CN102066419A - 人源化抗因子d抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗因子D抗体、它们的核酸和氨基酸序列、包含这些抗体的细胞和载体及它们的生产和它们在制备用于治疗与补体活化过度或不受控制有关的疾病和病症的组合物和药物中的用途。这些抗体对于疾病的诊断、预防和治疗是有用的。

Description

人源化抗因子D抗体及其用途
对相关申请的交叉引用
依据37CFR§1.53(b)提交的此非临时申请依据35USC§119(e)要求2008年4月28日提交的美国临时申请流水号61/048,431和2008年4月29日提交的美国临时申请流水号61/048,689的好处，通过述及将其内容完整收入本文。
发明背景
补体系统在清除免疫复合物和对传染剂、外来抗原、受到病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫应答中发挥中枢作用。然而，补体还涉及病理性炎症和自身免疫病。因此，抑制过度的或不受控制的补体级联活化能给具有此类疾病和状况的患者提供临床好处。
补体系统涵盖两种截然不同的活化途径，称作经典和旁路途径(V.M.Holers，在Clinical Immunology：Principles and Practice中，R.R.Rich编，MosbyPress；1996，363-391)。经典途径是一种钙/镁依赖性级联，其在正常情况中通过形成抗原-抗体复合物来活化。旁路途径是一种镁依赖性级联，其通过C3在某些易感表面(例如酵母和细菌细胞壁多糖，和某些生物聚合物材料)上沉积和活化来活化。补体途径的活化产生补体蛋白质的生物学活性片段，例如C3a、C4a和C5a过敏毒素和C5b-9膜攻击复合物(MAC)，其介导涉及白细胞趋化性，巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞活化，血管通透性，细胞溶解，和组织损伤的炎症活性。
因子D是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，其对于旁路补体途径的活化是至关重要的。它切割结合至C3b的因子B，产生C3b/Bb酶，即旁路途径C3/C5转化酶的活性成分。因子D可能是抑制的合适靶物，因为它在人体中的血浆浓度非常低(1.8μg/ml)，而且它已经显示出是旁路补体途径活化的限制酶(P.H.Lesavre和H.J.Müller-Eberhard，J.Exp.Med.，1978；148：1498-1510；J.E.Volanakis et al.，New Eng.J.Med.，1985；312：395-401)。
已经在动物模型和离体研究中证明下调补体活化有效治疗数种疾病适应证，例如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎(Y.Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.；1996，93：8563-8568)、类风湿性关节炎(Y.Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，1995；92：8955-8959)、心肺转流术和血液透析(C.S.Rinder，J.Clin.Invest.，1995；96：1564-1572)、器官移植中的超急性排斥反应(T.J.Kroshus etal.，Transplantation，1995；60：1194-1202)、心肌梗死(J.W.Homeister et al.，J.Immunol.，1993；150：1055-1064；H.F.Weisman et al.，Science，1990；249：146-151)、再灌注损伤(E.A.Amsterdam et al.，Am.J.Physiol.，1995；268：H448-H457)、和成人呼吸窘迫综合征(R.Rabinovici et al.，J.Immunol.，1992；149：1744-1750)。另外，其它炎性状况和自身免疫/免疫复合物疾病也与补体活化密切有关(V.M.Holers，见上文；B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest.，1994：24：219-228)，包括热伤、严重的哮喘、过敏性休克、肠炎症、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化、重症肌无力、膜性增生性肾小球肾炎、和斯耶格伦氏综合征。
补体介导的病症领域需要抗体治疗剂，而本发明的人源化抗因子D抗体及其抗体变体及其片段(例如抗原结合片段)提供对于满足这种需要有用的高亲和力抗体。
发明概述
一方面，本发明一般性涉及能够抑制与因子D有关的生物学活性的抗体。
一方面，本发明涉及具有多种治疗上想要的特征的人源化抗因子D抗体。本发明包括这些人源化抗因子D抗体的HVR的氨基酸序列，和它们相应的核酸序列。本发明包括所述人源化抗因子D抗体的重链和轻链可变域的氨基酸序列，和它们相应的核酸序列。本发明包括所述人源化抗因子D抗体的重链和轻链的氨基酸序列，和它们相应的核酸序列。
一方面，本发明范围内的具体抗体包括但不限于如下的人源化抗因子D抗体，其包含人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的HVR。在一个实施方案中，所述人源化抗因子D抗体包含人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的重链和/或轻链可变域。在一个实施方案中，所述人源化抗因子D抗体包含人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的重链和/或轻链。在一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11。在一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11全长抗体的抗体片段(例如抗原结合片段)。在一个实施方案中，本发明包括全长抗体或其抗原结合片段，其包含人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11重链和/或轻链的抗原结合序列。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个、或三个重链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个、或三个轻链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个重链可变域。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个轻链可变域。
一方面，本发明提供人源化抗因子D Fab克隆#111的抗体片段(例如抗原结合片段)或全长抗体，其包含对人源化抗因子D Fab克隆#111的至少一处序列修饰，其中此类全长抗体或此类抗原结合片段包含人源化抗因子DFab克隆#111重链和/或轻链的抗原结合序列。在一个实施方案中，人源化抗因子D Fab克隆#111的抗体片段(例如抗原结合片段)或全长抗体包含对人源化抗因子D Fab克隆#111序列的至少一处修饰，包含人源化抗因子D Fab克隆#111重链和/或轻链的抗原结合序列，还与人源化抗体Fab克隆#111结合基本上相同的表位。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个或三个重链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个或三个轻链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个重链可变域。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个轻链可变域。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在重链中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在轻链中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在重链可变域中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在轻链可变域中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在至少一个、两个或三个重链HVR中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在至少一个、两个或三个轻链HVR中。
一方面，本发明关注本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)，其以至少约10-9至10-12M的结合亲和力结合因子D。
一方面，本发明关注本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)，其中此类抗体的Fab片段以Fab片段对因子D摩尔比约0.05∶1(0.05)至约10∶1(10)、或约0.09∶1(0.09)至约8∶1(8)、或约0.1∶1(0.1)至约6∶1(6)、或约0.15∶1(0.15)至约5∶1(5)、或约0.19∶1(0.19)至约4∶1(4)、或约0.2∶1(0.2)至约3∶1(3)、或约0.3∶1(0.3)至约2∶1(2)、或约0.4∶1(0.4)至约1∶1(1)、或约0.5∶1(0.5)至约1∶2(0.5)、或约0.6∶1(0.6)至约1∶3(0.33)、或约0.7∶1(0.7)至约1∶4(0.25)、或约0.8∶1(0.8)至约1∶5(0.2)或约0.9∶1(0.9)至约1∶6(0.17)抑制因子D的生物学功能。
一方面，本发明的抗体包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
另一方面、本发明包括人源化抗因子D抗体的抗体片段(例如抗原结合片段)。本发明的抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、或自抗体片段形成的多特异性抗体。
在本发明的其它方面，本发明包括组合物，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)。在另一个实施方案中，本发明提供编码本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的至少一部分的载体和细胞系。一方面，本发明包括本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和组合物的制备方法、生产方法、和使用方法。在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的制备方法包括：(a)在适合于编码本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的多核苷酸表达的条件下培养包含载体的宿主细胞，例如真核或CHO细胞，该载体进一步包含编码所述抗体或其片段(例如抗原结合片段)的多核苷酸，并(b)分离所述抗体或其片段(例如抗原结合片段)。
又一方面，本发明关注组合物，其包含与载体组合的本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)，如本文中所描述的。任选地，所述载体是药学可接受载体。
本发明的另一方面是这些人源化抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)制备用于预防和/或治疗与过度的或不受控制的补体活化有关的病症的药物或组合物的用途。它们包括心肺旁路手术期间的补体活化；急性心肌梗死、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官功能衰竭、hypobolemic shock、肠缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再灌注损伤所致补体活化。补体活化已经显示出与炎性状况有关，诸如重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重的哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应的结果。它还包括自身免疫病，诸如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。在另一个实施方案中，补体活化还与移植排斥有关。在另一个实施方案中，补体活化还与眼疾病有关(其病理涉及补体包括经典和旁路补体途径的所有眼状况和疾病)，诸如例如但不限于黄斑变性性疾病诸如所有阶段的老年性黄斑变性(AMD)包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。在一个例子中，补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期(intermediate)干性AMD或地图样萎缩(geographic atrophy，GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个进一步的例子中，非渗出性AMD可包括硬玻璃疣、软玻璃疣、地图样萎缩和/或色素结块的存在。在另一个例子中，补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)，包括早期AMD(例如包括多个小的玻璃疣至一或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣)、中期AMD(例如包括广泛的中等玻璃疣至一或多个大玻璃疣)和晚期AMD(例如包括地图样萎缩或晚期湿性AMD(CNV)。在一个进一步的例子中，中期干性AMD可包括大的汇合的玻璃疣。在一个进一步的例子中，地图样萎缩可包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在一个进一步的例子中，地图样萎缩的区域可以是小的或大的，和/或可以在黄斑区域中或在周边视网膜中。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。
另一方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)。在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和使用指令。在一个实施方案中，本发明关注试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和施用所述抗体来治疗补体相关病症的指令。在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含装有组合物的第一容器，该组合物包含本发明的一种或多种抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)；和装有缓冲剂的第二容器。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案中，包含本发明抗体或其片段(例如抗原结合片段)的组合物进一步包含载体，其在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含对受试者施用所述组合物(例如抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)的指令。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含使用所述试剂盒的指令。
一方面，本发明关注制品，其含有对于治疗、预防和/或诊断补体相关病症有用材料。在一个实施方案中，本发明关注制品，其包含：(a)容器；(b)所述容器上的标签；和(c)装在所述容器中的组合物，其包含本发明的抗体或其变体或其片段(例如抗原结合片段)，其中所述容器上的标签指明所述组合物可用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症。
一方面，本发明提供本发明的抗因子D抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)、本发明的核酸、本发明的表达载体或本发明的宿主细胞在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如补体相关眼状况的药物中的用途。在一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎(endophthalmitis)和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。
一方面，本发明提供本发明的制品在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如补体相关眼状况的药物中的用途。在一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。
一方面，本发明提供本发明的试剂盒在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如补体相关眼状况的药物中的用途。在一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。
附图简述
图1A-1C显示下述各项的轻链可变域的序列比对：人源化抗因子D Fab克隆#111(SEQ ID NO：1)，人源化抗因子D Fab，238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10和238-11(分别为SEQ IDNO：6-17)和VLκI共有序列(SEQ ID NO：65)。位置依照Kabat编号且高变区(依照Kabat+Chothia HVR定义)框示(HVR：(1)HVR-L1鉴定为A1-A11(ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：30)、ITSTDIDDDLN(SEQ ID NO：31)、ITSTDIDDDIN(SEQ ID NO：32)、ITSTDIDDDMA(SEQ ID NO：33)或ITSTDIDDDMQ(SEQ ID NO：34))，(2)HVR-L2鉴定为B1-B7(GGNTLRP(SEQ ID NO：35)、GGSTLRP(SEQ ID NO：36)或GGATLRP(SEQ ID NO：37))，(3)HVR-L3鉴定为C1-C9(LQSDSLPYT(SEQ ID NO：38))。每种人源化抗因子D Fab中的氨基酸变化以粗体和斜体标示。
图2A-C显示下述各项的重链可变域的序列比对人源化抗因子D Fab克隆#111(SEQ ID NO：2)和人源化抗因子D Fab，238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10和238-11(分别为SEQ ID NO：18-29)和VH亚组7共有序列(SEQ ID NO：66)。位置依照Kabat编号且高变区(依照Kabat+Chothia HVR定义)框示(HVR：(1)HVR-H1鉴定为D1-D10(GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：39)，(2)HVR-H2鉴定为E1-E19(WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：40)，(3)HVR-H3鉴定为F1-F6(EGGVNN(SEQ ID NO：41)、EGGVAN(SEQ ID NO：42)、EGGVQN(SEQID NO：43)、EGGVNA(SEQ ID NO：44)或EGGVNQ(SEQ ID NO：45))。每种人源化抗因子D Fab中的氨基酸变化以粗体和斜体标示。
图3显示人源化抗因子D Fab 238轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238的轻链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图4(SEQ ID NO：47)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
图4显示人源化抗因子D Fab 238轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)。该氨基酸序列缺少由图3中所示SEQ ID NO：46编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CL1标有下划线。显示了框架(FR)区和HVR区：FR1-LC(SEQ ID NO：48)，FR2-LC(SEQ ID NO：49)，FR3-LC(SEQ ID NO：50)，FR4-LC(SEQ ID NO：51)，HVR1-LC(SEQ ID NO：30(ITSTDIDDDMN))，HVR2-LC(SEQ ID NO：35(GGNTLRP))，HVR3-LC(SEQ ID NO：38(LQSDSLPYT))和CL 1(SEQ IDNO：52)。
图5显示人源化抗因子D Fab 238重链的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238的重链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图6(SEQ ID NO：54)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
图6显示人源化抗因子D Fab 238重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)。该氨基酸序列缺少由图5中所示SEQ ID NO：53编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CH1标有下划线。显示了框架(FR)区和HVR区：FR1-HC(SEQ ID NO：55)，FR2-HC(SEQ ID NO：56)，FR3-HC(SEQ ID NO：57)，FR4-HC(SEQ ID NO：58)，HVR1-HC(SEQ ID NO：39(GYTFTNYGMN))，HVR2-HC(SEQ ID NO：40(WINTYTGETTYADDFKG))，HVR3-HC(SEQ ID NO：41(EGGVNN))和CH1(SEQ ID NO：59)。
图7显示人源化抗因子D Fab 238-1轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：60)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238-1的轻链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图8(SEQ ID NO：61)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
图8显示人源化抗因子D Fab 238-1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)。该氨基酸序列缺少由图7中所示SEQ ID NO：60编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CL1标有下划线。显示了框架(FR)区和HVR区：FR1-LC(SEQ ID NO：48)，FR2-LC(SEQ ID NO：49)，FR3-LC(SEQ ID NO：50)，FR4-LC(SEQ ID NO：51)，HVR1-LC(SEQ ID NO：30(ITSTDIDDDMN))，HVR2-LC(SEQ ID NO：35(GGNTLRP))，HVR3-LC(SEQ ID NO：38(LQSDSLPYT))和CL1(SEQ IDNO：52)。
图9显示人源化抗因子D Fab 238-1重链的核苷酸序列(SEQ ID NO：62)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab 238-1的重链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图10(SEQ ID NO：63)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
图10显示人源化抗因子D Fab 238-1重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)。该氨基酸序列缺少由图9中所示SEQ ID NO：62编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CH1标有下划线。显示了框架(FR)区和HVR区：FR1-HC(SEQ ID NO：64)，FR2-HC(SEQ ID NO：56)，FR3-HC(SEQ ID NO：57)，FR4-HC(SEQ ID NO：58)，HVR1-HC(SEQ ID NO：39(GYTFTNYGMN))，HVR2-HC(SEQ ID NO：40(WINTYTGETTYADDFKG))，HVR3-HC(SEQ ID NO：41(EGGVNN))和CH1(SEQ ID NO：59)。
图11显示人源化抗因子D Fab克隆#111和人源化抗因子D Fabs 238和238-1的溶血测定法结果，显示了对旁路补体活性的抑制。显示了IC50值。
图12显示在因子D的三种血清浓度(9.7nM、16.2nM和26.5nM)，人源化抗因子D Fab 238的溶血测定法结果，显示了对旁路途径(AP)补体活性的抑制。表3显示与因子D的三种血清浓度对应的IC50(nM)和IC90(nM)值(数值代表三项重复实验的平均值)。表3中还显示了抗体对靶因子D摩尔比。
图13显示使用2.5mg剂量单次玻璃体内(IVT)注射抗因子D Fab 238，对人眼中旁路途径(AP)补体活化的抑制的模拟持续时间(假设抗因子D Fab 238的半衰期(t1/2)＝11.5天，基于自家兔种间缩放)。单次IVT注射抗因子D Fab238估计抑制视网膜组织中的AP补体活化至少约74天和玻璃体液中的AP补体活化至少约97天。在图13中，虚线显示玻璃体内施用后玻璃体液中的模拟抗因子D Fab 238浓度。在图13中，实线显示玻璃体内施用后视网膜组织中的模拟抗因子D Fab 238浓度。玻璃体液和视网膜组织中的浓度差异基于视网膜组织分配系数估值20％；换言之，对玻璃体液施用的总药物中20％会到达视网膜组织。
发明详述
I.定义
贯穿本申请所使用的术语应当用对本领域普通技术人员通常的和典型的意义来解释。然而，申请人希望下列术语被给予如下文所限定的特定定义。
关于抗体链多肽序列的短语“基本上相同的”可解释为展现出与参照多肽序列至少70％、或80％、或90％、或95％序列同一性的抗体链。关于核酸序列的该术语可解释为展现出与参照核酸序列至少约85％、或90％、或95％、或97％序列同一性的核苷酸序列。
术语“同一性”或“同源性”应当解释为指比对序列并在必要时引入缺口以获取整个序列的最大百分比同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与同其比较的相应序列中的残基相同的氨基酸残基的百分比。N端或C端延伸或插入均不应当解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域中公知的。可使用序列分析软件来测量序列同一性。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定靶物的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏靶物特异性的抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成。每个重链具有在一端的可变域(VH)，接着是若干恒定域。每个轻链具有在一端的可变域(VL)和在其另一段的恒定域。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一个例子中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文中所使用的，“抗人因子D抗体”指以如下方式特异性结合人因子D的抗体，所述结合方式使其抑制或实质性降低补体活化。
术语“因子D”在本文中用于指天然序列和变体因子D多肽。
“天然序列”因子D指与自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的多肽，无论其制备模式。如此，天然序列因子D可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段生成。在成熟因子D蛋白诸如成熟人因子D蛋白(NM_001928)之外，术语“天然序列因子D”明确涵盖因子D的天然存在前体形式(例如无活性的前蛋白，其受到蛋白水解切割而生成活性形式)、因子D的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体，以及因子D分子的与来源于自然界的因子D多肽具有相同氨基酸序列的结构构象变体。非人动物(包括高等灵长类和非人哺乳类)的因子D多肽被明确包括在此定义内。
“因子D变体”意指与天然序列因子D多肽，诸如天然序列人因子D多肽(NM_001928)具有至少约80％氨基酸序列同一性的如下文中所定义的活性因子D多肽。通常，因子D变体与成熟人氨基酸序列(NM_001928)具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或至少约85％的氨基酸序列同一性，或至少约90％的氨基酸序列同一性，或至少约95％的氨基酸序列同一性，或至少约98％的氨基酸序列同一性，或至少约99％的氨基酸序列同一性。
“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照因子D序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后计算相对于较长序列的序列同一性，即即使较短序列显示与较长序列一部分的100％序列同一性，总体序列同一性也会小于100％。
“百分比(％)核酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照因子D编码序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。为测定百分比核酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后计算相对于较长序列的序列同一性，即即使较短序列显示与较长序列一部分的100％序列同一性，总体序列同一性也会小于100％。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达所编码多肽的细胞中包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
“分离的”因子D多肽编码核酸分子指已经鉴定且与因子D编码核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的因子D多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的因子D多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中时的编码核酸分子有区别。然而，分离的因子D编码核酸分子包括通常表达因子D的细胞中包含的因子D编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、降低或干扰因子D生物学活性的任何分子。因子D拮抗剂包括但不限于抗因子D抗体及其抗体变体、其抗原结合片段，结合因子D且能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、降低或干扰因子D活性(诸如因子D参与补体相关眼疾的病理学的能力)的其它结合性多肽、肽、和非肽小分子。
“小分子”在本文中定义为具有低于约600，优选低于约1000道尔顿的分子量。
“有活性的”或“活性”或“生物学活性”在本发明因子D拮抗剂的语境中指拮抗(部分或完全抑制)因子D生物学活性的能力。因子D拮抗剂的生物学活性的一个例子是在因子D相关疾病或疾患(诸如例如补体相关眼疾)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善的能力。所述活性可在体外或在体内测试中测定，包括结合测定法，旁路途径溶血测定法(例如测量对旁路途径补体活性或活化的抑制的测定法)，使用有关动物模型，或人体临床试验。
术语“补体相关病症”以最广义使用，包括与过度的或不受控制的补体活化有关的病症。它们包括心肺旁路手术期间的补体活化；急性心肌梗死、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官功能衰竭、hypobolemic shock、肠缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再灌注损伤所致补体活化。补体活化已经显示出与炎性状况有关，诸如重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重的哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应的结果。它还包括自身免疫病，诸如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。补体活化还与移植排斥有关。补体活化还与眼疾病有关，诸如老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。
术语“补体相关眼疾”以最广义使用，包括病理学涉及补体(包括经典途径和旁路途径，特别是补体旁路途径)的所有眼疾。补体相关眼疾包括但不限于黄斑变性性疾病诸如所有阶段的老年性黄斑变性(AMD)(包括干性和湿性(非渗出性和渗出性))形式、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变和其它缺血相关视网膜病变、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。在一个例子中，补体相关眼疾包括老年性黄斑变性(AMD)(包括非渗出性(例如中期干性AMD(intermediate dry AMD)或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个进一步的例子中，非渗出性AMD可包括硬玻璃疣、软玻璃疣、地图样萎缩和/或色素结块的存在。在另一个例子中，补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)，包括早期AMD(例如包括多个小的玻璃疣至一或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣)、中期AMD(例如包括广泛的中等玻璃疣至一或多个大玻璃疣)和晚期AMD(例如包括地图样萎缩或晚期湿性AMD(CNV)。(Ferris et al.，AREDS Report No.18；Sallo et al.，Eye Res.，34(3)：238-40(2009)；Jager et al.，New Engl.J.Med.，359(1)：1735(2008))。在一个进一步的例子中，中期干性AMD可包括大的汇合的玻璃疣。在一个进一步的例子中，地图样萎缩可包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在一个进一步的例子中，地图样萎缩的区域可以是小的或大的，和/或可以在黄斑区域中或在周边视网膜中。在一个例子中，补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，补体相关眼状况是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。
“治疗”或“处理”指旨在预防病症发展或改变病症病理而实施的干预。因而，“治疗”或“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗剂可直接改变免疫应答成分的应答程度，或者使得疾病对其它治疗剂(例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂、化疗剂等)的治疗更敏感。
疾病(诸如补体相关眼疾)的“病理”或“病理学”包括所有危及患者康乐的现象。这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)、抗体生成、自身抗体生成、补体生成、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、任何炎性或免疫学应答的抑制或恶化、炎症细胞(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)浸润入细胞间隙(cellular spaces)等。
如本文中所使用的，术语“哺乳动物”指归为哺乳类的任何动物，包括但不限于人，高等灵长类，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物指人。
与一种或多种其它治疗剂“联合/组合”施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。
“治疗有效量”指在目标疾病或疾患(诸如例如补体相关眼疾)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善所需要的“因子D拮抗剂”量。
术语“调控序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度会趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴定：(1)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中清洗，于55℃，接着于55℃在含EDTA的0.1xSSC中进行高严格性清洗。
“中等严格条件”可以如Sambrook等，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989中所述鉴定，包括使用比上文所述较不严格的清洗溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含20％甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5xDenhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1xSSC中清洗滤膜。技术人员会认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“可变的”在抗体可变域的语境中指可变域的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链二者可变域中称作互补决定区(CDR)也称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区非常接近的保持在一起，并与来自另一条链的CDR一起促成抗体的靶物结合位点的形成(参见Kabat et al.)。如本文中所使用的，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依照Kabat et al.，(Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitute of Health，Bethesda，Md.1987)的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行的，除非另外指明。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端在使用Kabat编号规则编号时在H32与H34之间变化，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入；如果35A和35B都不存在，那么该环在32处结束；如果只有35A存在，那么该环在33处结束；如果35A和35B都存在，那么该环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
 环        Kabat       AbM       Chothia     接触
 ----  -----------  ----------  ----------  ----------
L1    L24-L34    L24-L34    L24-L34        L30-L36
L2    L50-L56    L50-L56    L50-L56        L46-L55
L3    L89-L97    L89-L97    L89-L97        L89-L96
H1    H31-H35B   H26-H35B   H26-H32..34    H30-H35B
(Kabat编号)
H1    H31-H35    H26-H35    H26-H32        H30-H35
(Chothia编号)
H2    H50-H65    H50-H58    H52-H56        H47-H58
H3    H95-H102   H95-H102   H95-H102       H93-H101
高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35B(H1)、50-65/47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等，见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基或CDR残基以外的残基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)(通过述及明确收入本文)中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU指数”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.，见上文中报道的EU指数；重链恒定域中的铰链区大致为重链残基216-230(EU编号方式))。“Kabat中的EU指数”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请60/640,323，关于EU编号方式的图)。
如本文中所使用的，“多肽”一般指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白质。在一个例子中，多肽是哺乳动物蛋白质，例子包括因子D和因子D的片段和/或变体。在另一个例子中，多肽是结合人因子D的全长抗体，或其抗体片段(例如抗原结合片段)，例子包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；双抗体，线性抗体；单链抗体分子；和自抗体片段(例如抗原结合片段)形成的多特异性抗体。
起始多肽的“变体”或“氨基酸序列变体”指如下的多肽，其包含与起始多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。通常，变体会与天然多肽具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，和最优选至少98％序列同一性。百分比序列同一性是比对序列以提供最大同源性后，通过例如Fitch et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1382-1386(1983)，Needleman et al.，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)记载的算法形式确定的。可通过将适当的核苷酸改变引入编码多肽的DNA或者通过肽合成来制备多肽的氨基酸序列变体。此类变体包括例如感兴趣多肽氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。用于生成多肽的氨基酸序列变体的方法记载于例如美国专利No.5,534,615(通过述及而明确收入本文)。
起始抗体的“抗体变体”或“经修饰抗体”指如下的抗体，其包含与起始抗体之氨基酸序列不同的氨基酸序列，其中起始抗体的一个或多个氨基酸残基经过修饰。通常，抗体变体会与起始抗体具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，和最优选至少98％序列同一性。百分比序列同一性是比对起始抗体和候选抗体变体的序列以提供最大同源性后，通过例如Fitch et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1382-1386(1983)，Needleman et al.，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)记载的算法形式确定的。关于亲本序列的特异性或相似性在本文中定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选变体序列中与亲本抗体残基相同(即相同残基)或相似(即基于共同的侧链特性来自同一组的氨基酸残基，见下文)的氨基酸残基的百分比。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可通过将适当的核苷酸改变引入编码抗体的DNA或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类变体包括例如感兴趣抗体氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。用于生成抗体的抗体序列变体的方法与例如美国专利No.5,534,615(通过述及而明确收入本文)中记载的用于生成多肽的氨基酸序列变体的方法相似。
多肽分子的“脱酰胺”变体指如下的多肽，其中原始多肽的一个或多个天冬酰胺(N或Asn)残基被转变成天冬氨酸(D或Asp)，即中性的酰胺侧链被转变成总体具有酸性特征的残基。通过将天冬酰胺(N或Asn)转变成谷氨酰胺(Q或Gln)或丙氨酸(A或Ala)或丝氨酸(S或Ser)，可预防脱酰胺(Amphlett，G.etal.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。
多肽分子的“氧化”变体指如下的多肽，其中原始多肽的一个或多个甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp)残基经由甲硫氨酸的硫被转变成砜或亚砜。通过将甲硫氨酸(M或Met)转变成亮氨酸(L或Leu)或异亮氨酸(I或Ile)，可预防氧化(Amphlett，G.et al.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。
多肽分子的“焦谷氨酸”变体指如下的多肽，其中原始多肽的一个或多个谷氨酰胺(Q或Gln)残基被转变成焦谷氨酸，这在谷氨酰胺(例如N端谷氨酰胺残基)自发环化而产生焦谷氨酸时发生。通过将谷氨酰胺(Q或Gln)残基转变成谷氨酸(E或Glu)，可预防焦谷氨酸转变(Amphlett，G.et al.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是靶物结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。短语抗体的“功能性片段或类似物”指具有与全长抗体同样的定性的生物学活性的化合物。例如，抗人因子D抗体的功能性片段或类似物指能以如下方式结合因子D的抗人因子D抗体的功能性片段或类似物，所述结合方式使其阻止或实质性降低补体活化。在用于本文时，关于抗体的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab’)2片段。“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了一个靶物结合位点。六个CDR共同赋予抗体以靶物结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对靶物特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合靶物的能力。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成结合靶物的期望结构。
Fab片段包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)片段通过切割F(ab’)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键生成。抗体片段(例如抗原结合片段)的别的化学偶联是本领域普通技术人员所知的。
在用于本文时，“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列(例如本发明的多肽)，或者编码这些序列的核酸，这些序列在根据本发明方法导入这些序列的变异氨基酸组合方面是不同的。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一靶位点。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对靶物上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，与本发明一起使用的单克隆抗体可使用公知技术从噬菌体抗体文库分离。依照本发明使用的亲本单克隆抗体可通过最初由Kohler和Milstein，Nature 256，495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组方法来制备。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含自非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它靶物结合子序列)。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是选定的人免疫球蛋白模板的。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括后代。还应理解，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的，这是由于有意或无意的突变。包括具有相同功能或生物学性质的变体后代，如在最初转化的细胞中所筛选的。一般而言，本发明中所使用的“宿主细胞”指原核或真核宿主。
术语“载体”指包含与合适的控制序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体，所述合适的控制序列能够实现DNA在合适的宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子、任选的控制所述转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化入合适的宿主中，载体便可独立于宿主基因组地复制和发挥功能，或者在一些例子中可以自身整合入基因组中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意图包括如下的其它形式的载体，其发挥本领域中已知的等同功能，并且其是本领域中已知的，或变为本领域中已知的。
单词“标记物”在用于本文时指可与分子或蛋白质(例如抗体)直接或间接偶联的可检测的化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学变化。
在用于本文时，“固相”指本发明的抗体可粘着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮(silicone)形成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它是纯化柱(例如亲和层析柱)。
“噬菌体展示”是一种将变异多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白质，其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells和Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3：355-362，及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体得到了降低，使得分选基于内在的配体亲和力，而且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman和Wells(1991)Methods：A companion toMethods in Enzymology 3：205-0216。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如Co1E1)和一个拷贝的噬菌体基因区间的质粒载体。噬菌粒可利用任何已知噬菌体，包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也会包含抗生素抗性的选择标志。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一起而扩增。在给携带这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时，质粒的复制模式变成滚环复制，以生成质粒DNA的一条链的拷贝，并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括如下的噬菌粒，它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段，使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。
“变异Fc区”包含由于至少一处本文中所定义的“氨基酸修饰”而与另一Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％的同源性，最优选与它们具有至少约90％的同源性，更优选与它们具有至少约95％的同源性。“天然序列人Fc区”的例子显示于WO 00/42072图23，而且包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区以及它们的天然存在变体。天然序列鼠Fc区显示于WO 00/42072图22A。
依照本发明，“改变”的FcRn结合亲和力指与亲本多肽或包含天然序列Fc区的多肽相比具有增强的或削弱的FcRn结合活性。在一个例子中，具有改变的FcRn结合亲和力的抗体具有在pH 6.0升高的对FcRn的结合和/或在pH7.0降低的对FcRn的结合。对FcR“展示升高的结合”的变体以比亲本多肽好的亲和力结合至少一种FcR。对FcR“展示降低的结合”的变体以比亲本多肽差的亲和力结合至少一种FcR。以比亲本多肽“好的亲和力”结合FcR的变体是当结合测定法中多肽变体和亲本多肽的量基本上相同时以比亲本多肽实质性好的结合亲和力结合FcR的抗体。例如，在测定FcR结合亲和力的情况中，具有改进的FcR结合亲和力的多肽变体可展示与亲本多肽相比约1.15倍至约100倍，例如约1.2倍至约50倍的FcR结合亲和力改进。
“氨基酸修饰”指预定氨基酸序列的氨基酸序列中的改变。例示性修饰包括氨基酸替代、插入、和/或删除。本文中的氨基酸修饰的一个例子是替代。
“特定位置(例如Fc区的)处的氨基酸修饰”指特定残基的替代或删除，或与特定残基相邻的至少一个氨基酸残基的插入。“与特定残基相邻的”插入意指其1至2个残基内的插入。插入可在特定残基的N末端或C末端。
“氨基酸替代”指用另一种不同的替换氨基酸残基替换在预定氨基酸序列中的至少一个现有氨基酸残基。一个或多个替换残基可以是“天然存在氨基酸残基”(即由遗传密码所编码的)，并且选自下组：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。本文中氨基酸替代的定义还涵盖用一种或多种非天然存在氨基酸残基进行的替代。“非天然存在氨基酸残基”指能够与多肽链中的相邻氨基酸残基共价结合的、在上文所列的那些天然存在氨基酸残基以外的残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、及其它氨基酸残基类似物，诸如那些在Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中记载的。为了生成此类非天然存在氨基酸残基，可使用Noren等，Science 244：182(1989)和Ellman等，见上文的规程。简言之，这些规程牵涉用非天然存在氨基酸残基化学活化抑制型tRNA，接着在体外转录和翻译RNA。
“氨基酸插入”指将至少一个氨基酸掺入预定氨基酸序列。虽然插入通常会由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但是本申请涵盖更大的“肽插入”，例如约3个至约5个或甚至多达约10个氨基酸残基的插入。所插入的残基可以是上文所公开的天然存在的或非天然存在的。
“氨基酸删除”指从预定氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。
II.详细描述
本文中的发明提供因子D拮抗剂，包括抗因子D抗体及其变体及其片段(例如抗原结合片段)，它们可用于预防和治疗变体相关状况，包括眼状况(其病理涉及补体(包括经典和旁路途径，特别是旁路补体途径)的所有眼状况和疾病)，诸如例如黄斑变性性疾病诸如所有阶段的老年性黄斑变性(AMD)包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、眼内炎、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。一组补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个例子中，补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，补体相关眼状况是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。
AMD是年龄相关的黄斑变性，它是超过60岁的个体中不可逆的视功能障碍的首要原因。存在两种类型的AMD，即非渗出性(干性)和渗出性(湿性)AMD。干性或非渗出性形式涉及中央视网膜(黄斑)下面的视网膜色素上皮(RPE)的萎缩性和肥大性变化以及RPE上的沉积物(玻璃疣)。具有非渗出性AMD的患者能进展成湿性或渗出性形式的AMD，其中称作脉络膜新血管膜(CNVM)的异常血管在视网膜下形成，渗漏流体和血液，并最终在视网膜中和在视网膜下引起失明性盘状瘢痕。非渗出性AMD(其通常是渗出性AMD的前兆)更常见。非渗出性AMD的表现有所变化：硬玻璃疣、软玻璃疣、RPE地图样萎缩、和色素结块可存在。补体成分在AMD早期RPE上沉积，而且是玻璃疣的主要组分。
1.人源化抗因子D抗体
本文中的发明包括人源化抗因子D抗体及其片段的生产和使用。下面的小节中更详细地描述了用于生成抗体的例示性方法。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法实施(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR或CDR序列替代相应的人抗体序列来进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是将人抗体中的一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代而得到的抗体。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于生成人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，在一些情况中对于降低抗原性和/或HAMA应答(人抗小鼠抗体)会是非常重要。HAMA应答降低或消除通常是合适治疗剂的临床开发的一个重要方面。参见例如Khaxzaeli等，J.Natl.Cancer Inst.(1988)，80：937；Jaffers等，Transplantation(1986)，41：572；Shawler等，J.Immunol.(1985)，135：1530；Sears等，J.Biol.Response Mod(1984)，3：138；Miller等，Blood(1983)，62：988；Hakimi等，J.Immunol.(1991)，147：1352；Reichmann等，Nature(1988)，332：323；Junghans等，Cancer Res(1990)，50：1495。如本文中所描述的，本发明提供了经人源化使得HAMA应答降低或消除的抗体。可使用本领域已知的常规方法(其中有些在下文中有进一步描述)进一步获得这些抗体的变体。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
例如，来自本文所述抗体的氨基酸序列可充当框架和/或高变序列多样化的起始(亲本)序列。起始高变序列所连接的选定框架序列在本文中称为受体人框架。尽管受体人框架可来自或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，优选受体人框架来自或衍生自人共有框架序列，因为这样的框架已证实在人类患者中具有最小免疫原性或者没有免疫原性。就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。当存在预先存在的氨基酸变化时，优选存在不超过5个，优选4个或更少，或者3个或更少预先存在的氨基酸变化。在一个实施方案中，VH受体人框架在序列上VH人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列的一个亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人的一个亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人的亚组III。
当受体衍生自人免疫球蛋白时，可任选选择根据它与供体框架序列的同源性而选择的人框架序列，即将供体框架序列与人框架序列集合中的各种人框架序列比对，并选择最具同源性的框架序列作为受体。受体人框架可来自或衍生自公共数据库中可得的人抗体种系序列。
在一个实施方案中，本文中的人共有框架来自或衍生自VH亚组VII和/或VLκ亚组I共有框架序列。
在一个实施方案中，用于生成抗因子D抗体的人框架模板可包含来自如下模板的框架序列，该模板包含用于VH链的组合VI-4.1b+(VH7家族)和JH4d和/或用于VL链的组合DPK4(VκI家族)和JK2。
在一个实施方案中，VH受体人框架包含一项、两项、三项或所有下述框架序列：
FR1，其包含QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO：2之氨基酸1-25)，
FR2，其包含WVRQAPGQGLE(SEQ ID NO：2之氨基酸36-49)，
FR3，其包含RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCER(SEQ ID NO：2之氨基酸67-98)、
RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE(SEQ ID NO：2之氨基酸67-97)、
RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC(SEQ ID NO：2之氨基酸67-96)、
RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS(SEQ ID NO：3)、或
RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR(SEQ ID NO：4)，
FR4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2之氨基酸105-115)。
在一个实施方案中，VL受体人框架可包含一项、两项、三项或所有下述框架序列：
FR1，其包含DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：1之氨基酸1-23)，
FR2，其包含WYQQKPGKVPKLLIS(SEQ ID NO：1之氨基酸35-49)，
FR3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO：1之氨基酸57-88)，
FR4，其包含FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：1之氨基酸98-107)或FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：5)。
虽然受体可在序列上与选定的人框架序列相同，无论它是来自人免疫球蛋白或人共有框架，在本发明中，受体序列可包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列而言预先存在的氨基酸替代。这些预先存在的替代优选是最小限度的；通常相对于人免疫球蛋白序列或共有框架序列而言的仅四处、三处、两处或一处氨基酸差异。
将非人抗体的高变区残基掺入VL和/或VH受体人框架。例如，可掺入对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。任选的是，掺入如下延伸的高变区残基：24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97(L3)，26-35B(H1)，50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
一方面，本发明提供包含重链可变域的抗因子D抗体，该重链可变域包含SEQ ID NO：2。一方面，本发明提供包含轻链可变域的抗因子D抗体，该轻链可变域包含SEQ ID NO：1。一方面，本发明提供包含重链可变域和轻链可变域的抗因子D抗体，该重链可变域包含SEQ ID NO：2且该轻链可变域包含SEQ ID NO：1。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供包含重链可变域的抗因子D抗体，该重链可变域包含与氨基酸序列SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参照序列含有替代、插入、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合因子D的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO：2的序列中总共替代、插入、或删除1-10个氨基酸。在一些实施方案中，替代、插入或删除存在于HVR以外的区域中(即在FR中)。在一些实施方案中，抗因子D抗体包含重链可变域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一些实施方案中，本发明提供包含轻链可变域的抗因子D抗体，该轻链可变域包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参照序列含有替代、插入、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合因子D的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：1的序列中总共替代、插入、或删除1-10个氨基酸。在一些实施方案中，替代、插入或删除存在于HVR以外的区域中(即在FR中)。在一些实施方案中，抗因子D抗体包含轻链可变域，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：1。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
抗因子D抗体可包含任何合适的框架可变域序列，前提是抗体保留结合因子D的能力。例如，在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含重链可变域框架序列，其是VI.4.1b+和JH4d的组合(见图3)。在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含人亚组VII重链框架共有序列。在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含重链可变域框架序列，其包含：包含SEQ IDNO：2之氨基酸1-25的FR1、包含SEQ ID NO：2之氨基酸36-49的FR2、包含SEQ ID NO：2之氨基酸67-98的FR3和包含SEQ ID NO：2之氨基酸105-115的FR4。在这些抗体的一个实施方案中，重链可变域序列包含第40位和/或第88位(Kabat编号方式)处的替代。在这些抗体的一个实施方案中，第40位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)和/或第88位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)。在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含轻链可变域框架序列，其是DPK4和JK2的组合(见图4)。在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含人κI轻链框架共有序列。在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含轻链可变域框架序列，其包含：包含SEQ ID NO：1之氨基酸1-23的FR1、包含SEQID NO：1之氨基酸35-49的FR2、包含SEQ ID NO：1之氨基酸57-88的FR3和包含SEQ ID NO：1之氨基酸98-107的FR4。在这些抗体的一个实施方案中，轻链可变框架序列包含第15位、第43位和/或第104位(Kabat编号方式)处的一处或多处替代。在这些抗体的一个实施方案中，第15位是半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)，第43位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，第104位是缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
另外，抗因子D抗体可包含任何合适的恒定域序列，前提是抗体保留结合因子D的能力。例如，在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含重链恒定域的至少一部分。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含α、δ、ε、γ、或μ重链之一或组合的重链恒定域。根据其重链恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含重链恒定域，其包含导致对效应器功能(例如结合亲和力)期望影响的氨基酸位置替代。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含重链恒定域，其包含不导致对效应器功能(例如结合亲和力)影响的氨基酸位置替代。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含IgG型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定域且进一步包含第114位(Kabat编号方式；等同于EU编号方式中的118)、第168位(Kabat编号方式；等同于EU编号方式中的172)、第172位(Kabat编号方式；等同于EU编号方式中的176)和/或第228位(EU编号方式)处的替代。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)型的重链恒定域且进一步包含第114位处的替代，其中第114位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，第168位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，第172位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)和/或第228位是脯氨酸(P)、精氨酸(R)或丝氨酸(S)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
另外，例如在一些实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含轻链恒定域的至少一部分。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含κ或λ轻链之一或组合的轻链恒定域，根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的轻链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含轻链恒定域，其包含导致对效应器功能(例如结合亲和力)期望影响的氨基酸位置替代。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含轻链恒定域，其包含不导致对效应器功能(例如结合亲和力)影响的氨基酸位置替代。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含κ型的轻链恒定域且进一步包含第110位、第144位、第146位和/或第168位(Kabat编号方式)处的替代。在一个实施方案中，本发明的抗因子D抗体包含κ型的轻链恒定域且进一步包含第110位、第144位、第146位和/或第168位处的替代，其中第110位是半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)，第144位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，第146位是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)，第168位是半胱氨酸(C)或丝氨酸(S)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
2.经过修饰的抗因子D抗体
本文中的方面包括经过修饰的抗因子D抗体，例如经过修饰的人源化抗因子D抗体，及其变体，及其片段(例如抗原结合片段)的生产和使用。下面的小节中更为详细地描述了用于生成经过修饰的抗体的例示性方法。
可以修饰亲本抗因子D抗体(包括人源化抗因子D抗体)以生成经过修饰的抗因子D抗体及其变体。在一个实施方案中，经过修饰的抗因子D抗体及其变体可具有胜过亲本抗体改良的物理、化学、生物学或同质性特性。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含亲本抗体的一个或多个高变区中的一处或多处氨基酸改变(例如替代)。或者/另外，可以在亲本抗体的框架区中引入一处或多处改变(例如替代)。要修饰的框架区残基的例子包括那些直接非共价结合抗原的(Amit et al.，(1986)Science，233：747-753)；与CDR相互作用/影响CDR构象的(Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.，196：901-917)；和/或参与VL-VH界面的(EP 239 400B1)。在某些实施方案中，一个或多个此类框架区残基的修饰导致抗体对抗原的结合亲和力增强。例如，在本发明的这个实施方案中可以改变约1个至约5个框架残基。要修饰的框架或HVR区残基的例子包括如下的位点，其中此类位点处的修饰导致生成脱酰胺变体(例如天冬酰胺(N或Asn)残基被修饰成天冬氨酸(D或Asp))、氧化变体(例如甲硫氨酸(M或Met)残基和/或色氨酸(W或Trp)残基被修饰成砜或亚砜)或焦谷氨酸变体(例如谷氨酰胺(Q或Gln)残基被修饰成焦谷氨酸)。要修饰的框架区残基或HVR区残基的例子包括可能的脱酰胺位点(即天冬酰胺(N或Asn))、氧化位点(即甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp))或焦谷氨酸转变位点(即谷氨酰胺(Q或Gln))，其中此类位点处的修饰分别预防脱酰胺和/或氧化和/或焦谷氨酸转变。为了预防形成脱酰胺变体，可以将天冬酰胺(N或Asn)突变成丙氨酸(A或Ala)、谷氨酰胺(Q或Gln)或丝氨酸(S或Ser)。为了预防形成氧化变体，可以将甲硫氨酸(Met)或色氨酸(W或Trp)突变成亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。为了预防形成焦谷氨酸变体，可以将谷氨酰胺(Q或Gln)突变成谷氨酸(E或Glu)(Amphlett，G.et al.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。或者/另外，可以在亲本抗体的Fc区中有一处或多处框架区改变(例如替代)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含变异Fc区，使得抗体的体内半衰期相对于亲本抗体或包含天然序列Fc区的抗体延长或缩短。在一个实施方案中，抗体包含提高或降低新生儿Fc受体(FcRn)对抗体的结合亲和力的变异Fc区(参见WO2000042072，通过述及而完整收录)。例如，此类抗体可包含Fc区氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447任一处或多处的氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号方式是如Kabat中的EU索引的。此类对FcRn的结合降低的多肽变体可包含Fc区氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447任一处或多处的氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号方式是如Kabat中的EU索引的。或者，上文所述多肽变体可展示升高的对FcRn的结合，而且包含Fc区氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434任一处或多处的氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号方式是如Kabat中的EU索引的。例如，抗体包含以相对于亲本抗体或包含天然序列Fc区的抗体延长的体内半衰期结合的变异Fc区。例如，抗体包含以相对于亲本抗体或包含天然序列Fc区的抗体升高的亲和力结合FcRn的变异Fc区。
可如下测量FcRn结合亲和力：
可以使用例如BiaCore 3000设备通过表面等离振子共振来研究本发明抗体针对人FcRn的结合。使用胺偶联试剂盒将人FcRn偶联至传感器芯片。例如，可以将CM5传感器芯片用EDC/NHS以5ml/min活化7分钟。可以在活化后的芯片上以10ml/min流速注射100mg/ml人FcRn达30秒钟至2分钟以给出100至200的最终结合响应单位(RU)。偶联后，可以通过以5ml/min注射35ml 1M乙醇胺氢氯化物来封闭FcRn偶联的芯片。
可以测定在pH 6.0或pH 7.4本发明的抗体对人FcRn的结合。用于结合实验的运行缓冲液是含有0.01％P20和0.02％叠氮化钠的PBS pH 6.0或pH 7.4。可以将本发明的抗体交换缓冲液入pH 6.0或pH 7.4的运行缓冲液。在一个实施方案中，在25℃实施实验。对于pH 6.0运行，使抗体(浓度范围4mM至0.7nM)以30ml/min流过FcRn包被的芯片4分钟，然后容许自芯片解离5分钟。对于pH 7.4运行，将抗体(浓度范围12mM至100nM)以20ml/min注射流过FcRn包被的芯片1.5分钟，然后释放2分钟。还让抗体流过传感器芯片上未缀合的点以容许自对FcRn偶联芯片的结合减去背景非特异性结合。可以在各注射之间用30秒0.1M TRIS pH 8.3脉冲再生芯片。可在每次注射期结束时记录每次注射的稳态RU，稍后通过将稳态RU针对注射浓度绘图来计算解离常数(KD)。
用于生成此类经过修饰的抗体及其片段(例如抗原结合片段)及其变体的一种有用规程称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells(1989)Science244：1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它的突变，推敲那些对替代表现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性(即结合亲和力或溶血测定法)。
通常，会从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代导致生物学活性(例如结合亲和力)的改变，那么引入下表中称为“例示替代”的或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述的更实质性改变，并筛选产物。下表中列出了优选的替代。
表1：优选替代
Figure BPA00001279233400321
Figure BPA00001279233400331
对抗体或其片段(例如抗原结合片段)生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；及
(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
在另一个实施方案中，对为修饰而选择的位点进行修饰，并通过噬菌体展示选择那些具有改良的结合亲和力的修饰。
编码氨基酸序列突变体或经过修饰的氨基酸序列的核酸分子由本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变早先制备的变体或非变体型式的亲本抗体。制备突变体或变体或经过修饰的氨基酸序列的一种方法是定点诱变(参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)。
在某些实施方案中，经过修饰的抗体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中，亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，例如约2个至约10个高变区替代。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
通常，经过修饰的抗体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性(在上文定义一节中定义)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
产生经过修饰的抗体或其片段(例如抗原结合片段)后，测定该分子相对于亲本抗体或其片段(例如抗原结合片段)的生物学活性。如上所示，这可包括测定抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个实施方案中，制备一组经过修饰的抗体或其片段(例如抗原结合片段)并筛选针对抗原诸如因子D或其片段的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个或多个抗体突变体或经过修饰的抗体或其片段(例如抗原结合片段)进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)是真正有用的，例如可用于临床前研究。
本文所述经过修饰的抗因子D抗体或其片段(例如抗原结合片段)可进一步修饰，修饰时常取决于经过修饰的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的预期用途。此类修饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。对于氨基酸序列改变，示例性的修饰在上文有详述。例如，任何不参与保持经过修饰的抗体正确构象的半胱氨酸残基也可被替代，一般替代为丝氨酸，用以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段时，诸如Fv片段)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块和/或增加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块连接于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一连接于羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中(用于O-连接的糖基化位点)通过添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少一个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体变体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少一个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)重链的第1位氨基酸是E；
(b)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(c)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少一个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少两个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少两个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)重链的第1位氨基酸是E；
(b)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(c)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少两个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少三个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少三个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)重链的第1位氨基酸是E；
(b)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(c)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供本申请亲本抗因子D抗体的经过修饰的抗因子D抗体，其中所述经过修饰的抗因子D抗体包含所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列，其中所述本申请亲本抗因子D抗体的氨基酸序列的至少三个位置(依照Kabat编号方式)以下述一项或多项替代：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供包含参照抗体之轻链HVR的抗因子D抗体，其中所述抗因子D抗体进一步包含所述参照抗体的一个或多个位置处的替代，其中所述参照抗体包含：包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：30)的轻链HVR-1、包含GGNTLRP(SEQ ID NO：35)的轻链HVR-2、和包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：38)的轻链HVR-3，且其中所述替代是下述一项或多项：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供包含参照抗体之重链HVR的抗因子D抗体，其中所述抗因子D抗体进一步包含所述参照抗体的一个或多个位置处的替代，其中所述参照抗体包含：包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：39)的重链HVR-1、包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：40)的重链HVR-2、和包含EGGVNN(SEQ ID NO：41)的重链HVR-3，且其中所述替代是下述一项或多项：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供包含参照抗体之轻链HVR和重链HVR的抗因子D抗体，其中所述抗因子D抗体进一步包含所述参照抗体的一个或多个位置处的替代，其中所述参照抗体包含：包含ITSTDIDDDMN(SEQ IDNO：30)的轻链HVR-1、包含GGNTLRP(SEQ ID NO：35)的轻链HVR-2、和包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：38)的轻链HVR-3、及包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：39)的重链HVR-1、包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：40)的重链HVR-2、和包含EGGVNN(SEQ ID NO：41)的重链HVR-3，且其中所述替代是下述一项或多项：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供一种经过修饰的抗因子D抗体，其包含：
(a)至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自下组的HVR：
(i)HVR-H1，其包含与选自SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含与选自SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(iii)HVR-H3，其包含与选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(iv)HVR-L1，其包含与选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(v)HVR-L2，其包含与选自SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：37的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(vi)HVR-L3，其包含与选自SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)至少一个变异HVR，其中所述变异HVR包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、30、31、32、33、34、35、36、37或38中所示序列的至少一个残基的修饰。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一些实施方案中，氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的HVR相对于参照序列含有替代、插入、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合因子D的能力。在一些实施方案中，在选自下组的参照序列中总共替代、插入、或删除1-10个氨基酸：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
一方面，本发明提供一种经过修饰的抗因子D抗体，其包含：
(a)至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自下组的HVR：
(i)HVR-H1，其包含选自SEQ ID NO：39的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：40；
(iii)HVR-H3，其包含选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列；
(iv)HVR-L1，其包含选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的氨基酸序列；
(v)HVR-L2，其包含选自SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的氨基酸序列；和
(vi)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO：38的氨基酸序列；或(b)至少一个变异HVR，其中所述变异HVR包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、30、31、32、33、34、35、36、37或38中所示序列的至少一个残基的修饰。
在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含HVR-H1，该HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：39。在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含HVR-H2，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：40。在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含HVR-H3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：41。在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含HVR-L1，该HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：30。在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含HVR-L2，该HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：35。在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：38。在一个例子，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：39的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：40的HVR-H2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO：41的HVR-H3。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：30的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：35的HVR-L2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO：38的HVR-L3。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：39的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：40的HVR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO：41的HVR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO：30的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：35的HVR-L2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO：38的HVR-L3。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参照序列含有替代、插入、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合因子D的能力。在一些实施方案中，在选自下组的序列中总共替代、插入、或删除1-10个氨基酸：SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29。在一些实施方案中，替代、插入或删除存在于HVR以外的区域中(即在FR中)。在一些实施方案中，经过修饰的抗因子D抗体包含重链可变域，该重链可变域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列相对于参照序列含有替代、插入、或删除，但是包含该氨基酸序列的抗体保留结合因子D的能力。在一些实施方案中，在选自下组的序列中总共替代、插入、或删除1-10个：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17。在一些实施方案中，替代、插入或删除存在于HVR以外的区域中(即在FR中)。在一些实施方案中，经过修饰的抗因子D抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：18。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：6。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：18，该轻链可变域包含SEQ ID NO：6。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ IDNO：19。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：7。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：19，该轻链可变域包含SEQ ID NO：7。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：20。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQID NO：8。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：20，该轻链可变域包含SEQ IDNO：8。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：21。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：9。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：21，该轻链可变域包含SEQ ID NO：9。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQID NO：22。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：10。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：22，该轻链可变域包含SEQ ID NO：10。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：23。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：11。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：23，该轻链可变域包含SEQ ID NO：11。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：24。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：12。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：24，该轻链可变域包含SEQ ID NO：12。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：25。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：13。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：25，该轻链可变域包含SEQ ID NO：13。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ IDNO：26。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：14。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：26，该轻链可变域包含SEQ ID NO：14。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：27。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQID NO：15。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：27，该轻链可变域包含SEQID NO：15。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：28。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：16。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：28，该轻链可变域包含SEQ ID NO：16。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包含SEQ ID NO：29。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：17。例如，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含SEQID NO：29，该轻链可变域包含SEQ ID NO：17。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供一种多肽，其包含下述氨基酸序列：X1VQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGVX2X3WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：74)，其中X1是Q或E；X2是N、A或Q；而X3是N、A或Q。在一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含下述氨基酸序列：X1VQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGVX2X3WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：74)，其中X1是Q或E；X2是N、A或Q；而X3是N、A或Q。在一个例子中，本发明提供所述多肽的片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种多肽，其包含下述氨基酸序列：DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6TLRPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7EIK(SEQ ID NO：73)，其中X4是M、L或I；X5是N、A或Q；X6是N、S或A；而X7是L或V。在一个实施方案中，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其包含含有下述氨基酸序列的多肽：DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6TLRPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7EIK(SEQ ID NO：73)，其中X4是M、L或I；X5是N、A或Q；X6是N、S或A；而X7是L或V。在一个例子中，本发明提供所述多肽的片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。在另一个实施方案中，本发明提供一种多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。在一个例子中，本发明提供所述多肽的片段。
一方面，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链域包含序列SEQID NO：47。另一方面，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其中重链域包含序列SEQ ID NO：54。一方面，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链域包含序列SEQ ID NO：61。另一方面，本发明提供经过修饰的抗因子D抗体，其中重链域包含序列SEQ ID NO：63。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供一种多肽，其包含序列SEQ ID NO：47。另一方面，本发明提供一种多肽，其包含序列SEQ ID NO：54。一方面，本发明提供一种多肽，其包含序列SEQ ID NO：61。另一方面，本发明提供一种多肽，其包含序列SEQ ID NO：63。在一个例子中，本发明提供所述多肽的片段。
一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。。
一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中重链可变域包含选自下组的序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链域包含序列SEQ ID NO：47。另一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中重链域包含序列SEQ ID NO：54。一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链域包含序列SEQ ID NO：61。另一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中重链域包含序列SEQ ID NO：63。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：6且重链可变域包含序列SEQ ID NO：18。在一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：7且重链可变域包含序列SEQ ID NO：19。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：8且重链可变域包含序列SEQ ID NO：20。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ IDNO：9且重链可变域包含序列SEQ ID NO：21。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：10且重链可变域包含序列SEQ ID NO：22。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：11且重链可变域包含序列SEQ ID NO：23。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：12且重链可变域包含序列SEQ ID NO：24。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：13且重链可变域包含序列SEQ ID NO：25。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQID NO：14且重链可变域包含序列SEQ ID NO：26。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：15且重链可变域包含序列SEQ ID NO：27。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：16且重链可变域包含序列SEQ ID NO：28。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链可变域包含序列SEQ ID NO：17且重链可变域包含序列SEQ ID NO：29。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链域包含序列SEQ ID NO：47且重链域包含序列SEQ ID NO：54。一方面，本发明提供人源化抗因子D#111的经过修饰的抗因子D抗体，其中轻链域包含序列SEQ ID NO：61且重链域包含序列SEQ ID NO：63。
3.抗因子D抗体的亲和力和生物学活性
本文中的发明包括具有本文中鉴定的、抗因子D抗体想要的特征的抗体及其变体或其片段其片段(例如抗原结合片段)。可以对具有本文中鉴定的、抗因子D抗体想要的特征的抗体及其变体或其片段(例如抗原结合片段)筛选抑制性生物学活性，例如在体外或在体内，或通过测量结合亲和力。
a.亲和力
为了确定抗因子D抗体及其变体或其片段(例如抗原结合片段)是否与结合人因子D上由感兴趣抗体(例如那些拮抗因子D活性的抗体)结合的相同表位，可以实施交叉阻断测定法(Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988))。或者，可以实施表位作图来确定抗因子D抗体是否结合感兴趣表位(Champe et al.，J.Biol.Chem.，270：1388-1394(1995))。抗体亲和力(例如对人因子D的)可以使用标准方法来测定，包括实施例3中描述的那些。
一方面，本发明提供与鼠抗因子D抗体和/或人源化抗因子D抗体克隆#111和/或包含人源化抗因子D抗体克隆#111之可变域或HVR序列的抗体竞争的抗因子D抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)。还提供与鼠抗因子D抗体和/或人源化抗因子D抗体克隆#111和/或包含人源化抗因子D抗体克隆#111之可变域或HVR序列的抗体结合相同表位的抗因子D抗体或其变体或其片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体对因子D的单价亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)比如下的嵌合抗体的单价亲和力(例如作为Fab片段的嵌合抗体对因子D的亲和力)要低，例如低至少1倍或2倍，所述嵌合抗体包含来自鼠抗因子D抗体的轻链可变域和重链可变域、由其组成或基本上由其组成。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体对因子D的二价亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)比如下的嵌合抗体的单价亲和力(例如作为IgG的嵌合抗体对因子D的亲和力)要低，例如低至少1倍或2倍，所述嵌合抗体包含来自鼠抗因子D抗体的轻链可变域和重链可变域、由其组成或基本上由其组成。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体对因子D的单价亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)比如下的嵌合抗体的单价亲和力(例如作为Fab片段的嵌合抗体对因子D的亲和力)要高，例如高至少1倍或2倍，所述嵌合抗体包含来自鼠抗因子D抗体的轻链可变域和重链可变域、由其组成或基本上由其组成。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体对因子D的二价亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)比如下的嵌合抗体的二价亲和力(例如作为IgG的嵌合抗体对因子D的亲和力)要高，例如高至少1倍或2倍，所述嵌合抗体包含来自鼠抗因子D抗体的轻链可变域和重链可变域、由其组成或基本上由其组成。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为20nM(20x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为10nM(10x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为1.0nM(1.0x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为0.5nM(0.5x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为1.0pM(1.0x10-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为0.5pM(0.5x10-12M)或更好。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为10.0nM(10.0x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为5.0nM(5.0x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为1.0nM(1.0x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为0.5nM(0.5x10-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为5.0pM(5.0x10-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为2.0pM(2.0x10-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为1.0pM(1.0x10-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为0.5pM(0.5x10-12M)或更好。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)介于0.5mM(0.5x10-6M)和0.5pM(0.5x10-12M)之间。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)介于15nM(15x10-9M)和0.1nM(0.1x10-9M)之间。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)介于5.5nM(5.5x10-9M)和1nM(1x10-9M)之间。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)介于0.5pM(0.5x10-12M)和2pM(2x10-12M)之间。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)介于0.5mM(0.5x10-6M)和0.5pM(0.5x10-12M)之间。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)介于10nM(10x10-9M)和0.05nM(0.05x10-9M)之间。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)介于5.5nM(5.5x10-9M)和1nM(1x10-9M)之间。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)介于0.5pM(0.5x10-12M)和2pM(2x10-12M)之间。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为约1.4pM(1.4x10-12M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为约1.1pM(1.1x10-12M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为约0.19nM(0.19x10-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为约0.08nM(0.08x10-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为约12.3nM(12.3x10-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为约9.0nM(9.0x10-9M)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为约1.4pM(1.4x10-12M)+/-0.5。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为约1.1pM(1.1x10-12M)+/-0.6。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为约0.19nM(0.19x10-9M)+/-.01。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为约0.08nM(0.08x10-9M)+/-0.01。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为约12.3nM(12.3x10-9M)+/-2。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体或其抗体变体，其中抗体以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为约9.0nM(9.0x10-9M)+/-1。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在另一个实施方案中，抗因子D抗体或其抗体变体可具有约1.4pM(1.4x10-12M)+/-2的以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)。在另一个实施方案中，抗因子D抗体或其抗体变体可具有约1.1pM(1.1x10-12M)+/-2的以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)。在另一个实施方案中，抗因子D抗体或其抗体变体可具有约0.19nM(0.19x10-9M)+/-2的以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)。在另一个实施方案中，抗因子D抗体或其抗体变体可具有约0.08nM(0.08x10-9M)+/-2的以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)。在另一个实施方案中，抗因子D抗体或其抗体变体可具有约12.3nM(12.3x10-9M)+/-2的以其单价形式对因子D的亲和力(例如作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)。在另一个实施方案中，抗因子D抗体或其抗体变体可具有约9.0nM(9.0x10-9M)+/-2的以其二价形式对因子D的亲和力(例如作为IgG的抗体对因子D的亲和力)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
如本领域完全确立的，配体对其受体的结合亲和力可使用多种测定法之任一来测定，而且在多种定量数值方面来表述。因而，在一个实施方案中，结合亲和力表述为KD值并反映内在结合亲和力(例如具有最小化的亲合效应)。一般且优选，在体外测量结合亲和力，无论是在无细胞的或者是在细胞相关的设置中。如本文中极为详细描述的，结合亲和力的倍数差异可以在人源化抗体(例如处于Fab形式)的单价结合亲和力值)和参照/比较抗体(例如处于Fab形式)(例如具有供体高变区序列的鼠抗体)的单价结合亲和力值的比方面量化，其中结合亲和力值是在相似的测定条件下测定的。如此，在一个实施方案中，结合亲和力的倍数差异是作为处于Fab形式的人源化抗体和所述参照/比较Fab抗体的KD值比测定的。例如，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(A)具有比参照抗体(M)的亲和力“低3倍”的亲和力，那么若A的KD值是3x，则M的KD值会是1x，且A的KD对M的KD比会是3∶1。相反，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(C)具有比参照抗体(R)的亲和力“高3倍”的亲和力，那么若C的KD值是1x，则R的KD值会是3x，且C的KD对R的KD比会是1∶3。可以使用本领域已知的多种测定法之任一(包括本文中描述的那些)来获得结合亲和力测量，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)和ELISA。
另外，本发明抗体的KD值可以随所使用的特定测定法的条件而变化。例如，在一个实施方案中，可以在如下的测定法中获得结合亲和力测量，其中将Fab或抗体固定化并测量配体即因子D的结合，或者将Fab或抗体的配体即因子D固定化并测量Fab或抗体的结合。在一个实施方案中，可以在如下的测定法中获得结合亲和力测量，其中再生条件可包含(1)10mM甘氨酸或4MMgCl2pH 1.5，和(2)介于pH 1.0和pH 7.5之间的pH，包括pH 1.5、pH 5.0、pH 6.0和pH 7.2。在一个实施方案中，可以在如下的测定法获得结合亲和力测量，其中结合条件可包含(1)PBS或HEPES缓冲的盐水，和(2)Tween-20，即0.1％Tween-20。在一个实施方案中，可以在如下的测定法中获得结合亲和力测量，其中配体即因子D的来源可以来自商品化来源。在一个实施方案中，可以在如下的测定法中获得结合亲和力测量，其中(1)将Fab或抗体固定化并测量配体即因子D的结合，(2)再生条件包括4M MgCl2pH 7.2，及(3)结合条件包含含有0.1％Tween-20的HEPES缓冲的盐水pH 7.2。在一个实施方案中，可以在如下的测定法中获得结合亲和力测量，其中(1)将配体即因子D固定化并测量Fab或抗体的结合，(2)再生条件包括10mM甘氨酸pH 1.5，及(3)结合条件包括PBS缓冲液。
b.生物学活性
为了确定抗因子D抗体或其变体或片段(例如抗原结合片段)是否能够结合因子D及发挥生物学效果，例如抑制旁路途径溶血，可以使用溶血抑制测定法，其使用家兔RBC，包括实施例2中描述的那些。此类溶血抑制可使用标准测定法来测定(Kostavasili et al.，J of Immunology，158(4)：1763-72(1997)；Wiesmann et al.，Nature，444(7116)：159-60(2006))。此类测定法中的补体活化可以用血清或血浆来启动。血清或血浆中适宜的因子D浓度(Pascual et al.，Kidney International，34：529-536(1998)；Complement FactsBook，Bernard J.Morley和Mark J.Walport，editors，Academic Press(2000)；Barnum et al.，J.Immunol.Methods，67：303-309(1984))可依照本领域已知方法来常规测定，包括参考文献诸如Pascual et al.，Kidney International，34：529-536(1998)和Barnum et al.，J.Immunol.Methods，67：303-309(1984)和实施例4中披露的那些。本发明一般涉及能够抑制与因子D有关的生物学活性的抗体。例如，在18μg/ml的浓度(等同于血液中人因子D的摩尔浓度的约1.5倍；抗因子D抗体对因子D的摩尔比为约1.5∶1)，能观察到抗体对旁路补体活性的显著抑制(参见例如美国专利No.6,956,107)。
在一个实施方案中，本发明包括抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于30nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明包括抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于15nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明包括抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于10nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明包括抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于5nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于30nM和2nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于25nM和7nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于20nM和12nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于30nM和15nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于12nM和8nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于7nM和2nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于6nM和3nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于8nM和5nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于5nM和2nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于10nM和5nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于8nM和2nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于7nM和3nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于6nM和4nM之间的IC50值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约4.7nM±0.6nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约6.4nM±0.6nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约3.5nM±0.5nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约4.4nM±1.5nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约10.2nM±0.8nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约23.9nM±5.0nM的IC50值抑制旁路途径溶血。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于80nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于50nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于40nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于20nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以小于15nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于80nM和10nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于75nM和15nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于70nM和20nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于65nM和25nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于60nM和30nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于55nM和35nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于50nM和40nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于80nM和70nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于55nM和25nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以介于16nM和12nM之间的IC90值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约14.0nM±1.0nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约38.0nM±11.0nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在另一个实施方案中，本发明提供抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段以约72.6nM±4.8nM的IC90值抑制旁路途径溶血。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明关注抗因子D抗体或其片段(例如抗原结合片段)，其中此类抗体的Fab片段以约0.05∶1(0.05)至约10∶1(10)、或约0.09∶1(0.09)至约8∶1(8)、或约0.1∶1(0.1)至约6∶1(6)、或约0.15∶1(0.15)至约5∶1(5)、或约0.19∶1(0.19)至约4∶1(4)、或约0.2∶1(0.2)至约3∶1(3)、或约0.3∶1(0.3)至约2∶1(2)、或约0.4∶1(0.4)至约1∶1(1)、或约0.5∶1(0.5)至约1∶2(0.5)、或约0.6∶1(0.6)至约1∶3(0.33)、或约0.7∶1(0.7)至约1∶4(0.25)、或约0.8∶1(0.8)至约1∶5(0.2)或约0.9∶1(0.9)至约1∶6(0.17)的抗体对因子D摩尔比抑制旁路途径溶血。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。本发明的抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、或自抗体片段形成的多特异性抗体。在又一个实施方案中，本发明提供能够基本上穿透所有视网膜的人源化抗因子D抗体片段(例如抗原结合片段)。在又一个实施方案中，本发明提供能够穿透视网膜整个厚度的人源化抗因子D抗体片段(例如抗原结合片段)。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段在经单次玻璃体内注射而施用入哺乳动物眼(例如人)后具有至少3、5、7、10或12天的半衰期。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段在经单次玻璃体内注射而施用入哺乳动物眼(例如人)后抑制旁路途径(AP)补体活化达至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或115天。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段抑制旁路途径(AP)补体活化的浓度在经单次玻璃体内注射而施用入哺乳动物眼(例如人)后在视网膜组织中维持至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85天。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D抗体，其中此类抗体的Fab片段抑制旁路途径(AP)补体活化的的浓度在经单次玻璃体内注射而施用入哺乳动物眼(例如人)后在玻璃体液中维持至少80、85、90、95、100、105、110或115天。在一个例子中，本发明提供所述抗因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
抗体的生成
宿主细胞的选择和转化
将宿主细胞用本文所述用于抗因子D抗体生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian Cell Biotechnology：aPractical Approach，M.Butler，ed.，IRL Press，1991和Sambrook等，见上文。
真核细胞转染和原核细胞转化(即将DNA导入宿主中，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体整合)的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的、聚乙二醇/DMSO和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook等，见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw等，Gene 23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham和van der Eb，Virology 52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen等，J.Bact.130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown等，Methods inEnzvmology 185：527-537(1990)和Mansour等，Nature 336：348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核、酵母或高等真核细胞。适合于此目的的原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物体二者，例如肠细菌，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌)(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)副球菌属(Paracoccus)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31，446)，尽管其它菌株，诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)、大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)和K5772(ATCC 53，635)也是合适的。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110(Bachmann，Cellular andMolecular Biology，vol.2(Washington，D.C.：American Society for Microbiology，1987)，pp.1190-1219；ATCC保藏号27，325)可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55，244)，其具有完整基因型tonAptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大肠杆菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；大肠杆菌W3110菌株33D3，它具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lacIq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR(美国专利No.5,639,635)；及具有1990年8月7日授权的美国专利4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31，608)也是合适的。这些例子只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。
全长抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)及抗体融合物蛋白质可在细菌中制备，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如当治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联且免疫偶联物自身显示出肿瘤细胞破坏的效力时。全长抗体在循环中具有较长半衰期。大肠杆菌中的制备更快且更加省钱。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237(Carter等人)，US5,789,199(JoIy等人)，和US 5,840,523(Simmons等人)，它们描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，在此收入这些专利作为参考。表达后，从大肠杆菌细胞糊在可溶性级分中分离抗体，并且可例如根据同种型通过蛋白A或G柱来纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法类似的进行。
除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种、和株是普遍可得的且在本文中有用的，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、木霉属(Trichoderma)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养型酵母(Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs，269(1982)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。原则上，任何高等真核细胞培养物是可行的，无论是来自脊椎动物或无脊椎动物培养物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞，Luckow et al.，Bio/Technology 6，47-55(1988)；Miller et al.，Genetic Engineering，Setlow et al.eds.Vol.8，pp.277-279(Plenam publishing 1986)；Mseda et al.，Nature 315，592-594(1985)。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许的昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、伊蚊Aedes(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。此外，棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
脊椎动物细胞及培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。参见Tissue Culture，Academic Press，Kruse and Patterson，eds.(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是猴肾；人胚肾系；幼仓鼠肾细胞；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216)；小鼠塞托利(sertoli)细胞；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞；人肺细胞；人肝细胞；小鼠乳腺肿瘤；和NS0细胞。
为了重组生产本发明的抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)，分离编码它的核酸(例如cDNA或基因组DNA)，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体或其片段(例如抗原结合片段)的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。一般而言，优选的宿主细胞或是原核或是真核(通常是哺乳动物)起源的。
载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
因子D不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的编码抗因子D抗体的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者见美国专利5,010,182)或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP 362,179)或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。
用上述用于抗体生成的载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。
可以在多种培养基中培养用于生产本发明的抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)的宿主细胞。
a.原核宿主细胞
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
在碳源、氮源和无机磷酸盐源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围为约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选是约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等，J.Immunol.Methods 263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌入宿主细胞的周质并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可以转运入培养液并从中分离。可以从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达多肽。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选是约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可以在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等(1999)J.Bio.Chem.274：19601-19605；Georgiou等，美国专利No.6,083,715；Georgiou等，美国专利No.6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39：199-210)。
为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly等(1998)见上文；Georgiou等，美国专利No.5,264,365；Georgiou等，美国专利No.5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
b.真核宿主细胞
商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enzymol.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163；或6,048,728。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如X-氯化物，其中X是钠、钙、镁；和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
抗体纯化
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的抗因子D抗体或其片段(例如抗原结合片段)。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解使其从膜释放。抗因子D抗体表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂或细胞溶解剂。
可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化抗因子D抗体。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以除去污染物诸如IgG；及结合抗因子D抗体的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher，Methodsin Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principes and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用生成方法的性质和所产生的具体抗因子D抗体。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)，那么作为第一步，可以通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等，Bio/Technology 10：163-167，1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单地说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，一种纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等，1983，J.Immunol.Meth.62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人IgG3(Guss等，1986，EMBO J.5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)而言，可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)和污染物的混合物可以使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行低pH疏水相互作用层析。
药物配制剂
可通过将具有期望纯度的多肽或抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)或其抗体变体与任选的在本领域中通常采用的“药学可接受的”载体、赋形剂或稳定剂(均称为“赋形剂”)(例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张调节剂(isotonifier)、非离子型去污剂、抗氧化剂和其它各式各样的添加剂)混合来制备多肽或抗体的治疗用配制剂，以冻干配制剂或水溶液的形式供贮存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，A.Osol，编(1980)。此类添加剂在所采用的剂量和浓度对接受者必须是无毒的。
缓冲剂帮助将pH维持在接近生理学条件的范围内。它们优选以约2mM至约50mM的浓度存在。适于与本发明一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可提及磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐诸如Tris。
可添加防腐剂来延迟微生物生长，并可以0.2％-1％(w/v)范围的量添加。适于与本发明一起使用的防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基铵、苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、氯化己烷双铵、对羟基苯甲酸烃基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、和3-戊醇。
可添加等张调节剂(有时称为“稳定剂”)以确保本发明的液体组合物的等张力，并且等张调节剂包括多羟基糖醇，优选三羟基的或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
稳定剂指广泛种类的赋形剂，其在功能方面可从填充剂(bulking agent)变化至使治疗剂溶解或有助于防止变性或对容器壁的粘着的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上文列举的)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质诸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如右旋糖苷。稳定剂可以0.1至10,000份重量每份活性蛋白质重量的范围存在。
可添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及以保护治疗用蛋白质免于搅动诱导的聚集，其还容许配制剂在暴露于剪切表面应力时不引起蛋白质变性。合适的非离子型表面活性剂包括Polysorbate(20，80等)、Polyoxamer(184，188等)、Pluronic.RTM.多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖单醚(TWEEN.RTM.-20，TWEEN.RTM.-80等)。非离子型表面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
别的各式各样的赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。本文中的配制剂还可含有超过一种对于所治疗的特定适应症必需的活性化合物，优选那些具有互补活性且彼此不会不利影响的。例如，进一步提供免疫抑制剂可能是想要的。此类分子适合以对意图的目的有效的量组合存在。活性成分还可以封装于通过例如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，胶体药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osal，编(1980)中。
有待用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这易于通过例如流经无菌滤膜的过滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和-L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸使分子能够释放超过100天，但是某些水凝胶在较短的时间段释放蛋白质。在所封装的抗体在体内维持长时间时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性变化。根据所涉及的机制，可设计合理策略来稳定化。例如，若发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，则可通过修饰硫氢基、自酸性溶液冻干、控制湿度、使用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来稳定化。
用于预防或治疗眼病或眼疾的本发明化合物通常通过眼部、眼内、和/或玻璃体内注射、和/或近巩膜注射、和/或Tenon囊下注射、和/或脉络膜表面(superchoroidal)注射和/或滴眼剂和/或软膏剂形式的表面施用来施用。本发明的此类化合物可以通过多种方法来投递，例如玻璃体内，作为装置和/或储药库，其容许缓慢释放化合物入玻璃体，包括参考文献(诸如Intraocular DrugDelivery，Jaffe，Jaffe，Ashton，and Pearson，editors，Taylor & Francis(March2006))中记载的那些。在一个例子中，装置可以是释放化合物较长一段时间的微型泵和/或基质和/或被动扩散系统和/或封装细胞(encapsulated cell)的形式(Intraocular Drug Delivery，Jaffe，Jaffe，Ashton，and Pearson，editors，Taylor& Francis(March 2006))。也可使用其它施用方法，包括但不限于表面、胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、和病变内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。
用于眼部、眼内或玻璃体内施用的配制剂可通过本领域已知方法和使用本领域已知成分来制备。有效治疗的一项主要要求是适当渗透穿过眼。与眼前部的疾病(在这种情况中药物可以表面投递)不同，视网膜疾病要求更加位点特异性的办法。滴眼剂和软膏剂很少渗透眼后部，而且血眼屏障妨碍系统性施用的药物渗透到眼组织中。因而，为了治疗视网膜疾病，诸如AMD和CNV而选择的药物投递方法通常是直接玻璃体内注射。玻璃体内注射通常要重复进行，时间间隔取决于患者的状况及所投递药物的特性和半衰期。为了眼内(例如玻璃体内)渗透，通常优选较小的分子。
补体相关眼疾，诸如AMD或CNV的治疗功效可以通过评估眼内疾病时常用的多种终点来测量。例如，可评估视觉损失。视觉损失可通过但不限于例如下述各项来测量：测量最好矫正视力/视敏度(BCVA)自基线到预期时间点的均值变化(例如其中BCVA基于早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)视力表和测试距离4米的评估)；测量在预期时间点与基线相比视力损失小于15个字母的受试者比例；测量在预期时间点与基线相比视力获得超过或等于15个字母的受试者比例；测量在预期时间点Snellen视力相当于20/2000或更差的受试者比例；测量NEI视觉功能问卷(Visual FunctioningQuestionnaire)；测量预期时间点CNV的大小和CNV渗漏的量，例如通过荧光素血管造影术评估；等。眼部评估可通过下述各项来进行，例如包括但不限于例如实施眼部检查，测量眼内炎，评估视力，测量裂隙灯压(slitlamppressure)，评估眼内炎症，等。
治疗用多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)有效治疗特定病症或疾患的量会取决于病症或疾患的性质，并可通过标准临床技术来确定。若有可能的话，希望首先在体外，接着在有效的动物模型系统中测定本发明药物组合物和剂量-响应曲线，之后在人体内测试。
在一个实施方案中，治疗用多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的水溶液通过皮下注射来施用。在另一个实施方案中，治疗用多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的水溶液通过玻璃体内注射来施用。每剂可在每千克体重约0.5μg至约50μg，或更优选地，每千克体重约3μg至约30μg的范围内。
皮下施用的剂量给药日程表可自一月一次变化至一日一次，这取决于许多临床因素，包括疾病的类型、疾病的严重程度和受试者对治疗剂的敏感性。
提供下文实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
在此通过述及明确地完整收录本说明书中所引用的所有专利和参考文献。
制品和试剂盒
本发明的另一个实施方案是包含可用于治疗、预防和/或诊断本发明的抗体或其变体或其片段(例如抗原结合片段)所针对的状况的物质的制品。例如，本发明关注包含可用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症的物质的制品。所述制品包括容器及容器上或与容器相联系的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗、预防和/或诊断补体相关状况的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是本发明的抗因子D抗体或其片段(例如抗原结合片段)。所述标签或包装插页指明该组合物可用于治疗、预防和/或诊断特定状况。
包装插页指通常包括在治疗用产品商品化包装中的说明书，它包含有关此类治疗用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告的信息。在一个实施方案中，标签或包装插页指明该组合物用于治疗补体相关病症，诸如例如之前列出的任何状况，包括眼疾，例如老年性黄斑变性(AMD)。所述标签或包装插页会进一步包括关于对患者施用抗体组合物的说明书。
另外，所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
在另一个实施方案中，还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于治疗、预防和/或诊断补体相关状况，用于补体相关溶血测定法，用于自细胞纯化或免疫沉淀因子D多肽。为了分离和纯化因子D多肽，所述试剂盒可包含与珠子(例如sepharose珠子)偶联的抗因子D抗体。可提供包含用于因子D多肽体外检测和定量的抗体，例如在ELISA或Western印迹中进行的。与制品一样，所述试剂盒包括容器及容器上或与容器相联系的标签或包装插页。所述容器装有包含至少一种本发明抗因子抗体或其片段(例如抗原结合片段)的组合物。可包括装有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的别的容器。所述标签或包装插页可提供该组合物的描述以及意图体外或检测使用的说明书。所述标签或包装插页可提供关于对受试者施用(例如抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)的说明书。
人源化抗体的用途
本发明的人源化抗体或其片段(例如抗原结合片段)或其变体可用于诊断性测定法，例如用于检测感兴趣靶物在特定细胞、组织或血清中的表达。就诊断性应用而言，通常会用可检测模块标记抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)。可利用许多标记物。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O′Sullivan et al.，Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay，于Methods in Enzym.(Ed.J.Langone & H.Van Vunakis)，Academic press，NewYork，73：147-166(1981)。
有时，将标记物与抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)与生物素偶联，而且可以将上述三大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的间接偶联，将抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)与小型半抗原(例如地高辛)偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体或其抗体变体(例如抗地高辛抗体)或其片段(例如抗原结合片段)偶联。由此，可实现标记物与抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的间接偶联。
在本发明的另一个实施方案中，抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)无需标记，而且可使用结合该抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的经标记抗体检测其存在。
本发明的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)可用于任何已知测定方法，诸如竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，PP.147-158，CRC Press，Inc.，1987。
竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品竞争结合有限量的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的能力。测试样品中的靶物量与结合至抗体的标准品量成反比。为了便于测定得到结合的标准品的量，一般在竞争之前或之后使抗体不溶解。因此，可以方便的将结合至抗体的标准品和测试样品与仍然未结合的标准品和测试样品分离。
三明治/夹心式测定法牵涉使用两种抗体或其片段(例如抗原结合片段)，它们都能够结合待检测的不同免疫原性部分或表位或蛋白质。在三明治/夹心式测定法中，要分析的测试样品得到固定在固体支持物上的第一抗体的结合，此后第二抗体结合至测试样品，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国专利No.4,376,110。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的(直接夹心测定法)，或者可以使用经可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心测定法)。例如，一种类型的夹心测定法是ELISA测定法，其中的可检测模块是酶。
对于免疫组织化学，例如，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并用防腐剂诸如福尔马林固定。
抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)还可用于体内诊断性测定法。一般而言，用放射性核苷酸(诸如111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)标记抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)，从而可使用免疫闪烁描记法(immunoscintiography)来定位肿瘤。例如，本发明的高亲和力抗IgE抗体可用于检测例如哮喘患者的肺中存在的IgE的量。
可以在试剂盒中提供本发明的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)，即以预定量包装的试剂组合及实施诊断测定法的说明书。若抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)是用酶标记的，则试剂盒可包括酶所需要的底物和辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供实质性优化测定法灵敏度的、试剂在溶液中的浓度。具体而言，可以以包含赋形剂的干粉形式提供试剂，通常是冻干的，它们在溶解后提供具有适宜浓度的试剂溶液。
抗体的体内用途
设想了本发明的抗体或其抗体或其片段(例如抗原结合片段)可用于治疗哺乳动物。例如，在一个实施方案中，给非人哺乳动物施用抗体或其抗体用以获得临床前数据。示例性的要治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类动物、犬、猫、啮齿类动物和其它临床前研究所用的哺乳动物。这类哺乳动物可以是用抗体或其抗体治疗的疾病的已确立的动物模型，或者可用于研究目的抗体的毒性。在这些实施方案的每一个中，可以在哺乳动物中进行剂量放大研究。
通过任何合适手段施用抗体或其变体或其片段(例如抗原结合片段)或多肽，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及(如果想要局部免疫抑制治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，合适的是，通过脉冲输注来施用抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)，特别是使用递减剂量的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)。优选的是，通过注射给予剂量给药，最优选的是，通过静脉内或皮下注射给予剂量给药，这部分取决于施药是短期的还是长期的。
为了预防或治疗疾病，抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)或多肽的合适剂量将取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重性和进程、是为了预防还是为了治疗目的而施用抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的、以前的疗法、患者的临床史和对抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的应答、和主治医师的判断。
根据疾病类型和严重性，例如，约0.1mg/kg至150mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)是向患者施用的初始候选剂量，无论是一次或多次分开给药，或者通过连续输注。根据上述因素，典型的每日剂量的范围可以是约1mg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据状况，治疗持续到发生所希望的疾病症状消退。然而，可以用其它剂量方案。此疗法的进展可容易地用常规技术和测定法来监测。一种例示性的剂量给药方案披露于WO 94/04188。
抗体组合物可以以与优良医学实践一致的方式配成剂型、定剂量(dosed)、和施用。本文考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状况、病症成因、药剂投递位置、施用方法、施用计划、和医学从业人员已知的其它因素。要施用的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的“治疗有效量”将根据这类考量而决定，而且是预防、改善、或治疗疾病或病症所必需的最小量。抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)不必是但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂配制成剂型。这类其它药剂的有效量取决于存在于配方中的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)量、病症或治疗法的类型、和以上讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。
本发明的识别因子D作为其靶物的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)可用于治疗补体介导的病症。这些病症与过度的或不受控制的补体活化有关。它们包括：心肺旁路手术期间的补体活化；急性心肌梗死、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官功能衰竭、hypobolemic shock和肠缺血后缺血-再灌注损伤所致补体活化。这些病症还可包括作为炎性状况的疾病或状况，诸如重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重的哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应的结果。它还包括自身免疫病，诸如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。补体活化还与移植排斥有关。最近显示出补体活化与眼病之间有强关联，诸如老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。
实施例
作为例示而非限制，提供下面的实施例。除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下面的实施例和整篇说明书中以ATCC编号鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)。
实施例1：抗因子D抗体的修饰
为了鉴定会具有商业上想要的特征(诸如制造和生产期间的同质性)的经修饰抗因子D抗体及其变体及其片段(例如抗原结合片段)或为了分析表征，使用一种定点诱变办法来生成经修饰人源化抗因子D抗体及其变体及其片段(例如抗原结合片段)。首先，将来自人源化抗因子D Fab克隆#111的重链和轻链可变域(分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1)亚克隆入表达质粒。其次，将编码单突变的寡核苷酸退火至所得表达质粒以引入定点突变。
最初，将人源化抗因子D Fab克隆#111的重链和轻链可变域亚克隆入质粒pAEP1(pAEP1是一种用于在大肠杆菌中表达Fab抗体的质粒)，该亚克隆导致将一个缬氨酸(V)引入轻链可变域的第104位(依照Kabat编号方式，见图10)。
将人源化抗因子D Fab克隆#111的轻链可变域亚克隆pAEP1涉及连接两个DNA片段。第一个片段是其中已经消除了EcoRV/KpnI小片段的pAEP1载体。第二个片段是自人源化抗因子D Fab克隆#111的轻链质粒生成的大约300个碱基对的EcoRV-KpnI PCR片段，其中使用下面的引物：
5’-TTTCCCTTTGATATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCT-3’(SEQID NO：67)
5’-TTTCCCTTTGGTACCCTGGCCAAACGTGTACGGCAAAGAATC-3’(SEQ ID NO：68)。
将人源化抗因子D克隆#111的轻链可变域亚克隆入pAEP1在第104位引入了一个缬氨酸(V)，因为第104位在用于将人源化抗因子D克隆#111的轻链可变域插入pAEP1并因此在pAEP1质粒主链中的限制性内切核酸酶位点EcoRV和KpnI下游2个氨基酸。所得中间体质粒在本文中称作“pAEP1-283-VL”。
将人源化抗因子D克隆#111的重链可变域亚克隆入pAEP1-238-VL涉及连接两个DNA片段。第一个片段是其中已经消除了BsiWI/PspOMI小片段的pAEP1-238-VL载体。第二个片段是自人源化抗因子D Fab克隆#111的重链质粒生成的大约364个碱基对的BsiWI-PspOMI PCR片段，其中使用下面的引物：
5’-TTTGGGTTTCGTACGCTCAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGG-3’(SEQ ID NO：69)
5’-TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’(SEQ ID NO：70)。
所述两个DNA片段的连接产生人源化抗因子D Fab抗体变体238的质粒(变体在本文中也称作“238”；质粒在本文中称作“p238”)。
自人源化抗因子D#111亚克隆轻链和重链可变域后，使用定点PCR诱变将人源化抗因子D Fab抗体变体238重链可变域第1位(依照Kabat编号方式，见图1)谷氨酰胺(Q)突变成谷氨酸(E)，产生人源化抗因子D Fab抗体变体238-1(在本文中也称作“238-1”)。人源化抗因子D Fab抗体变体238-1的质粒(质粒在本文中称作“p238-1”)的构建涉及连接两个DNA片段。第一个片段是其中已经消除了BsiWI/PspOMI小片段的p238载体。第二个片段是自p238质粒生成的大约364个碱基对的BsiWI-PspOMI PCR片段，其中使用下面的引物：
5’-TTTGGGTTTCGTACGCTGAAGTCCAGCTGGTGCAATCTGGG-3’(SEQ ID NO：71)
5’-TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3’(SEQ ID NO：72)。
所述两个DNA片段的连接产生人源化抗因子D Fab抗体变体238-1的质粒(变体在本文中也称作“238-1”；质粒在本文中称作“p238-1”)，其包括第1位变成谷氨酸(E)的定点突变。发现此突变抑制人源化抗因子D Fab抗体变体238-1中的谷氨酰胺(Q)部分转变成焦谷氨酸(Amphlett，G.et al.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。
可以使用进一步的定点PCR诱变来突变甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp)残基与预防氧化或突变天冬酰胺(N或Asn)残基以预防脱酰胺。为了预防形成人源化抗因子D抗体的氧化变体，可以将甲硫氨酸(M或Met)(例如轻链第33位)突变成亮氨酸(L或Leu)(其在大小和疏水性方面与甲硫氨酸最相似，但是缺乏氧化需要的硫)，或者突变成异亮氨酸(I或Ile)(Amphlett，G.etal.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。为了预防形成人源化抗因子D抗体的脱酰胺变体，可以将天冬酰胺(N或Asn)(例如轻链第34位和第52位或重链第99位或第100位)突变成谷氨酰胺(Q或Gln)(其在化学方面与天冬酰胺(N或Asn)最相似)，或突变成丙氨酸(A或Ala)或丝氨酸(S或Ser)(它们是其它抗体中那些位置的常用替代)(Amphlett，G.et al.，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。
图1-2显示人源化抗因子D Fab抗体变体238(分别为SEQ ID No：6和18)和人源化抗因子D Fab抗体变体238-1(分别为SEQ ID NO：7和19)的轻链可变域和重链可变域序列。图4和图6显示人源化抗因子D Fab抗体变体238的轻链和重链序列(分别为SEQ ID NO：47和54)。图8和图10显示人源化抗因子D Fab抗体变体238-1的轻链和重链序列(分别为SEQ ID NO：61和63)。
BiaCore数据显示人源化抗因子D Fab抗体变体238对人因子D的亲和力以及克隆#111的人源化抗因子D全长mAb型式(人源化抗因子D全长mAb234)(在本文中称作“234”或“抗因子D全长mAb 234”或“人源化抗因子D全长MAb 234”)的亲和力(表2)。人源化抗因子D Fab抗体型式238和238-1还在溶血抑制测定法(图11)中进行测试以评估对旁路途径的抑制(见实施例3)。
实施例2：AP溶血测定法
通过使用C1q消减的人血清的溶血测定法和BiaCore分析(见下文实施例3)测定经修饰抗因子D抗体的生物学功能。如下实施溶血测定法。
为了测定旁路途径活性，将家兔红细胞(Er，Colorado Serum)在GVB中清洗3次，并重悬至2x109/ml。将抑制剂(50ul)和20ul Er悬浮液与GVB/0.1MEGTA/0.1M MgCl21∶1混和。通过添加经C1q消减的人血清(CompTech；30μl，在GVB中1∶3稀释)(以避免任何经由经典途径的补体活化)来启动补体活化。于室温温育30分钟后，添加200ul GVB/10mM EDTA以终止反应，并将样品以500g离心5分钟。通过测量412nm处的吸光度，在200ul上清液中测定溶血情况。数据表述成相对于在缺乏抑制剂时诱导的溶血的百分比。
图11显示人源化抗因子D Fab克隆#111(IC50＝4.7±0.6nM)，经修饰抗因子D Fab 238(IC50＝6.4±0.6nM)和经修饰抗因子D Fab 238-1(IC50＝3.5±0.5nM)对旁路途径溶血的抑制，其中使用以C1q消减的人血清作为补体来源的家兔红血球溶血测定法。对照是因子H(“人fH”)(CompTech)和抗糖蛋白120(“xgp120”)抗体。
实施例3：通过BiaCore对抗人因子D Fab的动力学分析
通过BiaCore 3000和BiaCore A100仪器上表面等离振子共振测量测定人因子D(Advanced Research，Inc.)结合固定化的经修饰抗因子D Fab 238(在本文中称作“238”；见实施例1)的动力学和亲和常数。对于表2中作为“BiaCore3000/BiaCore A100”结果列出的数值，在每一种仪器上进行分开的实验，分析来自分开的实验的数据以得到动力学常数，而且将动力学常数取平均值以得到表2中所示数值。或者，可以通过固定化人因子D并测量mAb或Fab的结合来测量人因子D结合的动力学和亲和常数，可以使用不同再生条件来测量(例如包含4M MgCl2的)和/或可以使用不同结合缓冲液来测量(例如包含PBS的)。还分析了克隆#111的人源化抗因子D全长mAb型式(在本文中称作“234”或“抗因子D全长mAb 234”或“人源化抗因子D全长mAb 234”)。
1.固定化
经胺偶联使用制造商提供的标准方案将mAb或Fab固定化。通过调节所注射mAb或Fab溶液的浓度或pH来调节偶联的密度，使得人因子D的饱和结合的总信号介于50和150个共振单位(RU)之间。偶联期望量的mAb或Fab后，通过注射乙醇胺来封闭传感器芯片上未反应的官能团。
2.动力学分析
进行结合实验，即注射浓度以2倍增量在500nM至0.98nM变化的一系列人因子D溶液的60μL等分试样。将所有样品在运行缓冲液中稀释，运行缓冲液含150mM NaCl，0.01％Tween-20和下述缓冲剂成分之一：(a)pH 7.2(10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；(b)pH 6.0(10mM MES(2-[N-吗啉子基]乙磺酸)；或pH 5.0(10mM乙酸钠)。流速为30μL/min，而且对所测试的人因子D的每一种浓度监测解离10分钟。自传感图减去在参照室(乙醇胺封闭)上注射相同溶液观察到的信号(传感图)。在传感图之间，使表面再生，即注射30μL 4M MgCl2以引起任何仍然结合至固定化抗体的人因子D解离。自人因子D传感图减去记录只在传感器芯片表面上注射缓冲液的对照传感图。使用BIAevaluation软件v4.1依照1∶1 Langmuir结合模型通过非线性回归分析这些数据。下文表2中提供了动力学和亲和常数。BiaCore技术是受到限制的，而且不能精确测量太快的结合速率(即小于约10pM的KD值)(Safstenet al.，Anal.Biochem.，353：181(2006))。
表2：BiaCore结果
Figure BPA00001279233400781
Figure BPA00001279233400791
实施例4：不同因子D浓度的AP溶血测定法
在因子D的三种血清浓度存在下，通过使用C1q消减的人血清的溶血抑制测定法和BiaCore分析(见上文实施例2)测定经修饰抗因子D抗体(包括抗因子D Fab 238)的生物学功能。
在因子D的定量ELISA(见下文)中分析C1q消减的人血清(CompTech)以及来自AMD患者眼的玻璃体液和Bruch氏膜组织(经由与Cole EyeInstitute，Cleveland，OH的协作获得)。因子D在C1q消减的血清中的浓度为97nM，而在来自AMD患者的玻璃体液和Bruch氏膜组织中的水平为16.2±10.3nM(均值±SD，n＝10)。
实施定量因子D ELISA，即将抗人补体因子D山羊多克隆抗体(R&DSystems，Minneapolis，MN)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至1μg/ml，并在4℃过夜温育期间将抗因子D多克隆抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)包被到384孔ELISA板(高结合板；Greiner Bio One through VWR International，Bridgeport，NJ)上。用清洗缓冲液(PBS/0.05％Tween-20)清洗3次后，将板用PBS/0.5％牛血清清蛋白(BSA)封闭1-2小时。这次和所有其它温育均于室温在定轨摇床上实施。在PBS/0.5％BSA/0.05％Tween-20中在15.6-1,000pg/ml的范围上制备因子D(Complement Technology，Inc.，Tyler，Texas)的标准曲线。融化为了在标准曲线的高、中、和低区定量而预稀释的冷冻对照样品。使用测定稀释剂(PBS/0.5％BSA/0.5％Tween-20)稀释C1q消减的人血清和人玻璃体液和Bruch氏膜溶胞样品。封闭步骤后，将板清洗并添加稀释的样品(血清，玻璃体液，和Bruch氏膜的溶胞物)，标准品和对照，并温育2小时。温育2小时后，将板清洗，并检测结合的因子D，即与生物素化抗因子D单克隆抗体(克隆9G7.1.16，在Genentech生成，稀释至62.5ng/ml)一起温育1-2小时，接着与一起在测定稀释剂中1/10,000稀释的链霉亲合素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)_(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)温育30分钟。最后一个清洗步骤后，添加四甲基联苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)，并容许显色5-7分钟。通过添加1M磷酸来停止反应。使用微量板读数仪(450nm，650nm参照)读取光密度，并自标准曲线的4参数拟合计算样品浓度。人玻璃体液和Bruch氏膜溶胞物样品中因子D的最小可定量浓度分别为780pg/mL(1/50最小稀释度)和156pg/mL(1/10最小稀释度)。
为了测定在与来自AMD患者眼的玻璃体液和Bruch氏膜组织中观察到的因子D浓度相似的因子D浓度存在下使用经修饰抗因子D Fab 238抑制旁路补体途径的IC50和IC90值，如实施例2中所述实施溶血测定法，其中使用10％C1q消减的血清(9.7nM因子D)或使用补充有另外的因子D(CompTech)以实现如下的因子D浓度的10％C1q消减的血清，所述因子D浓度代表在来自AMD患者的玻璃体液和Bruch氏膜组织中观察到的均值(16.2nM)或均值±1SD(26.5nM)浓度。数据表述成相对于在抑制剂缺失下诱导的溶血的百分比(图12)。使用4参数拟合模型(KaleidaGraph，Synergy Software，Reading，PA)通过抑制曲线的非线性回归为三项重复实验确定引起溶血反应50％和90％抑制的抗因子D Fab 238浓度(分别为IC50和IC90值)。还计算了IC50和IC90值对因子D相对浓度的摩尔比。表3中显示了平均IC50和IC90值和摩尔比。
表3：抗因子D Fab的IC50和IC90
Figure BPA00001279233400801
实施例5：对旁路途径补体活化的抑制的持续时间
以2.5mg剂量使用单次玻璃体内(IVT)注射抗因子D Fab 238(假设抗因子D Fab 238的半衰期(t1/2)为11.5天，基于来自家兔的种间缩放)，测量了人眼中对旁路途径(AP)补体活化的抑制的模拟持续时间(实施例13)。模拟数据基于来自新西兰白色家兔中单剂玻璃体内Fab 238的PK研究的缩放。
为了估算抗因子D Fab 238在人中的半衰期，计算抗因子D 238在家兔中的半衰期。给十二(12)只新西兰白色家兔每只眼中施用单剂玻璃体内1mgFab 238。在下述时间点自来自规定数目动物的两只眼收集玻璃体液和视网膜组织样品；第4，24和96小时3只动物(这些时间点每个的n＝6份样品)及第216小时1只动物(这个时间点的n＝2份样品)及第240小时2只动物(这个时间点的n＝4份样品)。在因子D结合ELISA中测量Fab 238在眼基体中的浓度。
分析来自所有动物的玻璃体液浓度-时间数据以估算药动学参数估值，其中使用不处理
Figure BPA00001279233400811
合并办法及IV推注输入模型(Models 201，WinNonlinPro version 5.2.1；Pharsight Corporation，Mountain View，CA)以提供终末半衰期(t1/2)的一个估值，3.83天。作为所有时间点所有眼取平均值的视网膜组织与玻璃体液中的浓度比来计算视网膜分配系数，其等于0.24。使用对ranibizumab观察到的相同的缩放因数将玻璃体液的PK参数缩放至人。假设人眼具有4mL的V1，假设人与家兔的半衰期比为3，则产生人中t1/2的一个估值，11.5天。这产生了玻璃体浓度和视网膜组织浓度的估值，作为时间的函数，如下：
玻璃体浓度＝(剂量/V1)*exp([-ln(2)/t1/2]*时间)
视网膜组织浓度＝(剂量/V1)*exp([-ln(2)/t1/2]*时间)*(视网膜分配系数)
在图13中，图是为单剂ITV 2.5mg/眼生成的，而且代表自t＝0至t＝112天的时间。IC90代表在如实施例2和4中所示实施的溶血测定法中产生90％抑制效果的Fab 238浓度，其中将10％合并的人血清补充至因子D浓度16.2nM。测定结果为IC90＝38nM Fab 238。为了比较视网膜与玻璃体浓度，使用下述方程进行摩尔-质量换算：
IC90＝38x10-9摩尔/L
Fab 238的MW＝50,000克/摩尔
IC90(ug/mL)＝(38x10-9摩尔/L)x(50x103克/摩尔)＝1.9x10-9克/L，或1.9ug/mL
如图13所示，作为单剂ITV 2.5mg/眼后玻璃体或视网膜浓度预测为1.9ug/mL以上的时间量来估算“IC90以上的天数”，并作为玻璃体或视网膜浓度的曲线图与1.9ug/mL的线交叉的点来观察。单次IVT注射抗因子D Fab 238后估算出抑制视网膜组织中和玻璃体液中的AP补体活化分别为至少约74天和至少约97天。图13中的虚线显示玻璃体内施用后玻璃体液中的模拟抗因子D Fab 238浓度。图13中的实线显示玻璃体内施用后视网膜组织中的模拟抗因子D Fab 238浓度。玻璃体液与视网膜组织中的浓度差异基于视网膜组织分配系数的估值，20％；换言之，施用至玻璃体液的总药物的20％会到达视网膜组织。
仅使用常规实验，本领域技术人员就会认识到或能够确定本文所述发明的具体实施方案的许多等同情况。所附权利要求书意图涵盖此类等同物。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过述及明确将本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收入本文。
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明并不限于所保藏构建物的范围，因为所保藏实施方案意图作为本发明某些方面的单一例示，而且功能上相当的任何构建物都在本发明的范围内。实际上，根据上面的描述，除了本文所显示和描述的，本发明的多种修饰对于本领域技`术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
Figure IPA00001279232800011
Figure IPA00001279232800021
Figure IPA00001279232800031
Figure IPA00001279232800041
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Figure IPA00001279232800271

Claims (76)

1.一种抗因子D抗体，其包含参照抗体的轻链HVR，其中所述抗因子D抗体在所述参照抗体的一个或多个位置处进一步包含替代，其中所述参照抗体包含含有ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：30)的轻链HVR-1、包含GGNTLRP(SEQ ID NO：35)的轻链HVR-2、和包含LQSDSLPYT(SEQ IDNO：38)的轻链HVR-3，且其中所述替代是下述一项或多项：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
2.一种抗因子D抗体，其包含参照抗体的重链HVR，其中所述抗因子D抗体在所述参照抗体的一个或多个位置处进一步包含替代，其中所述参照抗体包含含有GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：39)的重链HVR-1、包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：40)的重链HVR-2、和包含EGGVNN(SEQ ID NO：41)的重链HVR-3，且其中所述替代是下述一项或多项：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
3.一种抗因子D抗体，其包含参照抗体的轻链HVR和重链HVR，其中所述抗因子D抗体在所述参照抗体的一个或多个位置处进一步包含替代，其中所述参照抗体包含含有ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：30)的轻链HVR-1、包含GGNTLRP(SEQ ID NO：35)的轻链HVR-2、和包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：38)的轻链HVR-3、及包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：39)的重链HVR-1、包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ IDNO：40)的重链HVR-2、和包含EGGVNN(SEQ ID NO：41)的重链HVR-3，且其中所述替代是下述一项或多项：
(a)轻链的第33位氨基酸是L或I；
(b)轻链的第34位氨基酸是A或Q；
(c)轻链的第52位氨基酸是S或A；
(d)轻链的第104位氨基酸是V；
(e)重链的第1位氨基酸是E；
(f)重链的第99位氨基酸是A或Q；或
(g)重链的第100位氨基酸是A或Q。
4.一种抗因子D抗体，其包含：
(a)至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自下组的HVR：
(i)包含选自SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H1；
(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO：40的HVR-H2；
(iii)包含选自SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-H3；
(iv)包含选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQID NO：33和SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-L1；
(v)包含选自SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2；和
(vi)包含选自SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3；或
(b)至少一个变异HVR，其中所述变异HVR包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、30、31、32、33、34、35、36、37或38中所示序列的至少一个残基的修饰。
5.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：39的HVR-H1。
6.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：40的HVR-H2。
7.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：41的HVR-H3。
8.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：30的HVR-L1。
9.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：35的HVR-L2。
10.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：38的HVR-L3。
11.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：39的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：40的HVR-H2、和包含氨基酸序列SEQ IDNO：41的HVR-H3。
12.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：30的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：35的HVR-L2、和包含氨基酸序列SEQ IDNO：38的HVR-L3。
13.权利要求4的抗体，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：39的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：40的HVR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO：41的HVR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO：30的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：35的HVR-L2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO：38的HVR-L3。
14.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域。
15.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域。
16.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
17.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
18.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域和与选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
19.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域和与选自SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
20.权利要求4的抗体，其中该抗体包含选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28和SEQ ID NO：29的重链可变域。
21.权利要求4的抗体，其中该抗体包含选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的轻链可变域。
22.一种多肽，其包含下述氨基酸序列：
X1VQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQG
LEWMGWINTYTGETTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDT
AVYYCEREGGVX2X3WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：74)，其中X1是Q或E；X2是N、A或Q；且X3是N、A或Q。
23.一种多肽，其包含下述氨基酸序列：
DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLL
ISGGX6TLRPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPY
TFGQGTKX7EIK(SEQ ID NO：73)，其中X4是M、L或I；X5是N、A或Q；
X6是N、S或A；且X7是L或V。
24.一种多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28和SEQ ID NO：29。
25.一种多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。
26.一种抗因子D抗体，其包含权利要求22的多肽。
27.一种抗因子D抗体，其包含权利要求23的多肽。
28.一种抗因子D抗体，其包含权利要求22的多肽和权利要求23的多肽。
29.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：18。
30.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：19。
31.权利要求4的抗体，其中该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID NO：6。
32.权利要求4的抗体，其中该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID NO：7。
33.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：18和轻链可变域序列SEQ ID NO：6。
34.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：19和轻链可变域序列SEQ ID NO：7。
35.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域。
36.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域。
37.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
38.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
39.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域和与选自SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
40.权利要求4的抗体，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的重链可变域和与选自SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变域。
41.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：54。
42.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：63。
43.权利要求4的抗体，其中该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID NO：47。
44.权利要求4的抗体，其中该抗体包含轻链可变域序列SEQ ID NO：61。
45.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：54和轻链可变域序列SEQ ID NO：47。
46.权利要求4的抗体，其中该抗体包含重链可变域序列SEQ ID NO：63和轻链可变域序列SEQ ID NO：61。
47.一种多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：47和61。
48.一种多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54和63。
49.权利要求4或14-19或26-28的抗体，其中该抗体是人源化的。
50.权利要求4或14-19或26-28的抗体，其中所述因子D是哺乳动物因子D。
51.权利要求50的抗体，其中所述因子D是人因子D。
52.一种多核苷酸，其编码权利要求4或14-19或26-28的抗体。
53.一种多核苷酸，其编码权利要求22-25或47-48的多肽。
54.一种载体，其包含权利要求52或53的多核苷酸。
55.一种宿主细胞，其包含权利要求54的载体。
56.权利要求55的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核的。
57.权利要求55的宿主细胞，其中该宿主细胞是CHO细胞。
58.一种制备抗因子D抗体的方法，其中该方法包括(a)在适合于编码所述抗体的多核苷酸表达的条件下培养权利要求56或57的宿主细胞，并(b)分离所述抗体。
59.权利要求4或14-19或26-28的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
60.权利要求59的抗体，其中该抗体是选自下组的抗体片段：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv、或(Fab’)2片段。
61.权利要求59的抗体，其中该抗体是人源化的。
62.权利要求59的抗体，其是在细菌中生成的。
63.权利要求59的抗体，其是在CHO细胞中生成的。
64.一种药物配制剂，其包含权利要求59的抗因子D抗体，和药学可接受稀释剂、载体或赋形剂。
65.一种制品，其包含：
(a)权利要求64的药物配制剂；
(b)容器；和
(c)包装插页或标签，其指明所述药物配制剂能用于治疗补体相关病症。
66.一种试剂盒，其包含权利要求4或14-19或26-28的抗体和施用所述抗体来治疗补体相关病症的指令。
67.权利要求66的试剂盒，其中所述补体相关病症选自包含眼病的组。
68.权利要求67的试剂盒，其中所述眼病选自下组：老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。
69.权利要求68的试剂盒，其中所述老年性黄斑变性选自下组：中期干性AMD、地图样萎缩和地图样萎缩。
70.一种治疗选自包含炎性病症的组的补体相关病症的方法。
71.权利要求70的方法，其中所述炎性病症是自身免疫病。
72.权利要求71的方法，其中所述自身免疫病选自下组：系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。
73.一种治疗选自包含眼病的组的补体相关病症的方法。
74.权利要求73的方法，其中所述眼病选自下组：老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。
75.权利要求74的方法，其中所述老年性黄斑变性选自下组：中期干性AMD、地图样萎缩和地图样萎缩。
76.通过下述方法生成的抗体：
(a)培养表达包含权利要求14-15、29-30、35-36或41-42任一项的重链可变域和权利要求16-17、31-32、37-38或43-44任一项的轻链可变域的抗体的细胞；并
(b)自所述培养的细胞分离所述抗体。
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