCTGCTGGCGATGCTGCCG SEQ ID NO：21
QC-metKc1 132del-R CGGCAGCATCGCCAGCAGCTGCGC SEQ ID NO：22
a带下划线的核酸残基引入氨基酸突变。小写的核酸残基表示不同于野生型核酸序列的残基。
使用引物SacI-metAflank-F和Sal I-metAflank-R从细菌菌株W3110(Bachmann(1972)Bacteriol Rev 36：525-557)PCR扩增metA基因，用SacI和SalI消化，并连接到SacI和SalI消化的质粒pS1080以获得质粒pS1080-metAflank。质粒pS1080-metAflank(R27C)、pS1080-metAflank(Q64E)、pS1080-metAflank(Y294C)和pS1080-metAflank(I296SP298L)通过诱变质粒pS1080-metAflank构建，其中使用QuikChange试剂盒(Stratagene)和分别使用以下的引物组(QC-metAR27C-F；QC-metAR27C-R)，(QC-metAQ64E-F；QC-metAQ64E-R)，(QC-metAY294C-F；QC-metAY294C-R)和(QC-metAI296SP298L-F；QC-metAI296SP298L-R)。
使用引物SacI-metKflank-F和SalⅠ-metKflank-R从细菌菌株W3110PCR扩增metK基因，用SacI和SalI消化，并连接到SacI和SalI消化的质粒pS1080以获得质粒pS1080-metKflank。质粒pS1080-metKflank(V185E)和pS1080-metKflank(c1132del)通过诱变质粒pS1080-metKflank构建，其中使用QuikChange试剂盒(Stratagene)和分别使用以下引物组：(QC-metKV185E-F；QC-metKV185E-R)和(QC-metKc1132del-F；QC-metKc1132del-R)。
使用之前描述的方法进行等位基因交换(参见Metcalf等人,(1994)Gene 138:1-7；和Bass等人,(1996)J Bacteriol 178:1154-61)。
如上所述，使用Metcalf等人(同上)描述的、如Bass等人(同上)改造的方案进行等位基因交换。共合体(Cointegrate)转移到60E4宿主细胞背景或66H8宿主细胞背景。蔗糖反选择后，通过在含有羧苄青霉素的LB琼脂和LB琼脂平板上复制划线针对羧苄青霉素敏感性筛选蔗糖抗性菌落。随后分离羧苄青霉素敏感的菌落，通过完整metA或metK阅读框的PCR扩增以及随后的DNA测序确认等位基因交换。自杀质粒载体pS1080包含条件的R6Kγ起始和羧苄青霉素抗性选择标记，以及可反选择的sacB基因，其赋予蔗糖敏感性。
在本文描述的实验中所用的细菌菌株和质粒列于下表2。
表2
发酵
用基于pBR322的表达质粒转化大肠杆菌宿主菌株60E4，所述基于pBR322的表达质粒含有编码抗-VEGF抗体的抗原结合(Fab)片段的轻链和重链的多核酸(分别为SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34)。(参见国际申请公开号WO1998/45331中的抗VEGF抗体Y0317；国际申请公开号WO2002/40697(实施例2，描述了抗VEGF抗体Y0317的发酵)；和Chen等人,(1999)J Mol Biol 293:865-881，抗VEGF抗体Y0317，每一个以其整体被引入作为参考)。
用表达质粒转化大肠杆菌宿主菌株66F8，所述表达质粒含有编码分别对应于氨基酸序列SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49的抗因子D抗体的抗原结合(Fab)片段的轻链和重链的多核酸(见国际申请公开号WO2009/134711中的抗因子D抗体编号238-1和国际申请公开号WO2008/055206中的抗因子D抗体编号111，其每一个在此被整体引入作为参考)。
使用表达质粒转化大肠杆菌宿主菌株64B4，所述表达质粒含有编码分别对应于氨基酸序列SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52的抗Met抗体轻链、重链和重链片段的多核酸。
重组重链和轻链Fab片段多肽的表达通过phoA启动子控制，当培养基中的无机磷酸盐耗尽时发生诱导(参见Laird等人,(2005)ProteinExpr Purif 39:237-246)。重链和轻链Fab片段多肽由STII信号序列被定向输出到大肠杆菌周质，在周质中组装产物。10升工作体积(WV)的高细胞密度发酵如前所述进行(参见Simmons等人,(2002)J ImmunolMethods 263:133-147)。在细胞密度大约200OD550时，启动连续的3％甲硫氨酸或水进料，并且进料贯穿发酵过程的其余部分。
利用宿主细胞60E4(发酵过程AF1)、宿主细胞66F8(发酵过程AF2)和宿主细胞64B4(发酵过程AF3)检查了三种不同的发酵过程(见实施例5和下面的表4)。
纯化
发酵完成后，全细胞培养液在发酵罐中冷却至<15℃，将冷却的培养液用于蛋白质纯化处理。将一体积冷却的培养液与0.06体积的MgSO4(最终浓度60mM)混合，并用柠檬酸(1M)滴定至pH 3.8。然后用微射流机(microfluidizer)在约12000psi下使细胞破坏(Microfluidics,Redwood Shores,CA)，通过连续振荡在35℃下孵育破碎的细胞3小时。用冷的纯水将匀浆稀释3倍，并使用固定角度的转子在4℃、在6000×g下离心稀释的匀浆20分钟。用0.22μm过滤器过滤上清液并用1.5M Tris碱滴定至pH 7.5。
如下所述用蛋白G亲和色谱法纯化重组的Fab蛋白质。聚制备(Poly-prep)色谱柱(Bio Rad)中填充有蛋白G琼脂糖4快流树脂(Protein G Sepharose 4Fast Flow resin)(GE Healthcare)，并用至少5倍柱体积的PBS(pH值7.2)平衡色谱柱。过滤的上清液加载到蛋白G填充柱，用PBS洗涤两次，并用50mM柠檬酸洗脱。用1.5M Tris碱滴定最终的Fab蛋白集合至pH7，如下所述分析正亮氨酸含量。这对应于发酵过程AF1的纯化。
使用三种不同的重组蛋白产物纯化过程，其每一个特异于发酵过程AF1(对于宿主细胞60E4)、AF2(对于宿主细胞66F8)、或AF3(对于宿主细胞64B4)、(见实施例7和下面的表6)。
氨基酸分析
为了确定细胞内的甲硫氨酸水平，含有87.6×109个细胞的全细胞培养液样品在4℃下在17000×g下沉淀5分钟，在PBS中洗涤一次，然后再悬浮于提取缓冲液(10mM Tris，5mM EDTA，5mM碘乙酰胺(IAM)，0.2mg/ml溶菌酶，pH6.8)中。然后通过两个周期的超声处理将细胞裂解，然后在13500rpm下离心20分钟，以除去细胞碎片。将上清液转移至0.2μm的微离心管过滤器(Bio Rad公司)，并在4℃下在17000×g离心5分钟。将滤液稀释并如先前所述分析氨基酸(Feeney等人,(2013)Biotechnology and Bioengineering,110:1087-1097)。为了确定细胞外的甲硫氨酸水平，在14000×rpm离心3分钟后，稀释从发酵期间收集的全细胞培养液制备的上清液样品，并如下所述分析氨基酸(见Feeney等人,(2013)Biotechnology and Bioengineering,110:1087-1097)。
采用反相HPLC法分析了氨基酸浓度。用6氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯处理含氨基酸的样品，以产生高度荧光的衍生物(见Cohen和Michaud(1993)Anal Biochem 211:279-287)。使用的HPLC分析检测到下列氨基酸，检测限度为0.01mM：组氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，丙氨酸，脯氨酸，鸟氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和色氨酸。
磷酸盐水平
根据之前公开的方法使用COBAS Integra 400(Roche Diagnostics)测量磷酸盐水平(见Taussky和Shorr(1953)J Biol Chem 202:675-685)。
滴度测定
全细胞培养液样品用提取缓冲液(10mM Tris，5mM EDTA，5mMIAM，0.2mg/ml溶菌酶，pH6.8)稀释6倍，并在冰上孵育10分钟。经过两轮超声处理后，将样品在4℃、在17000×g下离心20分钟。利用HPLC测定来自上清液的产品滴度。
整体OD 550 测量
使用下列公式通过梯形积分确定整体OD550：
iOD 550 = &Sigma; i = j i = k ( t i - t i - 1 ) ( OD 550 , i + OD 550 , i - 1 ) 2
其中，
j＝在培养时间24小时或24小时之后进行的第一测量的指数；k＝进行的OD550测量的总数量；ti＝在测量i时经过的培养时间，以小时计；OD550，i＝在测量i时的OD550。
正亮氨酸分析
为了分析正亮氨酸含量，基于先前描述的方法对纯化的重组蛋白样品进行胰蛋白酶消化(参见Yu等人,(2009)Anal Chem 81:9282-9290)。如先前所述使用反相HPLC和在线液相色谱串联质谱法(LC/MS)进行肽图谱分析(参见Yu等人,(2009)Anal Chem 81:9282-9290；和Yu等人,(2011)Anal Chem 83:5912-5919)。使用LTQ-Orbitrap XL仪器进行高分辨率质量测定(Thermo Scientific，San Jose,US)，其中使用分辨率设定在m/z 400下60000的全MS测量扫描，随后通过离子阱MS2扫描感兴趣的离子。为了测定多肽中正亮氨酸的相对水平，使用带有单一同位素m/z±10ppm的提取窗口的最丰度的电荷状态，生成含有甲硫氨酸和含有正亮氨酸的肽的提取离子色谱。使用各自的整体峰面积计算含正亮氨酸品种相对于含甲硫氨酸品种的相对量。
蛋白质印迹
用提取缓冲液(10mM Tris，5mM EDTA，5mM IAM，0.2mg/ml溶菌酶，pH6.8)将发酵期间获得的全细胞培养液样品稀释6倍，并在冰上孵育10分钟。经过两轮的超声处理后，在4℃、在17000×g下离心样品25分钟。在非还原条件下将样品加载到4-12％Tris-甘氨酸凝胶上。使用iBlot印迹系统(Invitrogen)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用含0.5％明胶的NET缓冲(150mM氯化钠，5mM EDTA，50mM Tris，0.05％TritonX-100)封闭膜30分钟，随后温育在含稀释1：300,000的过氧化物酶偶联的山羊IgG级分抗人IgG Fab(MP生物医学)的封闭缓冲液中。用NET缓冲洗涤3次后，使用Western Lightning ECL底物(PerkinElmer)在X射线胶片上曝光后5秒后，印迹可视。
实施例1、在大肠杆菌发酵期间正亮氨酸的错误掺入
如上所述，正亮氨酸的错误掺入常发生在大肠杆菌中的重组蛋白生产期间。重组蛋白质生产期间正亮氨酸错误掺入的程度取决于多种因素，诸如，例如，重组蛋白的性质、使用发酵方法、和发酵培养基的内容物(见，例如，Bogosian等人,(1989)Biol Chem 264:531-539)。
为了检查重组蛋白表达发酵过程中正亮氨酸的错误掺入，进行了如下的研究。用含有编码Fab抗体片段轻链和重链的核酸序列(分别为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32)的质粒转化大肠杆菌宿主菌株60E4，并用于下面的发酵研究中，所述的发酵研究使用根据上述方法的水进料或甲硫氨酸进料。使用上述方法分析表达的重组蛋白的正亮氨酸含量。
如下表3所示，在没有连续的甲硫氨酸进料(即，水进料)时，在大肠杆菌宿主细胞60E4中表达的各重组多肽中观察到约5-10％的正亮氨酸错误掺入。正如所料，存在连续甲硫氨酸进料时，在表达的各重组多肽中没有检测到正亮氨酸(ND)。
表3
菌株 进料 肽1中的正亮氨酸(％) 肽2中的正亮氨酸(％)
60E4 Met ND ND
60E4 水 5.1±0.7 10±1.2
60E4 无进料
66H6 水 ND ND
66H8 水 ND ND
66H8 无进料 ND ND
67B8 水 ND ND
67B9 水 ND ND
67C2 水 ND ND
67C3 水 ND ND
这些结果证实，正亮氨酸错误掺入发生在无甲硫氨酸进料的细菌中的重组蛋白质生产中。
实施例2、甲硫氨酸生物合成途径突变的大肠杆菌宿主细胞的构建
如上所述，在重组蛋白发酵期间连续的甲硫氨酸进料常被用于防止正亮氨酸的错误掺入。如以上实施例1中所示，连续甲硫氨酸进料确保足够的甲硫氨酸可用于宿主细胞，从而减少或防止重组蛋白质生产过程中正亮氨酸的错误掺入。为了检查使用含有突变的metA和/或metK等位基因的大肠杆菌宿主细胞对正亮氨酸错误掺入的作用，而不是使用连续甲硫氨酸进料的效果，进行了下面的研究。
在本研究中，用等位基因交换方法(参见以上的材料和方法)，将含有R27C、Q64E、Y294C、I296S和P298L突变的metA等位基因(这些metA等位基因产生反馈抗性MetA)导入60E4宿主细胞，从而分别获得细菌宿主细胞株66H6(60E4metA(R27C))、66H8(60E4metA(Y294C))、67B8(60E4metA(Q64E))和67B9(60E4metA(I296SP298L))(见上面的表2和3)。
用等位基因交换方法(参见以上的材料和方法)，将含有V185E和c1132del(在metK基因的位置1132上胞嘧啶碱基缺失)突变的metK等位基因(其导致MetK酶功能的部分损失)导入66H8(60E4metA(Y294C))的宿主细胞，以分别获得细菌宿主细胞菌株67C2(66H8metK(V185E))和67C3(66H8metK(c1132del))(见以上表2和3)。
评估这些大肠杆菌宿主细胞在没有连续甲硫氨酸进料时进行的发酵过程中，在重组蛋白质生产期间正亮氨酸的错误掺入(见以下例3)。
实施例3、发酵结果
利用在本研究中构建的甲硫氨酸生物合成途径突变的细菌菌株进行无连续的甲硫氨酸进料的小规模发酵(10L)(见表1)。在这些实验的发酵期间使用水进料或无进料代替甲硫氨酸进料。使用对照宿主细胞株60E4进行三个如下的10L发酵：1)连续甲硫氨酸进料，2)连续水进料，以及3)无进料。
通过OD550监测的细胞生长发酵趋势示于图12A中。与进料性质(甲硫氨酸、水、或无进料)无关，甲硫氨酸生物合成途径突变的细菌宿主细胞60E4metA(R27C)，60E4metA(Y294C)，60E4metA(Y294C)metK(V185E)和60E4metA(Y294C)metK(c1132del)的生长，在发酵的生长阶段中(5-28小时)与对照宿主细胞中观察到的生长是相当的。然而，双重突变宿主细胞60E4metA(Y294C)metK(V185E)和60E4metA(Y294C)metK(c1132del)与对照宿主细胞发酵中观察到的相比，具有较低的iOD550(从发酵24小时至结束的生长曲线下的面积)(见图12B)。使用宿主细胞60E4和60E4metA(Y294C)用水进料进行的发酵，分别与用甲硫氨酸进料进行的对照宿主细胞发酵和通过无进料进行的60E4metA(Y294C)宿主细胞发酵中观察到的相比，具有稍高的iOD550。突变细胞60E4ΔmetJ::kanR和60E4metA(I296S P298L)具有较长的适应阶段，因此，与对照宿主细胞发酵所观察到的相比具有较低的iOD550(参见图12A和12B)。突变宿主细胞60E4metA(Q64E)发酵罐中生长不良，达到最大OD550为150，这比使用其它突变宿主细胞发酵中所观察到的最大OD550低大约30-40％(见图12A)。20小时后，突变宿主细胞60E4metA(Q64E)生长达到饱和，因此，使用这种突变宿主细胞的发酵具有最低的iOD550(参见图12A和12B)。
在发酵期间存在或不存在甲硫氨酸进料不影响60E4宿主细胞的生长(参见图12C)。
使用甲硫氨酸生物合成途径突变体的发酵与对照宿主细胞发酵中观察到的相比，在体内(即，细胞内)和细胞外培养基中积累更高水平的甲硫氨酸(参见图13A、13B、14A和14B)。在发酵过程开始时，在发酵培养基中存在过量的甲硫氨酸(>3mM)。当细胞开始生长时，其摄取甲硫氨酸用于蛋白质合成、甲基供体作用、以及其它功能。其结果是，随着细胞继续生长，细胞外甲硫氨酸浓度逐渐降低，在约16小时，细胞外甲硫氨酸水平达到低于可检测水平(<10μM)(参见图13A和14A)。
在16小时，不同宿主之间的细胞内甲硫氨酸浓度从0.5-2.5mM(浓度基于细胞容积)而不同。(参见图13B和14B)。在如此高的细胞内甲硫氨酸浓度下，野生型MetA被强烈抑制；然而，反馈抗性MetA突变体可能仅被较弱地抑制，从而允许突变的宿主细胞通过生物合成途径生产甲硫氨酸(见Usuda和Kurahashi(2005)Appl Environ Microbiol71:3228-3234)。然而，细胞内甲硫氨酸水平继续下降，直到约28小时，在该时间点细胞生长显著减缓。有能的是在发酵的细菌生长阶段(5-28小时)，用于蛋白质合成和其它细胞功能的甲硫氨酸利用速率可能超过在体内合成甲硫氨酸的速率。这可以解释细胞内的甲硫氨酸水平逐渐降低，直至生长阶段结束。
在发酵的重组蛋白生产期间(28小时直到发酵结束)，过生产甲硫氨酸的宿主细胞继续在体内合成甲硫氨酸，在发酵过程中的这一阶段细胞内甲硫氨酸水平持续增加(参见图13B和14B)。这些结果表明，在发酵的重组蛋白生产阶段，甲硫氨酸生物合成的速率超过用于各种细胞内功能的甲硫氨酸的利用速率。
用连续水进料进行的对照宿主细胞的发酵期间，无论是细胞外还是细胞内的甲硫氨酸水平都继续下降，在约16小时细胞外甲硫氨酸达到低于测定可检测的极限水平(10μM)，在约24小时细胞内甲硫氨酸达到低于测定可检测的极限水平(10μM)。对于用连续甲硫氨酸进料进行的对照宿主发酵，进料确保了在大约26小时后(进料开始的时间点)，在细胞内有过量的甲硫氨酸。在发酵的生产阶段，双突变的宿主细胞60E4metA(Y294C)metK(V185E)与用连续的甲硫氨酸进料进行的对照宿主细胞发酵中观察到的相比积累了更多的细胞内甲硫氨酸。
与对照宿主细胞中观察到的相比，宿主细胞60E4metA(I296SP298L)和60E4ΔmetJ::kanR的更长的适应阶段和宿主细胞60E4metA(Q64E)的不良生长，可能是由于高水平的高半胱氨酸的累积，该高半胱氨酸是甲硫氨酸生物合成途径中有毒的中间产物(参见Roe等人,(2002)Microbiology 148:2215-2222；参见图12A)。之前证明了高半胱氨酸抑制参与异亮氨酸生物合成途径第一个步骤的酶，苏氨酸脱氨酶，从而导致生长抑制(参见Tuite等人,(2005)J Bacteriol 187:4362-4371)。通过测量突变宿主细胞中的细胞内异亮氨酸水平验证了理论。分析表明，细胞内异亮氨酸水平与发酵过程中对照宿主细胞中观察到的是可比较的(数据未显示)。不能完全排除高半胱氨酸具有对细胞生长的其他毒性作用的可能性。然而，目前不能完全理解突变体间的这些生长差异。
蛋白质产物滴度的时间进程和免疫印迹数据示于图16A，16B和17。从宿主细胞60E4metA(Q64E)接种的发酵比其它宿主细胞中观察到的产生较少的产物。除了45-50h间的一个短暂的期间，在60E4metA(Q64E)宿主发酵期间磷酸盐水平从来没有耗尽(图15)；因此，重组蛋白质合成是低的。突变宿主细胞60E4metA(I296S P298L)和60E4ΔmetJ::kanR延长的适应阶段导致40小时后磷酸盐耗尽，这比通常观察到的晚大约12小时；因此，使用这些宿主细胞的发酵与较早耗尽磷酸盐的其它突变宿主细胞中观察到的相比，蛋白质产物的滴度较低(参见图12A，15和16A)。使用宿主细胞60E4metA(R27C)和60E4metA(Y294C)的发酵在所有检测的突变宿主细胞中产生最高的蛋白质产物滴度。
使用metA metK双突变的宿主细胞，60E4metA(Y294C)metK(V185E)和60E4metA(Y294C)metK(c1132del)的发酵产生有点低的蛋白质产物滴度，尽管具有与对照宿主细胞可比较的生长。这些双突变宿主细胞在metK基因中具有突变，导致MetK功能的部分丧失。MetK的产物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，其是细菌细胞中许多反应的甲基供体。但是，还不知道为什么降低的SAM水平会影响蛋白质产物滴度。在发酵过程中的连续进料可能会导致培养基的稀释，这可能导致较低的细胞密度和较低的产物滴度。没有任何进料的宿主细胞60E4metA(Y294C)发酵的生长和滴度，与使用连续水进料进行的相同宿主细胞的发酵中观察到的是可比较的。
实施例4、正亮氨酸的错误掺入
如上所述，正亮氨酸错误掺入到蛋白质是由于细胞中甲硫氨酸水平足够低，从而在蛋白质合成期间正亮氨酸可以与甲硫氨酸残基竞争加载甲硫氨酰tRNA。如以上实施例1所述，无甲硫氨酸进料进行的对照宿主细胞的发酵导致了重组蛋白质中高水平的正亮氨酸错误掺入(表3)。无甲硫氨酸进料进行的对照宿主细胞发酵的生产阶段，低细胞内甲硫氨酸水平表明了在重组蛋白中正亮氨酸残基可与甲硫氨酸残基竞争。然而，在突变宿主细胞发酵的生产阶段，观察到高水平的细胞外和细胞内甲硫氨酸(参见图13B和14B)。由于升高的细胞内甲硫氨酸水平，可以预期在使用这样的宿主细胞发酵中正亮氨酸的错误掺入能被最小化或消除。
重组蛋白质的胰蛋白酶消化得到2种含甲硫氨酸的肽：肽1：LSCAASGYDFTHYGM34NWVR(SEQ ID NO：35)；和肽2：STAYLQM83NSLR(SEQ ID NO：36)。肽图谱分析表明，从突变宿主细胞发酵中纯化的重组蛋白质集合包含小于可检测水平的正亮氨酸错误掺入，而无甲硫氨酸进料进行的对照宿主细胞发酵在两种含甲硫氨酸的肽中均积累了高水平的正亮氨酸(见表3)。这些结果表明，使用本发明的大肠杆菌宿主细胞菌株导致正亮氨酸掺入异源(例如重组)多肽的减少或防止。
实施例5、其他细菌宿主细胞
除使用宿主细胞60E4或来源于60E4的宿主细胞进行实验外，还开发了其他两个细菌宿主细胞，并检查了其生长，正亮氨酸错误掺入和重组蛋白生产，如下。
细菌宿主细胞66F8和64B4(以及细菌宿主细胞60E4)在上文表2中说明了。如表2所示，与宿主细胞66F8和64B4(其享有类似的基因型)相比，宿主细胞60E4中存在一些不同的基因型。
利用宿主细胞60E4(发酵过程AF1)，宿主细胞66F8(发酵过程AF2)和宿主细胞64B4(发酵过程AF3)检查了三种不同的发酵过程。下面的表4示出了在检查的各发酵过程(AF1，AF2和AF3)中多种发酵参数(pH值、搅拌、培养持续时间和进料开始时间)中的差异。
表4
AF1 AF2 AF3
对照宿主 60E4 66F8 64B4
pH 7.0 7.0 7.3
搅拌(rpm) 850a 650 650
培养持续时间(小时) 72 50 72
进料(甲硫氨酸或水)开始时间(OD550) 200 150 150
a细胞达到OD550为200后，搅拌降低至800，然后通过每2个小时100rpm逐步降低到500rpm。
使用上述实施例1描述的用于宿主细胞60E4的方法，将metA(Y294C)等位基因导入宿主细胞66F8和64B4。分别利用发酵过程AF2和AF3，使用66F8metA(Y294C)和64B4metA(Y294C)进行发酵，表明宿主细胞的生长与其亲本宿主细胞中观察到是相当的(参见图19A和19B；以及下表5)
实施例6、比较大肠杆菌宿主细胞的生长率和重组蛋白产物的产率
检测了各大肠杆菌宿主菌株60E4metA(Y294C)、66F8metA(Y294C)和64B4metA(Y294C)中分别使用发酵过程AF1、AF2、AF3的生长率和重组蛋白质产物的产率。如以上实施例3所述，使用如以上表4中列出的对各发酵过程的发酵过程改进，对菌株60E4的宿主细胞进行10L发酵。
对菌株60E4的各种宿主细胞观察到的生长速率和重组蛋白质产物的产率在以上实施例3中详细讨论。
如图20A、20B和20C所示，使用宿主菌株60E4metA(Y294C)、66F8metA(Y294C)和64B4metA(Y294C)获得的重组蛋白质产物的产率与使用宿主菌株60E4、66F8和64B4所观察到的是可以比较的(也参见下面的表5)。存在或不存在甲硫氨酸进料并不影响从60E4宿主细胞发酵获得的重组蛋白质产率。
表5
a对于60E4metJ和60E4metA metA(I296S P298L)宿主，分别使用6-14小时和14-22小时之间的时间计算μ。对于所有的其他宿主，使用2-10小时来计算μ。示出的μ值是n＝2轮运行的平均值。
b示出的值是n＝2轮运行的平均值。
c在发酵期间，当细胞达到OD550为200时加入最终浓度0.15mM的正亮氨酸浓注。
实施例7.正亮氨酸错误掺入的比较
使用三种不同的重组蛋白质产物的纯化过程，其各特定于发酵过程AF1(对于宿主细胞60E4)、AF2(对于宿主细胞66F8)和AF3(对于宿主细胞64B4)。下表6示出了检测的用于各发酵过程(即，AF1、AF2和AF3)的各纯化方法中的差异。
表6
a最终浓度表示为凝聚剂
使用LC-MS分析在胰蛋白酶肽上对如上所述的各重组蛋白产物进行正亮氨酸定量。
由60E4宿主产生的重组蛋白质的胰蛋白酶消化，得到2种含甲硫氨酸的肽(表7)。由66F8宿主产生的重组蛋白质的胰蛋白酶消化，得到3种含甲硫氨酸的肽(表8)。由64B4宿主产生的重组蛋白质的胰蛋白酶消化，得到6种含甲硫氨酸的肽(表9)。
表7
表8
表9
从使用60E4宿主在无甲硫氨酸进料下进行的AF1发酵过程中纯化的重组蛋白质在蛋白质中的两个甲硫氨酸残基上积累了5.1％和10％的正亮氨酸(表7)。使用宿主60E4metA(Y294C)(表7)、60E4metA(R27C)、60E4metA(Y294C)metK(V185E)和60E4metA(Y294C)metK(c1132del)，在无甲硫氨酸进料下进行的AF1发酵过程中纯化的重组蛋白质中没有检测到正亮氨酸(数据未显示)。
当60E4metA(Y294C)宿主发酵时，在发酵培养基中补充正亮氨酸(0.15mM终浓度)，在重组蛋白质中没有观察到正亮氨酸，这表明本发明的细菌宿主细胞在细胞中产生足够的甲硫氨酸，以防止重组蛋白质合成期间正亮氨酸的错误掺入。
使用66F8宿主、使用无甲硫氨酸进料进行的AF2发酵过程产生重组蛋白质，在从该重组蛋白质中获得的三种含甲硫氨酸的胰蛋白酶肽中观察到约2.7％、0.7％和1％的正亮氨酸错误掺入(见表8)。同样地，使用64B4宿主、使用无甲硫氨酸进料进行的AF3过程产生重组蛋白质，在从该重组蛋白质获得的六种含甲硫氨酸的胰蛋白酶肽中有大约1.3％、1.3％、2.4％、2.2％、1.5％和1.3％正亮氨酸错误掺入(见表9)。然而，从使用66F8metA(Y294C)宿主和64B4metA(Y294C)宿主进行的AF2和AF3发酵过程分别纯化的重组蛋白质中没有检测到正亮氨酸(见上文表8和9)。
胰蛋白酶肽图谱分析表明，从突变的宿主细胞发酵纯化的重组蛋白质集合包含小于可检测水平的正亮氨酸的错误掺入，而在无甲硫氨酸进料下进行的对照宿主细胞发酵在含甲硫氨酸的肽中积累了高水平的正亮氨酸。这些结果表明，使用本发明的大肠杆菌宿主细胞菌株导致减少或防止正亮氨酸掺入异源的(例如重组的)多肽。
虽然为了清楚地理解，以说明和实施例的方式详细地描述了上述发明，但是所述说明和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用以其全文并入本文。

Claims (36)

1.一种用于预防或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质或多肽中的方法，所述方法包括在微生物中表达蛋白质或多肽，其中所述微生物是突变的微生物，其产生足以防止或减少正亮氨酸错误地掺入到蛋白质中或多肽中的程度或范围的甲硫氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中微生物是细菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中微生物是大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中微生物是反馈抑制或反馈不敏感高丝氨酸琥珀酰转移酶微生物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中微生物是解除甲硫氨酸生产抑制的微生物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中微生物含有突变的metA等位基因、突变的metK等位基因、或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在不存在向培养基外源添加甲硫氨酸或无甲硫氨酸进料下进行微生物中蛋白质或多肽的表达。
8.一种微生物，其含有突变的metA等位基因、突变的metK等位基因、或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因。
9.根据权利要求8所述的微生物，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代的核酸序列，所述MetA氨基酸取代选自在氨基酸位置27的精氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置64的谷氨酰胺至谷氨酸的取代、在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代、在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代、和在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的核酸序列。
11.根据权利要求8所述的微生物，其中所述突变的metK等位基因包含编码在氨基酸位置185上包含缬氨酸至谷氨酸取代的MetK中氨基酸取代的核酸序列，或在metK等位基因的核酸残基位置1132上包含胞嘧啶碱基缺失的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的微生物，其中所述微生物包含突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列。
13.根据权利要求8所述的微生物，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含编码MetA中氨基酸取代的核酸序列，所述MetA氨基酸取代选自在氨基酸位置27的精氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置64的谷氨酰胺至谷氨酸的取代、在氨基酸位置294的酪氨酸至半胱氨酸的取代、在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代、在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代、和在氨基酸位置296的异亮氨酸至丝氨酸的取代和在氨基酸位置298的脯氨酸至亮氨酸的取代，并且进一步地其中所述突变的metK等位基因包含编码在氨基酸位置185上包含缬氨酸至谷氨酸取代的MetK中氨基酸取代的核酸序列，或在metK等位基因的核酸残基位置1132上包含胞嘧啶碱基缺失的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的微生物，其中所述微生物包含突变的metA等位基因，其中所述突变的metA等位基因包含选自SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的核酸序列，并且进一步地其中所述微生物包含突变的metK等位基因，其中所述突变的metK等位基因包含选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列。
15.根据权利要求8所述的微生物，进一步包含编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸。
16.根据权利要求15所述的微生物，其中编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸是编码氨基酸序列SEQ ID NO:46的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO:47的核酸。
17.根据权利要求15所述的微生物，其中编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸选自包含SEQ ID NO:33的核酸序列和包含SEQID NO:34的核酸序列。
18.根据权利要求8所述的微生物，进一步包含编码抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸。
19.根据权利要求18所述的微生物，其中编码抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸是编码氨基酸序列SEQ ID NO:48的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO:49的核酸。
20.根据权利要求8所述的微生物，进一步包含编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸。
21.根据权利要求20所述的微生物，其中所述编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸选自编码氨基酸序列SEQ ID NO:50的核酸、编码氨基酸序列SEQ ID NO:51的核酸和编码氨基酸序列SEQ IDNO:52的核酸。
22.一种用于在细菌宿主细胞中生产蛋白质或多肽的方法，其中所述蛋白质或多肽不含正亮氨酸错误掺入，所述方法包括在允许蛋白质或多肽表达的适合的培养条件下在细菌宿主细胞中表达编码该蛋白质或多肽的核酸，其中所述细菌宿主细胞包含突变的metA等位基因、突变的metK等位基因、或突变的metA等位基因和突变的metK等位基因，从而产生不含正亮氨酸错误掺入的蛋白质中或多肽中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细菌宿主细胞选自权利要求9的微生物、权利要求10的微生物、权利要求11的微生物、权利要求12的微生物、权利要求13的微生物和权利要求14的微生物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是抗体或抗体片段。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是抗体或抗体片段。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段。
27.根据权利要求26所述的方法，其中编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸是编码氨基酸序列SEQ ID NO:46的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO:47的核酸。
28.根据权利要求26所述的方法，其中编码抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段的核酸选自包含SEQ ID NO:33的核酸序列和包含SEQID NO:34的核酸序列。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是抗因子D抗体或抗因子D抗体片段。
30.根据权利要求29所述的方法，其中编码抗因子D抗体或抗因子D抗体片段的核酸是编码氨基酸序列SEQ ID NO:48的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO:49的核酸。
31.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是抗MET抗体或抗MET抗体片段。
32.根据权利要求31所述的方法，其中编码抗MET抗体或抗MET抗体片段的核酸选自编码氨基酸序列SEQ ID NO:50的核酸、编码氨基酸序列SEQ ID NO:51的核酸和编码氨基酸序列SEQ ID NO:52的核酸。
33.根据权利要求22所述的方法，其中在不存在向培养基外源添加甲硫氨酸或无甲硫氨酸进料下进行细菌宿主细胞中蛋白质或多肽的表达。
34.根据权利要求26、权利要求27、或权利要求28所述的方法生产的抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段。
35.根据权利要求29或权利要求30所述的方法生产的抗因子D抗体或抗因子D抗体片段。
36.根据权利要求31或权利要求32所述的方法生产的抗MET抗体或抗MET抗体片段。
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