KR101322027B1 - 인간화 항-인자 ｄ 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-인자 D 항체, 그의 핵산 및 아미노산 서열, 이들 항체를 수반하는 세포 및 벡터, 및 그의 생성, 및 과도하거나 제어되지 않는 보체 활성화와 연관된 질병 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 약물을 제조하는 데에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 이들 항체는 질병을 진단, 예방 및 치료하는 데 유용하다.

Description

인간화 항-인자 Ｄ 항체 및 그의 용도 {HUMANIZED ANTI-FACTOR D ANTIBODIES AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 참고
37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 본 비-가출원은 35 USC §119(e) 하에 미국 가특허원 제61/048,431호 (2008년 4월 28일자로 출원됨) 및 미국 가특허원 제61/048,689호 (2008년 4월 29일자로 출원됨) (이들의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 대한 이권을 청구하고 있다.
보체 시스템은 면역 복합체의 제거 및 감염체, 외래 항원, 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포에 대한 면역 반응에 있어서 중추적인 역할을 한다. 그러나, 보체는 병리학적 염증과 자가면역 질환에 관여하기도 한다. 따라서, 보체 케스케이드의 과도하거나 제어되지 않는 활성화를 억제시키는 것이 이러한 질병 및 질환이 있는 환자에게 임상적으로 이득을 제공할 수 있었다.
보체 시스템은 전통적 경로 및 대체 경로로 명명되는 두 가지 별개의 활성화 경로를 포괄한다 [참고: V. M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391]. 전통적 경로는 항원-항체 복합체의 형성에 의해 정상적으로 활성화되는 칼슘/마그네슘-의존성 케스케이드이다. 대체 경로는 특정 감수성 표면 (예: 효모 및 세균의 세포 벽 다당류, 및 특정 생체 중합체 물질) 상에서 C3의 침착 및 활성화에 의해 활성화되는 마그네슘-의존성 케스케이드이다. 보체 경로의 활성화로 인해, 보체 단백질의 생물학적 활성 단편, 예를 들어 C3a, C4a 및 C5a 아나필라톡신 (anaphylatoxin) 및 C5b-9 막 공격 복합체 (MAC)가 발생하는데, 이들은 백혈구 화학주성; 대식 세포, 호중구, 혈소판, 비만 세포 및 내피 세포의 활성화; 혈관 침투성; 세포용해 및 조직 손상과 관련된 염증 활성을 매개한다.
인자 D는 대체 보체 경로의 활성화에 있어 필수적인, 고도로 특이적인 세린 프로테아제이다. 이는 C3b와 결합된 인자 B를 절단시켜, 대체 경로 C3/C5 전환 효소의 활성 성분인 C3b/Bb 효소를 생성시킨다. 인자 D는 억제에 적합한 표적일 수 있는데, 이는 인간 내에서의 그의 혈장 농도가 극히 낮고 (1.8 ㎍/ml), 대체 보체 경로의 활성화에 대한 제한 효소인 것으로 밝혀졌기 때문이다 [참고: P. H. Lesavre and H.J. Muller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J. E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401].
보체 활성화를 하향 조절하는 것이 동물 모델 및 생체외 연구, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스 및 사구체신염 [참고: Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568], 류마티스성 관절염 [참고: Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959], 심폐 우회로 및 혈액 투석 [참고: C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1564-1572], 기관 이식에 있어서의 초급성 거부 [참고: T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202], 심근 경색 [참고: J. W. Homeister et al., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H. F. Weisman et al., Science, 1990; 249: 146-151], 재관류 손상 [참고: E.A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457], 및 성인 호흡 곤란 증후군 [참고: R. Rabinovici et al., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750]에서 몇 가지 질병 적응증을 치료하는 데 유효한 것으로 입증되었다. 또한, 기타 염증 질환 및 자가면역/면역 복합체 질환이 또한, 보체 활성화와 밀접한 연관이 있는데 [참고: V. M. Holers, ibid., B. P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994: 24: 219-228], 이에는 열 손상, 중증 천식, 아나필락시성 쇼크, 장 염증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 막증식성 사구체신염 및 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome)이 포함된다.
보체 매개된 장애 분야에서 항체 치료제에 대한 필요성이 대두되고 있고, 본 발명의 인간화 항-인자 D 항체, 및 그의 항체 변이체 및 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 이러한 필요성을 충족시키는 데 유용한 고 친화도 항체를 제공한다.
<발명의 요약>
한 국면에서, 본 발명은 일반적으로, 인자 D와 연관된 생물학적 활성을 억제시킬 수 있는 항체에 관한 것이다.
한 국면에서, 본 발명은 치료상 목적하는 각종 특징을 지닌 인간화 항-인자 D 항체에 관한 것이다. 본 발명에는 이들 인간화 항-인자 D 항체의 HVR의 아미노산 서열, 및 그들의 상응하는 핵산 서열이 포함된다. 본 발명에는 인간화 항-인자 D 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인의 아미노산 서열, 및 그들의 상응하는 핵산 서열이 포함된다. 본 발명에는 인간화 항-인자 D 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열, 및 그들의 상응하는 핵산 서열이 포함된다.
한 국면에서, 본 발명의 범위 내의 특이적 항체에는 인간화 항-인자 D Fab 클론 #238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 또는 238-11의 HVR을 포함하는 인간화 항-인자 D 항체가 비제한적으로 포함된다. 한 양태에서, 인간화 항-인자 D 항체는 인간화 항-인자 D Fab 클론 #238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 또는 238-11의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 인간화 항-인자 D 항체는 인간화 항-인자 D Fab 클론 #238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 또는 238-11의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명에는 인간화 항-인자 D Fab 클론 #238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 또는 238-11이 포함된다. 한 양태에서, 본 발명에는 인간화 항-인자 D Fab 클론 #238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 또는 238-11의 완전한 길이 항체의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 포함된다. 한 양태에서, 본 발명에는 인간화 항-인자 D Fab 클론 #238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 또는 238-11의 중쇄 및/또는 경쇄의 항원 결합성 서열을 포함하는, 완전한 길이의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 포함된다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 중쇄의 HVR의 1개, 2개 또는 3개 이상을 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 경쇄의 HVR의 1개, 2개 또는 3개 이상을 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 중쇄 가변 도메인의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 경쇄 가변 도메인의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다.
한 국면에서, 본 발명은 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 서열의 한 가지 이상 변형을 포함하는, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편) 또는 완전한 길이의 항체를 제공하는데, 이러한 완전한 길이의 항체 또는 항원 결합성 단편은 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 중쇄 및/또는 경쇄의 항원 결합성 서열을 포함한다. 한 양태에서, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 중쇄 및/또는 경쇄의 항원 결합성 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 서열의 한 가지 이상 변형을 포함하는, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편) 또는 완전한 길이의 항체는 인간화 항체 Fab 클론 #111과 본질적으로 동일한 에피토프와 추가로 결합한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 중쇄의 HVR을 1개, 2개 또는 3개 이상 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 경쇄의 HVR을 1개, 2개 또는 3개 이상 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 중쇄 가변 도메인의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 항원 결합성 서열은 경쇄 가변 도메인의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다. 한 양태에서, 상기 항체 단편 또는 완전한 길이의 항체 내에서의 상기 변형은 중쇄 내에 있다. 한 양태에서, 상기 항체 단편 또는 완전한 길이의 항체 내에서의 상기 변형은 경쇄 내에 있다. 한 양태에서, 상기 항체 단편 또는 완전한 길이의 항체 내에서의 상기 변형은 중쇄 가변 도메인 내에 있다. 한 양태에서, 상기 항체 단편 또는 완전한 길이의 항체 내에서의 상기 변형은 경쇄 가변 도메인 내에 있다. 한 양태에서, 상기 항체 단편 또는 완전한 길이의 항체 내에서의 상기 변형은 중쇄의 HVR 1개, 2개 또는 3개 이상 내에 있다. 한 양태에서, 상기 항체 단편 또는 완전한 길이의 항체 내에서의 상기 변형은 경쇄의 HVR 1개, 2개 또는 3개 이상 내에 있다.
한 국면에서, 본 발명은 인자 D와 약 10-9 내지 10-12 M 이상의 결합 친화도로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 관한 것이다.
한 국면에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 Fab 단편이 약 0.05:1 (0.05) 내지 약 10:1 (10), 또는 약 0.09:1 (0.09) 내지 약 8:1 (8), 또는 약 0.1:1 (0.1) 내지 약 6:1 (6), 또는 약 0.15:1 (0.15) 내지 약 5:1 (5), 또는 약 0.19:1 (0.19) 내지 약 4:1 (4), 또는 약 0.2:1 (0.2) 내지 약 3:1 (3), 또는 약 0.3:1 (0.3) 내지 약 2:1 (2), 또는 약 0.4:1 (0.4) 내지 약 1:1 (1), 또는 약 0.5:1 (0.5) 내지 약 1:2 (0.5), 또는 약 0.6:1 (0.6) 내지 약 1:3 (0.33), 또는 약 0.7:1 (0.7) 내지 약 1:4 (0.25), 또는 약 0.8:1 (0.8) 내지 약 1:5 (0.2) 또는 약 0.9:1 (0.9) 내지 약 1:6 (0.17)의 Fab 단편 대 인자 D 몰 비에서 인자 D의 생물학적 기능을 억제시키는, 본 발명의 항체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 관한 것이다.
한 국면에서, 본 발명의 항체에는 인간, 인간화 또는 키메라 항체가 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명에는 인간화 항-인자 D 항체의 항체 단편 (예: 항체 결합성 단편)이 포함된다. 본 발명의 항체 단편은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 미니보디 (minibody), 디아보디 (diabody), 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체일 수 있다.
본 발명의 기타 국면에서, 본 발명에는 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 포함하는 조성물이 포함된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 적어도 일부를 코딩하는 세포주 및 벡터를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명에는 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 및 조성물의 제조 방법, 생성 방법 및 사용 방법이 포함된다. 한 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 제조 방법은 (a) 벡터를 포함하고, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 진핵성 또는 CHO 세포를, 상기 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 이러한 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)를 단리하는 단계를 포함한다.
추가의 국면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 담체와 조합하여 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 담체는 제약상 허용되는 담체이다.
본 발명의 또 다른 국면은 과도하거나 제어되지 않는 보체 활성화와 연관된 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 약물 또는 조성물을 제조하기 위한, 상기 인간화 항체 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 용도이다. 이에는 심폐 우회로 수술 동안의 보체 활성화; 급성 심근 경색, 동맥류, 뇌졸증, 출혈성 쇼크, 압박 손상, 복합 장기부전, 저혈량 쇼크, 내장 허혈증 또는 허혈증을 유발시키는 기타 증상 후의 허혈증-재관류로 인한 보체 활성화가 포함된다. 보체 활성화는 또한, 염증 질환, 예를 들어 중증 화상, 내독소증, 패혈성 쇼크, 성인 호흡 곤란 증후군, 혈액 투석; 아나필락시성 쇼크, 중증 천식, 혈관부종, 크론병 (Crohn's disease), 겸상 적혈구 빈혈, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염 및 췌장염과 연관된 것으로 밝혀졌다. 상기 장애는 약물 부작용, 약물 알레르기, IL-2 유도된 혈관 누출 증후군 또는 방사선촬영 조영제 알레르기에 따른 결과일 수 있다. 이에는 또한, 자가면역 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) 및 다발성 경화증이 포함된다. 또 다른 양태에서, 보체 활성화는 또한, 이식체 거부와 연관이 있다. 또 다른 양태에서, 보체 활성화는 또한, 안과 질환 (그의 병리 상태가 보체의 전통적 및 대체 경로를 포함하여 보체와 관련된 모든 안과 질환 및 질병), 예를 들어 황반 변성 질환, 예를 들면 모든 병기의 연령 관련 황반 변성 (AMD) [건식 및 습식 (비-삼출성 및 삼출성) 형태 포함], 당뇨병성 망막증 및 기타 허혈증 관련 망막증, 맥락막 신생혈관증식 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병 (von Hippel-Lindau disease), 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄증 (CRVO), 각막 신생혈관증식, 및 망막 신생혈관증식과 연관이 있다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환에는 연령 관련 황반 변성 (AMD) [비-삼출성 (예: 중간 건식 AMD 또는 지도형 위축 (GA)) 및 삼출성 (예: 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식) (CNV)) AMD 포함], 당뇨병성 망막증 (DR), 안내염 및 포도막염이 포함된다. 추가의 예에서, 비-삼출성 AMD에는 경질 드루젠 (drusen), 연질 드루젠, 지도형 위축 및/또는 색소 클럼핑 (clumping)의 존재를 포함될 수 있다. 또 다른 예에서, 보체 관련 눈 질환에는 연령 관련 황반 변성 (AMD), 예를 들어 초기 AMD (예를 들어, 다수 개의 작은 드루젠 내지 1개 이상의 비-확장성 중간 크기의 드루젠를 포함한다), 중간 AMD (예를 들어, 확장성 중간 크기의 드루젠 내지 1개 이상의 큰 드루젠을 포함한다) 및 진행성 AMD (예를 들어, 지도형 위축 또는 진행성 습식 AMD (CNV))가 포함된다. 추가의 예에서, 중간 건식 AMD에는 큰 융합성 드루젠이 포함될 수 있다. 추가의 예에서, 지도형 위축에는 광수용체 및/또는 망막 색소침착 상피 (RPE) 손실이 포함될 수 있다. 추가의 예에서, 지도형 위축 부위는 작거나 클수 있고/있거나 황반 부위 또는 말초 망막 내일 수 있다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 중간 건식 AMD이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 지도형 위축이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식 (CNV))이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)를 포함하는 키트를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 및 보체 관련 장애를 치료하기 위해 상기 항체를 투여하는 것에 관한 지시 사항을 포함하는 키트에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기와, 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 양태에서, 완충제는 제약상 허용 가능하다. 한 양태에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 포함하는 조성물은 몇몇 양태에서 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 한 양태에서, 키트는 조성물 [예: 본 발명의 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)]을 대상체에게 투여하기 위한 지시 사항을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 키트는 이러한 키트의 사용 설명서를 추가로 포함한다.
한 국면에서, 본 발명은 보체 관련 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조품에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 (a) 용기; (b) 이러한 용기 상의 표지; 및 (c) 상기 용기와 함께 함유된, 본 발명의 항체, 또는 그의 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 포함하는 조성물을 포함하는 제조품에 관한 것인데, 상기 용기 상의 표지는 해당 조성물이 보체 관련 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 사용될 수 있다는 것을 표시한다.
한 국면에서, 본 발명은 보체 관련 눈 질환과 같은 질병을 치료적 및/또는 예방적 처치하기 위한 약물을 제조하는 데에 있어서의, 본 발명의 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편), 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 보체 관련 눈 질환은 연령 관련 황반 변성 (AMD) [비-삼출성 (예: 중간 건식 AMD 또는 지도형 위축 (GA)) 및 삼출성 (예: 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식) (CNV)) AMD 포함], 당뇨병성 망막증 (DR), 안내염 및 포도막염 중에서 선택된다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 중간 건식 AMD이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 지도형 위축이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식 (CNV))이다.
한 국면에서, 본 발명은 보체 관련 눈 질환과 같은 질병을 치료적 및/또는 예방적 처치하기 위한 약물을 제조하는 데에 있어서의, 본 발명의 제조품의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 보체 관련 눈 질환은 연령 관련 황반 변성 (AMD) [비-삼출성 (예: 중간 건식 AMD 또는 지도형 위축 (GA)) 및 삼출성 (예: 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식) (CNV)) AMD 포함], 당뇨병성 망막증 (DR), 안내염 및 포도막염 중에서 선택된다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 중간 건식 AMD이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 지도형 위축이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식 (CNV))이다.
한 국면에서, 본 발명은 보체 관련 눈 질환과 같은 질병을 치료적 및/또는 예방적 처치하기 위한 약물을 제조하는 데에 있어서의, 본 발명의 키트의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 보체 관련 눈 질환은 연령 관련 황반 변성 (AMD) [비-삼출성 (예: 중간 건식 AMD 또는 지도형 위축 (GA)) 및 삼출성 (예: 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식) (CNV)) AMD 포함], 당뇨병성 망막증 (DR), 안내염 및 포도막염 중에서 선택된다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 중간 건식 AMD이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 지도형 위축이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식 (CNV))이다.
도 1a-1c는 다음에 대한 가변 경쇄 도메인의 서열 정렬을 도시한 것이다: 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111 (서열 1), 인간화 항-인자 D Fab, 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 및 238-11 (각각 서열 6-17) 및 VL 카파 I 컨센서스 서열 (서열 65). 위치는 카바트 (Kabat)에 따라서 넘버링되고, 초가변 영역 [카바트 + 초티아 (Chothia) HVR 정의에 따름]은 박스안에 있다 [HVR: (1) HVR-L1: A1-A11 (ITSTDIDDDMN (서열 30), ITSTDIDDDLN (서열 31), ITSTDIDDDIN (서열 32), ITSTDIDDDMA (서열 33) 또는 ITSTDIDDDMQ (서열 34))로서 확인됨, (2) HVR-L2: B1-B7 (GGNTLRP (서열 35), GGSTLRP (서열 36) 또는 GGATLRP (서열 37))로서 확인됨, (3) HVR-L3: C1-C9 (LQSDSLPYT (서열 38))로서 확인됨]. 각 인간화 항-인자 D Fab 내에서의 아미노산 변화는 진한 이탤릭체이다.
도 2a-c는 다음에 대한 가변 중쇄 도메인의 서열 정렬을 도시한 것이다: 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111 (서열 2) 및 인간화 항-인자 D Fab, 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 및 238-11 (각각 서열 18-29) 및 VH 아군 7 컨센서스 서열 (서열 66). 위치는 카바트에 따라서 넘버링되고, 초가변 영역 [카바트 + 초티아 HVR 정의에 따름]은 박스안에 있다 [HVR: (1) HVR-H1: D1-D10 (GYTFTNYGMN (서열 39))로서 확인됨, (2) HVR-H2: E1-E19 (WINTYTGETTYADDFKG (서열 40))로서 확인됨, (3) HVR-H3: F1-F6 (EGGVNN (서열 41), EGGVAN (서열 42), EGGVQN (서열 43), EGGVNA (서열 44) 또는 EGGVNQ (서열 45))로서 확인됨]. 각 인간화 항-인자 D Fab 내에서의 아미노산 변화는 진한 이탤릭체이다.
도 3은 인간화 항-인자 D Fab 238의 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 46)을 도시한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 인간화 항-인자 D Fab 238의 경쇄를 코딩하는데, 출발 및 정지 코돈이 진하게 밑줄처져 있다. 도 4에서 첫 번째 아미노산 (서열 47)에 상응하는 코돈이 진한 이탤릭체이다.
도 4는 인간화 항-인자 D Fab 238에 대한 경쇄의 아미노산 서열 (서열 47)을 도시한 것이다. 이러한 아미노산 서열에는 도 3에 도시된 서열 46에 의해 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 신호 서열이 결여되어 있다. HVR 서열은 진한 이탤릭체이다. 가변 영역은 밑줄치지 않은 영역이지만, 제1 불변 도메인 CL1은 밑줄처져 있다. 골격 (FR) 영역 및 HVR 영역이 제시된다: FR1-LC (서열 48), FR2-LC (서열 49), FR3-LC (서열 50), FR4-LC (서열 51), HVR1-LC (서열 30 (ITSTDIDDDMN)), HVR2-LC (서열 35 (GGNTLRP)), HVR3-LC (서열 38 (LQSDSLPYT)) 및 CL1 (서열 52).
도 5는 인간화 항-인자 D Fab 238에 대한 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 53)을 도시한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 인간화 항-인자 D Fab 238의 중쇄를 코딩하는데, 출발 및 정지 코돈이 진하게 밑줄처져 있다. 도 6에서 첫 번째 아미노산 (서열 54)에 상응하는 코돈이 진한 이탤릭체이다.
도 6은 인간화 항-인자 D Fab 238에 대한 중쇄의 아미노산 서열 (서열 54)을 도시한 것이다. 이러한 아미노산 서열에는 도 5에 도시된 서열 53에 의해 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 신호 서열이 결여되어 있다. HVR 서열은 진한 이탤릭체이다. 가변 영역은 밑줄치지 않은 영역이지만, 제1 불변 도메인 CH1은 밑줄처져 있다. 골격 (FR) 영역 및 HVR 영역이 제시된다: FR1-HC (서열 55), FR2-HC (서열 56), FR3-HC (서열 57), FR4-HC (서열 58), HVR1-HC (서열 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2-HC (서열 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC (서열 41 (EGGVNN)) 및 CH1 (서열 59).
도 7은 인간화 항-인자 D Fab 238-1에 대한 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 60)을 도시한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 인간화 항-인자 D Fab 238-1의 경쇄를 코딩하는데, 출발 및 정지 코돈이 진하게 밑줄처져 있다. 도 8에서 첫 번째 아미노산 (서열 61)에 상응하는 코돈이 진한 이탤릭체이다.
도 8은 인간화 항-인자 D Fab 238-1에 대한 경쇄의 아미노산 서열 (서열 61)을 도시한 것이다. 이러한 아미노산 서열에는 도 7에 도시된 서열 60에 의해 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 신호 서열이 결여되어 있다. HVR 서열은 진한 이탤릭체이다. 가변 영역은 밑줄치지 않은 영역이지만, 제1 불변 도메인 CL1은 밑줄처져 있다. 골격 (FR) 영역 및 HVR 영역이 제시된다: FR1-LC (서열 48), FR2-LC (서열 49), FR3-LC (서열 50), FR4-LC (서열 51), HVR1-LC (서열 30 (ITSTDIDDDMN)), HVR2-LC (서열 35 (GGNTLRP)), HVR3-LC (서열 38 (LQSDSLPYT)) 및 CL1 (서열 52).
도 9는 인간화 항-인자 D Fab 238-1에 대한 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 62)을 도시한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 인간화 항-인자 D Fab 238-1의 중쇄를 코딩하는데, 출발 및 정지 코돈이 진하게 밑줄처져 있다. 도 10에서 첫 번째 아미노산 (서열 63)에 상응하는 코돈이 진한 이탤릭체이다.
도 10은 인간화 항-인자 D Fab 238-1에 대한 중쇄의 아미노산 서열 (서열 63)을 도시한 것이다. 이러한 아미노산 서열에는 도 9에 도시된 서열 62에 의해 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 신호 서열이 결여되어 있다. HVR 서열은 진한 이탤릭체이다. 가변 영역은 밑줄치지 않은 영역이지만, 제1 불변 도메인 CH1은 밑줄처져 있다. 골격 (FR) 영역 및 HVR 영역이 제시된다: FR1-HC (서열 64), FR2-HC (서열 56), FR3-HC (서열 57), FR4-HC (서열 58), HVR1-HC (서열 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2-HC (서열 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC (서열 41 (EGGVNN)) 및 CH1 (서열 59).
도 11은 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111 및 인간화 항-인자 D Fab 238 및 238-1에 대한 대체 보체 활성의 억제를 나타내는 용혈성 검정 결과를 도시한 것이다. IC50 값이 제시된다.
도 12는 인자 D의 3가지 혈청 농도 (9.7 nM, 16.2 nM 및 26.5 nM)에서 인간화 항-인자 D Fab 238에 대한 대체 경로 (AP) 보체 활성의 억제를 나타내는 용혈성 검정 결과를 도시한 것이다. 표 3은 인자 D의 3가지 혈청 농도에 상응하는 IC50 (nM) 및 IC90 (nM) 값 (이들 값은 3회 반복된 실험의 평균을 나타낸다)을 제시한다. 항체 대 표적 인자 D 몰 비가 표 3에 또한 제시되어 있다.
도 13은 항-인자 D Fab 238을 2.5 mg 용량으로 단일 유리질내 (IVT) 주사한 인간 눈에서 대체 경로 (AP) 보체 활성화의 모의 억제 기간을 도시한 것이다 (토끼로부터의 종간 스캐일링을 근거로 하여, 항-인자 D Fab 238의 반감기 (t1/2)가 11.5일이라고 추정하였다). 항-인자 D Fab 238의 단일 IVT 주사는 망막 조직에서는 약 74일 이상 동안, 그리고 유리체액에서는 약 97일 이상 동안 AP 보체 활성화를 억제시키는 것으로 추정되었다. 도 13에서, 데시 (-)는 유리질내 투여 후 유리체액 내에서의 모의 항-인자 D Fab 238 농도를 나타낸다. 도 13에서, 실선은 유리질내 투여 후 망막 조직 내에서의 모의 항-인자 D Fab 238 농도를 나타낸다. 유리체액 내에서의 농도와 망막 조직 내에서의 농도 차이는 20％의 망막 조직 분배 계수의 추정치를 기준으로 한 것인데, 달리 말하면 유리체액에 투여된 총 약물의 20％가 망막 조직에 접근될 것이다.
<발명의 상세한 설명>
I. 정의
본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어는 당업자에게 통상적이고 전형적인 의미를 지니는 것으로 간주되어야 한다. 그러나, 본 출원인은 다음 용어가 다음에 정의되는 바와 같이 특별한 정의로서 제공되기를 요망한다.
항체 쇄 폴리펩티드 서열과 관련하여 "실질적으로 동일한"이란 기준 폴리펩티드 서열과의 서열 동일성이 70％, 또는 80％, 또는 90％, 또는 95％ 이상인 항체 쇄로서 간주될 수 있다. 핵산 서열과 관련한 상기 용어는 기준 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 85％, 또는 90％, 또는 95％, 또는 97％ 이상인 뉴클레오티드 서열로서 간주될 수 있다.
"동일성" 또는 "상동성"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 전체 서열에 대한 최대 동일성을 달성하며, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않은 후에, 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (％)을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 어떠한 N- 또는 C-말단 연장물이나 삽입물도 동일성 또는 상동성을 저하시키는 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 구체적으로 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 및 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체)를 포괄한다. 항체 (Ab) 및 면역글로불린 (Ig)은 동일한 구조적 특징을 지닌 당단백질이다. 항체가 특이적 표적에 대한 결합 특이성을 나타내긴 하지만, 면역글로불린에는 표적 특이성이 결여된 항체와 기타 항체-유사 분자 둘 다가 포함된다. 천연 항체 및 면역글로불린은 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 구성분으로 확인되어 이러한 천연 환경으로부터 분리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 한 예에서는, 항체를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게 은 염색 (silver stain)을 이용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항-인간 인자 D 항체"는 보체 활성화를 억제하거나 실질적으로 저하시키는 방식으로 인간 인자 D와 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
용어 "인자 D"는 천연 서열 및 변이체 인자 D 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
"천연 서열" 인자 D는 그의 제조 방식과는 상관없이, 자연으로부터 유래된 인자 D 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 따라서, 천연 서열 인자 D는 천연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 성숙한 인자 D 단백질, 예를 들어 성숙한 인간 인자 D 단백질 (NM_001928) 이외에도, 용어 "천연 서열 인자 D"에는 구체적으로, 인자 D의 천연 발생적 전구체 형태 (예를 들어, 단백질 분해적으로 절단되어 활성 형태를 생성시키는, 불활성 전단백질), 인자 D의 천연 발생적 변이체 형태 (예: 대체 스플라이싱된 형태) 및 인자 D의 천연 발생적 대립유전자성 변이체 뿐만 아니라 자연으로부터 유래된 인자 D 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 인자 D 분자의 구조적 입체 형태적 변이체가 포괄된다. 고등 영장류 및 비-인간 포유류를 포함한 비-인간 동물의 인자 D 폴리펩티드가 이러한 정의 내에 구체적으로 포함된다.
"인자 D 변이체"는 천연 서열 인자 D 폴리펩티드, 예를 들어 천연 서열 인간 인자 D 폴리펩티드 (NM_001928)와의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인, 다음에 정의된 바와 같은 활성 인자 D 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 인자 D 변이체는 성숙한 인간 아미노산 서열 (NM_001928)과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 또는 약 85％ 이상, 또는 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상, 또는 약 99％ 이상일 것이다.
"아미노산 서열 동일성 (％)"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성을 달성하며, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않은 후에, 기준 인자 D 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (％)로서 규정된다. 아미노산 서열 동일성 (％)을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 메갈라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이에는 비교하고자 하는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데에 필요한 모든 알고리즘이 포함된다. 이어서, 보다 긴 서열을 기준으로 하여 서열 동일성을 계산하는데, 즉 보다 짧은 서열이 보다 긴 서열의 일부와 100％ 서열 동일성을 나타내는 경우일지라도, 전반적인 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
"핵산 서열 동일성 (％)"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성을 달성한 후에, 기준 인자 D-코딩 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 비율 (％)로서 규정된다. 핵산 서열 동일성 (％)을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 메갈라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이에는 비교하고자 하는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데에 필요한 모든 알고리즘이 포함된다. 이어서, 보다 긴 서열을 기준으로 하여 서열 동일성을 계산하는데, 즉 보다 짧은 서열이 보다 긴 서열의 일부와 100％ 서열 동일성을 나타내는 경우일지라도, 전반적인 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원 내에서 통상 연합되는 하나 이상의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 분리시킨 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자에는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 존재하는 경우에 코딩된 폴리펩티드를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
"단리된" 인자 D 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 인자 D 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원 내에서 통상 연합되는 하나 이상의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 분리시킨 핵산 분자이다. 단리된 인자 D 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 단리된 인자 D 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 바와 같은 코딩 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 단리된 인자 D 폴리펩티드-코딩 핵산 분자에는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 존재하는 경우에 인자 D를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 인자 D 폴리펩티드-코딩 핵산 분자가 포함된다.
용어 "길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 인자 D 생물학적 활성을 중화, 차단, 부분적 또는 완전히 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 모든 분자가 포함된다. 인자 D 길항제에는 인자 D와 결합하고, 인자 D 활성, 예를 들어 보체 관련 눈 질환의 병리 상태에 참여할 수 있는 인자 D의 능력을 중화, 차단, 부분적 또는 완전히 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 항-인자 D 항체, 및 그의 항체 변이체, 그의 항원 결합성 단편, 기타 결합성 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자가 비제한적으로 포함된다.
"소분자"는 분자량이 약 600 달톤 미만, 바람직하게 약 1000 달톤 미만인 분자를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본 발명의 인자 D 길항제의 맥락에서 "활성" 또는 "생물학적 활성"은 인자 D의 생물학적 활성을 길항 (부분적 또는 완전히 억제)시킬 수 있는 능력이다. 인자 D 길항제의 생물학적 활성을 한 가지 예는 인자 D 관련 질병 또는 질환, 예를 들어 보체 관련 눈 질환의 상태 (예: 병리 상태)를 측정 가능하게 개선시킬 수 있는 능력이다. 이러한 활성은 관련 동물 모델 또는 인간 임상 시험을 이용하여, 시험관내 또는 생체내 시험, 예를 들어 결합 검정, 대체 경로 용혈 검정 (예: 대체 경로 보체 활성 또는 활성화의 억제를 측정하는 검정)에서 결정할 수 있다.
용어 "보체 관련 장애"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 과도하거나 제어되지 않는 보체 활성화와 연관된 장애가 포함된다. 이에는 심폐 우회로 수술 동안의 보체 활성화; 급성 심근 경색, 동맥류, 뇌졸증, 출혈성 쇼크, 압박 손상, 복합 장기부전, 저혈량 쇼크, 내장 허혈증 또는 허혈증을 유발시키는 기타 증상 후의 허혈증-재관류로 인한 보체 활성화가 포함된다. 보체 활성화는 또한, 염증 질환, 예를 들어 중증 화상, 내독소증, 패혈성 쇼크, 성인 호흡 곤란 증후군, 혈액 투석; 아나필락시성 쇼크, 중증 천식, 혈관부종, 크론병, 겸상 적혈구 빈혈, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염 및 췌장염과 연관된 것으로 밝혀졌다. 상기 장애는 약물 부작용, 약물 알레르기, IL-2 유도된 혈관 누출 증후군 또는 방사선촬영 조영제 알레르기에 따른 결과일 수 있다. 이에는 또한, 자가면역 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 알츠하이머병 및 다발성 경화증이 포함된다. 보체 활성화는 또한, 이식체 거부와 연관이 있다. 보체 활성화는 또한, 안과 질환, 예를 들어 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증 및 기타 허혈증 관련 망막증, 맥락막 신생혈관증식 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄증 (CRVO), 각막 신생혈관증식, 및 망막 신생혈관증식과 연관이 있다.
용어 "보체 관련 눈 질환"은 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 그의 병리 상태가 전통적 및 대체 경로, 특히 보체의 대체 경로를 포함하여 보체와 관련이 있는 모든 눈 질환이 포함된다. 보체 관련 눈 질환에는 황반 변성 질환, 예를 들면 모든 병기의 연령 관련 황반 변성 (AMD) [건식 및 습식 (비-삼출성 및 삼출성) 형태 포함], 맥락막 신생혈관증식 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 기타 허혈증 관련 망막증, 및 기타 안내 신생혈관성 질병, 예를 들어 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄증 (CRVO), 각막 신생혈관증식, 및 망막 신생혈관증식이 비제한적으로 포함된다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환에는 연령 관련 황반 변성 (AMD) [비-삼출성 (예: 중간 건식 AMD 또는 지도형 위축 (GA)) 및 삼출성 (예: 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식) (CNV)) AMD 포함], 당뇨병성 망막증 (DR), 안내염 및 포도막염이 포함된다. 추가의 예에서, 비-삼출성 AMD에는 경질 드루젠, 연질 드루젠, 지도형 위축 및/또는 색소 클럼핑의 존재를 포함될 수 있다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환에는 연령 관련 황반 변성 (AMD), 예를 들어 초기 AMD (예를 들어, 다수 개의 작은 드루젠 내지 1개 이상의 비-확장성 중간 크기의 드루젠를 포함한다), 중간 AMD (예를 들어, 확장성 중간 크기의 드루젠 내지 1개 이상의 큰 드루젠을 포함한다) 및 진행성 AMD (예를 들어, 지도형 위축 또는 진행성 습식 AMD (CNV)를 포함한다)가 포함된다 [참고: Ferris et al., AREDS Report No. 18, ; Sallo et al., Eye Res., 34(3): 238-40 (2009); Jager et al., New Engl. J. Med., 359(1): 1735 (2008)]. 추가의 예에서, 중간 건식 AMD에는 큰 융합성 드루젠이 포함될 수 있다. 추가의 예에서, 지도형 위축에는 광수용체 및/또는 망막 색소침착 상피 (RPE) 손실이 포함될 수 있다. 추가의 예에서, 지도형 위축 부위는 작거나 클수 있고/있거나 황반 부위 또는 말초 망막 내일 수 있다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 중간 건식 AMD이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 지도형 위축이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식 (CNV))이다.
"치료"는 장애 발생을 예방하거나 또는 장애의 병리 상태를 변경시킬 의도로 수행되는 시술이다. 따라서, "치료"는 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 해당 장애가 있는 대상체 뿐만 아니라 이러한 장애를 예방시켜야 하는 대상체가 포함된다. 면역 관련 질병을 치료하는 데에 있어서, 치료제는 면역 반응 성분의 반응 크기를 직접 변경시킬 수 있거나, 또는 해당 질병이 기타 치료제, 예를 들어 항생제, 항진균제, 소염제, 화학요법제 등에 의한 치료에 보다 감수성이 되도록 할 수 있다.
보체 관련 눈 질환과 같은 질병의 "병리 상태"에는 환자의 행복을 손상시키는 모든 현상이 포함된다. 이에는 비정상적이거나 제어 불가능한 세포 성장 (호중구, 호산구, 단구, 림프구 세포), 항체 생성, 자가 항체 생성, 보체 생성, 이웃하는 세포의 정상적인 기능 방해, 사이토킨 또는 기타 분비성 생성물의 비정상적 수준 방출, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화, 세포성 공간 내로의 염증 세포 (호중구, 호산구, 단구, 림프구 세포)의 침윤 등이 비제한적으로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포유류"는 포유류로서 분류된 모든 동물을 지칭하는데, 이에는 인간, 고등 영장류, 가축용 및 농장용 동물, 및 동물원, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예를 들어 말, 돼지, 암소, 개, 고양 및 흰족제비 등이 비제한적으로 포함된다. 본 발명의 한 양태에서, 포유류는 인간이다.
한 가지 이상의 추가 치료제와 "병용해서" 투여하는 것에는 동시에 투여하는 것과 어떠한 순서로든 순차적으로 투여하는 것이 포함된다.
"치료상 유효량"은 표적 질병 또는 질환, 예를 들어 보체 관련 눈 질환의 상태 (예: 병리 상태) 상의 측정 가능한 개선을 달성하는 데 요구되는 "인자 D 길항제"의 양이다.
용어 "제어 서열"은 특별한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열을 발현시키는 데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의의 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 활용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 프리-서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터 또는 증강인자는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보솜-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더의 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속적이지 않다. 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있는데, 이는 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라서 실험적으로 계산한다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 보다 고온을 필요로 하는 반면, 보다 짧은 프로브는 보다 저온을 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보적 가닥이 그들의 융점 아래 환경 하에 존재하는 경우에 변성 DNA가 재어닐링될 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 간의 목적하는 상동성이 보다 높을 수록, 보다 높은 상대 온도를 사용할 수 있다. 그 결과, 보다 고온의 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 하는 경향이 있는 반면, 보다 저온은 이러한 경향을 감소시킨다. 혼성화 반응의 엄격도에 관한 부가의 상세 내역과 설명은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)].
본원에서 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1％ 나트륨 도데실 설페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들면 42℃ 하에 750 mM 염화나트륨, 75 mM 나트륨 시트레이트를 수반한 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 수반한 50％ (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50％ 포름아미드, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5x 덴하르츠 (Denhardt) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 설페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2xSSC (염화나트륨/나트륨 시트레이트)에서 세척하고 55℃ 하에 50％ 포름아미드로 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 고도로 엄격한 세척을 수행하는 조건에 의해 확인될 수 있다.
"적당한 수준으로 엄격한 조건"은 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 이에는 상기 언급된 것 보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예: 온도, 이온 세기 및 ％ SDS)을 사용하는 것이 포함된다. 적당한 수준으로 엄격한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10％ 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, 약 37 내지 50℃ 하에 1xSSC 중에서 필터를 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인들을 수용하기에 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식하고 있을 것이다.
항체의 가변 도메인 맥락에서 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭하고, 그의 특별한 표적에 대한 각각의 특별한 항체의 결합성 및 특이성을 위해 사용된다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역 (HVR)으로서 공지되기도 한, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭된 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 골격 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 CDR은 상기 FR 영역에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 CDR은 항체의 표적 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al.]. 본원에 사용된 바와 같은, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 표시되지 않는 한, 카바트 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따른다 [참고: Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987].
본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하는데, VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 서술된 수의 초가변 영역이 사용되고 있고 본원에 포괄된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초한 것이며, 가장 흔히 사용되고 있다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 초티아 (Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다 [참고: Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]. 카바트 넘버링 협약을 이용하여 넘버링할 경우 초티아 CDR-H1 루프의 말단은 이러한 루프의 길이에 따라서 H32와 H34 간에 다양하다 (이는 카바트 넘버링 도식이 H35A 및 H35B에 삽입물을 놓아두기 때문이고; 35A 또는 35B가 존재하지 않는다면, 루프는 32에서 종결되며; 35A 만이 존재한다면, 루프는 33에서 종결되고; 35A와 35B 둘 다가 존재한다면, 루프는 34에서 종결된다). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 초티아 구조적 루프 간의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 분자 (Oxford Molecular's) AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한 것이다. 이들 초가변 영역 각각으로부터의 잔기가 다음에 제시된다:
Figure 112010077495647-pct00001
초가변 영역은 다음과 같은 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35B (H1), 50-65, 47-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 참고]에 따라서 넘버링된다.
"골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", 및 그의 변수들은 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에서의 항체 편집에서 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 몇 개 적거나 부가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따르는 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예: 카바트에 따르는 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 카바트 잔기 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 결정할 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내의 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 [참고: 예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); 본원에 참고로 도입된다]. "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 카바트 등의 문헌에 보고된 EU 인덱스; 중쇄의 불변 도메인 내의 힌지 영역은 중쇄의 대략 잔기 216-230 (EU 넘버링)이다). "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 [참고: 예를 들어, 미국 가특허원 제60/640,323호, EU 넘버링에 대한 도면].
본원에서 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"는 일반적으로, 약 10개 초과의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 한 가지 예에서, 폴리펩티드는 포유류 단백질이고, 그의 예에는 인자 D 및 인자 D의 단편 및/또는 변이체가 포함된다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드는 인간 인자 D와 결합하는 완전한 길이의 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)인데, 그의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디, 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)으로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함된다.
출발 폴리펩티드의 "변이체" 또는 "아미노산 서열 변이체"는 출발 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 변이체는 천연 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게 90％ 이상, 보다 바람직하게 95％ 이상, 가장 바람직하게 98％ 이상일 것이다. 서열 동일성 (％)은 최대 상동율을 제공하기 위해 서열들을 정렬한 후, 예를 들어 문헌 [참고: Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1382-1386 (1983)] [문헌 (Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970))에 의해 기재된 알고리즘의 버전]에 의해 결정한다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내로 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변이체에는, 예를 들어 관심있는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환이 포함된다. 모든 결실, 삽입 및 치환 조합을 만들어 최종 구조물에 도달시키는데, 단 이러한 최종 구조물은 목적하는 특징을 보유하고 있어야 한다. 아미노산 변화는 또한, 폴리펩티드의 해독 후 프로세싱을 변경시킬 수 있는데, 예를 들어 글리코실화 부위 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 생성시키는 방법은, 예를 들어 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,534,615호에 기재되어 있다.
출발 항체의 "항체 변이체" 또는 "변형된 항체"는 출발 항체의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변형시킨, 출발 항체의 것과는 상이한 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 일반적으로, 항체 변이체는 출발 항체와의 서열 동일성이 80％ 이상, 바람직하게 90％ 이상, 보다 바람직하게 95％ 이상, 가장 바람직하게 98％ 이상일 것이다. 서열 동일성 (％)은 최대 상동율을 제공하기 위해 출발 항체 및 후보 항체 변이체의 서열들을 정렬한 후, 예를 들어 문헌 [참고: Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1382-1386 (1983)] [문헌 (Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970))에 의해 기재된 알고리즘의 버전]에 의해 결정한다. 모 서열을 기준으로 한 동일성 또는 유사율은 서열들을 정렬시키고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 (％)을 달성한 후, 모 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 또는 유사한 (즉, 공통의 측쇄 특성을 기초로 한 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기, 하기 참고) 후보 변이체 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (％)로서 본원에 정의된다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를, 이러한 항체를 코딩하는 DNA 내로 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변이체에는, 예를 들어 관심있는 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환이 포함된다. 모든 결실, 삽입 및 치환 조합을 만들어 최종 구조물에 도달시키는데, 단 이러한 최종 구조물은 목적하는 특징을 보유하고 있어야 한다. 아미노산 변화는 또한, 항체의 해독 후 프로세싱을 변경시킬 수 있는데, 예를 들어 글리코실화 부위 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다. 항체의 항체 서열 변이체를 생성시키는 방법은, 예를 들어 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,534,615호에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체의 생성 방법과 유사하다.
폴리펩티드 분자의 "탈아미드화" 변이체는 본래의 폴리펩티드의 1개 이상의 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기(들)를 아스파르테이트 (D 또는 Asp)로 전환시킨, 즉 중성 아미드 측쇄를, 전반적으로 산성 특성을 지닌 잔기로 전환시킨 폴리펩티드이다. 탈아미드화는 아스파라긴 (N 또는 Asn)을 글루타민 (Q 또는 Gln) 또는 알라닌 (A 또는 Ala) 또는 세린 (S 또는 Ser)으로 전환시킴으로써 방지할 수 있다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)].
폴리펩티드 분자의 "산화된" 변이체는 본래의 폴리펩티드의 1개 이상의 메티오닌 (M 또는 Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp) 잔기(들)를 메티오닌의 황을 통하여 설폰 또는 설폭시드로 전환시킨 폴리펩티드이다. 산화는 메티오닌 (M 또는 Met)을 루이신 (L 또는 Leu) 또는 이소루이신 (I 또는 Ile)으로 전환시킴으로써 방지할 수 있다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)].
폴리펩티드 분자의 "피로글루타메이트" 변이체는 본래의 폴리펩티드의 1개 이상의 글루타민 (Q 또는 Gln) 잔기(들)를, 글루타민 잔기, 예를 들어 N-말단 글루타민 잔기가 자발적으로 폐환되어 피로글루타메이트를 생성시키는 경우에 발생하는 피로글루타메이트로 전환시킨 폴리펩티드이다. 피로글루타메이트 전환은 글루타민 (Q 또는 Gln) 잔기(들)를 글루타메이트 (E 또는 Glu)로 전환시킴으로써 방지할 수 있다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)].
용어 "항체 단편"은 완전한 길이 항체의 일부, 일반적으로 표적 결합성 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이 포함된다. 항체의 "기능성 단편 또는 유사체"는 완전한 길이의 항체와 공통의 정성적 생물학적 활성을 지닌 화합물이다. 예를 들어, 항-인간 인자 D 항체의 기능성 단편 또는 유사체는 보체 활성화를 방지시키거나 실질적으로 저하시키는 방식으로 인자 D와 결합할 수 있는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 항체와 관련한 "기능성 단편"은 Fv, F(ab) 및 F(ab')2 단편을 지칭한다. "Fv" 단편은 완전한 표적 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소한의 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체 (VH-VL 이량체)로 이루어진다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개 CDR이 VH-VL 이량체 표면 상의 표적 결합 부위를 규정하도록 상호 작용한다. 집합적으로, 6개 CDR은 항체에 대한 표적 결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 표적에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 표적을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다. "단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 표적 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 수 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과는 상이하다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 분해 산물의 힌지 시스테인에서 디설파이드 결합을 절단시킴으로써 생성된다. 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 부가의 화학적 커플링물은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "라이브러리"는 복수 개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하는데, 이 서열은 본 발명의 방법에 따라서 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에 있어서 상이하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이물을 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 표적 부위에 대항하여 유도된다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 표적 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로, 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 모노클로날 항체는 널리 공지된 기술을 사용하여 파아지 (phage) 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler and Milstein, Nature, 256, 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 방법에 의해 만들 수 있다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 표적-결합성 아서열)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한, 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 선택된 인간 면역글로불린 주형의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 자손을 포함한다. 의도하였거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일할 수는 없다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능 또는 생물학적 특성을 지닌 변이체 자손이 포함된다. 본 발명에 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로, 원핵성 또는 진핵성 숙주이다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 제어 서열과 작동적으로 연결되는 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 이러한 제어 서열에는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 임의의 작동인자 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 제어하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파아지 입자, 또는 단순히 잠재적 게놈성 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 몇몇 경우에는, 게놈 자체 내로 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터는 종종 상호 교환적으로 사용되는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명에는 당해 분야에 공지된 바와 같은, 그리고 공지되고 있는 등가의 기능을 제공하는 기타 형태의 벡터가 포함된다.
본원에 사용된 경우의 용어 "표지"는 분자 또는 단백질, 예를 들어 항체와 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있는 탐지 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체가 탐지 가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 또는 효소 표지의 경우에는, 탐지 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "고체 상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포괄된 고체 상의 예에는 부분적으로 또는 완전히 유리 (예: 제어 공극 유리), 다당류 (예: 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 형성된 것들이 포함된다. 특정 양태에서는, 상황에 따라서 고체 상이 검정용 판의 웰을 포함할 수 있고, 기타 양태에서는 정제용 칼럼 (예: 친화 크로마토그래피 칼럼)이다.
"파아지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파아지, 예를 들어 섬유상 파아지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파아지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파아지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는 데 사용되어 왔다. 다가 파아지 디스플레이 방법은 섬유상 파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII과의 융합을 통하여 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다 [참고: Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362, 및 이에 인용된 참고 문헌들]. 1가 파아지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리를 유전자 III 또는 그의 일부와 융합시키고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재 하에 저 수준으로 발현시켜 파아지 입자가 상기 융합 단백질의 1개 카피를 디스플레이하거나 전혀 디스플레이하지 않도록 한다. 결합 활성도 효과는 다가 파아지에 비해 저하되므로, 분류는 내재된 리간드 친화성을 기준으로 하였고 DNA 조작을 단순화시켜 주는 파아지미드 (phagemid) 벡터를 사용하였다 [참고: Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216].
"파아지미드"는 세균성 복제 기점, 예를 들어 Co1E1, 및 박테리오파아지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파아지미드는 섬유상 박테리오파아지 및 람다 박테리오파아지를 포함한 공지된 모든 박테리오파아지 상에서 사용할 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 일반적으로, 항생제 내성을 위한 선별성 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 정착시킨 세포에 파아지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우에는, 플라스미드의 복제 방식이 롤링 서클 (rolling circle) 복제 방식으로 변화되어 플라스미드 DNA 및 패키지 파아지 입자의 1개 가닥 카피를 생성시킨다. 파아지미드는 감염성 또는 비-감염성 파아지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어에는 유전자 융합물로서 이종 폴리펩티드 유전자와 연결된 파아지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하므로 상기 이종 폴리펩티드가 파아지 입자의 표면 상에서 디스플레이 되도록 하는 파아지미드가 포함된다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에 정의된 바와 같은 한 가지 이상의 "아미노산 변형"을 통하여 또 다른 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동성이 바람직하게는 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상일 것이다. "천연 서열 인간 Fc 영역"의 예는 WO 00/42072의 도 23에 도시되어 있고, 이에는 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 천연 발생적 변이체가 포함된다. 천연 서열 뮤린 Fc 영역은 WO 00/42072의 도 22A에 도시되어 있다.
본 발명에 따르면, "변경된" FcRn 결합 친화도는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교해서 증강되거나 저하된 FcRn 결합 활성을 갖는 것이다. 한 가지 예에서, 변경된 FcRn 결합 친화도를 나타내는 항체는 pH 6.0에서 FcRn에 대한 증가된 결합을 나타내고/내거나 pH 7.0에서는 FcRn에 대한 저하된 결합을 나타낸다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체는 모 폴리펩티드 보다 더 우수한 친화도로 하나 이상의 FcR과 결합한다. FcR에 대한 "저하된 결합을 나타내는" 변이체는 모 폴리펩티드 보다 더 열악한 친화도로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 모 폴리펩티드 보다 "더 우수한 친화도"로 FcR과 결합하는 변이체는, 결합 검정에서 폴리펩티드 변이체와 모 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 모 폴리펩티드 보다 실질적으로 더 우수한 결합 친화도로 FcR과 결합하는 것이다. 예를 들어, 개선된 FcR 결합 친화도를 나타내는 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드와 비교해서 FcR 결합 친화도에 있어 약 1.15배 내지 약 100배, 예를 들어 약 1.2배 내지 약 50배 정도의 개선을 나타낼 수 있는데, FcR 결합 친화도는 기존에 보고된 바와 같이 결정한다.
"아미노산 변형"은 예정된 아미노산 서열의 아미노산 서열 상의 변화를 지칭한다. 예시되는 변형에는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 포함된다. 본원에서 아미노산 변형의 한 가지 예는 치환이다.
예를 들어, Fc 영역의 명시된 위치 "에서의 아미노산 변형"은 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 이러한 명시된 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 명시된 잔기에 "인접하게" 삽입한다는 것은, 그의 1개 내지 2개 잔기 이내에 삽입하는 것을 의미한다. 이러한 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"은 예정된 아미노산 서열 내의 1개 이상의 기존의 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체시키는 것을 지칭한다. 대체 잔기(들)는 "천연 발생적 아미노산 잔기" (즉, 유전 암호에 의해 코딩됨)일 수 있고, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소루이신 (Ile): 루이신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 1개 이상의 비-천연 발생적 아미노산 잔기로의 치환 역시 본원의 아미노산 치환 정의에 포괄된다. "비-천연 발생적 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 쇄 내의 인접한 아미노산 잔기(들)와 공유적으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생적 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭한다. 비-천연 발생적 아미노산 잔기의 예에는 노르루이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 잔기가 포함된다 [참고: Ellman et al., Meth . Enzym., 202:301-336 (1991)]. 이러한 비-천연 발생적 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, 문헌 [참고: Noren et al., Science 244:182 (1989) and Ellman et al., 상기 참고]의 과정을 사용할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이들 과정은 억제인자 tRNA를 비-천연 발생적 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시킨 다음, RNA를 시험관 내에서 전사 및 해독시키는 것을 포함한다.
"아미노산 삽입"은 하나 이상의 아미노산을 예정된 아미노산 서열 내로 혼입시키는 것을 지칭한다. 삽입이 통상적으로 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 삽입하는 것으로 이루어질 것이긴 하지만, 본 출원은 보다 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어 약 10개 이하 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들)는 상기 언급된 바와 같은 천연 발생적이거나 또는 비-천연 발생적일 수 있다.
"아미노산 결실"은 예정된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 지칭한다.
II. 상세한 설명
본 발명은 보체 관련 질환, 예를 들어 눈 질환 (그의 병리 상태가 보체의 전통적 및 대체 경로, 특히 대체 경로를 포함하여 보체와 관련이 있는 모든 눈 질환), 예를 들어 황반 변성 질환, 예를 들면 모든 병기의 연령 관련 황반 변성 (AMD) [건식 및 습식 (비-삼출성 및 삼출성) 형태 포함], 맥락막 신생혈관증식 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 기타 허혈증 관련 망막증, 안내염, 및 기타 안내 신생혈관성 질병, 예를 들어 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄증 (CRVO), 각막 신생혈관증식, 및 망막 신생혈관증식을 예방 및 치료하는 데 유용한 인자 D 길항제, 예를 들어 항-인자 D 항체, 및 그의 변이체, 및 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다. 보체 관련 눈 질환의 한 가지 군에는 연령 관련 황반 변성 (AMD) [비-삼출성 (예: 중간 건식 AMD 또는 지도형 위축 (GA)) 및 삼출성 (예: 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식) (CNV)) AMD 포함], 당뇨병성 망막증 (DR), 안내염 및 포도막염이 포함된다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 중간 건식 AMD이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 지도형 위축이다. 한 가지 예에서, 보체 관련 눈 질환은 습식 AMD (맥락막 신생혈관증식 (CNV))이다.
AMD는 60세가 넘는 개개인에게서 비가역적 시력 장해를 유발시키는 주요 원인인, 연령 관련 황반 변성이다. 2가지 유형의 AMD, 즉 비-삼출성 (건식) 및 삼출성 (습식) AMD가 존재한다. 건식 또는 비-삼출성 형태는 중앙 망막 (황반) 하부에 있는 망막 색소 상피 (RPE) 상의 위축성 및 비대성 변화 뿐만 아니라 RPE 상의 침착물 (드루젠)과 관련이 있다. 비-삼출성 AMD가 있는 환자는 습식 또는 삼출성 형태의 AMD로 진행될 수 있는데, 맥락막 신생혈관성 막 (CNVM)으로 불리우는 비정상적 혈관이 망막 아래 발생하고, 유체 및 혈액이 누출되며, 궁극적으로 망막 내에 및 망막 아래에 시력을 앗아가는 원반 모양의 반흔을 유발시킨다. 통상적으로 삼출성 AMD의 전구체인 비-삼출성 AMD가 보다 흔하다. 비-삼출성 AMD의 제시는 다양한데, 경질 드루젠, 연질 드루젠, RPE 지도형 위축, 및 색소 클럼핑이 존재할 수 있다. 보체 성분이 AMD에서 초기 RPE 상에 침착되고, 이는 드루젠의 주요 구성분이다.
1. 인간화 항-인자 D 항체
본 발명에는 인간화 항-인자 D 항체 및 그의 단편의 생성 및 용도가 포함된다. 예시되는 항체의 생성 방법이 다음 섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 본래의 인간 가변 도메인 보다 실질적으로 덜한 것을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 키메라 항체이다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 CDR 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는 데에 사용될, 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택은 몇몇 경우에 이러한 항체를 인간 치료용으로 사용하고자 할 때, 항원성 및/또는 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 저하시키는 데에 있어 중요할 수 있다. HAMA 반응의 저하 또는 제거는 일반적으로, 적합한 치료제를 임상적으로 개발하는 데에 있어 중요한 국면이다 [참고: 예를 들어, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495]. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 HAMA 반응이 저하 또는 제거되도록 인간화되는 항체를 제공한다. 이들 항체의 변이체는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법 (이들 중 몇몇이 다음에 추가로 기재된다)을 이용하여 추가로 수득할 수 있다. 소위 "최량 적합 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 설치류 항체의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 이 내에서의 인간 골격 영역 (FR)을 인간화 항체에 허용하였다 [참고: Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특별한 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특별한 골격 영역을 이용한다. 동일한 골격을 여러 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 [참고: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)].
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체로부터의 아미노산 서열은 골격 및/또는 초가변 서열(들)의 다양화를 위한 출발 (모) 서열로서 제공될 수 있다. 출발 초가변 서열과 연결되도록 선별된 골격 서열은 본원에서 수용체 인간 골격으로서 지칭된다. 이러한 수용체 인간 골격이 인간 면역글로불린 (그의 VL 및/또는 VH 영역)으로부터 유래될 수 있긴 하지만, 수용체 인간 골격은 인간 컨센서스 골격 서열로부터 유래될 수 있는데, 이는 이러한 골격이 인간 환자에서 최소한의 면역원성을 갖고 있거나 면역원성을 전혀 갖고 있지 않은 것으로 입증되었기 때문이다. 본원의 목적상 "수용체 인간 골격"은 인간 면역글로불린 골격으로부터 유래되거나 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 VL 또는 VH 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 "유래된" 수용체 인간 골격은 그의 동일한 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 기존의 아미노산 변화가 존재하는 경우에는, 바람직하게 5개 이하, 바람직하게 4개 이하, 또는 3개 이하의 기존의 아미노산 변화가 존재한다. 한 양태에서, VH 수용체 인간 골격은 VH 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열 면에서 동일하다. 한 양태에서, VL 수용체 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열 면에서 동일하다. "인간 컨센서스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선별시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열 아군으로부터이다. 일반적으로, 이러한 서열 아군은 카바트 등에서와 같은 아군이다. 한 양태에서, VL에 대한 아군은 카바트 등에서와 같은 아군 카파 I이다. 한 양태에서, VH에 대한 아군은 카바트 등에서와 같은 아군 III이다.
수용체가 인간 면역글로불린으로부터 유래되는 경우에는, 공여자 골격 서열을 인간 골격 서열 컬렉션 내의 각종 인간 골격 서열과 정렬시킴으로서 공여자 골격 서열에 대한 그의 상동성을 기준으로 하여 선별되는 인간 골격 서열을 임의로 선별하고, 수용체로서 가장 상동성인 골격 서열을 선별할 수 있다. 수용체 인간 골격은 공개 데이터베이스에서 입수 가능한 인간 항체 생식세포계 서열로부터이거나 이로부터 유래될 수 있다.
한 양태에서, 본원에서의 인간 컨센서스 골격은 VH 아군 VII 및/또는 VL 카파 아군 I 컨센서스 골격 서열로부터이거나 이로부터 유래된다.
한 양태에서, 항-인자 D 항체를 생성시키는 데 사용된 인간 골격 주형은 VH 쇄에 대해서는 VI-4.1b+ (VH7 계열)과 JH4d의 조합물을 포함하고/하거나 VL 쇄에 대해서는 DPK4 (VκI 계열)과 JK2의 조합물을 포함하는 주형으로부터의 골격 서열을 포함할 수 있다.
한 양태에서, VH 수용체 인간 골격은 다음 골격 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 전부를 포함한다:
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(서열 2의 아미노산 1-25)를 포함하는 FR1;
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(서열 2의 아미노산 36-49)을 포함하는 FR2;
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(서열 2의 아미노산 67-98),
Figure 112010077495647-pct00005
(서열 2의 아미노산 67-97),
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(서열 2의 아미노산 67-96),
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(서열 3), 또는
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(서열 4)을 포함하는 FR3;
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(서열 2의 아미노산 105-115)을 포함하는 FR4.
한 양태에서, VL 수용체 인간 골격은 다음 골격 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 전부를 포함할 수 있다:
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(서열 1의 아미노산 1-23)을 포함하는 FR1;
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(서열 1의 아미노산 35-49)을 포함하는 FR2;
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(서열 1의 아미노산 57-88)을 포함하는 FR3;
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(서열 1의 아미노산 98-107),또는
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(서열 5)을 포함하는 FR4.
수용체가 인간 면역글로불린으로부터 유래되든지 아니면 인간 컨센서스 골격으로부터 유래되든지 간에, 선별된 인간 골격 서열과 서열 면에서 동일할 수 있긴 하지만, 본 발명은 수용체 서열이 인간 면역글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 비교해서 기존에 아미노산 치환을 포함할 수 있다는 것을 고려하고 있다. 이들 기존의 치환은 바람직하게 최소한인데, 통상적으로 인간 면역글로불린 서열 또는 컨센서스 골격 서열과 비교해서 단지 4개, 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이 만을 나타낸다.
비-인간 항체의 초가변 영역 잔기를 VL 및/또는 VH 수용체 인간 골격 내로 혼입한다. 예를 들어, 카바트 CDR 잔기, 초티아 초가변 루프 잔기, Abm 잔기 및/또는 접촉 잔기에 상응하는 잔기를 혼입시킬 수 있다. 임의로, 다음과 같은 연장된 초가변 영역 잔기를 혼입시킨다: 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3).
한 국면에서, 본 발명은 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 서열 1을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 1을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공한다. 몇몇 양태에서, 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열은 기준 서열과 비교해서 치환, 삽입 또는 결실을 포함하지만, 이러한 아미노산 서열을 포함하는 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 몇몇 양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 2의 서열에서 치환, 삽입 또는 결실되었다. 몇몇 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이 HVR 외부 영역 (즉, FR 영역내)에서 일어난다. 몇몇 양태에서, 항-인자 D 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 예에서, 본 발명은 이러한 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 서열 1의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공한다. 몇몇 양태에서, 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열은 기준 서열과 비교해서 치환, 삽입 또는 결실을 포함하지만, 이러한 아미노산 서열을 포함하는 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 몇몇 양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열 1의 서열에서 치환, 삽입 또는 결실되었다. 몇몇 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이 HVR 외부 영역 (즉, FR 영역내)에서 일어난다. 몇몇 양태에서, 항-인자 D 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 예에서, 본 발명은 이러한 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
항-인자 D 항체는 적합한 어떠한 골격 가변 도메인 서열도 포함할 수 있는데, 단 이러한 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유해야 한다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 VI.4.1 b+와 JH4d의 조합물인 중쇄 가변 도메인 골격 서열을 포함한다 (도 3 참고). 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 인간 아군 VII 중쇄 골격 컨센서스 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 서열 2의 아미노산 1-25를 포함하는 FR1, 서열 2의 아미노산 36-49를 포함하는 FR2, 서열 2의 아미노산 67-98을 포함하는 FR3 및 서열 2의 아미노산 105-115를 포함하는 FR4를 포함하는 중쇄 가변 도메인 골격 서열을 포함한다. 이들 항체의 한 양태에서, 중쇄 가변 도메인 서열은 위치 40 및/또는 88 (카바트 넘버링)에서 치환(들)을 포함한다. 이들 항체의 한 양태에서, 위치 40은 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이고/이거나 위치 88은 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 DPK4와 JK2의 조합물인 경쇄 가변 도메인 골격 서열을 포함한다 (도 4 참고). 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 인간 카파 I (κI) 경쇄 골격 컨센서스 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 서열 1의 아미노산 1-23을 포함하는 FR1, 서열 1의 아미노산 35-49를 포함하는 FR2, 서열 1의 아미노산 57-88을 포함하는 FR3 및 서열 1의 아미노산 98-107을 포함하는 FR4를 포함하는 경쇄 가변 도메인 골격 서열을 포함한다. 이들 항체의 한 양태에서, 경쇄 가변 골격 서열은 위치 15, 43 및/또는 104 (카바트 넘버링)에서 하나 이상의 치환(들)을 포함한다. 이들 항체의 한 양태에서, 위치 15는 시스테인 (C) 또는 발린 (V)이고, 위치 43은 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이며, 위치 104는 발린 (V) 또는 루이신 (L)이다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
추가로, 항-인자 D 항체는 적합한 어떠한 불변 도메인 서열도 포함할 수 있는데, 단 이러한 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유해야 한다. 예를 들어, 몇몇 양태에서 본 발명의 항-인자 D 항체는 중쇄 불변 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 α, δ, ε, γ, 또는 μ 중쇄 중 하나 또는 조합물의 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 그의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소형으로 지정할 수 있다. 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 지정된 중쇄를 갖는 5가지 부류의 면역글로불린이 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능 상의 비교적 미미한 수준의 차이를 기준으로 하여 아부류로 추가로 분할되는데, 예를 들어 인간은 다음 아부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 , 및 IgA2. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 효과기 기능에 대한 목적하는 효과 (예: 결합 친화도)를 가져다 주는 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 효과기 기능에 대한 효과 (예: 결합 친화도)를 가져다 주지 못하는 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 IgG 유형 (예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 위치 114 (카바트 넘버링; EU 넘버링에서의 118에 등가임), 168 (카바트 넘버링; EU 넘버링에서의 172에 등가임), 172 (카바트 넘버링; EU 넘버링에서의 176에 등가임) 및/또는 228 (EU 넘버링)에서의 치환을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 IgG (예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 유형의 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 위치 114에서의 치환을 추가로 포함하는데, 위치 114는 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이고, 위치 168은 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이며, 위치 172는 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이고/이거나 위치 228은 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 또는 세린 (S)이다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
추가로, 예를 들어 몇몇 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 경쇄 불변 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 카파 또는 람다 경쇄 중 하나 또는 조합물의 경쇄 불변 도메인을 포함하는데, 이는 모든 척추동물 종으로부터의 경쇄가 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 하여 카파 및 람다로 불리우는 2가지 명백히 별개의 유형 중 하나로 지정될 수 있기 때문이다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 효과기 기능에 대한 목적하는 효과 (예: 결합 친화도)를 가져다 주는 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 효과기 기능에 대한 효과 (예: 결합 친화도)를 가져다 주지 못하는 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 카파 유형의 경쇄 불변 도메인을 포함하고, 위치 110, 144, 146 및/또는 168 (카바트 넘버링)에서의 치환을 추가로 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항-인자 D 항체는 카파 유형의 경쇄 불변 도메인을 포함하고, 위치 110에서의 치환 (110은 시스테인 (C) 또는 발린 (V)이다), 위치 144에서의 치환 (144는 시스테인 (C) 또는 알라닌 (A)이다), 위치 146에서의 치환 (146은 이소루이신 (I) 또는 발린 (V)이다) 및/또는 위치 168에서의 치환 (168은 시스테인 (C) 또는 세린 (S)이다)을 추가로 포함한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
2. 변형된 항-인자 D 항체
본 발명에는 변형된 항-인자 D 항체, 예를 들어 변형된 인간화 항-인자 D 항체, 및 그의 변이체, 및 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 생성 및 용도가 포함된다. 예시되는 변형된 항체의 생성 방법이 다음 섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.
인간화 항-인자 D 항체를 포함한 모 항-인자 D 항체는 변형된 항-인자 D 항체, 및 그의 변이체를 생성하도록 변형시킬 수 있다. 한 양태에서, 변형된 항-인자 D 항체, 및 그의 변이체는 모 항체에 비해 개선된 물리적, 화학적, 생물학적 또는 동질성 특성을 지닐 수 있다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 항체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역으로의 하나 이상의 아미노산 변경 (예: 치환)을 포함한다. 또 다른 한편, 또는 또한, 골격 영역 잔기의 하나 이상의 변경 (예: 치환)을 모 항체에 도입할 수 있다. 변형시키기 위한 골격 영역 잔기의 예에는 항원과 직접 비공유적으로 결합하는 잔기 [참고: Amit et al., (1986) Science, 233: 747-753]; CDR의 입체 형태와 상호 작용하거나 영향을 미치는 잔기 [참고: Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917], 및/또는 VL-VH 계면에 참여하는 잔기 [참고: EP 239 400B1]가 포함된다. 특정 양태에서, 이러한 골격 영역 잔기 1개 이상을 변형시키면, 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 증강된다. 예를 들어, 약 1개 내지 약 5개의 골격 잔기가 이러한 본 발명의 양태에서 변경될 수 있다. 변형시키기 위한 골격 또는 HVR 영역 잔기의 예에는, 탈아미드화 변이체 [예를 들어, 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기(들)를 아스파르테이트 (D 또는 Asp)로 변형시킴], 산화 변이체 [예를 들어, 메티오닌 (M 또는 Met) 잔기(들) 및/또는 트립토판 (W 또는 Trp) 잔기(들)를 설폰 또는 설폭시드로 변형시킴] 또는 피로글루타메이트 변이체 [예를 들어, 글루타민 (Q 또는 Gln) 잔기(들)를 피로글루타메이트로 변형시킴]를 생성시켜 주는 부위가 포함된다. 변형시키기 위한 골격 영역 잔기 또는 HVR 영역 잔기의 예에는 가능한 탈아미드화 부위 [즉, 아스파라긴 (N 또는 Asn)], 산화 부위 [즉, 메티오닌 (M 또는 Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp)] 또는 피로글루타메이트 전환 부위 [즉, 글루타민 (Q 또는 Gln)]가 포함되는데, 이러한 부위에서의 변형은 탈아미드화 및/또는 산화 및/또는 피로글루타메이트 전환을 각각 방시시켜 준다. 탈아미드화 변이체의 형성을 방지하기 위해, 아스파라긴 (N 또는 Asn)을 알라닌 (A 또는 Ala), 글루타민 (Q 또는 Gln) 또는 세린 (S 또는 Ser)으로 돌연변이시킬 수 있다. 산화된 변이체의 형성을 방지하기 위해, 메티오닌 (Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp)을 루이신 (L) 또는 이소루이신 (I)으로 돌연변이시킬 수 있다. 피로글루타메이트 변이체의 형성을 방지하기 위해, 글루타민 (Q 또는 Gln)을 글루타메이트 (E 또는 Glu)로 돌연변이시킬 수 있다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)]. 또 다른 한편, 또는 또한, 골격 영역 잔기의 하나 이상의 변경 (예: 치환)은 모 항체 내의 Fc 영역 내에서 이루어질 수 있다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 항체의 생체내 반감기가 모 항체 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교해서 증가 또는 감소되도록 하는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 항체에 대한 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합 친화도를 증가 또는 감소시켜 주는 변이체 Fc 영역을 포함한다 [참고: WO2000042072; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 예를 들어, 이러한 항체는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 또는 447 중 어느 하나 이상에서의 아미노산 변형을 포함할 수 있는데, Fc 영역에서의 잔기 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. FcRn에 대한 결합성이 저하된 폴리펩티드 변이체는 Fc 영역의 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 또는 447 중 어느 하나 이상에서의 아미노산 변형을 포함할 수 있는데, Fc 영역에서의 잔기 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 상기 언급된 폴리펩티드 변이체는 또 다른 한편으론, FcRn에 대한 증가된 결합성을 나타낼 수 있고, Fc 영역의 아미노산 위치 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 어느 하나 이상에서의 아미노산 변형을 포함할 수 있는데, Fc 영역에서의 잔기 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 예를 들어, 상기 항체는 모 항체 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교해서 증가된 생체내 반감기로 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, 상기 항체는 모 항체 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 항체와 비교해서 증가된 친화도로 FcRn과 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함한다.
FcRn 결합 친화도는 다음과 같이 측정할 수 있다:
인간 FcRn에 대항한 본 발명의 항체의 결합성은, 예를 들어 비아코어 (BiaCore) 3000 기기를 이용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 연구할 수 있다. 인간 FcRn을 아민 커플링 키트를 이용하여 센서 칩에 커플링시킨다. 예를 들어, CM5 센서 칩을 5 ㎕/min으로 7분 동안 EDC/NHS로 활성화시킬 수 있다. 100 ㎍/ml의 인간 FcRn을 30초 내지 2분 동안 10 ㎕/min의 유속으로 상기 활성화된 칩 상으로 주사하여 최종 결합 반응 단위 (RU) 100 내지 200을 수득할 수 있다. 접합시킨 후, 35 ㎕의 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드를 5 ㎕/min으로 주사함으로써 FcRn 커플링된 칩을 차단시킬 수 있다.
pH 6.0 또는 pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 본 발명의 항체의 결합성을 결정할 수 있다. 이러한 결합성 실험을 위한 수행 완충액은 0.01％ P20 및 0.02％ 나트륨 아지드를 함유하는 PBS pH 6.0 또는 pH 7.4이다. 본 발명의 항체는 pH 6.0 또는 pH 7.4 수행 완충액으로 완충제-교환시킬 수 있다. 한 양태에서, 상기 실험은 25℃ 하에 수행한다. pH 6.0 수행의 경우에는, 4 μM 내지 0.7 nM 농도 범위의 항체를 4분 동안 30 ㎕/min으로 FcRn 피복 칩 상으로 유동시킨 다음, 5분 동안 상기 칩으로부터 해리시켰다. pH 7.4 수행의 경우에는, 12 μM 내지 100 nM 농도 범위의 항체를 1.5분 동안 20 ㎕/min으로 FcRn 피복 칩 상으로 주사한 다음, 2분 동안 방출시켰다. 항체를 또한, 센서 칩 상의 접합되지 않은 반점 상으로 유동시켜 FcRn-커플링된 칩에 대한 결합으로부터 배경 비-특이적 결합을 공제하였다. 주사 사이에 30초 펄스의 0.1 M TRIS pH 8.3으로 칩을 재생시킬 수 있다. 각 주사에 대한 항정 상태 RU를 각 주사기의 마지막에 기록할 수 있고, 주사 농도에 대항하여 항정 상태 RU를 플롯팅함으로써 해리 상수 (KD)를 나중에 계산한다.
이러한 변형된 항체, 및 그의 단편 (예: 항원-결합성 단편) 및 그의 변이체를 생성시키기 위한 한 가지 유용한 과정은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 지칭된다 [참고: Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085]. 여기서는, 초가변 영역 잔기(들) 중 하나 이상을 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기로 대체시켜 아미노산과 항원과의 상호 작용에 영향을 미친다. 이때, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 초가변 영역 잔기(들)는 치환 부위에 추가의 또는 기타 돌연변이를 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하였지만, 돌연변이 자체의 특성이 예정될 필요는 없다. 이러한 방식으로 생성된 ala-돌연변이체를 대상으로 하여 본원에 기재된 바와 같은 그들의 생물학적 활성 (즉, 결합 친화도 또는 용혈 검정)에 관하여 스크리닝한다.
통상적으로, "바람직한 치환물"이란 표제 하에 다음에 나타낸 바와 같은 보존적 치환으로 시작할 수 있다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 (예: 결합 친화도) 상의 변화가 이루어진다면, 다음 표에서 "예시 치환물"로 명명되거나 아미노산 부류와 관련하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 보다 실재적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다. 바람직한 치환물은 다음 표에 열거되어 있다.
Figure 112010077495647-pct00015
항체 또는 그의 단편 (예: 항원-결합성 단편)의 생물학적 특성 면에 있어서 보다 더 실질적인 변형은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 입체 형태로서 유지시키는 데에 대한 그의 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키는 데에 대한 그의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 데에 대한 그의 효과 측면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 나눈다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시키는 것을 수반할 것이다.
또 다른 양태에서, 변형을 위해 선택된 부위를 변형시키고, 개선된 결합 친화도를 지닌 변형물을 파아지 디스플레이에 의해 선별한다.
아미노산 서열 돌연변이체 또는 변형된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 앞서 제조된 변이체 또는 모 항체의 비-변이체 버전을 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 돌연변이체 또는 변이체 또는 변형된 아미노산 서열을 제조하는 한 가지 방법은 부위 지시된 돌연변이 유발이다 [참고: 예를 들어, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488].
특정 양태에서, 변형된 항체는 치환된 단일 초가변 영역 잔기 만을 가질 것이다. 기타 양태에서, 모 항체의 초가변 영역 잔기의 2개 이상, 예를 들어 약 2개 내지 약 10개 초가변 영역이 치환될 것이다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
통상적으로, 변형된 항체는 모 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사율 (상기 정의 섹션에서 정의됨)이 75％ 이상, 보다 바람직하게 80％ 이상, 보다 바람직하게 85％ 이상, 보다 바람직하게 90％ 이상, 가장 바람직하게 95％ 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
변형된 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 생성시킨 후, 모 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 비교하여 해당 분자의 생물학적 활성을 결정한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 항체 변이체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 활성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 변형된 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 패널을 준비하고, 이를 대상으로 하여 항원 (예: 인자 D) 또는 그의 단편에 대한 결합 친화도에 관하여 스크리닝한다. 이러한 초기 스크린으로부터 선별된 하나 이상의 항체 돌연변이체 또는 변형된 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)를 대상으로 하여, 임의로 한 가지 이상의 추가 생물학적 활성 검정을 수행하여 상기 항체 변이체(들), 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 실제로, 예를 들어 전임상 연구에 유용한지를 확인한다.
본원에 기재된 변형된 항-인자 D 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 대상으로 하여, 종종 변형된 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 의도한 용도에 따라서 추가의 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형에는 아미노산 서열의 추가 변경, 이종 폴리펩티드(들)와의 융합 및/또는 다음에 상세히 설명되는 바와 같은 공유 변형이 포함될 수 있다. 아미노산 서열 변경과 관련하여, 예시 변형이 상기에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, 변형된 항체의 적당한 입체 형태를 유지시키는 데에 관여하지 않은 어떠한 시스테인 잔기도, 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 이상한 가교 결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합을 항체에 가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우). 또 다른 유형의 아미노산 돌연변이체는 변경된 글리코실화 패턴을 갖고 있다. 이는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/시키거나 항체에는 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가함으로써 달성할 수 있다. 항체, 또는 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 글리코실화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 글리코실화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다. 글리코실화 부위를 항체에 부가하는 것은 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우에는) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중 하나 이상를 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 1개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나; 또는
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 변형된 항-인자 D 항체 변이체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 1개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(b) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(c) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 1개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나;
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이거나;
(e) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(f) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(g) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 2개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나; 또는
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 2개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(b) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(c) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 2개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나;
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이거나;
(e) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(f) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(g) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 3개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나; 또는
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 3개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(b) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(c) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원의 모 항-인자 D 항체의 변형된 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 변형된 항-인자 D 항체는 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 본원의 모 항-인자 D 항체의 아미노산 서열의 3개 이상의 위치 (카바트 넘버링에 따름)가 다음 중 하나 이상으로 치환된다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나;
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이거나;
(e) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(f) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(g) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 기준 항체의 경쇄 HVR을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 항-인자 D 항체는 기준 항체의 1개 이상의 위치에서의 치환을 추가로 포함하고, 상기 기준 항체는 ITSTDIDDDMN (서열 30)을 포함하는 경쇄 HVR-1, GGNTLRP (서열 35)을 포함하는 경쇄 HVR-2, 및 LQSDSLPYT (서열 38)을 포함하는 경쇄 HVR-3을 포함하고, 상기 치환은 다음 중 하나 이상이다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나;
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이거나;
(e) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(f) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(g) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 기준 항체의 중쇄 HVR을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 항-인자 D 항체는 기준 항체의 1개 이상의 위치에서의 치환을 추가로 포함하고, 상기 기준 항체는 GYTFTNYGMN (서열 39)을 포함하는 중쇄 HVR-1, WINTYTGETTYADDFKG (서열 40)을 포함하는 중쇄 HVR-2, 및 EGGVNN (서열 41)을 포함하는 중쇄 HVR-3을 포함하고, 상기 치환은 다음 중 하나 이상이다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나;
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이거나;
(e) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(f) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(g) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 기준 항체의 경쇄 HVR 및 중쇄 HVR을 포함하는 항-인자 D 항체를 제공하는데, 이러한 항-인자 D 항체는 기준 항체의 1개 이상의 위치에서의 치환을 추가로 포함하고, 상기 기준 항체는 ITSTDIDDDMN (서열 30)을 포함하는 경쇄 HVR-1, GGNTLRP (서열 35)을 포함하는 경쇄 HVR-2, 및 LQSDSLPYT (서열 38)을 포함하는 경쇄 HVR-3; 및 GYTFTNYGMN (서열 39)을 포함하는 중쇄 HVR-1, WINTYTGETTYADDFKG (서열 40)을 포함하는 중쇄 HVR-2, 및 EGGVNN (서열 41)을 포함하는 중쇄 HVR-3을 포함하고, 상기 치환은 다음 중 하나 이상이다:
(a) 경쇄의 위치 33에서의 아미노산이 L 또는 I이거나;
(b) 경쇄의 위치 34에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나;
(c) 경쇄의 위치 52에서의 아미노산이 S 또는 A이거나;
(d) 경쇄의 위치 104에서의 아미노산이 V이거나;
(e) 중쇄의 위치 1에서의 아미노산이 E이거나;
(f) 중쇄의 위치 99에서의 아미노산이 A 또는 Q이거나; 또는
(g) 중쇄의 위치 100에서의 아미노산이 A 또는 Q이다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은
(a) (i) 서열 39로부터 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 서열 40으로부터 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(iii) 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44 및 서열 45 중에서 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(iv) 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33 및 서열 34 중에서 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(v) 서열 35, 서열 36 및 서열 37 중에서 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) 서열 38로부터 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
중에서 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR; 또는
(b) 서열 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38에 제시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR
을 포함하는, 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
몇몇 양태에서, 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 갖는 HVR은 기준 서열과 비교해서 치환, 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 아미노산 서열을 포함하는 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 몇몇 양태에서, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37 및 서열 38로 이루어진 군 중에서 선택된 기준 서열에서 총 1 내지 10개 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실되었다.
한 국면에서, 본 발명은
(a) (i) 서열 39로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
(iii) 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44 및 서열 45 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(iv) 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33 및 서열 34 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
(v) 서열 35, 서열 36 및 서열 37 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
(vi) 서열 38로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
중에서 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 HVR; 또는
(b) 서열 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38에 제시된 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR
을 포함하는, 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다.
한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2를 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 서열 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 몇몇 양태에서, 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열은 기준 서열과 비교해서 치환, 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 아미노산 서열을 포함하는 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 몇몇 양태에서, 서열 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 군 중에서 선택된 서열에서 총 1 내지 10개 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실되었다. 몇몇 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이 HVR 외부 영역 (즉, FR 영역내)에서 일어난다. 몇몇 양태에서, 변형된 항-인자 D 항체는 서열 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 및 29로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 서열 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 몇몇 양태에서, 서열 동일성이 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상인 아미노산 서열은 기준 서열과 비교해서 치환, 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 아미노산 서열을 포함하는 항체는 인자 D와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 몇몇 양태에서, 서열 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 군 중에서 선택된 서열에서 총 1 내지 10개 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실되었다. 몇몇 양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이 HVR 외부 영역 (즉, FR 영역내)에서 일어난다. 몇몇 양태에서, 변형된 항-인자 D 항체는 서열 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은 서열 18을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 6을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 18을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 6을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 19를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 7을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 19를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 7을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 20을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 8을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 20을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 8을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 21을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 9를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 21을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 9를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 22를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 10을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 22를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 10을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 11을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 11을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 24를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 12를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 24를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 12를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 25를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 25를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 26을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 26을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 14를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 27을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 15를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 27을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 15를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 28을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 16을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 28을 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 16을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 29를 포함하는 중쇄 가변 도메인과 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 다음 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다:
Figure 112010077495647-pct00016
(서열 74) (여기서, X1은 Q 또는 E이고; X2는 N, A 또는 Q이며; X3은 N, A 또는 Q이다). 한 양태에서, 본 발명은 다음 아미노산을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다:
Figure 112010077495647-pct00017
(서열 74) (여기서, X1은 Q 또는 E이고; X2는 N, A 또는 Q이며; X3은 N, A 또는 Q이다). 한 예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 단편을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 다음 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다:
Figure 112010077495647-pct00018
(서열 73) (여기서, X4는 M, L 또는 I이고; X5는 N, A 또는 Q이며; X6은 N, S 또는 A이고; X7은 L 또는 V이다). 한 양태에서, 본 발명은 다음 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다:
Figure 112010077495647-pct00019
(서열 73) (여기서, X4는 M, L 또는 I이고; X5는 N, A 또는 Q이며; X6은 N, S 또는 A이고; X7은 L 또는 V이다). 한 예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 단편을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28 및 서열 29를 포함하는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16 및 서열 17을 포함하는 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 단편을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 경쇄 도메인이 서열 47의 서열을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 중쇄 도메인이 서열 54의 서열을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 경쇄 도메인이 서열 61의 서열을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 중쇄 도메인이 서열 63의 서열을 포함하는 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 서열 47의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 서열 54의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 서열 61의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 서열 63의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 단편을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16 및 서열 17로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 가변 중쇄 도메인이 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28 및 서열 29로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 경쇄 도메인이 서열 47의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 중쇄 도메인이 서열 54의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 경쇄 도메인이 서열 61의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 중쇄 도메인이 서열 63의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 6의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 18의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 7의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 19의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 8의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 20의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 9의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 21의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 10의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 22의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 11의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 23의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 12의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 24의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 13의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 25의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 14의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 26의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 15의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 27의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 16의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 28의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 가변 경쇄 도메인이 서열 17의 서열을 포함하고, 가변 중쇄 도메인이 서열 29의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 국면에서, 본 발명은 경쇄 도메인이 서열 47의 서열을 포함하고, 중쇄 도메인이 서열 54의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 경쇄 도메인이 서열 61의 서열을 포함하고, 중쇄 도메인이 서열 63의 서열을 포함하는, 인간화 항-인자 D #111의 변형된 항-인자 D 항체를 제공한다.
3. 항-인자 D 항체의 친화도 및 생물학적 활성
본 발명에는 항-인자 D 항체에서 바람직한 것으로서 본원에서 확인된 특징을 갖는 항체, 및 그의 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 포함된다. 항-인자 D 항체에서 바람직한 것으로서 본원에서 확인된 특징을 갖는 항체, 및 그의 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 대상으로 하여, 예를 들어 시험관내 또는 생체 내에서 억제성 생물학적 활성을 알아보기 위해 스크리닝할 수 있거나 또는 결합 친화도를 측정함으로써 스크리닝할 수 있다.
a. 친화도
항-인자 D 항체, 및 그의 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 관심있는 항체 (예를 들어, 인자 D 활성을 길항시키는 항체)에 의해 결합된 인간 인자 D 상의 동일한 에피토프와 결합하는 지를 결정하기 위해, 교차-차단성 검정을 수행할 수 있다 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]. 또 다른 한편으론, 에피토프 지도화를 수행하여 항-인자 D 항체가 관심있는 에피토프와 결합하는지를 결정할 수 있다 [참고: Champe et al., J. Biol. Chem., 270:1388-1394 (1995)]. 예를 들어, 인간 인자 D에 대한 항체 친화도는 실시예 3에 기재된 방법을 포함한 표준 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
한 국면에서, 본 발명은 뮤린 항-인자 D 항체 및/또는 인간화 항-인자 D 항체 클론 #111, 및/또는 인간화 항-인자 D 항체 클론 #111의 가변 도메인 또는 HVR 서열을 포함하는 항체와 경쟁하는 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다. 뮤린 항-인자 D 항체 및/또는 인간화 항-인자 D 항체 클론 #111, 및/또는 인간화 항-인자 D 항체 클론 #111의 가변 도메인 또는 HVR 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프와 결합하는 항-인자 D 항체, 또는 그의 변이체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 또한 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 항체의 1가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가, 예를 들어 뮤린 항-인자 D 항체로부터의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 이들로 필수적으로 이루어지는 키메라 항체의 1가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 키메라 항체의 친화도) 보다 1배 또는 2배 이상 더 낮은 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 항체의 2가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가, 예를 들어 뮤린 항-인자 D 항체로부터의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 이들로 필수적으로 이루어지는 키메라 항체의 2가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 키메라 항체의 친화도) 보다 1배 또는 2배 이상 더 낮은 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 항체의 1가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가, 예를 들어 뮤린 항-인자 D 항체로부터의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 이들로 필수적으로 이루어지는 키메라 항체의 1가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 키메라 항체의 친화도) 보다 1배 또는 2배 이상 더 큰 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 항체의 2가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가, 예를 들어 뮤린 항-인자 D 항체로부터의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 이들로 필수적으로 이루어지는 키메라 항체의 2가 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 키메라 항체의 친화도) 보다 1배 또는 2배 이상 더 큰 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 20 nM (20x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 10 nM (10x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 1.0 nM (1.0x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 0.5 nM (0.5x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 1.0 pM (1.0x10-12 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 0.5 pM (0.5x10-12 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 10.0 nM (10.0x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 5.0 nM (5.0x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 1.0 nM (1.0x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 0.5 nM (0.5x10-9 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 5.0 pM (5.0x10-12 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 2.0 pM (2.0x10-12 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 1.0 pM (1.0x10-12 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 0.5 pM (0.5x10-12 M) 이상인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 0.5 mM (0.5x10-6 M) 내지 0.5 pM (0.5x10-12 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 15 nM (15x10-9 M) 내지 0.1 nM (0.1x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 5.5 nM (5.5x10-9 M) 내지 1 nM (1x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 0.5 pM (0.5x10-12 M) 내지 2 pM (2x10-12 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 0.5 mM (0.5x10-6 M) 내지 0.5 pM (0.5x10-12 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 10 nM (10x10-9 M) 내지 0.05 nM (0.05x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 5.5nM (5.5x10-9 M) 내지 1 nM (1x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 0.5 pM (0.5x10-12 M) 내지 2 pM (2x10-12 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 1.4 pM (1.4x10-12 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 1.1 pM (1.1x10-12 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 0.19 nM (0.19x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 0.08 nM (0.08x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 12.3 nM (12.3x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 9.0 nM (9.0x10-9 M)인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 1.4 pM (1.4x10-12 M)±0.5인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 1.1 pM (1.1x10-12 M)±0.6인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 0.19 nM (0.19x10-9 M)±0.01인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 0.08 nM (0.08x10-9 M)±0.01인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 12.3 nM (12.3x10-9 M)±2인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 항체의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 9.0 nM (9.0x10-9 M)±1인 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체는 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 1.4 pM (1.4x10-12 M)±2일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체는 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 1.1 pM (1.1x10-12 M)±2일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체는 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 0.19 nM (0.19x10-9 M)±2일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체는 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 0.08 nM (0.08x10-9 M)±2일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체는 인자 D에 대한 그의 1가 형태의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화도)가 약 12.3 nM (12.3x10-9 M)±2일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-인자 D 항체, 또는 그의 항체 변이체는 인자 D에 대한 그의 2가 형태의 친화도 (예를 들어, 인자 D에 대한 IgG로서의 항체의 친화도)가 약 9.0 nM (9.0x10-9 M)±2일 수 있다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
당해 분야에 널리 확립된 바와 같이, 리간드의 그의 수용체에 대한 결합 친화도는 각종의 어떠한 검정을 이용해서도 결정할 수 있고, 각종 정량적 값으로 표현할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 결합 친화도는 KD 값으로서 표현되고, 이는 내재된 결합 친화도를 반영하고 있다 (예를 들어, 최소한의 결합 활성도 효과를 지닌다). 일반적으로, 및 바람직하게, 결합 친화도는 세포 무함유 환경에 있든지 아니면 세포 관련 환경에 있든지 간에 시험관 내에서 측정한다. 본원에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 결합 친화도 상의 차이 배수는 인간화 항체 (예를 들어, Fab 형태)의 1가 결합 친화도 값과 기준/비교 항체 (예를 들어, Fab 형태) (예: 공여자 초가변 영역 서열을 갖는 뮤린 항체)의 1가 결합 친화도 값의 비 측면에서 정량화할 수 있는데, 이러한 결합 친화도 값은 유사한 검정 조건 하에 결정한다. 따라서 한 양태에서, 결합 친화도 상의 차이 배수는 Fab 형태의 인간화 항체의 KD 값과 상기 기준/비교 Fab 항체의 KD 값의 비로서 결정한다. 예를 들어 한 양태에서, 본 발명의 항체 (A)가 기준 항체 (M)의 친화도 보다 "3배 더 낮은" 친화도를 갖는 경우, A에 대한 KD 값은 3x이고, M에 대한 KD 값은 1x일 것이며, A의 KD 대 M의 KD 비는 3:1일 것이다. 역으로 말하면, 한 양태에서, 본 발명의 항체 (C)가 기준 항체 (R)의 친화도 보다 "3배 더 큰" 친화도를 갖는 경우, C에 대한 KD 값은 1x이고, R에 대한 KD 값은 3x일 것이며, C의 KD 대 R의 KD 비는 1:3일 것이다. 본원에 기재된 것을 포함한, 당해 분야에 공지된 수 많은 검정을 이용하여 결합 친화도 측정치를 수득할 수 있는데, 이에는, 예를 들어 비아코어, 방사성 면역검정 (RIA) 및 ELISA가 포함된다.
추가로, 본 발명의 항체에 대한 KD 값은 사용된 특별한 검정 조건에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어 한 양태에서, 결합 친화도 측정치는 Fab 또는 항체를 고정화시키고 리간드, 즉 인자 D의 결합을 측정하거나 또는 또 다른 한편으론, Fab 또는 항체에 대한 리간드, 즉 인자 D를 고정화시키고 이러한 Fab 또는 항체의 결합을 측정하는 검정에서 수득할 수 있다. 한 양태에서, 결합 친화도 측정치는 재생 조건이 (1) 10 mM 글리신 또는 4 M MgCl2 (pH 1.5), 및 (2) pH 1.0 내지 pH 7.5 (pH 1.5, pH 5.0, pH 6.0 및 pH 7.2 포함)를 포함할 수 있는 검정에서 수득할 수 있다. 한 양태에서, 결합 친화도 측정치는 결합 조건이 (1) PBS 또는 HEPES-완충 식염수 및 (2) 트윈-20, 즉 0.1％ 트윈-20을 포함할 수 있는 검정에서 수득할 수 있다. 한 양태에서, 결합 친화도 측정치는 리간드, 즉 인자 D의 공급원이 시판용 공급원으로부터 유래될 수 있는 검정에서 수득할 수 있다. 한 양태에서, 결합 친화도 측정치는 (1) Fab 또는 항체를 고정화시키고 리간드, 즉 인자 D의 결합을 측정하며, (2) 재생 조건이 4 M MgCl2 (pH 7.2)를 포함하며, (3) 결합 조건이 0.1％ 트윈-20을 함유하는 HEPES-완충 식염수, pH 7.2를 포함하는 검정에서 수득할 수 있다. 한 양태에서, 결합 친화도 측정치는 (1) 리간드, 즉 인자 D를 고정화시키고 Fab 또는 항체의 결합을 측정하며, (2) 재생 조건이 10 mM 글리신 (pH 1.5)을 포함하며, (3) 결합 조건이 PBS 완충제를 포함하는 검정에서 수득할 수 있다.
b. 생물학적 활성
항-인자 D 항체, 또는 그의 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 인자 D와 결합할 수 있고 생물학적 효과, 예를 들어 대체 경로 용혈의 억제를 발휘할 수 있는지를 결정하기 위해, 토끼 RBC를 이용하는 용혈성 억제 검정을 사용할 수 있는데, 이에는 실시예 2에 기재된 검정이 포함된다. 이러한 용혈성 억제는 표준 검정을 이용하여 결정할 수 있다 [참고: Kostavasili et al., J of Immunology, 158(4): 1763-72 (1997); Wiesmann et al., Nature, 444(7116): 159-60 (2006)]. 이러한 검정에서 보체의 활성화는 혈청 또는 혈장을 이용하여 개시할 수 있다. 혈청 또는 혈장 중 적당한 농도의 인자 D [참고: Pascual et al., Kidney International, 34: 529-536 (1998); Complement Facts Book, Bernard J. Morley and Mark J. Walport, editors, Academic Press (2000); Barnum et al., J. Immunol. Methods, 67: 303-309 (1984)]는 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 통상적으로 결정할 수 있는데, 이에는 다음 참고 문헌 및 실시예 4에 기재된 방법이 포함된다 [참고: Pascual et al., Kidney International, 34: 529-536 (1998) 및 Barnum et al., J. Immunol. Methods, 67: 303-309 (1984)]. 본 발명은 일반적으로, 인자 D와 연관된 생물학적 활성을 억제시킬 수 있는 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 18 ㎍/ml의 농도 (혈액 중 인간 인자 D의 몰 농도의 약 1.5배에 등가임; 항-인자 D 항체 대 인자 D의 몰 비 약 1.5:1) 하에서는, 상기 항체에 의한 대체 보체 활성의 상당한 억제가 관찰될 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,956,107호].
한 양태에서, 본 발명에는 항체의 Fab 단편이 30 nM 미만의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체가 포함된다. 한 양태에서, 본 발명에는 항체의 Fab 단편이 15 nM 미만의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체가 포함된다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 10 nM 미만의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 5 nM 미만의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 30 nM 내지 2 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 25 nM 내지 7 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 20 nM 내지 12 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 30 nM 내지 15 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 12 nM 내지 8 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 7 nM 내지 2 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 6 nM 내지 3 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 8 nM 내지 5 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 5 nM 내지 2 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 10 nM 내지 5 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 8 nM 내지 2 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 7 nM 내지 3 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 6 nM 내지 4 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 4.7 nM ± 0.6 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 6.4 nM ± 0.6 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 3.5 nM ± 0.5 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 4.4 nM ± 1.5 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 10.2 nM ± 0.8 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 23.9 nM ± 5.0 nM의 IC50 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 80 nM 미만의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 50 nM 미만의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 40 nM 미만의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 20 nM 미만의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 15 nM 미만의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 80 nM 내지 10 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 75 nM 내지 15 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 70 nM 내지 20 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 65 nM 내지 25 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 60 nM 내지 30 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 55 nM 내지 35 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 50 nM 내지 40 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 80 nM 내지 70 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 55 nM 내지 25 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 16 nM 내지 12 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 14.0 nM ± 1.0 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 38.0 nM ± 11.0 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 72.6 nM ± 4.8 nM의 IC90 값으로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 항체의 Fab 단편이 약 0.05:1 (0.05) 내지 약 10:1 (10), 또는 약 0.09:1 (0.09) 내지 약 8:1 (8), 또는 약 0.1:1 (0.1) 내지 약 6:1 (6), 또는 약 0.15:1 (0.15) 내지 약 5:1 (5), 또는 약 0.19:1 (0.19) 내지 약 4:1 (4), 또는 약 0.2:1 (0.2) 내지 약 3:1 (3), 또는 약 0.3:1 (0.3) 내지 약 2:1 (2), 또는 약 0.4:1 (0.4) 내지 약 1:1 (1), 또는 약 0.5:1 (0.5) 내지 약 1:2 (0.5), 또는 약 0.6:1 (0.6) 내지 약 1:3 (0.33), 또는 약 0.7:1 (0.7) 내지 약 1:4 (0.25), 또는 약 0.8:1 (0.8) 내지 약 1:5 (0.2) 또는 약 0.9:1 (0.9) 내지 약 1:6 (0.17)의 항체 대 인자 D 몰 비로 대체 경로 용혈을 억제시키는 항-인자 D 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 관한 것이다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명에는 인간화 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 포함된다. 본 발명의 항체 단편은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 미니보디, 디아보디, 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체일 수 있다. 추가의 양태에서, 본 발명은 실질적으로 모든 망막을 관통할 수 있는 인간화 항-인자 D 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다. 보다 추가의 양태에서, 본 발명은 망막의 전체 두께를 관통할 수 있는 인간화 항-인자 D 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명에는 항체의 Fab 단편의 반감기가, 단일 유리질내 주사를 통하여 포유류 눈 (예: 인간) 내로 투여된 후 3, 5, 7, 10 또는 12일 이상인 인간화 항-인자 D 항체가 포함된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에는 항체의 Fab 단편이, 단일 유리질내 주사를 통하여 포유류 눈 (예: 인간) 내로 투여된 후 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 또는 115일 이상 동안 대체 경로 (AP) 보체 활성화를 억제시키는 인간화 항-인자 D 항체가 포함된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에는 대체 경로 (AP) 보체 활성화를 억제시키는 항체의 Fab 단편의 농도가, 단일 유리질내 주사를 통하여 포유류 눈 (예: 인간) 내로 투여된 후 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85일 이상 동안 망막 조직 내에 유지되는 인간화 항-인자 D 항체가 포함된다. 또 다른 양태에서, 본 발명에는 본 발명에는 대체 경로 (AP) 보체 활성화를 억제시키는 항체의 Fab 단편의 농도가, 단일 유리질내 주사를 통하여 포유류 눈 (예: 인간) 내로 투여된 후 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 또는 115일 이상 동안 유리체액 내에 유지되는 인간화 항-인자 D 항체가 포함된다. 한 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 제공한다.
항체의 생성
숙주 세포의 선별 및 형질전환
숙주 세포를 항-인자 D 항체 생성을 위해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 배양 조건, 예를 들어 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실제적 기술은 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 참고].
진핵 세포 형질감염 방법 및 원핵 세포 형질전환 (이는 DNA를 숙주 내로 도입하여 이러한 DNA가 염색체외적으로 또는 염색체성 통합체에 의해 복제 가능하도록 하는 것을 의미한다) 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개된 방법, 폴리에틸렌-글리콜/DMSO 및 전기천공법이 있다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 형질전환은 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 참고]에 기재된 바와 같이, 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공이 일반적으로, 원핵생물에 사용된다. 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로의 감염은 문헌 [참고: Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일자로 공개됨)]에 기재된 바와 같이 특정한 식물 세포를 형질전환시키는 데 사용한다. 세포 벽을 수반하지 않은 포유류 세포의 경우에는, 문헌 [참고: Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 이용할 수 있다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 국면이 미국 특허 제4,399,216호에 기재되었다. 효모 내로의 형질전환은 전형적으로, 문헌 [참고: Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)]의 방법에 따라서 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 기타 방법, 예를 들어 핵 미세주사, 전기천공, 본래 세포와의 세균성 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴을 이용할 수도 있다. 포유류 세포를 형질전환시키기 위한 각종 기술은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)].
본원 내의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는 데에 적합한 숙주 세포는 원핵성, 효모 또는 고등 진핵성 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 그램-음성 및 그램-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들면 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 파라코쿠스 (Paracoccus) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)도 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다. 균주 W3110이 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주 중 하나인데, 이는 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문이다. 바람직하게는, 숙주 세포가 최소량의 단백질 분해적 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110 [참고: Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol.2 (Washington, D.C: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325]은 숙주에 대해 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자 내에 유전적 돌연변이를 수행하도록 변형시킬 수 있는데, 이러한 숙주의 예에는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan r 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 수반한 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac lq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kan R 을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 33D3 [참고: 5,639,635] 및 미국 특허 제4,946,783호 (1990년 8월 7일자로 허여됨)에 기재된 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주가 포함된다. 기타 균주 및 그의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)가 또한 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 상기 언급된 세균 중 어는 것의 유도체를 구축하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [참고: Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 세균 세포 내에서 레플리콘의 복제 가능성을 고려하여 적당한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드를 사용하여 레플리콘을 공급하는 경우에는, 이. 콜라이, 세라티아, 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소 량의 단백질 분해적 효소를 분비해야 하고, 부가의 프로테아제 억제제를 세포 배양물 내에 혼입시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 한편으론, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 기타 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
완전한 길이 항체, 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편), 및 항체 융합 단백질은, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않는 경우, 예를 들어 치료적 항체를 세포독성제 (예: 독소)에 접합시키고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴에 있어 효능을 나타내는 경우에는, 세균에서 생성시킬 수 있다. 완전한 길이 항체는 순환시 반감기가 보다 크다. 이. 콜라이에서의 생성이 보다 신속하고 비용 면에서 보다 효율적이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 세균에서 발현시키는 경우에는, 예를 들어 미국 특허 제5,648,237호 (Carter et. al.), 미국 특허 제5,789,199호 (Joly et al.), 및 미국 특허 제5,840,523호 (Simmons et al.) (이들 특허는 본원에 참고로 도입된다)를 참고할 수 있는데, 이에는 발현 및 분비를 최적화하기 위한 해독 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열이 기재되어 있다. 발현시킨 후, 항체를 가용성 분획 중 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 이소형에 따라서 예를 들어, 단백질 A 또는 G 칼럼 내로 정제할 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행할 수 있다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들어 필라멘트상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 저급 진핵성 숙주 미생물 중에서 가장 흔히 사용되고 있다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 이용 가능하고, 본원에서 유용한데, 예를 들면 시조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces); 캔디다 (Candida); 트리코데르마 (Trichoderma); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 및 필라멘트상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다. 메틸로트로픽 (methylotrophic) 효모가 본원에 적합하며, 이에는 한세눌라 (Hansenula), 캔디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아 (Pichia), 삭카로마이세스 (Saccharomyces), 토룰로프시스 (Torulopsis), 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 이루어진 속 중에서 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 부류의 효모로 예시되는 구체적인 종의 목록이 다음 문헌에 보고되었다 [참고: C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)].
글리코실화 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 원칙상, 모든 고등 진핵성 세포 배양물이 척추동물 배양물로부터 유래되든지 아니면 무척추동물 배양물로부터 유래되든지 간에 작동 가능하다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다 [참고: Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds. Vol. 8, pp. 277-279 (Plenam publishing 1986); Mseda et al., Nature 315, 592-594 (1985)]. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 (Aedes) (모기: mosquito), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다. 더우기, 면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다 [참고: Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, eds. (1973)]. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장; 인간 배아 신장주; 유아 햄스터 신장 세포; 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO (참고: Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 (1980))]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포; 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개의 신장 세포; 인간 폐 세포; 인간 간 세포; 마우스 유방 종양; 및 NS0 세포이다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 재조합 생성하기 위해, 이를 코딩하는 핵산 (예: cDNA 또는 게놈성 DNA)을 단리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 발현시킨다. 본 발명의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로, 사용될 숙주 세포에 좌우된다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성 (일반적으로 포유류) 기원이다.
벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스성 입자 또는 파아지 형태일 수 있다. 적당한 핵산 서열을 각종 과정에 의해 상기 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, DNA를 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입한다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지되어 있는 표준 연결 기술을 이용한다.
인자 D는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드 (이는 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드일 수 있다)와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 구성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 항-인자 D 항체-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더로 이루어진 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우에는, 신호 서열이, 예를 들어 효모 전화효소 리더, 알파 인자 리더 [삭카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함; 후자는 미국 특허 제5,010,182호에 기재되어 있다], 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 [참고: EP 362,179 (1990년 4월 4일자로 공개됨)], 또는 문헌 [참고: WO 90/13646 (1990년 11월 15일자로 공개됨)]에 기재된 신호일 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열, 예를 들어 동일한 종 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
숙주 세포를 항체 생성을 위해 상기 언급된 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다.
a. 원핵성 숙주 세포
본 발명의 폴리펩티드를 생성시키기 위해 사용된 원핵성 세포는 당해 분야에 공지되어 있고 선별된 숙주 세포의 배양을 위해 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예에는 필수 영양분 보충물이 부가된 루리아 육즙 (LB)이 포함된다. 몇몇 양태에서는, 상기 배지가 또한, 발현 벡터 구축을 기초로 하여 선택된 선별 작용제를 함유하여, 이러한 발현 벡터를 함유하는 원핵성 세포의 성장을 선택적으로 허용해 준다. 예를 들어, 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 앰피실린을 배지에 가한다.
탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의 모든 필수 보충물이, 단독으로 도입되거나 또는 또 다른 보충물 또는 배지 (예: 복합 질소원)과의 혼합물로서 도입된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지가 글루타치온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵성 숙주 세포를 적합한 온도 하에 배양한다. 예를 들어, 이. 콜라이 성장에 바람직한 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 보다 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라서 약 5 내지 약 9 범위 내의 모든 pH 값일 수 있다. 이. 콜라이의 경우, pH가 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우에는, 이러한 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 단백질 발현을 유도시킨다. 본 발명의 한 국면에서는, 폴리펩티드의 전사를 제어하기 위해 PhoA 프로모터를 사용한다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를, 유도를 위해 인산염-제한 배지에서 배양한다. 바람직하게는, 이러한 인산염-제한 배지가 C.R.A.P. 배지이다 [참고: 예를 들어, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147]. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이용된 벡터 구조물에 따라서 각종의 기타 유도제를 사용할 수 있다.
한 양태에서는, 본 발명의 발현된 폴리펩티드가 숙주 세포의 주변세포질 (periplasm) 내로 분비되어, 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 미생물을 일반적으로 삼투압 쇽, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 붕괴시키는 것을 포함한다. 세포가 일단 붕괴되면, 세포 부스러기 또는 완전 세포를 원심분리 또는 여과함으로써 제거할 수 있다. 단백질을, 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피함으로써 추가로 정제할 수 있다. 또 다른 한편으론, 단백질을 배양 배지 내로 수송하고, 이 안에서 단리시킬 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과시킨 다음, 생성된 단백질의 추가 정제를 위해 이를 농축시킬 수 있다. 발현된 폴리펩티드를, 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 (Western blot) 검정을 이용하여 추가로 단리 및 확인할 수 있다.
본 발명의 한 국면에서는, 항체를 발효 공정에 의해 대량으로 생성시킨다. 각종 대규모 공급-배치식 발효 과정이 재조합 단백질 생성을 위해 이용 가능하다. 대규모 발효기는 용량이 1000 리터 이상, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터이다. 이들 발효기는 산소 및 영양분, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지원)을 분배시키기 위해 진탕기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 용적이 대략 100 리터 이하인 발효기 내에서의 발효를 지칭하는데, 이는 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서는, 단백질 발현 유도가 전형적으로, 세포를 적합한 조건 하에 목적 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장 (이 단계에서는 세포가 초기 증식 정지기에 있다)시킨 후에 개시된다. 당해 분야에 공지되어 있고 상기 언급된 바와 같이, 이용된 벡터 구조물에 따라서 각종 유도제를 사용할 수 있다. 유도시키기에 앞서, 세포를 보다 단기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50 시간 동안 유도시키지만, 보다 길거나 짧은 유도 시간을 사용할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율과 질을 추가로 개선시키기 위해, 각종 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적당한 어셈블리와 폴딩을 개선시키기 위해, 샤페론 (chaperone) 단백질, 예를 들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 지니고 있는 펩티딜프로필 시스,트랜스-이소머라제)를 과발현하는 부가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵성 세포를 공동-형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 세균성 숙주 세포에서 생성된 이종 단백질의 적당한 폴딩과 용해도를 촉진시키는 것으로 입증되었다 [참고: Chen et al., (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; 미국 특허 제6,083,715호 (Georgiou et al.); 미국 특허 제6,027,888호 (Georgiou et al.); Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210].
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질분해적으로 민감한 단백질)의 단백질분해를 최소화하기 위해서는, 단백질분해성 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주를 변형시켜, 공지된 세균성 프로테아제, 예를 들어 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그들의 조합물을 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 수행할 수 있다. 몇몇 이. 콜라이 프로테아제-결핍성 균주가 이용 가능하고, 이는 예를 들어, 문헌 [참고: Joly et al., (1998) 상기 참고; 미국 특허 제5,264,365호 (Georgiou et al.); 미국 특허 제5,508,192호 (Georgiou et al.); Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
한 양태에서는, 단백질분해성 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환시킨 이. 콜라이 균주를 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용한다.
b. 진핵성 숙주 세포
시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 숙주 세포를 배양하는 데에 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham et al., Meth. Enzymol. 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980); 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,560,655호; 제5,122,469호; 제5,712,163호; 또는 제6,048,728호]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 [예: X-클로라이드 (여기서, X는 나트륨, 칼슘, 마그네슘이다); 및 인산염], 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
항체 정제
항-인자 D 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 형태를 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막-결합된 경우, 이는 적합한 세제 용액 (예: 트리톤-X 100)을 이용하거나 효소적 절단에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항-인자 D 항체의 발현에 이용된 세포를 각종 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 붕괴 또는 세포 용해제에 의해 붕괴시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 항-인자 D 항체를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 다음 과정은 적합한 정제 과정의 예들이다: 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토분획 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 및 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 세파로스 칼럼; 및 항-인자 D 항체의 에피토프-태그화 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트화 칼럼. 각종 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]. 선택된 정제 단계(들)는, 예를 들어 사용된 생성 방법의 종류 및 생성된 특별한 항-인자 D 항체에 좌우될 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 문헌 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 전술된 단계들 중 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 한 가지 정제 기술이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 존재하는 모든 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 [참고: Lindmark et al., J. Immunol Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 IgG3에 권장된다 [참고: Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것 보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토분획, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 따라서 이용하기도 한다.
예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예: 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피할 수 있다.
제약 제제
폴리펩티드 또는 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편), 또는 그의 항체 변이체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 폴리펩티드를 당해 분야에서 전형적으로 이용되고 있는 임의의 "제약상 허용되는" 담체, 부형제 또는 안정화제 (이들 모두는 "부형제"로 명명된다), 예를 들어 완충제, 안정화제, 방부제, 등장화제, 비이온성 세정제, 항산화제 및 기타 여러 가지 첨가제와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수성 용제로서 저장하기 위해 제조할 수 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, Ed. (1980)]. 이러한 첨가제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이어야만 한다.
완충제는 생리적 조건에 근접한 pH 범위를 유지시키는 데에 도움을 준다. 이는 바람직하게, 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기 적합한 완충제에는 유기 및 무기산 및 그의 염, 예를 들어 시트레이트 완충제 (예: 일나트륨 시트레이트-이나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-삼나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-일나트륨 시트레이트 혼합물 등), 석시네이트 완충제 (예: 석신산-일나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-이나트륨 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제 (예: 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르트산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (예: 푸마르산-일나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (예: 푸마르산-일나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-이나트륨 푸마레이트 혼합물, 일나트륨 푸마레이트-이나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제 (예: 글루콘산-나트륨 글루코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제 (예: 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제 (예: 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등), 및 아세테이트 완충제 (예: 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)이 포함된다. 부가적으로, 인산염 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염 (예: 트리스)이 언급될 수 있다.
방부제를 부가하여 미생물 성장을 지연시킬 수 있고, 이는 0.2％ 내지 1％ (w/v) 범위의 양으로 가할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 방부제에는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레솔, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 벤즈알코늄 할라이드 (예: 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 및 3-펜타놀이 포함된다.
종종 "안정화제"로서 공지된 등장화제를 가하여 본 발명의 액상 조성물의 등장성을 보장할 수 있고, 이에는 다가 당 알코올, 바람직하게 3가 또는 보다 고 차수의 당 알코율, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 솔비톨 및 만니톨이 포함된다.
안정화제는 벌크제로부터, 치료제를 가용화시키거나 또는 치료제가 변성되지 못하게 하거나 용기 벽에 부착되지 못하게 도와주는 첨가제까지 기능상 여러 범위에 걸친 광범위한 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올 (상기 열거됨); 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-루이신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예를 들어 락토스, 트레할로스, 스타키로스, 만니톨, 솔비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등 (이노시톨과 같은 시클리톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예를 들어 우레아, 글루타치온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, 알파-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오설페이트; 저분자량 폴리펩티드 (즉, 10개 미만 잔기); 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈 단당류, 예를 들면 크실로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류, 예를 들면 락토스, 말토스, 슈크로스 및 삼당류, 예를 들면 라피노스; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 1 중량부당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세정제 ("습윤제"로서 공지되기도 한다)를 가하여 치료제를 가용화시키는 것을 도와줄 수 있을 뿐만 아니라 치료 단백질이 진탕-유도된 응집되지 못하게 해줄 수 있는데, 이는 또한 단백질의 변성을 유발시키지 않으면서 제형이 응력된 전단 표면에 노출될 수 있도록 해준다. 적합한 비이온성 계면활성제에는 폴리솔베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 (Pluronic™) 폴리올, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르 (TWEEN™-20, TWEEN™-80 등)이 포함된다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
부가의 여러 가지 부형제에는 벌크제 (예: 전분), 킬레이트제 (예: EDTA), 항산화제 (예: 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 조용매가 포함된다. 본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자들은 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다. 활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osal, Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다. 지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 간에 걸친 분자 방출을 가능케 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막화된 항체가 체내에 장시간 동안 잔존할 경우, 이들은 37℃ 하 수분에 대한 노출 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 기전에 따라서, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며 특이적 중합체 매트릭스 조성을 개발함으로써, 안정화를 달성시킬 수 있다.
안과 질병 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위한 본 발명의 화합물은 전형적으로, 점안약 및/또는 연고 형태로 안과, 안내, 및/또는 유리질내 주사, 및/또는 공막근처 주사, 및/또는 장부하 주사, 및/또는 초맥락막 주사 및/또는 국소 주사에 의해 투여한다. 이러한 본 발명의 화합물은 각종 방법, 예를 들어 다음 참고 문헌에 기재된 바를 포함한, 당해 화합물을 유리질 내로 서서히 방출시켜 줄 수 있는 장치 및/또는 데포로서 유리질내 전달할 수 있다 [참고: Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)]. 한 예에서, 장치는 당해 화합물을 장기간 동안 방출시키는 미니펌프 및/또는 매트릭스 및/또는 수동 확산 시스템 및/또는 피막화 세포의 형태일 수 있다 [참고: Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)]. 기타 투여 방법을 사용할 수도 있는데, 이에는 국소, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비내 및 병변내 투여가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다.
안과, 안내 또는 유리질내 투여용 제형은 당해 분야에 공지된 방법 및 성분을 사용하여 제조할 수 있다. 효율적인 치료를 위해 요구되는 주요 사항은 눈 안으로 적당히 침투하는 것이다. 약물을 국소적으로 전달할 수 있는 눈 전방의 질병과는 달리, 망막 질환은 보다 부위-특이적 접근 방식을 요구한다. 점안약과 연고는 눈 이면을 거의 침투하지 못하고, 혈액-안과 장벽은 전신 투여된 약물이 안과 조직 내로 침투하는 것을 방해한다. 따라서, 통상적으로 망막 질환 (예: AMD 및 CNV)을 치료하기 위한 약물 전달 방법으로 선택된 것은 직접적인 유리질내 주사이다. 유리질내 주사는 통상적으로, 환자의 상태, 및 전달된 약물의 특성 및 반감기에 좌우되는 간격으로 반복한다. 안내 (예: 유리질내) 침투시키는 경우에는, 통상적으로 보다 작은 크기의 분자가 바람직하다.
보체 관련 눈 질환 (예: AMD 또는 CNV)의 치료 효능은 안내 질환을 평가하는 데 흔히 사용되고 있는 각종 종말점에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 시력 상실을 평가할 수 있다. 시력 상실은, 예를 들어 기준선으로부터 목적하는 시점까지의 가장 우수한 교정 시력 (BCVA) 상의 평균 변화로써 측정하거나 [예를 들어, BCVA가 4 미터의 검사 거리에서의 초기 치료 당뇨병성 망막증 연구 (ETDRS) 시력 차트 및 평가를 기준으로 한 경우), 기준선과 비교해서 목적하는 시점에서 시력이 15개 미만 글자를 보는 것으로 상실되는 대상체의 비율을 측정하거나, 기준선과 비교해서 목적하는 시점에서 시력이 15개 이상 글자를 보는 것으로 늘게 된 대상체의 비율을 측정하거나, 목적하는 시점에서 20/2000의 시력 스넬렌 (Snellen)을 나타내거나 이 보다 더 악화된 대상체의 비율을 측정하거나, NEI 시력 기능 질문서를 평가하거나, 또는 목적하는 시점에서, 예를 들어 플루오레세인 혈관조영술에 의해 CNV의 크기와 CNV의 누출 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 안과 평가, 예를 들어 눈 검사를 수행하거나, 안내압을 측정하거나, 시력을 평가하거나, 세극등 (slitlamp) 압력을 측정하거나, 또는 안내 염증을 평가하는 것을 수행할 수 있다.
특별한 장애 또는 질환을 치료하는 데에 유효할 치료적 폴리펩티드, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 양은 이러한 장애 또는 질환의 종류에 좌우될 것이고, 이는 표준 임상 기술에 의해 결정할 수 있다. 가능한 경우, 본 발명의 제약 조성물 및 용량-반응 곡선은 인간에게 시험하기에 앞서, 먼저 시험관 내에서 결정한 다음 유용한 동물 모델 시스템에서 결정하는 것이 요망된다.
한 양태에서, 치료적 폴리펩티드, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 수성 용제를 피하 주사함으로써 투여한다. 또 다른 양태에서, 치료적 폴리펩티드, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 수성 용제를 유리질내 주사함으로써 투여한다. 각 용량은 체중 1 kg 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 또는 보다 바람직하게, 체중 1 kg 당 약 3 ㎍ 내지 약 30 ㎍의 범위일 수 있다.
피하 투여하는 경우의 투여 스케줄은 질병의 유형, 질병의 중증도, 및 치료제에 대한 대상체의 민감도를 포함한 수 많은 임상 요인에 따라서 1개월에 1회서부터 1일 1회로 다양할 수 있다.
다음 예는 단지 예시 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 그들의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
제조품 및 키트
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항체, 또는 그의 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 의해 표적화된 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 예를 들어, 본 발명은 보체 관련 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조품에 관한 것이다. 이러한 제조품은 용기, 및 이러한 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 보체 관련 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항-인자 D 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 특별한 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 유용하다는 것을 표시한다.
패키지 삽입물은 치료 생성물의 상업적 패키지 내에 통상적으로 포함되는 지시 사항을 지칭할 수 있고, 이러한 치료 생성물의 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기 사항 및/또는 사용에 관한 경고에 관한 정보를 함유할 수 있다. 한 양태에서, 표지 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 보체 관련 장애, 예를 들어 전술된 모든 장애, 예를 들면 눈 장애 [예: 연령 관련 황반 변성 (AMD)]을 치료하는 데에 사용된다는 것을 표시한다. 표지 또는 패키지 삽입물은 당해 항체 조성물을 환자에게 투여하기 위한 지시 사항을 추가로 포함할 것이다.
부가적으로, 본 발명의 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 각종의 목적, 예를 들어 보체 관련 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데에 유용하거나, 보체 관련 용혈 검정에 유용하거나, 세포로부터 인자 D 폴리펩티드를 정제 또는 면역침전시키는 데에 유용한 키트가 또한 제공된다. 인자 D 폴리펩티드를 단리 및 정제하기 위해서는, 키트가 비드 (예: 세파로스 비드)와 커플링된 항-인자 D 항체를 함유할 수 있다. 시험관내, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 인자 D 폴리펩티드를 탐지 및 정량화하기 위한 항체를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품과 같이, 키트도 용기, 및 이러한 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 하나 이상의 항-인자 D 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 포함하는 조성물을 보유하고 있다. 예를 들어, 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 함유하는 부가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 당해 조성물에 관한 설명 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 탐지 용도에 관한 지시 사항을 제공할 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 대상체에 대한 투여 [예를 들어, 항체, 또는 그의 항체 단편 (예: 항원 결합성 단편)]에 관한 지시 사항을 포함할 수 있다.
인간화 항체에 대한 용도
본 발명의 인간화 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 또는 그의 변이체는 진단 검정, 예를 들어 특이적 세포, 조직 또는 혈청 중에서 관심있는 표적의 발현을 탐지하기 위한 진단 검정에 유용하다. 진단 적용하는 경우, 본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)은 전형적으로, 탐지 가능한 부분으로 표지시킬 것이다. 수 많은 표지가 이용 가능하다. 형광 상의 변화를 정량화하는 기술이 상기 언급되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 예를 들어 화학발광계를 사용하여 측정할 수 있는 빛을 방출하거나 에너지를 형광 수용체에 기증할 수 있다. 효소적 표지의 예에는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알킬리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예: 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)].
종종, 표지를 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 간접적으로 접합시킨다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 바이오틴과 접합시키고, 상기 언급된 3 가지 광범위한 범주의 표지 중 어느 하나를 아비딘과 접합시킬 수 있는데, 그 반대의 경우도 가능하다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하므로, 표지를 이러한 간접 방식으로 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 접합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 표지를 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 간접적으로 접합시키기 위해, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 작은 합텐 [예: 디곡신 (digoxin)]과 접합시키고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중 하나를 항-합텐 항체, 또는 그의 항체 변이체 (예: 항-디곡신 항체) 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 접합시킨다. 이로써, 표지와 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 표지시킬 필요가 없는데, 그의 존재는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과 결합하는 표지된 항체를 사용하여 탐지할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)은 공지된 모든 검정 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에 이용할 수 있다 [참고: Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].
경쟁적 결합 검정은 제한된 양의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)과의 결합을 놓고 시험 샘플 분석물과 경쟁할 수 있는 표지된 표준물의 능력에 좌우된다. 시험 샘플 중 표적의 양은 항체와 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양을 결정하는 것을 촉진시키기 위해, 항체를 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 가용화시킨다. 그 결과, 항체와 결합되는 표준물 및 시험 샘플은 결합되지 않은 채로 남아 있는 표준물 및 시험 샘플로부터 편리하게 분리시킬 수 있다.
샌드위치 검정은 각각 탐지하고자 하는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 항체, 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 사용하는 것을 포함한다. 샌드위치 검정에서는, 분석하고자 하는 시험 샘플이 고체 지지체 상에서 고정화되는 제1 항체에 의해 결합된 후, 제2 항체가 시험 샘플과 결합하므로, 불용성 3-부분 복합체가 형성된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호]. 제2 항체 자체를 탐지 가능한 부분으로 표지시킬 수 있거나 (직접 샌드위치 검정) 또는 탐지 가능한 부분으로 표지시킨 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 검정). 예를 들어, 샌드위치 검정의 한 가지 유형이 ELISA 검정이고, 여기서는 탐지 가능한 부분이 효소이다.
면역조직화학의 경우에는, 종양 샘플이 신선하거나 동결될 수 있거나, 또는 파라핀에 포매시키고 포르말린 등의 방부제로 고정시킬 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 생체내 진단 검정에 사용할 수도 있다. 일반적으로, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 방사성 핵종 (예: 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지시켜 면역섬광조영술을 이용하여 종양을 국재시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 고 친화성 항-IgE 항체를 사용하여, 예를 들어 천식 환자의 폐에 존재하는 IgE의 양을 탐지할 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 키트 내에 제공할 수 있는데, 즉 진단 검정을 수행하기 위한 지시 사항과 함께 예정량으로 패키지된 시약 조합물로 제공될 수 있다. 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 효소로 표지시킨 경우에는, 키트가 이러한 효소에 의해 요구되는 기질 및 조인자 (예를 들어, 탐지 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 기타 부가제, 예를 들어 안정화제, 완충제 (예: 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등을 포함할 수 있다. 각종 시약의 상대량은 해당 검정의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약 용액 중 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 시약은 통상적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있는데, 이에는 용해시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공해주는 부형제가 포함된다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 사용하여 포유류를 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 한 양태에서, 상기 항체, 또는 그의 항체 변이체를, 예를 들어 전임상 데이터를 수득할 목적으로 비-인간 포유류에게 투여한다. 치료하고자 하는 예시 비-인간 포유류에는 전임상 연구가 수행되는 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 기타 포유류가 포함된다. 이러한 포유류는 상기 항체, 또는 그의 항체 변이체로 치료하고자 하는 질병에 대해 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 이러한 포유류를 사용하여 관심있는 항체의 독성을 연구할 수 있다. 이들 양태 각각에서, 포유류에 대해 용량을 단계적으로 상승시킨 연구를 수행할 수 있다.
항체, 또는 그의 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 또는 폴리펩티드는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 국소 면역억제 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여를 포함한 적합한 모든 수단에 의해 투여한다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)은 펄스 주입에 의해, 특히 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 용량을 감소시키면서 펄스 주입함으로써 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게, 투여는 부분적으로 투여가 단시간 내에 이루어지는지 아니면 만성적으로 이루어지는지에 따라서 주사, 가장 바람직하게 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
질병을 예방 또는 치료하는 데 적당한 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 또는 폴리펩티드의 투여량은 치료하고자 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)이 예방적 용도로 투여되는지 아니면 치료적 용도로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다.
질병의 유형과 중증도에 따라서, 1회 이상의 별도 투여이든지 아니면 연속적인 주입이든지 간에, 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편) 약 0.1 mg/kg 내지 약 150 mg/kg (예: 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 mg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 질환에 따라서 목적하는 질병 증상 억제가 나타날 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 기타 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 본 발명의 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다. 예시되는 투여 섭생이 WO 94/04188에 기재되어 있다.
항체 조성물은 우수한 의료 행위에 일관되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 고려해야 하는 요인에는 치료하고자 하는 특별한 장애, 치료하고자 하는 특별한 포유류, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여하고자 하는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 "치료상 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 좌우될 것이며, 이는 특정 질병이나 장애를 예방, 완화 또는 치료하는 데 필요한 최소량이다. 본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상의 작용제와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화한다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)의 양, 장애 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 지금까지 사용된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용되거나, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99％이다.
그의 표적으로서 인자 D를 인식하는 본 발명의 항체, 또는 그의 항체 변이체 또는 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 사용하여 보체 매개된 장애를 치료할 수 있다. 이들 장애는 과도하거나 제어되지 않는 보체 활성화와 연관이 있다. 이에는 심폐 우회로 수술 동안의 보체 활성화; 급성 심근 경색, 동맥류, 뇌졸증, 출혈성 쇼크, 압박 손상, 복합 장기부전, 저혈량 쇼크 및 내장 허혈증 후의 허혈증-재관류로 인한 보체 활성화가 포함된다. 이들 장애에는 또한, 염증 질환, 예를 들어 중증 화상, 내독소증, 패혈성 쇼크, 성인 호흡 곤란 증후군, 혈액 투석; 아나필락시성 쇼크, 중증 천식, 혈관부종, 크론병, 겸상 적혈구 빈혈, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염 및 췌장염인 질병 또는 질환이 포함될 수 있다. 이러한 장애는 약물 부작용, 약물 알레르기, IL-2 유도된 혈관 누출 증후군 또는 방사선촬영 조영제 알레르기에 따른 결과일 수 있다. 이에는 또한, 자가면역 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 알츠하이머병 및 다발성 경화증이 포함된다. 보체 활성화는 또한, 이식체 거부와 연관이 있다. 최근에는 보체 활성화와 안과 질환, 예를 들어 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증 및 기타 허혈증 관련 망막증, 맥락막 신생혈관증식 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄증 (CRVO), 각막 신생혈관증식, 및 망막 신생혈관증식 간에는 강력한 상관 관계가 있다는 것이 밝혀졌다.
<실시예>
다음 실시예는 예시를 위해 제공된 것이지, 이로써 제한되는 것은 아니다. 본 실시예에서 지칭된 시판용 시약은 달리 나타내지 않는 한 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 다음 실시예, 및 본 명세서 전반에 걸쳐 ATCC 승인 번호로써 확인된 세포의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션이다 [American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209].
실시예 1: 항-인자 D Ab의 변형
상업적으로 바람직한 특징, 예를 들어 제조 및 생성 동안의 균질성 또는 분석적 성상 확인을 위한 균질성을 나타낼 수 있는 변형된 항-인자 D 항체, 및 그의 변이체 및 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 확인하기 위해, 부위 지시된 돌연변이 유발 접근 방식을 이용하여 변형된 인간화 항-인자 D 항체, 및 그의 변이체 및 그의 단편 (예: 항원 결합성 단편)을 생성시켰다. 첫째, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 (각각 서열 2 및 서열 1)을 발현 플라스미드 내로 서브클로닝하였다. 둘째, 단일 돌연변이물을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 상기 생성된 발현 플라스미드에 어닐링시켜 부위 지시된 돌연변이물을 도입하였다.
초기에는, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 플라스미드 pAEP1 (pAEP1은 이. 콜라이에서 Fab 항체의 발현을 위한 플라스미드이다) 내로 서브클로닝하였는데, 이러한 서브클로닝으로 인해 가변 경쇄 도메인의 위치 104 (카바트 넘버링에 따름, 도 10 참고)에 발린 (V)이 도입되었다.
인간화 항-인자 D Fab 클론 #111의 가변 경쇄 도메인을 pAEP1 내로 서브클로닝시키는 것은 2개의 DNA 단편을 연결시키는 것을 포함하였다. 첫 번째 단편은 소형 EcoRV/KpnI 단편을 제거시킨 pAEP1 벡터였다. 두 번째 단편은 다음 프라이마를 사용하여, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111에 대한 경쇄 플라스미드로부터 생성된 대략 300개 염기쌍 EcoRV-KpnI PCR 단편이었다:
Figure 112010077495647-pct00020
(서열 67)
Figure 112010077495647-pct00021
(서열 68).
인간화 항-인자 D 클론 #111의 가변 경쇄 도메인을 pAEP1 내로 서브클로닝시키는 것은 위치 104에 발린 (V)을 도입시켰는데, 이는 위치 104가 제한 엔도뉴클레아제 부위 EcoRV 및 KpnI의 2개 아미노산 하류이기 때문인데, 이를 사용하여 인간화 항-인자 D 클론 #111의 가변 경쇄 도메인을 pAEP1 내로 삽입시키므로, pAEP1 플라스미드의 주쇄에 삽입시켰다. 이로써 생성된 중간체 플라스미드가 본원에서 "pAEP1-283-VL"로서 지칭된다.
인간화 항-인자 D 클론 #111의 가변 중쇄 도메인을 pAEP1-283-VL 내로 서브클로닝시키는 것은 2개의 DNA 단편을 연결시키는 것을 포함하였다. 첫 번째 단편은 소형 BsiWI/PspOMI 단편을 제거시킨 pAEP1-283-VL 벡터였다. 두 번째 단편은 다음 프라이마를 사용하여, 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111에 대한 중쇄 플라스미드로부터 생성된 대략 364개 염기쌍 BsiWI-PspOMI PCR 단편이었다:
Figure 112010077495647-pct00022
(서열 69)
Figure 112010077495647-pct00023
(서열 70).
이러한 2개 DNA 단편의 연결로 인해, 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238 (본원에서 "238"로서 지칭되기도 함)에 대한 플라스미드가 생성되었다 (플라스미드는 본원에서 "p238"로서 지칭된다).
인간화 항-인자 D #111로부터의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인을 서브클로닝한 후, 부위 지시된 PCR 돌연변이 유발을 이용하여, 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238의 가변 중쇄의 위치 1 (카바트 넘버링에 따름, 도 1 참고)에서의 글루타민 (Q)을 글루타메이트 (E)로 돌연변이시켰는데, 이로써 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238-1 (본원에서 "238-1"로서 지칭되기도 함)이 생성되었다. 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238-1에 대한 플라스미드 (플라스미드는 본원에서 "p238-1"로서 지칭된다)의 구축은 2개의 DNA 단편을 연결시키는 것을 포함하였다. 첫 번째 단편은 소형 BsiWI/PspOMI 단편을 제거시킨 p238 벡터였다. 두 번째 단편은 다음 프라이마를 사용하여, p238 플라스미드로부터 생성된 대략 364개 염기쌍 BsiWI-PspOMI PCR 단편이었다:
Figure 112010077495647-pct00024
(서열 71)
Figure 112010077495647-pct00025
(서열 72).
이러한 2개 DNA 단편의 연결로 인해, 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238-1 (본원에서 "238-1"로서 지칭되기도 함)에 대한 플라스미드 (플라스미드는 본원에서 "p238-1"로서 지칭된다)가 생성되었는데, 이에는 위치 1이 글루타메이트 (E)로 부위 지시된 돌연변이된 것이 포함되었다. 이러한 돌연변이는 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238-1에서 글루타민 (Q)이 피로글루타메이트로 부분적으로 전환되는 것을 억제시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)].
추가의 부위 지시된 PCR 돌연변이 유발을 이용하여 메티오닌 (M 또는 Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp) 잔기를 돌연변이시켜 산화를 방지시키거나 또는 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기를 돌연변이시켜 탈아미드화를 방지시킬 수 있다. 인간화 항-인자 D 항체의 산화 변이체 형성을 방지하기 위해, 예를 들어 경쇄의 위치 33에 있는 메티오닌 (M 또는 Met)을 루이신 (L 또는 Leu) (이는 크기와 소수성 측면에서 메티오닌과 가장 유사하지만, 산화를 위한 황이 결여되어 있다)으로 돌연변이시킬 수 있거나, 또는 이소루이신 (I 또는 Ile)으로 돌연변이시킬 수 있다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)]. 인간화 항-인자 D 항체의 탈아미드화 변이체 형성을 방지하기 위해, 예를 들어 경쇄의 위치 34 및 52에 있거나 중쇄의 위치 99 또는 100에 있는 아스파라긴 (N 또는 Asn)을 글루타민 (Q 또는 Gln) [이는 아스파라긴 (N 또는 Asn)과 화학적으로 가장 유사하다]으로 돌연변이시킬 수 있거나, 또는 알라닌 (A 또는 Ala) 또는 세린 (S 또는 Ser) (이는 기타 항체 내의 상기 위치에서 흔한 치환물이다)으로 돌연변이시킬 수 있다 [참고: Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)].
도 1 내지 2는 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238에 대한 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인 서열 (각각 서열 6 및 18) 및 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238-1에 대한 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인 서열 (각각 서열 7 및 19)을 도시한 것이다. 도 4 및 도 6은 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238에 대한 경쇄 및 중쇄 서열 (각각 서열 47 및 54)을 도시한 것이다. 도 8 및 도 10은 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238-1에 대한 경쇄 및 중쇄 서열 (각각 서열 61 및 63)을 도시한 것이다.
비아코어 데이터는 인간 인자 D에 대한 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238의 친화도 뿐만 아니라 클론 #111의 인간화 항-인자 D 완전한 길이 mAb 버전 (인간화 항-인자 D 완전한 길이 mAb 234) (본원에서 "234" 또는 "항-인자 D 완전한 길이 mAb 234" 또는 "인간화 항-인자 D 완전한 길이 MAb 234"로서 지칭된다)의 친화도를 나타내었다 (표 2). 인간화 항-인자 D Fab 항체 변이체 238 및 238-1을 또한, 용혈 억제 검정에서 시험하여 (도 11) 대체 경로의 억제를 평가하였다 (실시예 3 참고).
실시예 2: AP 용혈 검정
변형된 항-인자 D Ab의 생물학적 기능은 C1q-고갈된 인간 혈청을 이용하는 용혈 억제 검정 및 비아코어 분석을 이용하여 결정하였다 (하기 실시예 3 참고). 용혈 검정은 다음과 같이 수행하였다:
대체 경로 활성을 결정하기 위해, 토끼 적혈구 (Er, Colorado Serum)를 GVB에서 3회 세척하고 재현탁시켜 2 x 109/ml가 되도록 하였다. 억제제 (50 ㎕) 및 20 ㎕의 Er 현탁물을 GVB/0.1 M EGTA/0.1 M MgCl2와 1:1로 혼합하였다. C1q-고갈된 인간 혈청 (전통적 경로를 통한 모든 보체 활성화를 피하기 위함) (CompTech; GVB에서 1:3으로 희석된 30 ㎕)을 부가함으로써 보체 활성화를 개시시켰다. 실온 하에 30분 동안 항온 배양한 후, 200 ㎕ GVB/10 mM EDTA를 가하여 상기 반응을 중지시키고, 샘플을 500 g 하에 5분 동안 원심분리시켰다. 412 nm 하에서의 흡광도를 측정함으로써 용혈을 200 ㎕ 상등액에서 결정하였다. 데이터는 억제제의 부재 하에 유도된 용혈의 ％로서 표현하였다.
도 11은 보체 공급원으로서 C1q-고갈된 인간 혈청을 이용하는 토끼 적혈구 용혈 검정을 사용하여 대체 경로 용혈에 대한 인간화 항-인자 D Fab 클론 #111 (IC50 = 4.7 ± 0.6 nM), 변형된 항-인자 D Fab 238 (IC50 = 6.4 ± 0.6 nM) 및 변형된 항-인자 D Fab 238-1 (IC50 = 3.5 ± 0.5 nM)의 억제를 도시한 것이다. 대조군은 인자 H ("인간 fH") (공급처: CompTech) 및 항-당단백질 120 ("xgp120") 항체였다.
실시예 3: 비아코어에 의한 항-인간 인자 D Fab의 역학적 분석
변형된 고정화 항-인자 D Fab 238 (본원에서 "238"로서 지칭됨; 실시예 1 참고)에 대한 인간 인자 D (공급처: Advanced Research, Inc.)의 결합을 위한 역학 및 친화도 상수는 비아코어 3000 및 비아코어 A100 기기 둘 다 상에서 표면 플라스몬 공명 측정함으로써 결정하였다. "비아코어 3000/비아코어 A100" 결과로서 열거되는 표 2 내의 값의 경우에는, 별도의 실험을 각 기기 상에서 수행하였고, 별도의 실험으로부터의 데이터를 분석하여 역학 상수를 수득하였으며, 이러한 역학 상수의 평균을 내어 표 2에 제시된 값을 수득하였다. 또 다른 한편으론, 인간 인자 D의 결합에 대한 역학 및 친화도 상수는 인간 인자 D를 고정화시키고 mAb 또는 Fab의 결합을 측정함으로써 측정할 수 있고/있거나, 상이한 재생 조건 (예를 들어, 4 M MgCl2를 포함한다)을 이용하여 측정할 수 있고/있거나 상이한 결합 완충제 (예를 들어, PBS를 포함한다)를 이용하여 측정할 수 있다. 클론 #111의 인간화 항-인자 D 완전한 길이 mAb 버전 (본원에서 "234" 또는 "항-인자 D 완전한 길이 mAb 234" 또는 "인간화 항-인자 D 완전한 길이 mAb 234"로서 지칭된다)을 또한 분석하였다.
1. 고정화
mAb 또는 Fab를 제조업자에 의해 공급된 표준 프로토콜을 이용하여 아민-커플링을 통하여 고정화시켰다. 이러한 커플링의 밀도는 주사된 mAb 또는 Fab 용액의 농도 또는 pH를 조정함으로써 조절하여, 인간 인자 D의 결합도 포화를 위한 총 신호가 50 내지 150 공명 단위 (RU)가 되도록 하였다. 목적하는 양의 mAb 또는 Fab를 커플링시킨 후, 센서 칩 상의 반응하지 않은 관능기는 에탄올아민을 주사함으로써 차단시켰다.
2. 역학적 분석
농도가 500 nM 내지 0.98 nM으로 다양한 일련의 인간 인자 D 용액 (2배씩 증가시킴) 60 ㎕ 분취액을 주사함으로써 결합성 실험을 수행하였다. 모든 샘플을 150 mM NaCl, 0.01％ 트윈-20, 및 다음 완충제 성분 중 하나로 구성된 수행 완충액에서 희석시켰다: (a) pH 7.2 (10 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산); (b) pH 6.0 (10 mM MES (2-[N-모르폴리노]에탄설폰산); 또는 pH 5.0 (10 mM 나트륨 아세테이트). 유속은 30 ㎕/min였고, 시험된 인간 인자 D의 각 농도에 대해 10분 동안 해리를 모니터링하였다. 기준 세포 (에탄올아민 차단시킴) 전반에 걸쳐 동일한 용액을 주사하여 관찰된 신호 (센서그램)를 센서그램으로부터 공제하였다. 센서그램 사이에, 30 ㎕의 4 M MgCl2를 주사하여, 고정화 항체와 결합되어 잔존하는 모든 인간 인자 D의 해리를 유발시킴으로써 표면을 재생시켰다. 단지 센서 칩 표면 상에서만 완충제 주사에 대해 기록된 대조군 센서그램을 인간 인자 D 센서그램으로부터 공제하였다. 이들 데이터는 BIA 평가 소프트웨어 v4.1을 이용하는 1:1 랑뮈르 (Langmuir) 결합성 모델에 따라서 비-선형 회귀에 의해 분석하였다. 역학 및 친화도 상수가 다음 표 2에 제공되어 있다. 비아코어 기술은 제한되고, 이는 너무 신속한 작동 속도 (즉, 약 10 pM 보다 더 작은 KD 값)를 정확하게 측정할 수 없다 [참고: Safsten et al., Anal. Biochem., 353: 181 (2006)].
Figure 112010077495647-pct00026
실시예 4: 다양한 인자 D 농도를 이용한 AP 용혈 검정
항-인자 D Fab 238을 포함한 변형된 항-인자 D Ab의 생물학적 기능은 인자 D의 3가지 혈청 농도의 존재 하에, C1q-고갈된 인간 혈청을 이용한 용혈 억제 검정 및 비아코어 분석을 이용하여 결정하였다 (상기 실시예 2 참고).
C1q-고갈된 인간 혈청 (공급처: CompTech) 뿐만 아니라 AMD 환자의 눈으로부터의 유리체액 및 브루크막 (Bruch's membrane) 조직 [Cole Eye Institute (Cleveland, OH)과의 협력 하에 수득함]을 인자 D에 관한 정량적 ELISA에서 분석하였다 (하기 참고). C1q-고갈된 인간 혈청 중 인자 D의 농도는 97 nM인 반면, AMD 환자로부터의 유리체액 및 브루크막 조직 내에서의 수준은 16.2 ± 10.3 nM (평균 ± SD, n=10)이었다.
정량적 인자 D ELISA는 항-인간 보체 인자 D 염소 폴리클로날 항체 (공급처: R&D Systems, Minneapolis, MN)를 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에서 1 ㎍/ml로 희석시키고, 4℃ 하에 밤새 항온 배양하는 동안 항-인자 D 폴리클로날 항체 (공급처: R&D Systems, Minneapolis, MN)를 384 웰 ELISA 판 (고-결합 판; 공급처: Greiner Bio One through VWR International, Bridgeport, NJ) 상으로 피복하였다. 세척 완충액 (PBS/0.05％ 트윈-20)으로 3회 세척한 후, 상기 판을 PBS/0.5％ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 1 내지 2시간 동안 차단시켰다. 이러한 항온 배양 및 기타 모든 항온 배양은 궤도 진탕기 상에서 실온 하에 수행하였다. 인자 D (공급처: Complement Technology, Inc., Tyler, Texas)에 대한 표준 곡선은 15.6 내지 1,000 pg/ml에 걸쳐 PBS/0.5％ BSA/0.05％ 트윈-20에서 제조하였다. 고, 중간 및 저 영역의 표준 곡선에서 정량화하기 위해 예비-희석시킨 동결 대조군 샘플을 해동시켰다. C1q-고갈된 인간 혈청 및 인간 유리체액 및 브루크막 용해물 샘플은 검정 희석액 (PBS/0.5％ BSA/0.5％ 트윈-20)을 이용하여 희석시켰다. 차단 단계 후, 판을 세척하고, 상기 희석시킨 샘플 (혈청, 유리체액, 및 브루크막의 용해물), 표준물 및 대조군을 가하고 2시간 동안 항온 배양하였다. 2시간 동안 항온 배양한 후, 판을 세척하고, 1 내지 2시간 항온 배양 동안 바이오티닐화 항-인자 D 모노클로날 항체 (클론 9G7.1.16; 공급처: Genentech; 62.5 ng/ml로 희석시킴)를 이용하여 결합된 인자 D를 탐지한 다음, 검정 희석액 중에서 1/10,000로 희석시킨 스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 (SA-HRP)_(공급처: Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)와 함께 30분 동안 항온 배양하였다. 최종 세척 단계 후, 테트라메틸 벤지딘 (공급처: Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)을 가하고, 색상을 5 내지 7분 동안 전개시켰다. 1 M 인산을 가함으로써 반응을 중지시켰다. 미세판 판독기 (450 nm, 650 nm 기준)를 이용하여 광학 밀도를 판독하였고, 표준 곡선의 4개 파라미터 피트로부터 샘플 농도를 계산하였다. 인간 유리체액 및 브루크막 용해물 샘플 중 인자 D의 정량화 가능한 최소 농도는 각각 780 pg/ml (1/50 최소 희석도) 및 156 pg/ml (1/10 최소 희석도)였다.
AMD 환자의 눈으로부터의 유리체액 및 브루크막 조직에서 관찰된 인자 D의 농도와 유사한 인자 D 농도의 존재 하에 변형된 항-인자 D Fab 238을 이용하여 대체 보체 경로의 억제를 위한 IC50 및 IC90 값을 결정하기 위해, 10％ C1q-고갈된 혈청 (9.7 nM 인자 D)을 사용하거나 또는 부가의 인자 D가 보충된 10％ C1q-고갈된 혈청 (공급처: CompTech)을 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 용혈 검정을 수행하여, AMD 환자의 눈으로부터의 유리체액 및 브루크막 조직에서 관찰된 평균 (16.2 nM) 또는 평균 ± 1 SD (26.5 nM) 농도를 나타내는 인자 D 농도를 달성하였다. 데이터는 억제제의 부재 하에 유도된 용혈의 ％로서 표현하였다 (도 12). 용혈 반응의 50％ 및 90％ 억제를 유발시키는 항-인자 D Fab 238의 농도 (각각 IC50 및 IC90 값)는 4개 파라미터 피트 모델 (공급처: KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA)을 이용하여 억제 곡선의 비-선형 회귀에 의해 3가지 반복 실험에 대해 결정하였다. IC50 및 IC90 값의 몰 비 대 인자 D의 상대적 농도를 또한 계산하였다. 평균 IC50 및 IC90 값 및 몰 비가 표 3에 제시되어 있다.
Figure 112013007513206-pct00049
실시예 5: 대체 경로 보체 활성화의 억제 기간
항-인자 D Fab 238을 2.5 mg 용량으로 단일 유리질내 (IVT) 주사하여 인간 눈에서 대체 경로 (AP) 보체 활성화의 모의 억제 기간을 측정하였다 (토끼로부터의 종간 스캐일링을 근거로 하여, 항-인자 D Fab 238의 반감기 (t1/2)가 11.5일이라고 추정하였다) (도 13). 모의 데이터는 뉴질랜드산 흰토끼에서 Fab 238의 단일 유리질내 용량의 PK 연구로부터의 스캐일링에 기초하였다.
인간에게서 항-인자 D Fab 238의 반감기를 평가하기 위해, 토끼에서 항-인자 D 238의 반감기를 계산하였다. 12마리 뉴질랜드산 흰토끼의 각 눈에 1 mg의 단일 유리질내 용량의 Fab 238를 투여하였다. 다음 시점에서 명시된 수의 동물로부터의 양 눈으로부터 유리체액 및 망막 조직 샘플을 수집하였다: 3마리 동물은 4, 24 및 96시간째에 수집하였고 (이들 시점 각각에서 6개 샘플), 1마리 동물은 216시간째에 수집하였으며 (이러한 시점에서 2개 샘플), 2마리 동물은 240시간째에 수집하였다 (이 시점에서 4개 샘플). 안과 매트릭스 중 Fab 238의 농도를 인자 D 결합성 ELISA에서 측정하였다.
모든 동물로부터의 유리체액 농도-시간 데이터를 분석하여, IV 거환 주입 모델 (Models 201, WinNonlin Pro version 5.2.1; Pharsight Corporation, Mountain View, CA)을 이용하여 실험하지 않고 풀링된 접근 방식을 사용하여 약동학적 파라미터 추정치를 추정하여 3.83일의 종결 반감기 (T1/2)의 1개 추정치를 제공하였다. 모든 시점에서 모든 눈에 대해 평균을 낸 유리체액 중에서의 농도에 대한 망막 조직 내에서의 농도의 비로서 망막 분배 계수를 계산하였는데, 이는 0.24였다. 유리체액에 대한 PK 파라미터는 라니비주마브 (ranibizumab)에 대해 관찰된 동일한 스캐일링 인자를 이용하여 인간에 대해 스캐일링하였다. 인간 눈은 4 ml의 V1을 갖고 있는 것으로 추정되고, 인간에서의 반감기 대 토끼에서의 반감기 비는 3인 것으로 추정되는데, 이로써 인간에게서 11.5일의 t1/2 추정치가 생성된다. 이로써, 다음과 같이 시간의 함수로서 유리체 농도 및 망막 조직 농도에 대한 추정치가 생성되었다:
유리체 농도 = (용량/V1)*exp([-In(2)/t1/2]*시간)
망막 조직 농도 = (용량/V1)*exp([-In(2)/t1/2]*시간)*(망막 분배 계수).
도 13에서, 각 눈에 대한 2.5 mg의 단일 ITV 용량에 관한 그래프를 생성시켰고, 이를 t=0일에서부터 t=112일까지의 시간으로 나타내었다. IC90은 10％ 풀링된 인간 혈청을 16.2 nM의 인자 D 농도가 되도록 보충시킨 실시예 2 및 4에 제시된 바와 같이 수행된 용혈 검정에서 90％ 억제 효과를 가져다 주는 Fab 238의 농도를 나타낸다. 검정 결과는 IC90 = 38 nM Fab 238였다. 망막 농도와 유리체 농도를 비교하기 위해, 다음 방정식을 이용하여 몰을 질량으로 전환시켰다:
IC90 = 38 x 10-9 몰/L
Fab 238의 MW = 50,000 그램/몰
IC90 (㎍/ml) = (38 x 10-9 몰/L) x (50 x103 그램/몰) = 1.9 x 10-9 그램/L, 또는 1.9 ㎍/ml.
도 13에 도시된 바와 같이, "IC90 초과의 일수"는 유리체 또는 망막 농도가 2.5 mg/눈의 단일 ITV 용량 투여 후 1.9 ㎍/ml 초과일 것으로 예측되는 시간 양으로서 추정되었고, 유리체 농도 또는 망막 농도의 그래프가 1.9 ㎍/ml에서 교차하는 시점으로서 관찰되었다. 항-인자 D Fab 238을 단일 IVT 주사하는 것이, 망막 조직에서는 약 74일 이상 동안, 그리고 유리체액에서는 약 97일 이상 동안 AP 보체 활성화를 억제시키는 것으로 추정되었다. 도 13에서 데시 (-)는 유리질내 투여 후 유리체액 내에서의 모의 항-인자 D Fab 238 농도를 나타낸다. 도 13에서 실선은 유리질내 투여 후 망막 조직 내에서의 모의 항-인자 D Fab 238 농도를 나타낸다. 유리체액 내에서의 농도와 망막 조직 내에서의 농도 차이는 20％의 망막 조직 분배 계수의 추정치를 기준으로 한 것인데, 달리 말하면 유리체액에 투여된 총 약물의 20％가 망막 조직에 접근될 것이다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 이용해서, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 양태에 대한 많은 등가 양태를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 양태가 다음 특허청구범위에 포괄된다.
전술된 발명이 명료한 이해를 위해 예시 및 예를 통하여 보다 상세히 기재되긴 하였지만, 이러한 설명과 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 기술은 그들의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
전술된 명세서는 당업자는 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 간주된다. 본 발명은 기탁된 구조물로써 그 범위가 제한되지 않는데, 이는 기탁된 양태는 본 발명의 특정 국면의 단일 예시로서 의도되고, 본 발명의 범위 내에서 기능상 등가인 모든 구조물로서 의도된다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형은 전술된 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (77)

  1. (a) GYTFTNYGMN (서열 39)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 HVR-H1, WINTYTGETTYADDFKG (서열 40)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 HVR-H2, 및 EGGVNN (서열 41)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
    (b) ITSTDIDDDMN (서열 30)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 HVR-L1, GGNTLRP (서열 35)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 HVR-L2, 및 LQSDSLPYT (서열 38)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편으로서, 중쇄 가변 도메인이 위치 1에서 E를 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 도메인이 FGQGTKVEIK(서열 51)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 골격영역(FR)-4을 포함하는 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날인 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편인 항-인자 D 항체의 항원결합 단편.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 D가 포유류 인자 D인 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 포유류 인자 D가 인간 인자 D인 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  14. 제1항의 항-인자 D 항체의 가변 도메인.
  15. 삭제
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 삭제
  18. 제14항의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제16항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  21. 제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제20항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제21항에 있어서, 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포.
  24. 제22항에 있어서, 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포.
  25. 제23항에 있어서, CHO 세포 또는 세균인 숙주 세포.
  26. 제24항에 있어서, CHO 세포 또는 세균인 숙주 세포.
  27. (a) 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건 하에 제21항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편의 생성 방법.
  28. (a) 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건 하에 제22항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 가변 도메인을 단리하는 단계를 포함하는, 항-인자 D 항체의 가변 도메인의 생성 방법.
  29. 제27항의 방법으로 생성된 항-인자 D 항체 또는 그의 항원결합 단편.
  30. 삭제
  31. 제28항의 방법으로 생성된 항-인자 D 항체의 가변 도메인.
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