PT2283041E - Anticorpos anti-fator d humanizados e utilizações dos mesmos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS ANTI—FATOR D HUMANIZADOS E UTILIZAÇÕES DOS

MESMOS

Antecedentes da Invenção 0 sistema complemento desempenha um papel central na depuração de complexos imunes e na resposta imunitária contra agentes infeciosos, antigénios estranhos, células infetadas com vírus e células tumorais. No entanto, o complemento também está envolvido na inflamação patológica e em doenças autoimunes. Assim, a inibição da ativação excessiva ou descontrolada da cascata do complemento pode proporcionar um benefício clínico a pacientes com tais doenças e condições. 0 sistema complemento abrange duas vias de ativação distintas designadas as vias clássica e a alternativa (V.M. Holers, In Clinical immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). A via clássica é uma cascata dependente de cálcio/magnésio, que é normalmente ativada pela formação de complexos antigénio-anticorpo. A via alternativa é uma cascata dependente de magnésio, que é ativada por deposição e ativação de C3 em certas superfícies suscetíveis (por exemplo, polissacarídeos da parede celular de leveduras e bactérias, e certos materiais biopoliméricos). A ativação da via do complemento gera fragmentos biologicamente ativos de proteínas do complemento, por exemplo, anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e complexos de ataque à membrana C5b-9 (MAC), que medeiam atividades inflamatórias que envolvem a quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastócitos e células endoteliais, permeabilidade vascular, citólise e lesão de tecidos. 0 fator D é uma serina protease altamente específica essencial para a ativação da via alternativa do complemento. Cliva o fator B ligado a C3b, gerando a enzima C3b/Bb que é o componente ativo das C3/C5 convertases da via alternativa. 0 fator D pode ser um alvo adequado para a inibição, uma vez que a sua concentração plasmática em seres humanos é muito baixa (1,8 pg/ml) e verificou-se ser a enzima limitante para a ativação da via alternativa do complemento (P.H. Lesavre e H.J. Muller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312:395-401).

Tem sido demonstrado que a regulação negativa da ativação do complemento é eficaz no tratamento de várias indicações de doença em modelos animais e em estudos ex vivo, por exemplo, lúpus eritematoso sistémico e glomerulonef rite (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sei.; 1996, 93: 8563-8568), artrite reumatoide (Y. Wang et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., 1995; 92: 8955-8959), bypass cardiopulmonar e hemodiálise (C.S. Rinder, J. Clin, invest., 1995; 96: 1564-1572), rejeição hiperaguda em transplante de órgãos (T.J. Kroshus et al., Transplantation, 1995; 60:1194-1202), enfarte do miocárdio (J. W. Homeisteretal., J. Immunol., 1993; 150:1055-1064; H.F. Weismanetal.,Science, 1990;249:146-151), lesão de reperfusão (E.A. Amsterdam et al., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457), e síndrome de dificuldade respiratória do adulto (R. Rabinovici et al. , J. Immunol., 1992; 149:1744-1750). Além disso, outras condições inflamatórias e doenças de complexos autoimunes/imunes também estão intimamente associadas com a ativação do complemento (V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994:24: 219-228), incluindo lesão térmica, asma grave, choque anafilático, inflamação do intestino, urticária, angioedema, vasculite, esclerose múltipla, miastenia gravis, glomerulonefrite membranoproliferativa e síndrome de Sjõgren.

Existe uma necessidade de terapêuticas de anticorpos no domínio dos distúrbios mediados pelo complemento, e anticorpos anti-fator D humanizados e variantes de anticorpos dos mesmos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) da presente invenção proporcionam anticorpos de elevada afinidade úteis para satisfazer esta necessidade. 0 documento W02008/055206, publicado após a data de prioridade do presente pedido, também divulga anticorpos anti-fator D humanizados.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a anticorpos anti-Fator D de acordo com a reivindicação 1.

Num aspeto, a presente invenção refere-se a anticorpos capazes de inibir atividades biológicas associadas com Fator D.

Num aspeto, a presente invenção refere-se a anticorpos anti-Fator D humanizados, que têm uma variedade de características desejadas terapeuticamente. A invenção inclui as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-Fator D humanizados e suas sequências de ácidos nucleicos correspondentes. A invenção inclui as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-Fator D humanizados e suas sequências de ácidos nucleicos correspondentes.

Num aspeto, anticorpos específicos dentro do âmbito desta invenção são os anticorpos anti-Fator D humanizados com os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de clones Fab anti-Fator D humanizados 238-1. Numa forma de realização, os anticorpos anti-Fator D humanizados compreendem as cadeias pesada e/ou leve do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 238. Numa forma de realização, a invenção inclui o clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 238 Numa forma de realização, a invenção inclui fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) de anticorpos de comprimento completo do clone Fab de anti-Fator D humanizado n.° 238.

Anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) descritos no presente documento, podem ligar-se ao Fator D com uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1CT9 a 1CT12 M. São descritos no presente documento, anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) , em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe uma função biológica do Fator D num fragmento Fab para uma razão molar do Fator D de cerca de 0,05:1 (0,05) a cerca de 10:1 (10) ou cerca de 0,09:1 (0,09) até cerca de 8:1 (8) ou cerca de 0,1:1 (0,1) até cerca de 6:1 (6) ou cerca de 0,15:1 (0,15) até cerca de 5:1 (5) ou cerca de 0,19:1 (0,19) até cerca de 4:1 (4) ou cerca de 0,2:1 (0,2) até cerca de 3:1 (3) ou cerca de 0,3:1 (0,3) até cerca de 2:1 (2) ou cerca de 0,4:1 (0,4) até cerca de 1:1 (1) ou cerca de 0,5:1 (0,5) até cerca de 1:2 (0,5) ou cerca de 0,6:1 (0,6) até cerca de 1:3 (0,33) ou cerca de 0,7:1 (0,7) até cerca de 1:4 (0,25) ou cerca de 0,8:1 (0,8) até cerca de 1:5 (0,2) ou cerca de 0,9:1 (0,9) até cerca de 1:6 (0,17) .

Num aspeto, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos.

Num outro aspeto, a presente invenção inclui fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) de anticorpos anti-Fator D humanizados. Os fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2r scFv, (scFv)2, dAb, fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia simples, minibodies, diabodies ou anticorpos multiespecificos formados de fragmentos de anticorpo.

Noutros aspetos da invenção, a presente invenção inclui composições que compreendem um anticorpo da invenção ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) . Noutra forma de realização, a invenção proporciona linhas celulares e vetores que codificam pelo menos uma porção de um anticorpo da invenção ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) . Num aspeto, a invenção inclui um método de produzir anticorpos, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). Numa forma de realização, o método de produzir um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), em que o método compreende (a) cultura de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula eucariótica ou CHO, que compreende um vetor, que compreende adicionalmente um polinucleótido que codifica um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), sob condições adequadas para a expressão do polinucleótido que codifica o anticorpo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) e (b) isolamento do anticorpo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio).

Ainda num outro aspeto, a invenção refere-se a uma composição de matéria que compreende um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), como descrito no presente documento, em combinação com um veículo. 0 veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.

Outro aspeto da presente invenção é a utilização destes anticorpos humanizados ou fragmentos de anticorpo dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio), para a preparação de um medicamento ou composição para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios associados à ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Eles incluem a ativação do complemento durante operações de bypass cardiopulmonar; ativação do complemento devido a isquemia-reperfusão após enfarte agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão traumática, falência múltiorgânica, choque hipovolémico, isquemia intestinal ou outros eventos que causam isquemia. Também se tem verificado que a ativação do complemento está associada com condições inflamatórias tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, sindrome da dificuldade respiratória do adulto, hemodiálise; choque anafilático, asma grave, angioedema, Doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. 0 distúrbio pode ser o resultado de uma reação adversa a fármaco, alergia a fármaco, sindrome de extravasamento vascular induzido por IL-2 ou alergia a meios de contraste radiográficos. Também inclui doença autoimune tal como lúpus eritematoso sistémico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla. Noutra forma de realização, a ativação do complemento está também associada com a rejeição de transplantes. Noutra forma de realização, a ativação do complemento está também associada com doenças oculares (todas as condições e doenças oculares cuja patologia envolva o complemento, incluindo a via clássica e a via alternativa do complemento), tais como, por exemplo, sem limitação, doença degenerativa da mácula, tal como todos os estádios de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), que incluem as formas seca e húmida (não exsudativa e exsudativa) , retinopatias diabética e outras relacionadas com a isquemia, neovascularização coroideia (CNV), uveite, edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da córnea e neovascularização da retina. Num exemplo, as condições oculares associadas ao complemento incluem degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo não exsudativa (por exemplo, AMD intermediária seca ou atrofia geográfica (GA)) e AMD exsudativa (por exemplo, AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)), retinopatia diabética (DR) , endoftalmite e uveite. Num exemplo adicional, a AMD não exsudativa pode incluir a presença de drusas duras, drusas moles, atrofia geográfica e/ou aglomeração de pigmento. Num outro exemplo, as condições oculares associadas ao complemento incluem degeneração macular relacionada com a idade (AMD), que inclui AMD precoce (por exemplo, inclui múltiplas drusas pequenas até uma ou mais drusas de tamanho médio não-extensivas), AMD intermediária (por exemplo, inclui de drusas extensivas médias até uma ou mais drusas grandes) e AMD avançada (por exemplo, inclui atrofia geográfica ou AMD avançada húmida (CNV). Num exemplo adicional, a AMD intermediária seca pode incluir drusas confluentes grandes. Num exemplo adicional, a atrofia geográfica pode incluir perda de fotorrecetores e/ou Epitélio Pigmentado da Retina (RPE). Num exemplo adicional, a área de atrofia geográfica pode ser pequena ou grande e/ou pode estar na área da mácula ou na retina periférica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD intermediária seca. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é atrofia geográfica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)). É descrito no presente documento um kit que compreende um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um kit que compreende um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) e instruções de utilização. É descrito no presente documento um kit que compreende um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) e instruções para a administração do dito anticorpo, para tratar um distúrbio associado ao complemento. É descrito no presente documento um kit que compreende um primeiro recipiente que compreende uma composição que compreende um ou mais anticorpos da invenção, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio); e um segundo recipiente que compreende um tampão. 0 tampão pode ser farmaceuticamente aceitável. É descrita uma composição que compreende um anticorpo da invenção, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) que compreende adicionalmente um veículo, que pode ser farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente um kit compreende adicionalmente instruções para a administração da composição (por exemplo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) a um sujeito. Opcionalmente um kit compreende adicionalmente instruções de utilização do kit. É descrito no presente documento um artigo de fabrico que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios associados ao complemento. É descrito no presente documento um artigo de fabrico, que compreende: (a) um recipiente; (b) um rótulo no recipiente e (c) uma composição de matéria que compreende um anticorpo ou variante do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), da presente invenção, contida com o recipiente, em que o rótulo no dito recipiente indica que a composição pode ser utilizada para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios associados ao complemento. É descrita no presente documento a utilização de um anticorpo anti-Fator D da invenção, ou fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), ácido nucleico da invenção, vetor de expressão da invenção ou célula hospedeira da invenção, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento. Opcionalmente a condição ocular associada ao complemento é selecionada a partir de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo AMD não exsudativa (por exemplo, AMD intermediária seca ou atrofia geográfica (GA)) e exsudativa (por exemplo, AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)), retinopatia diabética (DR), endoftalmite e uveite. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD intermediária seca. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é atrofia geográfica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)). É descrita no presente documento a utilização de um artigo de fabrico na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento. A condição ocular associada ao complemento pode ser selecionada a partir de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo AMD não exsudativa (por exemplo, AMD intermediária seca ou atrofia geográfica (GA)) e exsudativa (por exemplo, AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)), retinopatia diabética (DR), endoftalmite e uveite. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD intermediária seca. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é atrofia geográfica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)).

É descrita no presente documento a utilização de um kit na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento. A condição ocular associada ao complemento pode ser selecionada a partir degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo AMD não exsudativa (por exemplo, AMD intermediária seca ou atrofia geográfica (GA)) e exsudativa (por exemplo, AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)), retinopatia diabética (DR), endoftalmite e uveite. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD intermediária seca. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é atrofia geográfica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)).

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1A-1C mostram o alinhamento de sequências dos domínios variáveis de cadeia leve para o seguinte: clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 (SEQ. ID N.° 1), Fabs anti-Fator D humanizados 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 e 238-11 (SEQ. ID N.°s 6-17, respetivamente) e sequência de consenso VL Capa I (SEQ. ID N.° 65) . As posições são numeradas de acordo com Rabat e as regiões hipervariáveis (em conformidade com as definições de HVR de Rabat + Chothia) estão dentro de caixas (HVRs: (1) HVR-L1 identificada como Al-All (ITSTDIDDDMN (SEQ. ID N.° 30), ITSTDIDDDLN (SEQ. ID N.° 31), ITSTDIDDDJCN (SEQ. ID N.° 32), ITSTDIDDDMA (SEQ. ID N.° 33) ou ITSTDIDDDMQ (SEQ. ID N.° 34)), (2) HVR-L2 identificada como B1-B7 (GGNTLRP (SEQ. ID N.° 35), GGSTLRP (SEQ. ID N.° 36) ou GGATLRP (SEQ. ID N.° 37)), (3) HVR-L3 identificada como C1-C9 (LQSDSLPYT (SEQ. ID N.° 38)). As alterações de aminoácidos em cada Fab anti-Fator D humanizado estão em negrito e itálico. A Figura 2A-C mostra o alinhamento de sequências dos domínios variáveis de cadeia leve para o seguinte: clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 (SEQ. ID N.° 2) e Fabs anti-Fator D humanizados 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 e 238-11 (SEQ. ID N.°s 18-29, respetivamente) e sequência de consenso VH subgrupo 7 (SEQ. ID N.° 66) . As posições são numeradas de acordo com Rabat e as regiões hipervariáveis (em conformidade com as definições de HVR de Kabat + Chothia) estão dentro de caixas (HVRs: (1) HVR-H1 identificada como D1-D10 (GYTFTNYGMN (SEQ. ID N.° 39), (2) HVR-H2 identificada como E1-E19 (WINTYTGETTYADDFKG (SEQ. ID N.° 40), (3) HVR-H3 identificada como F1-F6 (EGGVNN (SEQ. ID N.° 41), EGGVAN (SEQ. ID N.° 42), EGGVQN (SEQ. ID N.° 43), EGGVNA (SEQ. ID N.° 44) ou EGGVNQ (SEQ. ID N.° 45)). As alterações de aminoácidos em cada Fab anti-Fator D humanizado estão em negrito e itálico. A Figura 3 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 46) da cadeia leve do Fab anti-Fator D humanizado 238. A sequência de nucleótidos codifica para a cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado 238 com o codão de iniciação e terminação mostrado em negrito e sublinhado. O codão correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 4 (SEQ. ID N.° 47) está em negrito e itálico. A Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 47) da cadeia leve do Fab anti-Fator D humanizado 238. A sequência de aminoácidos carece de sequência de sinal N-terminal do polipéptido codificado pela SEQ. ID N.° 46 mostrada na Figura 3. As sequências HVR estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas enquanto o primeiro domínio constante CL1 está sublinhado. São mostradas regiões estruturais (FR) e regiões HVR: FR1-LC (SEQ. ID N.° 48), FR2-LC (SEQ. ID N.° 49), FR3-LC (SEQ. ID N.° 50), FR4-LC (SEQ. ID N.° 51), HVR1-LC (SEQ. ID N.° 30 (ITSTDID-DDMN) ) , HVR2-LC (SEQ. ID N.° 35 (GGNTLRP) ) , HVR3-LC (SEQ. ID N.° 38 (LQSDSLPYT) ) e CL1 (SEQ. ID N.° 52) . A Figura 5 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 53) da cadeia pesada do Fab anti-Fator D humanizado 238. A sequência de nucleótidos codifica para a cadeia pesada do Fab anti-Fator D humanizado 238 com o codão de iniciação e terminação mostrado em negrito e sublinhado. O codão correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 6 (SEQ. ID N.° 54) está em negrito e itálico. A Figura 6 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 54) da cadeia pesada do Fab anti-Fator D humanizado 238. A sequência de aminoácidos carece da sequência de sinal N-terminal do polipéptido codificado pela SEQ. ID N.° 53 mostrada na Figura 5. As sequências HVR estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas enquanto o primeiro domínio constante CHI está sublinhado. São mostradas regiões estruturais (FR) e regiões HVR: FR1-HC (SEQ. ID N.° 55), FR2-HC (SEQ. ID N.° 56), FR3-HC (SEQ. ID N.° 57), FR4-HC (SEQ. ID N.° 58), HVR1-HC (SEQ. ID N.° 39 (GYTFT-NYGMN)), HVR2-HC (SEQ. ID N.° 40 (WINTYTGETTYADDFKG) ) , HVR3-HC (SEQ. ID N.° 41 (EGGVNN) ) e CHI (SEQ. ID N.0 59). A Figura 7 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 60) da cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado 238-1. A sequência de nucleótidos codifica para a cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado 238-1 com o o codão de iniciação e terminação mostrado em negrito e sublinhado. O codão correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 8 (SEQ. ID N.° 61) está em negrito e itálico. A Figura 8 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 61) da cadeia leve para Fab anti-Fator D humanizado 238-1. A sequência de aminoácidos carece da sequência de sinal N-terminal do polipéptido codificado pela SEQ. ID N.° 60 mostrada na Figura 7. As sequências HVR estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas enquanto o primeiro domínio constante CL1 está sublinhado. São mostradas regiões estruturais (FR) e regiões HVR: FR1-LC (SEQ. ID N.° 48), FR2-LC (SEQ. ID N.° 49), FR3-LC (SEQ. ID N.° 50), FR4-LC (SEQ. ID N.° 51), HVR1-LC (SEQ. ID N.° 30 (ITSTDID-DDMN) ) , HVR2-LC (SEQ. ID N.° 35 (GGNTLRP) ) , HVR3-LC (SEQ. ID N.° 38 (LQSDSLPYT) ) e CL1 (SEQ. ID N.° 52) .

A Figura 9 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 62) da cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado 238-1. A sequência de nucleótidos codifica a cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado 238-1 com o codão de iniciação e terminação mostrado em negrito e sublinhado. 0 codão correspondente ao primeiro aminoácido na Figura 10 (SEQ. ID N.° 63) está em negrito e itálico. A Figura 10 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 63) da cadeia pesada para Fab anti-Fator D humanizado 238-1. A sequência de aminoácidos carece da sequência de sinal N-terminal do polipéptido codificado pela SEQ. ID N.° 62 mostrada na Figura 9. As sequências HVR estão em negrito e itálico. As regiões variáveis são regiões não sublinhadas enquanto o primeiro domínio constante CHI está sublinhado. São mostradas regiões estruturais (FR) e regiões HVR: FRl-HC (SEQ. ID N.° 64), FR2-HC (SEQ. ID N.° 56), FR3-HC (SEQ. ID N.° 57), FR4-HC (SEQ. ID N.° 58), HVR1-HC (SEQ. ID N.° 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2-HC (SEQ. ID N.° 40 (WINTYTGETTYADDFKG) ) , HVR3-HC (SEQ. ID N.° 41 (EGGVNN) ) e CHI (SEQ. ID N.0 59). A Figura 11 mostra os resultados do ensaio hemolitico, mostrando a inibição da atividade alternativa do complemento para o clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 e Fabs anti-Fator D humanizados 238 e 238-1. São mostrados os valores de CI50. A Figura 12 mostra os resultados do ensaio hemolitico, mostrando a inibição da atividade da via alternativa (AP) do complemento, para Fab anti-Fator D humanizado 238, em três concentrações séricas de Fator D (9,7 nM, 16,2 nM e 26,5 nM) . O Quadro 3 mostra os valores de CI50 (nM) e CI90 (nM) (os valores representam a média de três experiências repetidas), correspondentes às três concentrações séricas de Fator D. As razões molares de anticorpo para Fator D alvo são também mostradas no Quadro 3. A Figura 13 mostra a duração simulada da inibição da ativação da via alternativa (AP) do complemento num olho de um ser humano utilizando uma única injeção intravitrea (IVT) de Fab anti-Fator D 238 numa dose de 2,5 mg (assumindo uma semivida (ti/2) do Fab anti-Fator D 238 = 11,5 dias, com base na escala inter-espécies a partir do coelho) . Foi estimado que uma única injeção IVT de Fab anti-Fator D 238 inibe a ativação da AP do complemento no tecido da retina durante pelo menos cerca de 74 dias e no humor vítreo durante pelo menos cerca de 97 dias. Na Figura 13, a linha tracejada mostra a concentração simulada do Fab anti-Fator D 238 no humor vítreo após a administração intravitrea. Na Figura 13, a linha contínua mostra a concentração simulada do Fab anti-Fator D 238 no tecido da retina após a administração intravitrea. A diferença na concentração no humor vítreo e no tecido da retina é baseada numa estimativa do coeficiente de partição do tecido da retina de 20%, por outras palavras, 20% do fármaco total administrado ao humor vítreo terá acesso ao tecido da retina.

Descrição Detalhada da Invenção I. Definições

Os termos utilizados ao longo deste pedido devem ser interpretados com o significado comum e típico pelos peritos na especialidade. No entanto, os Requerentes desejam que aos termos seguintes seja dada a definição particular, tal como abaixo definido. A frase "substancialmente idêntica" com respeito a uma sequência polipeptídica de cadeia de anticorpo pode ser interpretada como uma cadeia de anticorpo que apresenta pelo menos 70%, ou 80%, ou 90% ou 95% de identidade de sequência com a sequência polipeptídica de referência. O termo com respeito a uma sequência de ácidos nucleicos pode ser interpretado como uma sequência de nucleótidos que apresenta, pelo menos cerca de 85%, ou 90%, ou 95% ou 97% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de referência. 0 termo "identidade" ou "homologia" deve ser interpretado como significando a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de uma sequência correspondente à qual é comparada, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário para alcançar a percentagem de identidade máxima para toda a sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. Nem extensões ou inserções N- ou C-terminais devem ser interpretadas como reduzindo a identidade ou homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. A identidade de sequência pode ser medida utilizando programas de análise de sequências. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (Igs) são glicoproteinas que possuem as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos apresentam especificidade de ligação para um alvo específico, as imunoglobulinas incluem tanto anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpo que carecem de especificidade para o alvo. Anticorpos e imunoglobulinas nativos são normalmente glicoproteinas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (VH) numa extremidade seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) numa extremidade e um domínio constante na sua outra extremidade.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Num exemplo, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo tal como determinado pelo método de Lowry e mais preferivelmente mais do que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração de prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Como utilizado no presente documento, "anticorpo anti-Fator D humano" significa um anticorpo que se liga especificamente ao Fator D humano de tal modo a inibir ou reduzir substancialmente a ativação do complemento. 0 termo "Fator D" é utilizado no presente documento em referência a polipéptidos de Fator D de sequência nativa e variantes.

Um Fator D de "sequência nativa", é um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos tal como um polipéptido de Fator D derivado da natureza, independentemente do seu modo de preparação. Assim, o Fator D de sequência nativa pode ser isolado a partir da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. Em adição a uma proteína de Fator D madura, tal como uma proteína de Fator D madura humana (NM_001928), o termo "Fator D de sequência nativa", abrange especificamente formas precursoras de ocorrência natural do

Fator D (por exemplo, uma pré-proteína inativa, que é clivada proteoliticamente para produzir a forma ativa), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas de splicing alternativas) variantes alélicas do Fator D de ocorrência natural, assim como variantes conformacionais estruturais de moléculas de Fator D tendo a mesma sequência de aminoácidos que um polipéptido de Fator D derivado da natureza. Polipéptidos de Fator D de animais não humanos, incluindo primatas superiores e mamíferos não humanos, estão especificamente incluídos dentro desta definição. "Variante de Fator D" significa um polipéptido de Fator D ativo tal como definido abaixo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipéptido de Fator D de sequência nativa, tal como o polipéptido de Fator D humano de sequência nativa (NM_001928). Normalmente, uma variante de Fator D terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos, ou pelo menos cerca de 99% de sequência de aminoácidos com a de sequência de aminoácidos madura humana (NM_0 01928) . "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos numa sequência de Fator D de referência, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a identidade de sequência percentual máxima e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias formas que estão dentro da perícia na especialidade, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, que incluem quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento completo das sequências a serem comparadas. A identidade de sequência é então calculada em relação à sequência mais longa, isto é, mesmo se uma sequência mais curta mostra 100% de identidade de sequência com uma parte de uma sequência mais longa, a identidade de sequência total será inferior a 100%. "Percentagem (%) de identidade de sequência de ácidos nucleicos" é definida como a percentagem de nucleótidos numa sequência candidata que são idênticos com os nucleótidos numa sequência codificadora de Fator D de referência, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a identidade de sequência percentual máxima. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico pode ser alcançado de várias formas que estão dentro da perícia na especialidade, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento completo das sequências a serem comparadas. A identidade de sequência é então calculada em relação à sequência mais longa, isto é, mesmo se uma sequência mais curta mostra 100% de identidade de sequência com uma parte de uma sequência mais longa, a identidade de sequência total será inferior a 100%.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra diferente da forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Assim, moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui moléculas de ácido nucleico contidas em células que normalmente expressam um polipéptido codificado onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente daquela das células naturais.

Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de Fator D "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico que codifica o Fator D. Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de Fator D isolada é outra diferente da forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Assim, moléculas de ácido nucleico que codificam o polipéptido de Fator D isoladas distinguem-se da(s) molécula(s) de ácido nucleico codificante tal como existem em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico que codifica Fator D isolada inclui moléculas de ácido nucleico que codificam Fator D contidas em células que normalmente expressam Fator D onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente daquela das células naturais. 0 termo "antagonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que é capaz de neutralizar, bloquear, inibir parcial ou totalmente, anular, reduzir ou interferir com uma atividade biológica do Fator D. Antagonistas do Fator D incluem, sem limitação, anticorpos anti-Fator D e variantes de anticorpo dos mesmos, fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, outros polipéptidos, péptidos e pequenas moléculas não peptídicas de ligação que se ligam ao Fator D e são capazes neutralizar, bloquear, inibir parcial ou totalmente, anular, reduzir ou interferir com atividades do Fator D, tais como a capacidade do Fator D de participar na patologia de uma condição ocular associada ao complemento.

Uma "molécula pequena" é definida no presente documento como tendo uma massa molecular abaixo de cerca de 600, de preferência abaixo de cerca de 1000 daltons. "Ativo" ou "atividade" ou "atividade biológica" no contexto de um antagonista do Fator D da presente invenção é a capacidade de antagonizar (inibir parcial ou totalmente) uma atividade biológica do Fator D. Um exemplo de uma atividade biológica de um antagonista do Fator D é a capacidade de alcançar uma melhoria mensurável no estado, por exemplo, patologia, de uma condição ou doença associada ao Fator D, tal como, por exemplo, uma condição ocular associada ao complemento. A atividade pode ser determinada em testes in vitro ou in vivo, incluindo ensaios de ligação, ensaios de hemólise de via alternativa (por exemplo, ensaios que medem a inibição da atividade ou ativação da via alternativa do complemento) , utilizando um modelo animal relevante, ou ensaios clínicos em seres humanos. O termo "distúrbio associado ao complemento" é utilizado no sentido mais lato e inclui distúrbios associados com ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Incluem a ativação do complemento durante operações de bypass cardiopulmonar; ativação do complemento devido a isquemia-reperfusão após enfarte agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão traumática, falência multiorgânica, choque hipovolémico, isquemia intestinal ou outros eventos que causam isquemia. Também se tem verificado que ativação do complemento está associada com condições inflamatórias tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, sindrome da dificuldade respiratória do adulto, hemodiálise; choque anafilático, asma grave, angioedema, Doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. 0 distúrbio pode ser o resultado de uma reação adversa a fármaco, alergia a fármaco, Sindrome de extravasamento vascular induzido por IL-2 ou alergia a meios de contraste radiográficos. Também inclui doença autoimune tal como lúpus eritematoso sistémico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla. A ativação do complemento também está associada com rejeição de transplante. A ativação do complemento também está associada com doenças oculares tal como degeneração macular relacionada com a idade, retinopatias diabética e outras relacionadas com a isquemia, neovascularização coroideia (CNV), uveite, edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da córnea e neovascularização da retina. 0 termo "condição ocular associada ao complemento" é utilizado no sentido mais lato e inclui todas as condições oculares cuja patologia envolva o complemento, incluindo as vias clássica e a alternativa, e em particular a via alternativa do complemento. As condições oculares associadas ao complemento incluem, sem limitação, doenças degenerativas da mácula, tais como todos os estádios de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), que incluem as formas seca e húmida (não exsudativa e exsudativa, neovascularização coroideia (CNV), uveite, retinopatias diabética e outras relacionadas com a isquemia e outras doenças neovasculares intraoculares, tais como edema macular diabético, miopia patológica, doença de von

Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da cornea e neovascularização da retina. Num exemplo, condições oculares associadas ao complemento incluiem degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo não exsudativa (por exemplo, AMD intermediária seca ou atrofia geográfica (GA)) e exsudativa (por exemplo, AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)) AMD, retinopatia diabética (DR), endoftalmite e uveíte. Num exemplo adicional, AMD não exsudativa pode incluir a presença de drusas duras, drusas moles, atrofia geográfica e/ou

aglomeração de pigmento. Num exemplo, condições oculares associadas ao complemento incluem degeneração macular relacionada com a idade (AMD), que inclui AMD precoce (por exemplo, inclui desde múltiplas drusas pequenas até uma ou mais drusas de tamanho médio não extensiva), AMD intermediária (por exemplo, inclui desde drusas extensivas médias até uma ou mais drusas grandes) e AMD avançada (por exemplo, inclui atrofia geográfica ou AMD avançada húmida (CNV) . (Ferris et al., Relatório AREDS N.° 18; Sallo et al. , Eye Res., 34(3): 238-40 (2009); Jager et al. , New

Engl. J. Med., 359(1): 1735 (2008)). Num exemplo adicional, a AMD intermediária seca pode incluir drusas confluentes grandes. Num exemplo adicional, a atrofia geográfica pode incluir fotorrecetores e/ou Epitélio Pigmentado da Retina (RPE) . Num exemplo adicional, a área de atrofia geográfica pode ser pequena ou grande e/ou pode estar na área da mácula ou na retina periférica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD intermediária seca. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é atrofia geográfica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)). "Tratamento" é uma intervenção efetuada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou alterar a patologia de um distúrbio. Consequentemente, "tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles que já possuem o distúrbio bem como aqueles em que o distúrbio deve ser prevenido. No tratamento de uma doença relacionada com a imunidade, um agente terapêutico pode alterar diretamente a magnitude da resposta de um componente da resposta imunitária, ou tornar a doença mais suscetível a tratamento por outros agentes terapêuticos, por exemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes anti-inflamatórios, quimioterapêuticos, etc. A "patologia" de uma doença, tal como uma condição ocular associada ao complemento, inclui todos os fenómenos que comprometem o bem-estar do paciente. Isto inclui, sem limitação, crescimento anormal ou incontrolável de células (células neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas, linfocíticas), produção de anticorpos, produção de auto-anticorpos, produção do complemento, interferência com o funcionamento normal das células vizinhas, libertação de citoquinas ou outros produtos de secreção em níveis anormais, supressão ou agravamento de qualquer resposta inflamatória ou imunológica, infiltração de células inflamatórias (neutrofílicas, eosinofílicas, monocítica, linfocíticas) para espaços celulares, etc. 0 termo "mamífero" como utilizado no presente documento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, que inclui, sem limitação, seres humanos, primatas superiores, animais domésticos e de quinta e de zoológico, animais de desporto ou de estimação tais cavalos, suínos, bovinos, cães, gatos e furões, etc. Numa forma de realização da invenção, o mamífero é um ser humano.

Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais, inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva por qualquer ordem. "Quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade de um "antagonista do Fator D", que é necessária para alcançar uma melhoria mensurável do estado, por exemplo, patologia, da doença ou condição alvo, tal como, por exemplo, uma condição ocular associada ao complemento. 0 termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação a ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.

Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou líder de secreção está operativamente ligado a ADN para um polipéptido se é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afeta a transcrição da sequência; ou um local de ligação a ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a serem ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, os adaptadores ou ligantes oligonucleótidos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional. A "restringência" das reações de hibridação é facilmente determinável por um perito na especialidade e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas mais altas para hibridação correta, enquanto sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação depende geralmente da capacidade do ADN desnaturado para voltar a hibridar quando estão presentes cadeias complementares num ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridável, maior a temperatura relativa que pode ser utilizada. Como resultado, segue-se que temperaturas relativas mais elevadas tenderão a tornar as condições de reação mais restringentes, enquanto temperaturas mais baixas as tornarão menos restringentes. Para detalhes adicionais e explicação da restringência das reações de hibridação, ver Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condições restringentes" ou "condições de restringência elevada", como definido no presente documento, podem ser identificadas por aquelas que: (1) utilizam uma força iónica baixa e temperatura elevada para lavagem, por exemplo cloreto de sódio a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio a 0,1% a 50 °C; (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão de fosfato de sódio a 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM a 42 °C; ou (3) empregam formamida a 50%, 5 x SSC (NaCl a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55 °C, seguido por uma lavagem de restringência elevada que consiste em 0,1 x SSC que contém EDTA a 55°C. "Condições moderadamente restringentes" podem ser identificadas como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de solução de lavagem e condições de hibridação (por exemplo, temperatura, força iónica e %SDS) menos restringentes que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente restringentes é a incubação durante a noite a 37 °C numa solução que compreende: formamida a 20%, 5 x SSC (NaCl a 150 mM, citrato de sódio a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão fragmentado e desnaturado a 20 mg/ml, seguido de lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37-50 °C. O perito na especialidade reconhecerá como ajustar a temperatura, força iónica, etc., conforme necessário para acomodar fatores tais como o comprimento da sonda e semelhantes. O termo "variável" no contexto de domínio variável de anticorpos, refere-se ao facto de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu alvo particular. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente através dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs), também conhecidas como regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são designadas regiões estruturais (FR) . Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro regiões FR, que adotam em grande parte uma configuração de folha-β, ligadas por três CDRs, que formam ansas que ligam, e em alguns casos, formam parte da estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação alvo de anticorpos (ver Rabat et al.) . Como utilizado no presente documento, a numeração dos resíduos de aminoácidos de imunoglobulina é feita de acordo com o sistema de numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulinas de Rabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987), salvo indicação em contrário. 0 termo "região hipervariável", "HVR", ou "HV", quando utilizado no presente documento refere-se às regiões de domínio variável de um anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam ansas estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três na VH (Hl, H2, H3) e três na VL (Ll, L2, L3) . Um número de delineações da região hipervariável está em utilização e estão abrangidos no presente documento. As Regiões Determinantes de Complementaridade de Rabat (CDRs) baseiam-se na variabilidade de sequência e são as mais comummente utilizadas (Rabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se, por outro lado, à localização das ansas estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). O final da ansa CDR-H1 de Chothia quando numerado utilizando a convenção de numeração de Rabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento da ansa (isto porque o esquema de numeração de Rabat situa as inserções a H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estão presentes, a ansa termina a 32; se apenas 35A está presente, a ansa termina a 33; se ambos 35A e 35B estão presentes, a ansa termina a 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre as CDRs de Rabat e as ansas estruturais de Chothia e são utilizadas pelo programa de modelagem de anticorpos AbM de Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de "contacto" são baseadas numa análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são observados a seguir.

Regiões hipervariáveis pode compreender "regiões hipervariáveis estendidas" como se segue: 24-36 ou 24-34 (Ll), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3) na VL e 26-35B (Hl), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Rabat et al., supra para cada uma destas definições.

Resíduos "estruturais" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável para além dos resíduos da região hipervariável ou resíduos de CDR definidos no presente documento. O termo "numeração de resíduo de domínio variável como em Rabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Rabat", e variações do mesmo, refere-se ao sistema de numeração utilizado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Rabat et al., Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991) .

Utilizando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear atual pode conter menos ou mais aminoácidos correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Rabat) após o resíduo 52 de H2 e os resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Rabat) após o resíduo FR 82 de cadeia pesada. A numeração de Rabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Rabat "padrão". 0 sistema de numeração de Rabat é utilizado geralmente quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Rabat et ai., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1991) . O "sistema de numeração da UE" ou "índice UE" é utilizado geralmente quando se refere a um resíduo numa região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice UE reportado em Rabat et al. , supra; a região de charneira no domínio constante da cadeia pesada é aproximadamente os resíduos 216-230 (numeração da UE) da cadeia pesada) . O "índice UE como em Rabat" refere-se à numeração do resíduo do anticorpo IgGl humano UE. Salvo indicação em contrário no presente documento, referências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos significa numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Rabat. Salvo indicação em contrário no presente documento, referências a números de resíduo no domínio constante de anticorpos significa numeração de resíduos pelo sistema de numeração da UE (por exemplo, veja-se o Pedido Provisório dos Estados Unidos N.° 60/640.323,

Figuras para numeração da UE) .

Como utilizado no presente documento, "polipéptido" refere-se geralmente a péptidos e proteínas que têm mais de cerca de dez aminoácidos. Num exemplo, o polipéptido é uma proteína de mamífero, exemplos do qual incluem Fator D e fragmentos e/ou variantes de Fator D. Num outro exemplo, o polipéptido é um anticorpo de comprimento completo, ou fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), que liga o Fator D humano, exemplos do qual incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diabodies, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) .

Uma "variante" ou "variante de sequência de aminoácidos" de um polipéptido de partida é um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos diferente daquela dos polipéptidos de partida. Geralmente, uma variante possuirá pelo menos 80% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência e ainda mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipéptido nativo. A percentagem de identidade de sequência é determinada por exemplo, pela versão de Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80: 1382-1386 (1983), do algoritmo descrito por Needleman et al. , J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970), após alinhamento das sequências para proporcionar máxima homologia. Variantes da sequência de aminoácidos de um polipéptido podem ser preparadas introduzindo alterações de nucleótidos apropriadas no ADN que codifica o polipéptido, ou por síntese peptidica. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro da sequência de aminoácidos do polipéptido de interesse. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as caracteristicas desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-tradução do polipéptido, tais como alteração do número ou posição de locais de glicosilação. Métodos para gerar variantes de sequência de aminoácidos de polipéptidos são descritos no documento de Patente U.S. N.° 5.534.615, por exemplo.

Uma "variante de anticorpo" ou "anticorpo modificado" de um anticorpo de partida é um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos diferente daquela do anticorpo de partida, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos do anticorpo de partida foram modificados. Geralmente, uma variante de anticorpo possuirá pelo menos 80% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência e ainda mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência com o anticorpo de partida. A percentagem de identidade de sequência é determinada por exemplo, pela versão de Fitch et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 80: 1382-1386 (1983), do algoritmo descrito por Needleman et al. , J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970), após alinhamento das sequências do anticorpo de partida e da variante de anticorpo candidato para proporcionar máxima homologia. A identidade ou semelhança com respeito ao parental sequenciado é definida no presente documento como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência variante candidata que são idênticos (isto é, o mesmo resíduo) ou semelhantes (isto é, resíduo de aminoácido do mesmo grupo com base em propriedades comuns da cadeia lateral, ver abaixo) com os resíduos do anticorpo parental, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência. Variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas por introdução de alterações de nucleótidos apropriadas no ADN que codifica o anticorpo ou por síntese peptídica. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro da sequência de aminoácidos do anticorpo de interesse. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-tradução do polipéptido, tais como alteração do número ou posição de locais de glicosilação. Métodos para gerar variantes de sequência de aminoácidos de polipéptidos são descritos no documento de Patente U.S. N.° 5.634.615, por exemplo.

Uma variante "desamidada" de uma molécula de polipéptido é um polipéptido em que um ou mais resíduo (s) de asparagina (N ou Asn) do polipéptido original foram convertidos em aspartato (D ou Asp), ou seja, a cadeia lateral de amida neutra foi convertida num resíduo com um carácter global ácido. A desamidação pode ser prevenida pela conversão de asparaginas (N ou Asn) em glutamina (Q ou Gin) ou alanina (A ou Ala) ou serina (S ou Ser) (Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)).

Uma variante "oxidada" de uma molécula de polipéptido é um polipéptido em que um ou mais resíduo(s) de metionina (M ou Met) ou triptofano (W ou Trp) do polipéptido original foram convertidos em sulfona ou sulfóxido, através do enxofre da metionina. A oxidação pode ser prevenida através da conversão de metionina (M ou Met) em leucina (L ou Leu) ou isoleucina (I ou Ile) (Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)).

Uma variante de "piroglutamato" de uma molécula de polipéptido é um polipéptido em que os resíduos(s) de glutamina (Q ou Gin) do polipéptido original foram convertidos em piroglutamato que ocorre quando os resíduos de glutamina, por exemplo, resíduos de glutamina N-terminal, ciclizaram, de forma espontânea, resultando em piroglutamato. A conversão em piroglutamato pode ser prevenida através da conversão de resíduo (s) de glutamina (Q ou Gin) em glutamato (E ou Glu) (Amphlett, G. et al. , Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)). O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento completo, geralmente a região de ligação ao alvo ou variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab,)2 e Fv. A frase "fragmento ou análogo funcional" de um anticorpo é um composto que tem atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo de comprimento completo. Por exemplo, um fragmento ou análogo funcional de um anticorpo anti-Fator D humano é aquele que se pode ligar ao Fator D de tal modo que previna ou reduza substancialmente a ativação do complemento. Como utilizado no presente documento, "fragmento funcional" com respeito a anticorpos, refere-se a fragmentos Fv, F(ab) e F(ab')2· Um fragmento "Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um local de ligação e de reconhecimento do alvo completo. Esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e de uma cadeia leve numa associação estreita, não covalente (dímero VH-VL) . É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação a alvo sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a alvo ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um alvo) tem a capacidade de reconhecer e ligar-se ao alvo. Fragmentos de anticorpo de "Fv de cadeia simples" ou "sFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa cadeia simples de polipéptido. Geralmente, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligante de polipéptido entre os domínios VH e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada para ligação ao alvo. 0 fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de charneira do anticorpo. Os fragmentos F (ab') são produzidos por clivagem da ligação de dissulfido nas cisteínas de dobradiça do produto da digestão da pepsina de F(ab')2· Acoplamentos químicos adicionais de fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) são conhecidos dos peritos na especialidade.

Como utilizado no presente documento, "biblioteca" refere-se a uma pluralidade de sequências de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos (por exemplo, polipéptidos da invenção) ou ácidos nucleicos que codificam estas sequências, as sequências sendo diferentes na combinação de aminoácidos de variantes que são introduzidos nestas sequências de acordo com os métodos da invenção. 0 termo "anticorpo monoclonal" como utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local alvo. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra uma única determinante no alvo. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que podem ser sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. 0 modificador "monoclonal" indica ο caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser interpretado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para utilização com a presente invenção podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas bem conhecidas. Os anticorpos monoclonais parentais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos através do método do hibridoma descrito primeiramente por Kohler e Milstein, Nature 256, 495 (1975), ou podem ser feitos através de métodos recombinates.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao alvo) que contêm uma sequência mínima derivada a partir de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado pode também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de um modelo de imunoglobulina humana escolhido.

Os termos "célula", "linha celular" e "cultura celular" incluem a descendência. É também entendido que toda a descendência pode não ser exatamente idêntica em conteúdo de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Está incluída a descendência variante que tem a mesma função ou propriedade biológica, conforme rastreado na célula originalmente transformada. As "células hospedeiras" utilizadas na presente invenção são geralmente hospedeiros procarióticos ou eucarióticos. 0 termo "vetor" significa uma construção de ADN que contém uma sequência de ADN que está operacionalmente ligada a uma sequência de controlo adequada capaz de efetuar a expressão do ADN num hospedeiro adequado. Tais sequências de controlo incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar tal transcrição, uma sequência que codifica os sítios de ligação ao ribossoma de ARNm adequados, e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução. 0 vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula fágica ou simplesmente uma potencial inserção genómica. Uma vez transformado num hospedeiro adequado, o vetor pode replicar-se e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode, em alguns casos, integrar-se no próprio genoma. Na presente memória descritiva, "plasmídeo" e "vetor" são por vezes utilizados indistintamente, já que o plasmídeo é a forma mais comummente utilizada de vetor. No entanto, a invenção destina-se a incluir outras tais formas de vetores que servem uma função equivalente e que são, ou se tornam, conhecidas na técnica. A palavra "marcador" quando utilizada no presente documento refere-se a um composto ou composição detetável que pode ser conjugado direta ou indiretamente com uma molécula ou proteína, por exemplo, um anticorpo. 0 rótulo pode ser ele próprio detetável (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detetável.

Como utilizado no presente documento "fase sólida" significa uma matriz não aquosa à qual o anticorpo da presente invenção se pode aderir. Exemplos de fases sólidas abrangidas no presente documento incluem aquelas formadas parcial ou inteiramente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas formas de realização, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; noutras é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia de afinidade). "Exibição de fagos" é uma técnica pela qual polipéptidos variantes são exibidos como proteínas de fusão a pelo menos uma porção de proteína de revestimento sobre a superfície do fago, por exemplo, fagos filamentosos, partículas. Uma utilidade de exibição de fagos reside no facto de grandes bibliotecas de variantes de proteína randomizadas podem ser rápida e eficientemente classificadas para as sequências que se ligam a um antigénio alvo com afinidade elevada. A exibição de bibliotecas de péptidos e proteínas em fagos tem sido utilizada para rastrear em milhões de polipéptidos aqueles com propriedades de ligação específica. Métodos de exibição em fagos polivalentes têm sido utilizados para a exibição de pequenos péptidos aleatórios e pequenas proteínas, através de fusões quer ao gene III ou gene VIII de fago filamentoso. Wells e Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362 e referências aí citadas. Numa exibição em fagos monovalentes, uma biblioteca de proteínas ou péptidos é fundida a um gene III ou a uma porção do mesmo, e expressa em níveis baixos na presença da proteína do gene III do tipo selvagem, de modo que as partículas de fago exibam uma cópia ou nenhuma das proteínas de fusão. Os efeitos de avidez são reduzidos em relação ao fago polivalente, de modo que a classificação é com base na afinidade intrínseca do ligando, e vetores fagemideos são utilizados, o que simplifica as manipulações de ADN. Lowman e Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216.

Um "fagemídeo" é um vetor de plasmídeo tendo uma origem de replicação bacteriana, por exemplo, ColEl e uma cópia de uma região intergénica de um bacteriófago. 0 fagemideo pode ser utilizado em qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófagos filamentosos e bacteriófagos lambdoides. 0 plasmídeo conterá também, geralmente, um marcador selecionável para resistência aos antibióticos. Segmentos de ADN clonados nestes vetores podem ser propagados como plasmideos. Quando as células que abrigam estes vetores são proporcionadas com todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o modo de replicação do plasmídeo muda para replicação por círculo rolante para gerar cópias de uma cadeia do ADN de plasmídeo e empacotar partículas fágicas. 0 fagemideo pode formar partículas fágicas infeciosas ou não infeciosas. Este termo inclui fagemídeos que contêm um gene de proteína de revestimento do fago ou fragmento do mesmo ligado a um gene de polipéptido heterólogo como uma fusão génica de tal modo que o polipéptido heterólogo é exibido na superfície da partícula fágica.

Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma outra região Fc em virtude de pelo menos uma "modificação de aminoácidos", tal como definido no presente documento. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipéptido parental, por exemplo, desde cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente desde cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos numa região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipéptido parental. A região Fc variante no presente documento possuirá preferivelmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipéptido parental, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta. Exemplos de "regiões Fc humanas de sequência nativa" são mostrados na FIGURA 23 do documento WO 00/42072 e incluem uma região Fc delgGl humana de sequência nativa (alotipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas. São mostradas regiões Fc murinas de sequência nativa na FIGURA 22A do documento WO 00/42072.

De acordo com esta invenção, afinidade de ligação de FcRn "alterada" é aquela que tem atividade de ligação de FcRn aumentada ou diminuída comparada com um polipéptido parental ou com um polipéptido que compreende uma região Fc de sequência nativa. Num exemplo, o anticorpo com afinidade de ligação de FcRn alterada possui uma ligação aumentada a FcRn a pH 6,0 e/ou ligação diminuída a FcRn a pH 7,0. A variante que "exibe ligação aumentada" a um FcR liga-se a pelo menos um FcR com maior afinidade que o polipéptido parental. A variante que "exibe ligação diminuída" a um FcR liga-se a pelo menos um FcR com pior afinidade que um polipéptido parental. A variante que se liga a um FcR com "melhor afinidade" do que um polipéptido parental, é uma que se liga a um FcR com uma afinidade de ligação substancialmente melhor do que o anticorpo parental, quando as quantidades de variante de polipéptido e polipéptido parental no ensaio de ligação são essencialmente as mesmas. Por exemplo, a variante de polipéptido com afinidade de ligação a FcR melhorada pode apresentar uma melhoria de desde cerca de 1,15 vezes até cerca de 100 vezes, por exemplo, desde cerca de 1,2 vezes até cerca de 50 vezes na afinidade de ligação a FcR em comparação com o polipéptido parental, onde a afinidade de ligação a FcR é determinada.

Uma "modificação de aminoácidos" refere-se a uma alteração na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos predeterminada. Modificações exemplares incluem uma substituição, inserção e/ou deleção de um aminoácido. Um exemplo de uma modificação de aminoácidos no presente documento é uma substituição.

Uma "modificação de aminoácidos em" uma posição especificada, por exemplo, da região Fc, refere-se à substituição ou deleção dos resíduos especificados ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido adjacente do resíduo especificado. Pela inserção "adjacente" de um resíduo especificado entende-se a inserção dentro de um a dois dos resíduos do mesmo. A inserção pode ser N-terminal ou C-terminal relativamente ao resíduo especificado.

Uma "substituição de aminoácido" refere-se à substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente numa sequência de aminoácidos predeterminada com outro resíduo de aminoácido diferente de "substituição". 0 resíduo ou resíduos de substituição podem ser " resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente" (isto é, codificados pelo código genético) e selecionados a partir do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagirie (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gin); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly), histidina (His); isoleucina (Ile); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr) e valina (Vai) . A substituição com um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural é também abrangida pela definição de uma substituição de aminoácidos no presente documento. Um "resíduo de aminoácido de ocorrência não natural" refere-se a um resíduo, que não sejam os resíduos de aminoácidos enumerados acima que ocorrem naturalmente, que é capaz de se ligar covalentemente a resíduo(s) de aminoácidos adjacente (s) numa cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos, tais como os descritos em Ellman et al., Meth. Enzym, 202: 301-336 (1991). Para gerar tais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, podem ser utilizados os procedimentos de Noren et al., Science, 244:182 (1989) e Ellman et al., supra. Resumidamente, estes procedimentos envolvem a ativação química de um ARNt supressor com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural seguido por transcrição in vitro e tradução do ARN.

Uma "inserção de aminoácidos" refere-se à incorporação de pelo menos um aminoácido numa sequência predeterminada de aminoácidos. Enquanto a inserção irá consistir, geralmente, na inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, o presente pedido contempla "inserções de péptidos" maiores, por exemplo, inserção de cerca de três a cerca de cinco ou até cerca de dez resíduos de aminoácidos. 0(s) resíduo(s) inserido(s) pode(m) ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, como divulgado acima.

Uma "deleção de aminoácido" refere-se à remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido a partir de uma sequência de aminoácidos predeterminada. II. Descrição Detalhada São descritos no presente documento os antagonistas do Fator D, incluindo anticorpos anti-Fator D, e variantes dos mesmos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) úteis para a prevenção e tratamento de condições associadas ao complemento, incluindo condições oculares (todas as condições e doenças oculares cuja patologia envolve o complemento, incluindo as vias clássica e alternativa e em particular a via alternativa do complemento), tais como, por exemplo, doenças degenerativas da mácula, tais como todos os estádios de degeneração macular relacionada com a idade (AMD), que incluem as formas seca e húmida (não exsudativa e exsudativa), neovascularização coroideia (CNV), uveíte, retinopatias diabética e outras relacionadas com a isquemia, endoftalmite e outras doenças neovasculares intraoculares, tal como edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da córnea, e neovascularização da retina. Um grupo de condições oculares associadas ao complemento inclui degeneração macular relacionada com a idade (AMD), incluindo AMD não exsudativa (por exemplo, AMD intermediária seca ou atrofia geográfica (GA) e exsudativa) (por exemplo, AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)), retinopatia diabética (DR), endoftalmite e uveite. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD intermediária seca. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é atrofia geográfica. Num exemplo, a condição ocular associada ao complemento é AMD húmida (neovascularização coroideia (CNV)). A AMD é a degeneração macular relacionada com a idade, que é a principal causa de disfunção visual irreversível em indivíduos com idade superior a 60 anos. Existem dois tipos de AMD, AMD não exsudativa (seca) e exsudativa (húmida). A forma seca ou não exsudativa, envolve alterações atróficas e hipertróficas no epitélio pigmentado da retina (RPE) subjacente à retina central (mácula), bem como depósitos (drusas) no RPE. Pacientes com AMD não exsudativa podem progredir para a forma húmida ou exsudativa de AMD, em que vasos sanguíneos anormais chamados membranas neovasculares coroidais (CNVMs) se desenvolvem sob a retina; extravasam fluido e sangue e, finalmente, causam uma cicatriz disciforme que provoca cegueira, sobre e sob a retina. A AMD não exsudativa, que é geralmente um precursor de AMD exsudativa, é mais comum. A apresentação da AMD não exsudativa varia: podem estar presentes drusas duras, drusas moles, atrofia geográfica do RPE e aglomeração de pigmento. Em AMD componentes do complemento são depositados precocemente no RPE e são os principais constituintes das drusas. 1. Anticorpos anti-Fator D humanizados São descritas no presente documento a produção e utilização de anticorpos anti-Fator D humanizados e fragmentos dos mesmos. Métodos exemplares para gerar anticorpos são descritos com mais detalhe nas secções seguintes.

Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente retirados a partir de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et ai., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:823-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo CDRs ou sequências de CDRs de roedor pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Em conformidade, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (documento de Patente U.S. N.° 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são anticorpos tipicamente humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos a partir de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, para serem utilizados na preparação dos anticorpos humanizados pode, em alguns casos, ser importante para reduzir a antigenicidade e/ou resposta HAMA (anticorpo humano anti-ratinho) quando o anticorpo se destina a utilização terapêutica em seres humanos. A redução ou eliminação de uma resposta HAMA é geralmente um aspeto significante do desenvolvimento clinico de agentes terapêuticos adequados. Veja-se, por exemplo, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al. , J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., CancerRes. (1990), 50:1495. Como descrito no presente documento, a invenção proporciona anticorpos que são humanizados de tal modo que a resposta HAMA é reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ainda ser obtidas utilizando métodos de rotina conhecidos na técnica, alguns dos quais são adicionalmente descritos abaixo. De acordo com o denominado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada em relação a toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência do domínio V humano que está mais próxima da do roedor é identificada e a região estrutural (FR) humana no seu interior aceite para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutural particular derivada a partir da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma região estrutural pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

Por exemplo, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo como descrito no presente documento pode servir como um sequência de partida (parental) para a diversificação da(s) sequência (s) estrutural (ais) e/ou hipervariável(éis). Uma sequência estrutural selecionada à qual uma sequência hipervariável de partida está ligada é referida no presente documento como uma estrutura humana aceitadora. Enquanto as estruturas humanas aceitadoras podem ser de, ou derivadas de, uma imunoglobulina humana (as regiões VL e/ou VH das mesmas), as estruturas humanas aceitadoras podem ser de, ou derivadas de, uma sequência estrutural de consenso humana já que foi demonstrado que tais estruturas têm uma imunogenicidade mínima, ou ausente em paciente humanos. Uma "estrutura humana aceitadora" para os propósitos do presente documento é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura VL ou VH derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana, ou de uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura humana aceitadora "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma, ou pode conter alterações de sequência de aminoácidos preexistentes. Onde as alterações de aminoácidos preexistentes estão presentes, preferivelmente não mais do que 5 e preferivelmente 4 ou menos ou 3 ou menos, alterações de aminoácidos preexistentes, estão presentes. A estrutura humana aceitadora de VH pode ser idêntica em sequência com a sequência estrutural de imunoglobulina humana VL ou sequências de estrutura de consenso humana. A estrutura humana aceitadora VL pode ser idêntica em sequência com a sequência estrutural de imunoglobulina humana VL ou sequência estrutural de consenso humana. Uma "estrutura de consenso humana" é uma estrutura que representa o resíduo de aminoácido que ocorre mais vulgarmente numa seleção de sequências estruturais de imunoglobulina humana VL ou VH. Geralmente, a seleção de sequências de imunoglobulina humana VL ou VH é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Rabat et al.

Para a VL, o subgrupo pode ser o subgrupo capa I como em Rabat et al. Para a VH, o subgrupo pode ser o subgrupo III como em Rabat et al.

Onde o aceitador é derivado a partir de uma imunoglobulina humana, pode-se selecionar opcionalmente uma sequência estrutural humana que é selecionada com base na sua homologia com a sequência estrutural do dador, alinhando a sequência estrutural do dador com várias sequências estruturais humanas numa coleção de sequências estruturais humanas, e selecionar a sequência estrutural mais homóloga como a aceitadora. A estrutura aceitadora humana pode ser a partir de, ou derivada a partir de, sequências de linha germinal de anticorpo humano disponíveis nas bases de dados públicas.

Estruturas de consenso humanas podem ser a partir de, ou derivadas a partir de, sequências estruturais de consenso de subgrupo VII VH e/ou subgrupo capa I VL. 0 modelo estrutural humano utilizado para a geração de um anticorpo anti-Fator D pode compreender sequências estruturaos a partir de um modelo que compreende uma combinação de VI-4.1b+ (família VH7) e JH4d para a cadeia VH e/ou uma combinação de DPR4 (família VkI) e JR2 para a cadeia VL.

Como descrito no presente documento, a estrutura humana aceitadora de VH pode compreender uma, duas, três ou todas das seguintes sequências estruturais: FR1 que compreende QVQLVQSGPELRRPGASVRVSCRAS (aminoácidos 1-25 de SEQ. ID N.0 2), FR2 que compreende WVRQAPGQGLE (aminoácidos 36-49 de SEQ. ID N.0 2), FR3 que compreende RFVFSLDTSVSTAYLQISSLRAEDTAVYYCER (aminoácidos 67-98 de SEQ. ID N.° 2), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLRAEDTAVYYCE (aminoácidos 67-97 de SEQ. ID N.0 2), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLRAEDTAVYYC (aminoácidos 67-96 de SEQ. ID N.0 2) , RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS (SEQ. ID N.° 3), ou RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR (SEQ. ID N.° 4) FR4 que compreende WGQGTLVTVSS (aminoácidos 105-115 de SEQ. ID N.0 2).

Como descrito no presente documento, a estrutura humana aceitadora de VL pode compreender uma, duas, três ou todas das seguintes sequências estruturais: FR1 que compreende DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC (aminoácidos 1-23 de SEQ. ID N.0 1), FR2 que compreende WYQQKPGKVPKLLIS (aminoácidos 35-49 de SEQ. ID N.0 1).

FR3 que compreende GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (aminoácidos 57-88 de SEQ. ID N.° 1), FR4 que compreende FGQGTKLEIK (aminoácidos 98-107 de SEQ. ID N.° 1), ou FGQGTKVEIK (SEQ. ID N.° 5).

Enquanto o aceitador pode ser idêntico em sequência à sequência estrutural humana selecionada, quer seja de uma imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana, a sequência aceitadora pode compreender substituições de aminoácidos preexistentes em relação à sequência de imunoglobulina humana ou uma sequência estrutural de consenso humana. Preferivelmente estas substituições preexistentes são mínimas; normalmente apenas quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácidos em relação à sequência de imunoglobulina humana ou sequência estrutural de consenso.

Os resíduos de região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados nas estruturas aceitadoras humanas VL e/ou VH. Por exemplo, podem-se incorporar resíduos que correspondem aos resíduos de CDR de Rabat, os resíduos de ansa hipervariável de Chothia, os resíduos de Abm e/ou resíduos de contacto. Opcionalmente, os resíduos da região hipervariável estendida como se segue, são incorporados: 24-36 ou 24-34 (Ll), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 (L3), 26- 35B (Hl), 50-65, 47-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 2. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ. ID N.° 1. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 2 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ. ID N.° 1. Também é descrito no presente documento um fraqmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) .

Um anticorpo anti-Fator D pode compreender qualquer sequência de domínio variável estrutural adequada, desde que o anticorpo retenha a capacidade de se ligar ao Fator D. Por exemplo, os anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento compreendem uma sequência estrutural de domínio variável de cadeia pesada que é uma combinação de VI.4.1 b+ e JH4d (Veja-se a Figura 3) . Alguns anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento compreendem uma sequência de consenso estrutural de cadeia pesada de subgrupo VII humano. Alguns anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento compreendem uma sequência estrutural de domínio variável de cadeia pesada que compreende FR1 que compreende os aminoácidos 1-25 de SEQ. ID N.° 2, FR2 que compreende os aminoácidos 36-49 de SEQ. ID N.° 2, FR3 que compreende os aminoácidos 67-98 de SEQ. ID N.° 2 e FR4 que compreende os aminoácidos 105-115 de SEQ. ID N.° 2. A sequência de domínio variável de cadeia pesada compreende a(s) substituição (ões) na posição 40 e/ou 88 (numeração de Rabat) . A posição 40 é cisteína (C) ou alanina (A) e/ou a posição 88 é cisteína (C) ou alanina (A) . Alguns anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento compreendem uma sequência estrutural de domínio variável de cadeia leve que é uma combinação de DPK4 e JK2 (Veja-se a Figura 4). Alguns anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento compreendem uma sequência de consenso estrutural de cadeia leve Capa I (κΐ) humana. Alguns anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento compreendem uma sequência estrutural de domínio variável de cadeia leve que compreende FR1 que compreende os aminoácidos 1-23 de SEQ. ID N.° 1, FR2 que compreende os aminoácidos 35-49 de SEQ. ID N.° 1, FR3 que compreende os aminoácidos 57-88 de SEQ. ID N.° 1 e FR4 que compreende os aminoácidos 98-107 da SEQ. ID N.° 1. A sequência estrutural variável de cadeia leve pode compreender uma ou mais substituições na posição 15, 43 e/ou 104, (numeração de

Rabat). Numa forma de realização destes anticorpos, a posição 15 é cisteína (C) ou valina (V) , a posição 43 é cisteína (C) ou alanina (A) , a posição 104 é valina (V) ou leucina (L). Um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D é descrito no presente documento (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

Adicionalmente um anticorpo anti-Fator D pode compreender qualquer sequência de domínio constante apropriada, desde que o anticorpo mantenha a capacidade de se ligar ao Fator D. Por exemplo, em algumas formas de realização, os anticorpos anti-Fator D da invenção compreendem pelo menos uma porção de um domínio constante de cadeia pesada. Numa forma de realização, anticorpos anti-Fator D da invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada de uma ou de uma combinação de cadeia pesada α, δ, ε, γ, ou μ. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH) , as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que têm cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ e μ respetivamente. As classes γ e α estão adicionalmente divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores na sequência e função de CH, por exemplo, os seres humanos expressam as subclasses seguintes: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Numa forma de realização, os anticorpos anti-Fator D da invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada que compreende substituições nas posições de aminoácidos que resultam num efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Numa forma de realização, os anticorpos anti-Fator D da invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada que compreende substituições nas posições de aminoácidos que não resultam num efeito na função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Numa forma de realização, anticorpos anti-Fator D da invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada do tipo IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) e adicionalmente compreende uma substituição na posição 114 (numeração de Rabat, equivalente a 118 na numeração UE), 168 (numeração de Rabat, equivalente a 172 na numeração UE) , 172 (numeração de Rabat, equivalente a 176 na numeração UE) e/ou 228 (numeração UE). Numa forma de realização, anticorpos anti-Fator D da invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada do tipo IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) e compreendem ainda uma substituição na posição 114 em que a posição 114 é uma cisteína (C) ou alanina (A), a posição 168 é cisteína (C) ou alanina (A), a posição 172 é uma cisteína (C) ou alanina (a) e/ou a posição 228 é uma prolina (P), arginina (R) ou serina (S) . Num exemplo, a invenção proporciona um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

Adicionalmente, anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento podem compreender pelo menos uma porção de um domínio constante de cadeia leve. Anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento podem compreender um domínio constante de cadeia leve de uma ou de uma combinação de uma cadeia leve capa ou uma lambda, já que a cadeia leve de qualquer espécie vertebrada pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento podem compreender um domínio constante de cadeia leve que compreende substituições nas posições de aminoácidos que resultam num efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento podem compreender um domínio constante de cadeia leve que compreendem substituições nas posições de aminoácidos de que não resultam num efeito desejado sobre a função efetora (por exemplo, afinidade de ligação). Anticorpos anti-Fator D descritos no presente documento podem compreender um domínio constante de cadeia leve de tipo capa e adicionalmente compreender uma substituição na posição 110, 144, 146 e/ou 168 (numeração de Rabat) . Anticorpos anti-Fator D descritos no presente podem compreender um domínio constante de cadeia leve de tipo capa e adicionalmente compreender uma substituição na posição 110 em que 110 é uma cisteína (C) ou valina (V), na posição 144 em que 144 é uma cisteína (C) ou alanina (A) , na posição 146 em que 146 é uma isoleucina (I) ou valina (V) e/ou na posição 168 em que 168 é uma cisteína (C) ou serina (S) . Fragmentos dos ditos anticorpos anti-Fator D são descritos no presente documento (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). 2. Anticorpos anti-Fator D modificados A produção e utilização de anticorpos anti-Fator D modificados são descritas no presente documento, por exemplo, anticorpos anti-Fator D modificados humanizados, e variantes dos mesmos, e fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). Métodos exemplares para gerar anticorpos modificados são descritos com mais detalhe nas secções seguintes.

Um anticorpo anti-Fator D parental, que inclui um anticorpo anti-Fator D humanizado pode ser modificado para gerar anticorpos anti-Fator D modificados e variantes dos mesmos. Os anticorpos anti-Fator D modificados e variantes dos mesmos, podem propriedades físicas, químicas, biológicas ou de homogeneidade melhoradas em relação ao anticorpo parental. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

Um anticorpo como descrito no presente documento pode compreender uma ou mais alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) numa ou mais das regiões hipervariáveis do anticorpo parental. Em alternativa ou, adicionalmente, uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) de resíduos de região estrutural podem ser introduzidas no anticorpo parental. Exemplos de resíduos de região estrutural para modificar incluem aqueles que se ligam diretamente ao antigénio de forma não covalente (Amit et al. , (1986) Science, 233: 747-753); interagem com/afetam a confirmação de uma CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917) e/ou participam na interface VL-VH (EP 239 400B1). A modificação de um ou mais destes resíduos de região estrutural pode resultar numa melhoria da afinidade de ligação do anticorpo para o antigénio. Por exemplo, podem ser alterados desde cerca de um até cerca de 5 resíduos estruturais. Exemplos de resíduos de região estrutural ou HVR a modificar incluem locais, em que as modificações em tais locais resultam na geração de variantes desamidadas (por exemplo, resíduo (s) de asparagina (N ou Asn) modificado(s) para aspartato (D ou Asp) , variantes de oxidação (por exemplo, resíduo (s) de metionina (M ou Met) e/ou resíduo (s) de triptofano (W ou Trp) modificado(s) para sulfona ou sulfóxido) ou variantes de piroglutamato (por exemplo, resíduo(s) de glutamina (Q ou Gin) modificado (s) para piroglutamato) . Exemplos de resíduos de região estrutural ou resíduos de região HVR a modificar incluem possíveis locais de desamidação (isto é asparagina (N ou Asn)), locais de oxidação (isto é metionina (M ou Met) ou triptofano (W ou Trp)) ou locais de conversão de piroglutamato (isto é glutamina (Q ou Gin)), em que a modificação em tais locais previne a desamidação e/ou oxidação e/ou conversão em piroglutamato, respetivamente. Para impedir a formação de variantes desamidadas, asparagina (N ou Asn) pode ser mutada para alanina (A ou Ala) , glutamina (Q ou Gin) ou serina (S ou Ser). Para impedir a formação de variantes oxidadas, metionina (Met) ou triptofano (W ou Trp) podem ser mutados para leucina (L) ou isoleucina (I). Para impedir a formação de variantes de piroglutamato, glutamina (Q ou Gin) pode ser mutada em glutamato (E ou Glu) . (Amphlett, G. et ai., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)). Em alternativa, ou em adição, uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) de resíduos de região estrutural podem ser na região Fc no anticorpo parental. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

Um anticorpo como descrito no presente documento pode compreender uma região Fc variante de tal modo que a semivida do anticorpo in vivo é aumentada ou diminuída em relação ao anticorpo parental ou ao anticorpo que compreende uma região Fc de sequência nativa. O anticorpo pode compreender uma região Fc variante que aumenta ou diminui a afinidade de ligação do recetor Fc neonatal (FcRh) ao anticorpo (veja-se o documento W02000042072). Por exemplo, tal anticorpo pode compreender uma modificação de aminoácido em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311,312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 ou 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice UE como em Rabat. Tais variantes de polipéptido com ligação reduzida a um FcRn podem compreender uma modificação de aminoácido em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 ou 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice UE como em Rabat. As variantes de polipéptido acima mencionadas podem, em alternativa, apresentar ligação aumentada a FcRn e compreender uma modificação de aminoácido em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é a do índice UE como em Rabat. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região Fc variante que se liga com semivida in vivo aumentada em relação ao anticorpo parental ou ao anticorpo que compreende uma região Fc de sequência nativa. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região Fc variante que se liga com afinidade aumentada a FcRn em relação ao anticorpo parental ou ao anticorpo que compreende a região Fc de sequência nativa. A afinidade de ligação a FcRn pode ser medida como se segue: A ligação de anticorpos contra FcRn humano pode ser estudada por ressonância de plasmon de superfície utilizando, por exemplo, um aparelho BiaCore 3000. FcRn humano é acoplado a um chip sensor que utiliza um kit de acoplamento de amina. Por exemplo, um chip sensor CM5 pode ser ativado com EDC/NHS durante 7 min. a 5 μΐ/min. 100 pg/ml de FcRn humano pode ser injetado durante 30 seg. até 2 min. a uma taxa de fluxo de 10 μΐ/min. sobre o chip ativado para dar uma unidade de resposta de ligação final (RU) de 100 a 200. Após a conjugação, o chip acoplado a FcRn pode ser bloqueado por uma injeção de 35 μΐ de cloridrato de etanolamina a 1 M a 5 μΐ/min. A ligação de anticorpos a FcRn humano a pH 6,0 ou pH 7,4 pode ser determinada. O tampão de corrida para a experiência de ligação é PBS pH 6,0 ou pH 7,4 contendo P20 a 0,01% e azida de sódio a 0,02%. Os anticorpos podem ser trocados de tampão para tampão de corrida a pH 6,0 ou pH 7,4. As experiências podem ser realizadas a 25 °C. Para a corrida em pH 6,0, anticorpos com concentrações que variam desde 4 μΜ até 0,7 nM, são feitos fluir sobre um chip revestido de FcRn a 30 μΐ/min. durante 4 min. e em seguida são deixados a dissociar-se do chip durante 5 min. Para a corrida em pH 7,4, anticorpos com concentrações que variam desde 12 μΜ até 100 nM, são injetados sobre o chip revestido de FcRn a 20 μΐ/min. durante 1,5 min. e depois libertados durante 2 min. Os anticorpos são também feitos fluir sobre um ponto não conjugado no chip sensor para permitir a subtração de ligação não específica de fundo da ligação ao chip acoplado a FcRn. O chip pode ser regenerado com um pulso de 30 seg. de TRIS a 0,1 M, pH 8,3 entre as injeções. A RU de estado estacionário para cada injeção pode ser registada no final de cada fase de injeção e as constantes de dissociação (KD) são posteriormente calculadas traçando graficamente a RU de estado estacionário contra a concentração de injeção.

Um procedimento útil para gerar tais anticorpos modificados e fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) e variantes dos mesmos, é chamado "mutagénese de varrimento por alaninas" (Cunningham e Wells (1989) Science 244:1081-1085). Aqui, um ou mais do(s) resíduo (s) de região hipervariável é(são) substituído(s) por resíduo (s) de alanina ou polialanina para afetar a interação dos aminoácidos com o antigénio. Aquele(s) resíduos(s) da região hipervariável que demonstra(m) sensibilidade funcional às substituições é(são) então refinado(s) pela introdução de mais ou de outras mutações no, ou para os locais de substituição: Assim, embora o local para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita de ser predeterminada. Os mutantes de ala produzidos deste modo são rastreados quanto à sua atividade biológica (isto é, afinidade de ligação ou ensaio de hemólise) tal como descrito no presente documento.

Normalmente começar-se-ia com uma substituição conservadora tal como aquelas mostradas abaixo sob o titulo "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem numa alteração da atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação), então alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" no quadro seguinte, ou como adicionalmente descrito abaixo em referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos rastreados. As substituições preferidas estão enumeradas no quadro abaixo.

Modificações ainda mais substanciais nas propriedades biológicas dos anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) são alcançadas selecionando substituições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura da cadeia principal do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural dividem-se em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr, asn, gin; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

Como descrito no presente documento, os locais selecionados para modificação podem ser modificados e estas modificações com afinidade de ligação melhorada são seleccionadas por exibição em fagos.

Moléculas de ácidos nucleicos que codificam mutantes de sequência de aminoácidos ou sequências de aminoácidos modificadas são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou sítio-dirigida), mutagénese por PCR e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo parental. Um método para fazer sequências de aminoácidos mutantes ou variantes ou modificadas é a mutagénese sítio-dirigida (veja-se, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 82 : 488) . 0 anticorpo modificado pode ter apenas um único resíduo de região hipervariável substituído. Em alternativa, dois ou mais dos resíduos da região hipervariável do anticorpo parental terão sido substituídos, por exemplo, desde cerca de duas até cerca de dez substituições de regiões hipervariáveis. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

Normalmente, o anticorpo modificado terá uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade ou semelhança de sequência de aminoácidos (definida acima na secção Definições) com a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo parental, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos 95%. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditoss anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

Após a produção do anticorpo modificado, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação ao antigénio) é determinada a atividade biológica dessa molécula em relação ao anticorpo parental, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio). Como observado acima, isto pode envolver determinar a afinidade de ligação e/ou outras atividades biológicas da variante de anticorpo ou fragmento da mesma (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio). Como descrito no presente documento, um painel de anticorpos modificados ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) é preparado e rastreado quanto à afinidade de ligação para o antigénio tal como Fator D ou um fragmento do mesmo. Um ou mais dos anticorpos mutantes ou anticorpos modificados, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) selecionados a partir rastreio inicial são opcionalmente submetidos a um ou mais ensaios de atividade biológica adicionais para confirmar que a(s) variante(s) de anticorpo, ou fragmentos da(s) mesma(s) (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) são de facto úteis, por exemplo, para estudos pré-clínicos.

Os anticorpos anti-Fator D modificados, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) descritos no presente documento podem ser submetidos a modificações adicionais, muitas vezes, dependendo da utilização pretendida para o anticorpo modificado ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio). Tais modificações podem envolver a alteração adicional da sequência de aminoácidos, fusão com polipéptido(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes, tais como as elaboradas abaixo. No que diz respeito a alterações de sequência de aminoácidos, modificações exemplares são elaboradas acima. Por exemplo, qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo modificado também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a ligação cruzada aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv) . Outro tipo de aminoácido mutante tem um padrão de glicosilação alterado. Isto pode ser conseguido por deleção de uma ou mais frações de hidrato de carbono encontradas no anticorpo, e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos, ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de ligação a anténio) é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à ligação da fração de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da fração de hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. Glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser utilizadas. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que contêm uma ou mais das sequências tripeptídicas acima descritas (para locais de glicosilação ligados a N) . A alternância pode também ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligados a 0) . A invenção proporciona um anticorpo anti-Fator D modificado que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 19 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a SEQ. ID N.° 7.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 19. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 7. Também é descrito no presente documento um fragmento do dito polipéptido.

Num aspeto, a invenção proporciona um anticorpo anti-Fator D modificado em que o domínio de cadeia leve compreende a sequência de SEQ. ID N.° 61. Num outro aspeto, a invenção proporciona um anticorpo anti-Fator D modificado, em que o domínio de cadeia pesada compreende a sequência de SEQ. ID N.° 63. Num exemplo, a invenção proporciona um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) .

Num aspeto, a invenção proporciona um polipéptido que compreende a sequência de SEQ. ID N.° 61. Num outro aspeto, a invenção proporciona um polipéptido que compreende a sequência de SEQ. ID N.° 63. Também é descrito no presente documento um fragmento do dito polipéptido.

Num aspeto, a invenção proporciona um anticorpo anti-Fator D modificado de anti-Fator D humanizado n.° 111, em que o domínio de cadeia leve variável compreende a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 7 e em que o domínio de cadeia pesada variável domínio compreende a sequência SEQ. ID N.° 19. Num exemplo, a invenção proporciona um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

3. Afinidade e Atividade Biológica de Anticorpos anti-Fator D São descritos no presente documento anticorpos e variantes dos mesmos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio), que têm características identificadas no presente documento como sendo desejáveis num anticorpo anti-Fator D. Anticorpos e variantes dos mesmos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio), que têm características identificadas no presente documento como sendo desejáveis num anticorpo anti-Fator D, podem ser rastreadas quanto à atividade biológica inibidora, por exemplo in vitro ou in vivo ou por medição afinidade de ligação, a. Afinidade

Para determinar se um anticorpo anti-Fator D e variantes do mesmo ou fragmentos do mesmo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio), se ligam ao mesmo epitopo no Fator D humano ligado por um anticorpo de interesse (por exemplo, aqueles anticorpos que antagonizam a atividade do Fator D), um ensaio de bloqueio cruzado pode ser realizado (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988)) . Em alternativa, o mapeamento de epitopos pode ser realizado para determinar se um anticorpo anti-Fator D se liga a urn epitopo de interesse (Champe et al., J. Biol. Chem., 270:1388-1394 (1995). Afinidades de anticorpo, por exemplo, para o Fator D humano, podem ser determinadas utilizando métodos convencionais, incluindo os descritos no Exemplo 3. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D ou variantes de anticorpo dos mesmos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio), que competem com um anticorpo anti-Fator D murino e/ou clone de anticorpo anti-Fator D humanizado n.° 111 e/ou um anticorpo que compreende domínio variável ou sequências HVR de clone de anticorpo anti-Fator D humanizado n.° 111. Também são descritos anticorpos anti-Fator D ou variantes dos mesmos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) que se ligam ao mesmo epitopo que um anticorpo anti-Fator D murino e/ou clone de anticorpo anti-Fator D humanizado n.° 111, e/ou um anticorpo que compreende o domínio variável ou sequências HVR de clone de anticorpo anti-Fator D humanizado n.° 111. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D, ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade monovalente do anticorpo para Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um fragmento Fab para o Fator D) é menor, por exemplo, pelo menos 1 vez ou vezes menor que a afinidade monovalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um fragmento Fab para o Fator D) que compreende, consiste ou consiste essencialmente num domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-Fator D murino. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade bivalente do anticorpo para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é menor, por exemplo pelo menos 1 vez ou 2 vezes menor que a afinidade bivalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um IgG para o Fator D) , que compreende, consiste ou consiste essencialmente num domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-Fator D murino. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade monovalente do anticorpo para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é maior, por exemplo pelo menos 1 vez ou 2 vezes maior que a afinidade monovalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como um Fragmento Fab para o Fator D), que compreende, consiste ou consiste essencialmente num domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-Fator D murino. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-

Fator D ou variantes de anticorpo do mesmo, em que a afinidade bivalente do anticorpo para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é maior, por exemplo pelo menos 1 vez ou 2 vezes maior que a afinidade bivalente de um anticorpo quimérico (por exemplo, afinidade do anticorpo quimérico como uma IgG para o Fator D) , que compreende, consiste ou consiste essencialmente num domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-Fator D murino. Também é descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-

Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o

Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um

Fragmento Fab para o Fator D) é 20 nM (20xl0~9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o

Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um

Fragmento Fab para o Fator D) é 10 nM (10xl0~9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o

Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um

Fragmento Fab para o Fator D) é 1,0 nM (l,0xlCT9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D, ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o

Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um

Fragmento Fab para o Fator D) é 0,5 nM (0,5xl0~9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é 1,0 pM (1,0χ10~12 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é 0,5 pM (0,5xl0~12 M) ou melhor. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 10,0 nM (10,0xl0~9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 5,0 nM (5,0xlCT9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 1,0 nM (l,0xlCT9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 0,5 nM (0,5xl0~9 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 5,0 pM (5,0xl0~12 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 2,0 pM (2,0xl0~12 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 1,0 pM (1,0χ10~12 M) ou melhor. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é 0,5 pM (0,5xl0~12 M) ou melhor. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é entre 0,5 mM (0,5xl0~6 M) e 0,5 pM (0,5xl0~12 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é entre 15 nM (15xlCT9 M) e 0,1 nM (0,lxl0~9 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é entre 5,5 nM (5,5xlCT9 M) e 1 nM (lxlCT9 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é entre 0,5 pM (0,5xl0~12 M) e 2 pM (2xlCT12 M) . É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é entre 0,5 mM (0,5xlCT6 M) e 0,5 pM (0,5xlCT12 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variantes de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é entre 10 nM (lOxlCT9 M) e 0,05 nM (0,05xlCT9 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é entre 5,5 nM (5,5xlCT9 M) e 1 nM (lxlCT9 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é entre 0,5 pM (0,5xlCT12 M) e 2 pM (2xlCT12 M) . É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 1,4 pM (l,4xlCT12 M). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 1,1 pM (l,lx!CT12 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 0,19 nM (0,19xlCT9 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 0,08 nM (0,08xlCT9 M) . É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 12,3 nM (12,3xlCT9 M). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 9, 0 nM (90xlCT9 M) . Num exemplo, a invenção proporciona um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 1,4 pM (l,4xlCT12 M) +/-0,5. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 1,1 pM (l,lxlCT12 M) +/- 0,6. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente a Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um

Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 0,19 nM (0,19xl0~9 M) +/- 01. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 0,08 nM (0,08xl0~9 M) +/- 0,01. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 12,3 nM (12,3xlCT9 M) +/- 2. É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, em que a afinidade do anticorpo na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 9,0 nM (9,0xl0~9 M) +/- 1. Num exemplo, a invenção proporciona um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) .

Como descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, pode ter uma afinidade na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) de cerca de 1,4 pM (l,4xlCT12 M) +/- 2. Como descrito no presente documento, um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, pode ter uma afinidade na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) de cerca de 1,1 pM (l,lxlCT12 M) +/- 2. Como descrito no presente documento, um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, pode ter uma afinidade na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 0,19 nM (0,lxl0~9 M) +/- 2. Como descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, pode ter uma afinidade na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 0,08 nM (0,08xlCT9 M) +/- 2. Como descrito no presente documento, um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, pode ter uma afinidade na sua forma monovalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como um Fragmento Fab para o Fator D) é cerca de 12,3 nM (12,3xlCT9 M) +/- 2. Como descrito no presente documento, um anticorpo anti-Fator D ou variante de anticorpo do mesmo, pode ter uma afinidade na sua forma bivalente para o Fator D (por exemplo, afinidade do anticorpo como uma IgG para o Fator D) é cerca de 9,0 nM (9,0xlCT9 M) +/- 2. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio).

Como está bem estabelecido na técnica, a afinidade de ligação de um ligando ao seu recetor pode ser determinada utilizando qualquer de uma variedade de ensaios e expressa em termos de uma variedade de valores quantitativos. Em conformidade, como descrito no presente documento, a afinidade de ligação é expressa como valores de KD e reflete a afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com efeitos de avidez minimizados). Geralmente e preferivelmente, a afinidade de ligação é medida in vitro, quer num ambiente isento de células ou associado a células. Como descrito com maior detalhe no presente documento, a diferença de vezes da afinidade de ligação pode ser quantificada em termos da razão do valor de afinidade de ligação monovalente de um anticorpo humanizado (por exemplo, em forma Fab) e o valor de afinidade de ligação monovalente de um anticorpo de referência/comparador (por exemplo, em forma Fab) (por exemplo, um anticorpo murino tendo sequências de região hipervariável de dador) , em que os valores de afinidade de ligação são determinados sob condições de ensaio semelhantes. Assim, como descrito no presente documento, a diferença de vezes da afinidade de ligação é determinada como a razão dos valores de KD do anticorpo humanizado em forma Fab e dito anticorpo Fab de referência/comparador. Por exemplo, como descrito no presente documento, de um anticorpo da invenção (A) tem uma afinidade que é "3 vezes menor" que a afinidade de um anticorpo de referência (M), então, se o valor KD para A é 3x, o valor de KD de M seria lx e a razão de KD de A para KD de M seria de 3:1. Por outro lado, como descrito no presente documento, se um anticorpo (C) tem uma afinidade que é "3 vezes maior" que a afinidade de um anticorpo de referência (R), então se o valor de KD para C é lx, o valor de KD de R seria 3x, e a razão de KD de C para KD de R seria de 1:3. Qualquer de uma série de ensaios conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento, pode ser utilizado para obter medições de afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.

Adicionalmente, valores KD para um anticorpo como descrito no presente documento, podem variar dependendo das condições do ensaio particular utilizadas. Por exemplo, como descrito no presente documento, medições de afinidade de ligação podem ser obtidas num ensaio em que o Fab ou anticorpo está imobilizado e a ligação do ligando, isto é Fator D, é medida ou em alternativa, o ligando, isto é Fator D, para o Fab ou anticorpo está imobilizado e a ligação do Fab ou anticorpo é medida. Como descrito no presente documento as medições de afinidade de ligação podem ser obtidas num ensaio em que as condições de regeneração podem compreender (1) glicina a 10 mM ou MgCl2 a 4 M a pH 1,5 e (2) pH entre um pH de 1,0 e pH de 7,5, que inclui pH de 1,5, pH de 5,0, pH de 6,0 e pH de 7,2. Como descrito no presente documento, as medições de afinidade de ligação podem ser obtidas num ensaio em que as condições de ligação podem compreender (1) PBS ou solução salina tamponada com HEPES e (2) Polissorbato 20 (Tween-20 comercialmente), isto é Tween-20 a 0,1%. Como descrito no presente documento as medições de afinidade de ligação podem ser obtidas num ensaio em que a fonte do ligando, isto é, Fator D, pode ser a partir de fontes disponíveis comercialmente. Como descrito no presente documento as medições de afinidade de ligação podem ser obtidas num ensaio em que (1) o Fab ou anticorpo está imobilizado e a ligação do ligando, isto é Fator D é medida, (2) as condições de regeneração compreendem MgCÍ2 a 4 M a pH 7,2 e (3) as condições de ligação compreendem solução salina tamponada com HEPES, pH 7,2 que contém Tween-20 a 0,1%. Como descrito no presente documento as medições de afinidade de ligação podem ser obtidas num ensaio em que (1) o ligando, isto é, Fator D, está imobilizado e a ligação do Fab ou anticorpo é medida, (2) as condições de regeneração compreendem glicina a 10 mM a pH 1,5 e (3) as condições de ligação compreendem tampão PBS. b. Atividade Biológica

Para determinar se um anticorpo anti-Fator D ou variante ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação ao antigénio) é capaz de se ligar ao Fator D e exercendo um efeito biológico, por exemplo, inibição da hemólise pela via alternativa, podem ser usados ensaios de inibição hemolítica utilizando RBCs de coelho, incluindo os descritos no Exemplo 2. Tal inibição hemolítica pode ser determinada utilizando ensaios padrão (Kostavasili et al., J of Immunology, 158(4): 1763-72 (1997); Wiesmann et al.,

Nature, 444(7116): 159-60 (2006)). A ativação do complemento em tais ensaios pode ser iniciada com soro ou plasma. Concentrações apropriadas de Fator D no soro ou plasma (Pascual et al. , Kidney International, 34: 529-536 (1998); Complement Facts Book, Bernard J. Morley and Mark J. Walport, editores, Academic Press (2000); Barium et al., J. Immunol. Methods, 67: 303-309 (1984)) podem ser rotineiramente determinadas de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo aqueles que foram descritos nas referências tais como Pascual et al. , Kidney International, 34: 529-536 (1998) e Barnum et al. , J. Immunol. Methods, 67: 303-309 (1984) e Exemplo 4. São descritos no presente documento anticorpos capazes de inibir atividades biológicas associadas com o Fator D. Por exemplo, a uma concentração de 18 pg/ml (equivalente a cerca de 1,5 vezes a concentração molar de Fator D humano no sangue; razão molar de anticorpo anti-Fator D para Fator D de cerca de 1,5:1), pode ser observada uma inibição significativa da atividade alternativa do complemento pelo anticorpo (veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 6.956.107) . São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 inferiores a 30 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 inferiores a 15 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 inferiores a 10 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 inferiores a 5 nM. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 30 nM e 2 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 25 nM e 7 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 20 nM e 12 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 30 nM e 15 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 12 nM e 8 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 7 nM e 2 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores CI50 entre 6 nM e 3 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores CI50 entre 8 nM e 5 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores CI50 entre 5 nM e 2 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 10 nM e 5 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 8 nM e 2 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 7 nM e 3 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 entre 6 nM e 4 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor CI50 de cerca de 4,7 nM ± 0,6 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI50 de cerca de 6,4 nM ± 0,6 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-

Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI50 de cerca de 3,5 nM ± 0,5 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI50 de cerca de 4,4 nM ±1,5 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI50 de cerca de 10,2 nM ± 0,8 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-

Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI50 de cerca de 23,9 nM ± 5,0 nM. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio). São descritos no presente documento anticorpos anti-

Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 inferiores a 80 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 inferiores a 50 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 inferiores a 40 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 inferiores a 20 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI50 inferiores a 15 nM. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio). São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 entre 80 nM e 10 nM). São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI9o entre 75 nM e 15 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 entre 70 nM e 20 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI9o entre 65 nM e 25 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI9o entre 60 nM e 30 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 entre 55 nM e 35 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI9o entre 50 nM e 40 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 entre 80 nM e 70 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 entre 55 nM e 25 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com valores de CI90 entre 16 nM e 12 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI90 de cerca de 14,0 nM ± 1,0 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI90 de cerca de 38,0 nM ± 11,0 nM. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D, em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa com um valor de CI9o de cerca de 72,6 nM ± 4,8 nM. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio). É descrito no presente documento um anticorpo anti-Fator D ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) em que um fragmento Fab de tais anticorpos inibe a hemólise pela via alternativa numa razão molar de anticorpo para Fator D de cerca de 0,05:1 (0,05) a cerca de 10:1 (10) ou cerca de 0,09:1 (0,09) a cerca de 8:1 (8) ou cerca de 0,1:1 (0,1) a cerca de 6:1 (6) ou cerca de 0,15:1 (0,15) a cerca de 5:1 (5) ou cerca de 0,19:1 (0,19) a cerca de 4:1 (4) ou cerca de 0,2:1 (0,2) a cerca de 3:1 (3) ou cerca de 0,3:1 (0,3) a cerca de 2:1 (2) ou cerca de 0,4:1 (0,4) a cerca de 1:1 (1) ou cerca de 0,5:1 (0,5) a cerca de 1:2 (0,5) ou cerca de 0,6:1 (0,6) a cerca de 1:3 (0,33) ou cerca de 0,7:1 (0,7) a cerca de 1:4 (0,25) ou cerca de 0,8:1 (0,8) a cerca de 1:5 (0,2) ou cerca de 0,9:1 (0,9) a cerca de 1:6 (0,17) . É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) .

Numa forma de realização, a presente invenção inclui fragmentos de anticorpos anti-Fator D humanizados (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) . Os fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única, minibodies, diabodies, ou anticorpos multiespecificos formados de fragmentos de anticorpo. Numa forma de realização adicional, a invenção proporciona um fragmento de anticorpo anti-Fator D humanizado (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) que é capaz de penetrar substancialmente em toda a retina. Ainda noutra forma de realização adicional, a invenção proporciona um fragmento de anticorpo anti-Fator D humanizado (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) que é capaz de penetrar por toda a espessura total da retina. Num exemplo, a invenção proporciona um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) . São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D humanizados, em que um fragmento Fab de tais anticorpos tem uma semivida de pelo menos 3, 5, 7, 10 ou 12 dias após a administração no olho de um mamífero (por exemplo, ser humano) através de uma única injeção intravítrea. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D humanizados em que um fragmento Fab de tais anticorpos que inibe a ativação do complemento de via alternativa (AP) durante pelo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ou 115 dias após a administração no olho de um mamífero (por exemplo, ser humano) através de uma única injeção intravítrea. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D humanizados, em que a concentração de um fragmento Fab de tais anticorpos que inibe a ativação do complemento de via alternativa (AP) é mantida no tecido da retina durante pelo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85 dias após a administração no olho de um mamífero (por exemplo, ser humano) através de uma única injeção intravítrea. São descritos no presente documento anticorpos anti-Fator D humanizados, em que a concentração de um fragmento Fab de tais anticorpos que inibe a ativação do complemento de via alternativa (AP) é mantida no humor vítreo durante pelo menos 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ou 115 dias após a administração no olho de um mamífero (por exemplo, ser humano) através de uma única injeção intravítrea. É descrito no presente documento um fragmento dos ditos anticorpos anti-Fator D (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio).

GERAÇÃO DE ANTICORPOS

SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS Células hospedeiras são transfetadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem descritos no presente documento para a produção de anticorpos anti-Fator D e cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meio, temperatura, pH e semelhantes, podem ser selecionadas pelo perito na especialidade sem experimentação indevida. No geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas de células podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical

Approach, M. Butler, edição (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra . Métodos de transfeção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas, que significa a introdução de ADN no hospedeiro de modo que o ADN seja replicável, quer como um extracromossómico ou por integrante cromossómico, são conhecidos pelos peritos na especialidade, por exemplo, CaCl2, CaP04, mediada por lipossomas, polietilenoglicol/DMSO e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão apropriadas para tais células. 0 tratamento com cálcio utilizando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al, supra, ou eletroporação é geralmente utilizado para procariotas. A infeção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células de plantas, como descrito por Shaw et al. , Gene, 23:315 (1983) e no documento WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamífero sem estas paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspetos gerais de transfeções de sistemas de hospedeiro de células de mamífero foram descritos no documento de Patente U.S. N.° 4.399.216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J., Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A.), 76:3829 (1979). No entanto, também podem ser utilizados outros métodos para introduzir ADN em células, tais como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, por exemplo, polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de ADN nos vetores no presente documento, são para clonagem ou expressão de ADN nos vetores no presente documento, são células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores. Procariotas adequados para este fim incluem tanto organismos gram-negativos como gram-positivos, por exemplo, Enterobactérias tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia,

Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P divulgada no documento DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, Rhlzobia,

Vitreoscilla, Paracoccus, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras estirpes sejam adequadas tais como E. coli B, E. coli XI7 7 6 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido porque é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinante. Preferivelmente, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, estirpe W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, volume 2 (Washington, D.C.: American Society for

Microbiology, 1987), páginas 1190-1219; Depósito ATCC N.° 27.325) pode ser modificada para efectuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos destes hospedeiros incluindo E. coli W3110 estirpe 1A2, que possui o genótipo completo tonA; E. coli W3110 estirpe 9E4, que possui o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 estirpe 27C7 (ATCC 55.244), que possui o genótipo completo tonA ptr3phoA E15 (argF-lac) 169degPompTkanr; E. coli W3110 estirpe 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 estirpe 40B4 que é a estirpe 37D6 com uma mutação de deleção de degP não resistente a canamicina; E. coli W3110 estirpe 33D3 que tem o genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR (documento de Patente U.S. N.° 5.639.635) e uma estirpe de E. coli que tem protease periplasmática mutante, divulgada no documento de Patente U.S. N.° 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Outras estirpes e derivados das mesmas, tais como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308 (ATCC 31.608) também são adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas tendo genotipos definidos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bactérias apropriadas tendo em consideração a replicabilidade do replicão nas células de uma bactéria. Por exemplo, E. coli, Serratia ou espécies de Salmonella podem ser utilizadas como hospedeiro, quando plasmideos bem conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 são utilizados para fornecer o replicão. Tipicamente, a célula hospedeira deve segregar quantidades mínimas de enzimas proteoliticas e inibidores de protease adicionais podem desejavelmente ser incorporados na cultura de células. Em alternativa, são adequados métodos de clonagem in vitro, por exemplo, PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucleico.

Anticorpos de comprimento completo, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) e proteínas de fusão de anticorpo podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o imunocon jugado por si só mostra a eficácia na destruição de células de tumor. Anticorpos de comprimento completo têm uma maior semivida em circulação. A produção em E. coli é mais rápida e mais rentável. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipéptidos em bactérias, veja-se, por exemplo, os documentos U.S. 5.648.237 (Carter et al.), U.S. 5.789.199 (Joly et al.) e U.S. 5.840.523 (Simmons et al.) que descrevem a região de iniciação da tradução (TIR) e sequências de sinal para otimizar a expressão e secreção. Após expressão, o anticorpo é isolado da pasta celular de E. coli numa fração solúvel e pode ser purificado através de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser levada a cabo de forma semelhante ao processo para purificação do anticorpo expresso, por exemplo, em células CHO.

Além de procariotas, micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores de codificação de anticorpos. Saccharomyces cerevisiae é o mais vulgarmente utilizado entre os microrganismos hospedeiros eucariotas inferiores. No entanto, um número de outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são úteis no presente documento, tais como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; Candida; Trichoderma; Neurospora crassa e fungos filamentosos tais como, por exemplo, hospedeiros de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tais como A. nidulans e A. nigger. Leveduras metilotrópicas são adequadas no presente documento e incluem, mas não estão limitadas a, leveduras capazes de crescer em metanol selecionadas a partir dos géneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Em principio, qualquer cultura de células eucarióticas superiores é viável, seja cultura de vertebrados ou invertebrados. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de inseto, Luckow et ai, Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et ai.,

Genetic Engineering, Setlow et al. eds. Volume 8, páginas 277-279 (Plenam publishing 1986); Mseda et al., Nature 315, 592-594 (1985). Foram identificadas numerosas estirpes e variantes baculovirais e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes a partir de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de estirpes virais para transfeção estão disponíveis ao público, por exemplo, a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser utilizados como o vírus no presente documento de acordo a presente invenção, particularmente para transfeção de células de Spodoptera frugiperda. Além disso, culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também são utilizadas como hospedeiros.

As células de vertebrado e propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Veja-se Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, eds. (1973) . Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são rim de macaco; linha de rim embrionário humano; células de rim de hámster bebé; células de ovário de hamster Chinês/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho; células de carcinoma do colo do útero humano (HELA); células de rim canino; células de pulmão humano; células de fígado humano; tumor mamário de ratinho e células NSO.

Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, ou um fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação ao antigénio), o ácido nucleico (por exemplo, ADNc ou ADN genómico) que o codifica, é isolado e inserido num vetor replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. O ADN que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação ao antigénio) é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, por utilização de sondas oligonucleot ídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira a ser utilizada. Geralmente, as células hospedeiras preferidas são quer de origem procariótica ou eucariótica (geralmente de mamífero). 0 vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, ADN é inserido num ou mais sítios de endonuclease de restrição apropriados utilizando técnicas conhecidas na técnica. Componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais marcadores genéticos, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. Construção de vetores adequados contendo um ou mais destes componentes empregam técnicas de ligação padrão que são conhecidas pelo perito na especialidade. 0 Fator D pode ser produzido de modo recombinante não só diretamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipéptido que tem um sítio de clivagem especifico no N-terminal da proteína madura ou polipéptido. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do ADN que codifica o anticorpo anti-Fator D que é inserido no vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II termoestável. Para a secreção em leveduras a sequência de sinal pode ser, por exemplo, o líder de invertase de levedura, líder fator alfa (que inclui líderes de Fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces, este último descrito no documento de Patente U.S. N.° 5.010.182) ou líder de fosfatase ácida, líder de glucoamilase de C. albicans (documento EP 362.179 publicada em 4 de abril de 1990) ou o sinal descrito no documento WO 90/13646 publicado em 15 de novembro de 1990. Em expressão em células de mamífero, as sequências de sinal de mamífero podem ser utilizadas para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipéptidos segregados das mesmas espécies ou relacionadas, bem como líderes de secreção virais. Células hospedeiras são transformadas com os vetores acima descritos para produção de anticorpos e cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.

As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo ou variante de anticorpo ou fragmento (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do mesmo, desta invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios, a. Células Hospedeiras Procarióticas Células procarióticas utilizadas para produzir os polipéptidos da invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e adequados para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem o caldo luria (LB) mais os suplementos de nutrientes necessários. Opcionalmente, o meio também contém um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas que contêm o vetor de expressão. Por exemplo, a ampicilina é adicionada ao meio para crescimento de células que expressam o gene resistente a ampicilina.

Quaisquer suplementos necessários para além de carbono, azoto e fontes de fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidos sozinhos ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte complexa de azoto. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

As células hospedeiras procariotas são cultivadas a temperaturas adequadas. Para crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia entre cerca de 20 °C até cerca de 39 °C, mais preferivelmente desde cerca de 25 °C até cerca de 37 °C, ainda mais preferivelmente a cerca de 30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH no intervalo de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é preferivelmente de cerca de 6,8 a cerca de 7,4 e mais preferivelmente cerca de 7,0.

Se um promotor indutível é utilizado no vetor de expressão da invenção, a expressão da proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Num aspecto da invenção, os promotores PhoA são utilizados para controlar a transcrição dos polipéptidos. Em conformidade, as células hospedeiras transformadas são cultivadas num meio limitante de fosfato para indução. Preferivelmente, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (veja-se, por exemplo, Simmons et al, J. Immunol Methods (2002), 263:133-147). Pode ser utilizada uma variedade de outros indutores, de acordo com a construção de vetor empregue, tal como é conhecido na técnica

Como descrito no presente documento, os polipéptidos expressos podem ser secretados para, e recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente interrupção do microrganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, ultrassons ou lise. Uma vez que as células são interrompidas, fragmentos de células ou células completas podem ser removidas por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser ainda purificadas, por exemplo, por cromatografia de afinidade de resina. Em alternativa, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultura e nele isoladas. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante de cultura sendo filtrado e concentrado para posterior purificação das proteínas produzidas. Os polipéptidos expressos podem ser ainda isolados e identificados utilizando métodos geralmente conhecidos tais como electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio de Western blot.

Num aspeto da invenção, a produção de anticorpo é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação de alimentação de lote em larga escala estão disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Fermentações em grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, preferivelmente cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam impulsores agitadores para distribuir oxigénio e nutrientes, especialmente glucose (a fonte preferida de carbono/energia). A fermentação em pequena escala refere-se genericamente à fermentação num fermentador que não tem mais do que aproximadamente 100 litros de capacidade volumétrica, e pode variar desde cerca de 1 litro até cerca de 100 litros.

Num processo de fermentação, a indução da expressão de proteína é tipicamente iniciada depois das células terem sido cultivadas sob condições adequadas para uma densidade desejada, por exemplo, uma DO550 de cerca de 180-220, estádio em que as células estão na fase estacionária precoce. Pode ser utilizada uma variedade de indutores, de acordo com a construção de vetor empregue, tal como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmente induzidas durante cerca de 12-50 horas, embora maior ou menor tempo de indução possa ser utilizado.

Para melhorar o rendimento da produção e qualidade dos polipéptidos da invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para melhorar a montagem e dobramento correto dos polipéptidos dos anticorpos secretados, vetores adicionais que sobre-expressam proteínas chaperona, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis-trans isomerase com atividade chaperona) podem ser utilizados para co-transformar as células hospedeiras procarióticas. Tem sido demonstrado que proteínas chaperona facilitam o dobramento correto e solubilidade de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., documento de Patente U.S. N.° 6.083.715; Georgiou et al., documento de Patente U.S. N.° 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210 .

Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), certas estirpes hospedeiras deficientes em enzimas proteoliticas podem ser utilizadas para a presente invenção. Por exemplo, as estirpes de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética (s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações das mesmas. Algumas estirpes de E. coll deficientes em protease estão disponíveis e são descritas em, por exemplo, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., documento de Patente U.S. N.° 5.264.365; Georgiou et al. , documento de Patente U.S. N.° 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2 : 63-72 (1996) .

Como descrito no presente documento, as estirpes de E. coll deficientes em enzimas proteoliticas e transformadas com plasmideos que sobre-expressam uma ou mais proteínas chaperona podem ser utilizadas como células hospedeiras em sistemas de expressão, b. Células Hospedeiras Eucarióticas

Meios comercialmente disponíveis tais como Ham's, FIO (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para cultura de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al. , Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), documentos de Patente U.S. N.°s 4.767.704.; 4.687.866; 4.560.655; 5.122.469; 5.712.163 ou 6.048.728 podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloretos de X, em que X é sódio, cálcio, magnésio e fosfato) , tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco GENTAMICINA), elementos residuais (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na gama micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para o perito na especialidade .

PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

Formas de anticorpos anti-Fator D, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou a partir de lisados de células hospedeiras. Se estiverem ligados à membrana, podem ser libertados da membrana utilizando uma solução detergente adequada (por exemplo Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. Células empregues na expressão de anticorpo anti-Fator D podem ser interrompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, sonicação, rutura mecânica ou agentes de lise celular.

Pode ser desejável purificar o anticorpo anti-Fator D a partir de proteínas ou polipéptidos celulares recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação adequados: por fracionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; cromatograf ia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de Sefarose proteína A para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes de metal para ligar formas marcadas com epítopo do anticorpo anti-Fator D. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregues e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);

Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,

Springer-Verlag, Nova Iorque (1982). A(s) etapas(s) de purificação selecionada (s) irá(ão) depender, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do anticorpo anti-Fator D particular produzido.

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) do mesmo, pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado para o meio. Se o anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do mesmo, for produzido intracelularmente, como primeira etapa, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et ai., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são secretados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30 minutos. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do mesmo é secretado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente concentrados primeiro utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer das etapas que se seguem para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxiapatita, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo uma técnica de purificação. A adequabilidade da proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do mesmo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas de IgGl, IgG2 ou IgG4 humanas (Lindmark et al. , J. Immunol Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para IgG3 humana (Guss et al.r EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual o ligando de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli (estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que os alcançados com agarose. Quando o anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABXTM (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fracionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia em heparina, cromatografia com SEPHAROSE™ sobre uma resina de permuta catiónica ou aniónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio estão também disponíveis dependendo do anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do mesmo a ser recuperado.

Após qualquer uma das etapas de purificação preliminares, a mistura compreendendo o anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do mesmo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica a pH baixo utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmente realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, desde cerca de 0-0,25 M de sal).

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

Formulações terapêuticas do polipéptido ou anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), ou variante de anticorpo do mesmo, podem ser preparadas para armazenamento como formulações liofilizadas ou soluções aquosas através da mistura do polipéptido tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais "farmaceuticamente aceitáveis", tipicamente empregues na técnica (todos os quais são denominados "excipientes"). Por exemplo, agentes de tamponamento, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes não iónicos, antioxidantes e outros aditivos diversos. (Veja-se Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, A. Osol, Ed. (1980)). Tais aditivos devem ser não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações empregues.

Agentes de tamponamento ajudam a manter o pH no intervalo que se aproxima de condições fisiológicas. Eles estão preferivelmente presentes numa concentração que varia desde cerca de 2 mM até cerca de 50 mM. Agentes de tamponamento adequados para utilização com a presente invenção incluem ambos os ácidos orgânicos e inorgânicos e sais dos mesmos, tais como tampões de citrato (por exemplo, mistura de citrato monossódico-citrato dissódico, mistura de ácido cítrico-citrato trissódico, mistura de ácido cítrico-citrato monossódico, etc.), tampões de succinato (por exemplo, mistura de ácido succínico-succinato monossódico, mistura de ácido succínico-hidróxido de sódio, mistura de ácido succínico-succinato dissódico, etc), tampões de tartarato (por exemplo, mistura de ácido tartárico-tartarato de sódio, mistura de ácido tartárico-tartarato de potássio, mistura de ácido tartárico-hidróxido de sódio, etc.), tampões de fumarato (por exemplo, mistura de ácido fumárico-fumarato monossódico, etc.), tampões de fumarato (por exemplo, mistura de ácido fumárico-fumarato monossódico, mistura de ácido fumárico-fumarato dissódico, mistura de fumarato monossódico-fumarato dissódico, etc.), tampões de gluconato (por exemplo, mistura de ácido glucónico-gluconato de sódio, mistura de ácido glucónico-hidróxido de sódio, mistura de ácido glucónico- gluconato de potássio, etc.), tampão de oxalato (por exemplo, mistura de ácido oxálico-oxalato de sódio, mistura de ácido oxálico-hidróxido de sódio, mistura de ácido oxálico-oxalato de potássio, etc.), tampões de lactato (por exemplo, mistura de ácido lático-lactato de sódio, mistura de ácido lático-hidróxido de sódio, mistura de ácido lático-lactato de potássio, etc.) e tampões de acetato (por exemplo, mistura de ácido acético-acetato de sódio, mistura de ácido acético-hidróxido de sódio, etc.). Além disso, podem mencionar-se tampões de fosfato, tampões de histidina e sais de trimetilamina tais como Tris.

Conservantes podem ser adicionados para retardar o crescimento microbiano, e podem ser adicionados em guantidades gue variam entre 0,2%-l% (p/v). Conservantes adequados para utilização com a presente invenção incluem fenol, álcool benzilico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, halogenetos de benzalcónio (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de hexametónio, alquilparabenos tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol e 3-pentanol.

Isotonificantes, por vezes conhecidos como "estabilizadores", podem ser adicionados para assegurar a isotonicidade das composições liquidas da presente invenção e incluem álcoois de açúcar poli-hidricos, preferivelmente trihidricos ou álcoois de açúcares superiores, tais como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.

Estabilizadores referem-se a uma vasta categoria de excipientes que podem variar em função desde um agente de volume até um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a evitar desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Estabilizadores típicos podem ser álcoois de açúcar poli-hídricos (enumerados acima); aminoácidos tais como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc, açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar tais como lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e semelhantes, incluindo ciclitóis tais como inositol; polietilenoglicol; polímeros de aminoácidos; agentes redutores contendo enxofre, tais como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, alfa-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; polipéptidos de baixa massa molecular (isto é, <10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro humano, albumina de soro bovino, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como por exemplo monossacarídeos de polivinilpirrolidona, tais como xilose, manose, frutose, glicose; dissacarideos tais como lactose, maltose, sacarose e trissacarídeos tais como rafinose; polissacarídeos tais como dextrano. Os estabilizadores podem estar presentes no intervalo de peso de 0,1 a 10.000 por parte de peso de proteína ativa.

Tensioativos ou detergentes não iónicos (também conhecidos como "agentes humectantes") podem ser adicionados para ajudar a solubilizar o agente terapêutico bem como para proteger a proteína terapêutica contra a agregação induzida por agitação, o que também permite que a formulação seja exposta a tensão de cisalhamento superficial sem causar a desnaturação da proteína. Tensioativos não iónicos adequados incluem polissorbatos (20, 80, etc.), polioxameros (184, 188, etc.) Pluronic.RTM. polióis, monoéteres de polioxietileno-sorbitano (Tween. RTM.-20, Tween.RTM.-80, etc.). Os tensioativos não iónicos podem estar presentes num intervalo de cerca de 0,05 mg/ml até cerca de 1,0 mg/ml, preferivelmente cerca de 0,07 mg/ml até cerca de 0,2 mg/ml.

Excipientes diversos adicionais incluem agentes de volume (por exemplo, amido), agentes quelantes (por exemplo, EDTA), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) e co-solventes. A formulação no presente documento pode também conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não se afetem adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente um agente imunossupressor. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Os ingredientes ativos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respetivamente, em sistemas coloidais de distribuição de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, A. Osal, Ed. (1980) .

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo têm de ser estéreis. Isto é facilmente conseguido, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Preparações de libertação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo ou variante ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) dos mesmos, em que as matrizes estão sob a forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , ou álcool polivinílico, poliláctidos (documento de Patente U.S. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D- (-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando encapsulados os anticorpos permanecem no corpo durante um longo tempo, podem desnaturar ou agregar como resultado de exposição a humidade a 37° C, resultando numa perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planeadas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de permuta de tio-dissulfureto, a estabilização pode ser conseguida modificando resíduos de sulfidrilo, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de humidade, utilizando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matriz de polímeros específicas.

Os compostos da invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença ou condição ocular são tipicamente administrados por injeção ocular, intraocular, e/ou intravitrea e/ou injeção justaescreral e/ou injeção subtenoniana e/ou injeção supracoroidal e/ou administração tópica sob a forma de gotas e/ou pomada. Tais compostos da invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos, por exemplo, por via intravitrea como um dispositivo e/ou um depósito que permite a libertação lenta do composto para dentro do humor vítreo, incluindo os descritos em referências tais como Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton e Pearson, editores, Taylor & Francis (março de 2006) . Num exemplo, um dispositivo pode ter a forma de uma minibomba e/ou uma matriz e/ou urn sistema de difusão passiva e/ou células encapsuladas que libertam o composto durante um período de tempo prolongado (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton e Pearson, editores, Taylor & Francis (março de 2006). Também podem ser utilizados outros métodos de administração, o que inclui, mas não está limitado a, tópica, parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal e a administração intralesional. Infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea.

Formulações para administração ocular, intraocular ou intravítrea podem ser preparadas por métodos e utilizando ingredientes conhecidos na técnica. A principal exigência para tratamento eficiente é a penetração apropriada através do olho. Ao contrário de doenças da parte frontal do olho, em que o fármaco pode ser entregue por via tópica, doenças da retina requerem uma abordagem mais específica do local. Gotas para os olhos e pomadas raramente penetram na parte posterior do olho, e a barreira hemato-ocular impede a penetração de fármacos administrados por via sistémica no tecido ocular. Consequentemente, normalmente o método de eleição para a administração de fármacos para tratar doenças da retina, tais como AMD e CNV, é a injeção direta intravítrea. Injeções intravítreas são geralmente repetidas em intervalos que dependem da condição do paciente, e das propriedades e semivida do fármaco entregue. Para penetração intraocular (por exemplo, intravítrea), geralmente são preferidas moléculas de tamanho menor. A eficácia do tratamento de condições oculares associadas ao complemento, tais como AMD ou CNV, pode ser medido por vários parâmetros vulgarmente utilizados na avaliação de doenças intraoculares. Por exemplo, a perda de visão pode ser avaliada. A perda de visão pode ser avaliada por, mas não se limitando a, por exemplo, medindo pela alteração média na melhor correção de acuidade visual (BCVA) da linha de base num instante desejado (por exemplo, onde BCVA é baseada no Estudo de Tratamento Precoce de Retinopatia Diabética (ETDRS) da tabela de acuidade visual e avaliação numa distância de ensaio de 4 metros), medindo a proporção de sujeitos que perdem menos de 15 letras na acuidade visual num instante desejado em relação à linha de base, medindo a proporção de sujeitos que ganham mais ou igual a 15 letras na acuidade visual num instante desejado em relação à linha de base, medindo a proporção de sujeitos com uma acuidade visual de Snellen equivalente a 20/2000 ou pior a um instante desejado, medindo Questionário da Função Visual do NE I, medindo o tamanho de CNV e quantidade de extravasamento de CNV num instante desejado, por exemplo, por angiografia com fluoresceina, etc. Avaliações oculares podem ser feitas, por exemplo, que incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, realização de exame ocular, medição da pressão intraocular, avaliação da acuidade visual, medição da pressão com lâmpada de fenda, avaliação de inflamação intraocular, etc. A quantidade de polipéptido, anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo terapêutico (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) que será eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição particular dependerá da natureza do distúrbio ou condição, e pode ser determinada por técnicas clinicas padrão. Quando possível, é desejável determinar a curva de resposta à dose e as composições farmacêuticas da invenção, primeiro in vitro e depois em sistemas de modelos animais úteis antes de se testar em seres humanos.

Uma solução aquosa de polipéptido, anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo terapêutico (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), pode ser administrada por injeção subcutânea. Em alternativa, uma solução aquosa de polipéptido, anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo terapêutico (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) pode ser administrada por injeção intravítrea. Cada dose pode variar entre cerca de 0,5 yg a cerca de 50 yg por quilograma de peso corporal, ou mais preferivelmente, entre cerca de 3 yg a cerca de 30 yg por quilograma de peso corporal. O regime de dosagem para administração subcutânea pode variar na forma de uma vez por mês a diariamente dependendo de um número de fatores clínicos, incluindo o tipo de doença, gravidade da doença e a sensibilidade do sujeito ao agente terapêutico.

Os exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de nenhuma maneira.

ARTIGOS DE FABRICO E KITS É descrito no presente documento um artigo de fabrico que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de condições que são alvo dos anticorpos da invenção ou variantes dos mesmos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) : Por exemplo, é descrito no presente documento um artigo de fabrico que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de distúrbios associados ao complemento. O artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre, ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos para injetáveis, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente possui uma composição que é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição associada ao complemento e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco para solução intravenosa ou um frasco para injetáveis possuindo uma rolha perfurável por uma agulha para injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-Fator D ou um fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) . 0 rótulo ou folheto informativo indica que a composição é útil para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de uma condição particular.

Folheto informativo refere-se a instruções habitualmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos sobre o uso de tais produtos terapêuticos. Tal como descrito no presente documento, o rótulo ou folheto informativo indica que a composição é utilizada para o tratamento de distúrbios associados ao complemento, tais como, por exemplo, qualquer uma das condições enumeradas antes, incluindo por exemplo, distúrbios oculares, por exemplo, degeneração macular relacionada com a idade (AMD). 0 rótulo ou folheto informativo compreenderá ainda instruções para a administração da composição de anticorpo ao paciente.

Adicionalmente, o artigo de fabrico pode compreender ainda um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Também são proporcionados kits que são úteis para vários fins, por exemplo, para o tratamento, prevenção e/ou

diagnóstico de distúrbios associados ao complemento, para ensaios de hemólise associada ao complemento, para purificação ou imunoprecipitação de polipéptido de Fator D a partir de células. Para isolamento e purificação do polipéptido de Fator D, o kit pode conter um anticorpo anti-Fator D acoplado a esferas (por exemplo, esferas de sefarose) . Podem ser proporcionados kits que contenham anticorpos para a deteção e quantificação de polipéptido de Factor D in vitro, por exemplo, num ELISA ou um Western blot. Tal como acontece com o artigo de fabrico, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre, ou associado com o recipiente. 0 recipiente contém uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-Fator, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) da invenção. Recipientes adicionais podem ser incluídos que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controlo. 0 rótulo ou folheto informativo pode proporcionar uma descrição da composição bem como instruções para a utilização in vitro ou de deteção pretendida. 0 rótulo ou folheto informativo pode proporcionar instruções para a administração (por exemplo, do anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) a um sujeito. UTILIZAÇÕES PARA O ANTICORPO HUMANIZADO

Os anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) ou variante dos mesmos, da presente invenção são úteis em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para detetar expressão de um alvo de interesse em células específicas, tecidos, ou soros. Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), será tipicamente marcado com uma fração detetável. Numerosos marcadores estão disponíveis. Técnicas para quantificar uma mudança na fluorescência são descritas acima. 0 substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimioluminómetro, por exemplo) ou doa energia a um recetor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; documenti de Patente U.S. N.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionos, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glucose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes. As técnicas para conjugação de enzimas a anticorpos estão descritas em O'Sullivan et al., Methods for the Preparation de Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Edição J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nova Iorque, 73: 147-166 (1981).

Por vezes, o marcador é conjugado indiretamente com o anticorpo ou variante de anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) . 0 perito na especialidade estará ciente das diversas técnicas para atingir isto. Por exemplo, o anticorpo ou variante de anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), pode ser conjugado com biotina e qualquer das três amplas categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugada com avidina, ou vice-versa. A biotina liga-se seletivamente a avidina e assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) desta maneira indireta. Em alternativa, para conseguir a conjugação indireta do marcador com o anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), o anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) é conjugado com um hapteno pequeno (por exemplo digloxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com o anticorpo anti-hapteno da técnica, ou variante de anticorpo do mesmo (por exemplo, anticorpo anti-digloxina) ou fragmento do mesmo (por exemplo, o antigénio de ligação a fragmento). Assim, a conjugação indireta do marcador com o anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), pode ser alcançada. 0 anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), não necessita de ser marcado e a presença do mesmo pode ser detetada utilizando um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio).

Os anticorpos ou variantes de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) da presente invenção podem ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios de tipo sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Ensaios de ligação competitiva assentam na capacidade de um padrão marcado competir com a amostra de teste pela ligação com uma quantidade limitada de anticorpo, ou variantes de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio). A quantidade de alvo na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, os anticorpos são geralmente insolubilizados antes ou após a competição. Como resultado, as amostras padrão e de teste que estão ligadas aos anticorpos podem ser convenientemente separadas das amostras padrão e de teste que permanecem não ligadas.

Os ensaios de tipo sanduíche envolvem a utilização de dois anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio), cada um capaz de se ligar a uma porção imunogénica diferente, no epitopo ou proteína a ser detetada. Num ensaio do tipo sanduíche, a amostra de ensaio a analisar está ligada por um primeiro anticorpo que está imobilizado num suporte sólido, e depois um segundo anticorpo liga-se à amostra de teste, formando assim um complexo de três partes insolúvel. Veja-se, por exemplo, o documento de Patente U.S. N.° 4.376.110. O segundo anticorpo pode ele próprio ser marcado com uma fração detetável (ensaios de tipo sanduíche diretos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que está marcado com uma fração detetável (ensaio de tipo sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio de tipo sanduíche é um ensaio ELISA, caso em que a fração detetável é uma enzima.

Para imunohistoquímica, a amostra de tumor pode ser fresca ou congelada ou pode estar embebida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.

Os anticorpos ou variantes de anticorpo dos mesmos, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) podem também ser utilizados para ensaios de diagnóstico in vivo. Geralmente, o anticorpo ou variantes de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), é marcado com um radionucleótido (tal como .sup.lll In, .sup.99 Tc, .sup.14 C, .sup.131 I, sup.3. H, .sup.32 P ou .sup.35 S) de modo a que o tumor possa ser localizado utilizando imunoscintigrafia. Por exemplo, um anticorpo anti-IgE de alta afinidade da presente invenção pode ser utilizado para detetar a quantidade de IgE presente em, por exemplo, os pulmões de um paciente asmático. 0 anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) da presente invenção pode ser proporcionado num kit, ou seja, combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para executar o ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo ou variantes de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), está marcado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detetável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser amplamente variadas para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que em dissolução proporcionarão uma solução reagente que possuindo a concentração apropriada.

UTILIZAÇÕES IN VIVO PARA O ANTICORPO É contemplado que os anticorpos, ou anticorpos dos mesmos, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) da presente invenção podem ser utilizados para tratar um mamífero. Descrito no presente documento, o anticorpo ou anticorpo do mesmo, é administrado a um mamífero não humano para fins de obtenção de dados pré-clínicos, por exemplo. Mamíferos não humanos exemplares a serem tratados incluem primatas não humanos, cães, gatos, roedores e outros mamíferos em que são realizados estudos pré-clínicos. Tais mamíferos podem ser modelos animais estabelecidos para uma doença a ser tratada com o anticorpo ou anticorpo do mesmo, ou podem ser utilizados para estudar a toxicidade do anticorpo de interesse. Estudos de escalonamento de dose podem ser realizados no mamífero. 0 anticorpo, ou variante do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) ou polipéptido é administrado por qualquer meio adequado, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento imunossupressor local, administração intralesional. Infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio), é adequadamente administrado por infusão pulsada, particularmente com doses decrescentes do anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio). Preferivelmente a dosagem é dada por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crónica.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) ou polipéptido dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapêutica anterior, do historial clínico e da resposta ao anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) do paciente e do critério do médico assistente.

Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 0,1 mg/kg a 150 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) é uma dosagem de partida candidata para administração ao paciente, quer, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão continua. Uma dosagem diária típica pode estar no intervalo desde cerca de 1 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapêutica é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais. Um regime de dosagem exemplar está descrito no documento WO 94/04188.

As composições de anticorpos podem ser formuladas, doseadas e administradas de um modo consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o programa de administração e outros fatores conhecidos dos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) a ser administrada será regida por tais considerações e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou distúrbio. O anticorpo ou variante de anticorpo do mesmo ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação ao antigénio) não tem de ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes correntemente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo, ou variante de anticorpo do mesmo, ou fragmento do mesmo (por exemplo, fragmento de ligação a antigénio) presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração anteriormente utilizadas ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregues até agora.

Os anticorpos, ou variantes de anticorpo dos mesmos, ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) da presente invenção que reconhecem o Fator D como o seu alvo podem ser usados para tratar distúrbios mediados por complemento. Estes distúrbios estão associados à ativação excessiva ou descontrolada do complemento. Incluem: a ativação do complemento durante operações de bypass cardiopulmonar; ativação do complemento devido a reperfusão-isquemia após enfarte agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão traumática, falência múltiorgânica, choque hipovolémico e isquemia intestinal. Estes distúrbios também podem incluir doença ou condição que é uma condição inflamatória tais como queimaduras graves, endotoxemia, choque séptico, sindrome da dificuldade respiratória do adulto, hemodiálise; choque anafilático, asma grave, angioedema, Doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica e pancreatite. 0 distúrbio pode ser o resultado de uma reação adversa a fármaco, alergia a fármaco, sindrome de extravasamento vascular induzido por IL-2 ou alergia a meios de contraste radiográfico. Também inclui doença autoimune tal como lúpus eritematoso sistémico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla. A ativação do complemento também está associada com a rejeição de transplantes. Recentemente foi demonstrado haver uma forte correlação entre a ativação do complemento e doenças oculares tais como degeneração macular relacionada com a idade, retinopatias diabética e outras relacionadas com a isquemia, neovascularização coroideia (CNV), uveíte, edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação. Reagentes disponíveis comercialmente referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, salvo indicação em contrário. A fonte das células nos exemplos seguintes, e ao longo da descrição, foi identificada pelos números de acesso da ATCC que é a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 .

Exemplo 1: Modificação de Abs Anti-Fator D

Para identificar anticorpos anti-Fator D modificados, ou variantes dos mesmos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio) que teriam características comercialmente desejáveis, tais como a homogeneidade durante fabrico e produção ou para fins de caracterização analítica, uma abordagem de mutagénese sítio-dirigida foi utilizado para gerar anticorpos anti-Fator D humanizados modificados e variantes dos mesmos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a antigénio). Em primeiro lugar, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 (SEQ. ID N.° 2 e SEQ. ID N.° 1, respetivamente) foram subclonados num plasmídeo de expressão. Em segundo lugar, os oligonucleótidos que codificam para mutações simples foram emparelhados com o plasmídeo de expressão resultante para introduzir as mutações sítio-dirigidas.

Inicialmente, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 foram subclonados no plasmídeo pAEPl (pAEPl é um plasmídeo para a expressão de anticorpos Fab em E. coli.), com a subclonagem resultando na introdução de uma valina (V) na posição 104 (de acordo com a numeração de Rabat, veja-se a Figura 10) do domínio variável de cadeia leve. A subclonagem do domínio variável de cadeia leve do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 em pAEPl envolveu a ligação de dois fragmentos de ADN. O primeiro fragmento foi o vetor pAEPl no qual o pequeno fragmento EcoRV/Kpnl tinha sido removido. O segundo fragmento era um fragmento de PCR EcoRV-Kpnl de aproximadamente 300 pares de bases gerado a partir da cadeia leve do plasmídeo para o clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111, utilizando os seguintes iniciadores: 5,-TTTCCCTTTGATATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCT-3' (SEQ. ID N.° 67) 5,-TTTCCCTTTGGTACCCTGGCCAAACGTGTACGGCAAAGAATC-3' (SEQ. ID N. 0 68) . A subclonagem do domínio variável de cadeia leve do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 em pAEPl introduziu uma valina (V) na posição 104 porque a posição 104 está 2 aminoácidos a jusante dos locais de endonucleases de restrição, EcoRV e Kpnl, que foram utilizados para inserir o domínio variável de cadeia leve do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 em pAEPl e, por conseguinte, na estrutura principal do plasmídeo pAEPl. Este plasmídeo intermediário resultante é referido no presente documento como "pAEPl-283-VL"

A subclonagem do domínio variável de cadeia pesada do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 em pAEPl-283-VL envolveu a ligação de dois fragmentos de ADN. O primeiro fragmento foi o vetor pAEPl-283-VL no qual o pequeno fragmento BsiWl/PspOMl tinha sido removido. O segundo fragmento era um fragmento de PCR BsiWI-PspOMI de aproximadamente 364 pares de bases gerado a partir do plasmídeo de cadeia pesada para clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111, utilizando os seguintes iniciadores: 5' -TTTGGGTTTCGTACGCTCAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGG-3' (SEQ. ID N.° 69) 5'-TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3' (SEQ. ID N.° 70).

Esta ligação dos dois fragmentos de ADN resultou no plasmídeo para a variante de anticorpo Fab 238 anti-Fator D humanizado (também referida no presente documento como "238"; o plasmídeo é referido no presente documento como " P 2 3 8 " ) .

Depois da subclonagem dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo anti-Fator D humanizado n.° 111, mutagénese por PCR sítio-dirigida foi utilizada para mutar a glutamina (Q) na posição 1 (de acordo com a numeração de Rabat, veja-se a Figura 1) da cadeia pesada variável da variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238 para um glutamato (E), resultando na variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238-1 (também referida no presente documento como "238-1"). A construção do plasmídeo para a variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238-1 (o plasmídeo é referido no presente documento como "p238-l") envolveu a ligação de dois fragmentos de ADN. O primeiro fragmento foi o vetor p238 no qual o pequeno fragmento BsiWI/PspOMI tinha sido removido. O segundo fragmento era um fragmento de PCR BsiWI-PspOMI de aproximadamente 364 pares de bases gerado a partir do plasmídeo p238, utilizando os seguintes iniciadores: 5'-TTTGGGTTTCGTACGCTGAAGTCCAGCTGGTGCAATCTGGG-3' (SEQ. ID N.0 71) 5' -TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3' (SEQ. ID N.° 72).

Esta ligação dos dois fragmentos de ADN resultou no plasmídeo para a variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238-1 (também referida no presente documento como "238-1"; o plasmídeo é referido no presente documento como "P238-1"), que inclui a mutação sítio-dirigida da posição 1 para um glutamato (E) . Verificou-se que esta mutação inibe a conversão parcial da glutamina (Q) em variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238-1 em piroglutamato (Amphlett, G. et al. , Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)) .

Além disso a mutagénese por PCR sítio-dirigida pode ser utilizada para mutar resíduos de metionina (M ou Met) ou triptofano (W ou Trp) para evitar a oxidação ou para mutar resíduos de asparagina (N ou Asn) para impedir a desamidação. Para evitar a formação de variantes oxidadas dos anticorpos anti-Fator D humanizados, metioninas (M ou Met) , por exemplo, na posição 33 da cadeia leve podem ser mutadas para leucina (L ou Leu) , que é mais semelhante em tamanho e hidrofobicidade à metionina, mas carece de um enxofre para oxidação ou, em alternativa, mutadas para isoleucina (I ou Ile) (Amphlett, G. et al., Pharm.

Biotechnol., 9:1-140 (1996)). Para prevenir a formação de variantes desamidadas dos anticorpos anti-Fator D humanizados, asparaginas (N ou Asn), por exemplo, na posição 34 e 52 da cadeia leve ou posição 99 ou 100 da cadeia pesada podem ser mutadas em glutamina (Q ou Gin) , que é mais semelhante quimicamente a asparagina (N ou Asn) ou mutadas para alanina (A ou Ala) ou serina (S ou Ser) , que são substituições comuns nestas posições em outros anticorpos (Amphlett, G. et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)) .

As Figuras 1-2 mostram sequências do domínio variável de cadeia leve e domínio variável de cadeia pesada para variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238 (SEQ. ID N.°s 6 e 18, respetivamente) e variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238-1 (SEQ. ID N.°s 7 e 19, respetivamente). A Figura 4 e Figura 6 mostram sequências da cadeia leve e cadeia pesada (SEQ. ID N. °s 47 e 54, respetivamente) para a variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238. A Figura 8 e a Figura 10 mostram sequências da cadeia leve e cadeia pesada (SEQ. ID N.°s 61 e 63, respetivamente) para a variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238-1.

Dados BiaCore mostraram a afinidade da variante de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238 para o Fator D humano, bem como afinidade da versão do clone de mAb de comprimento completo anti-Fator D humanizado n.° 111 (mAb anti-Fator D de comprimento completo humanizado 234) (referido no presente documento como "234" ou "mAb anti-Fator D de comprimento completo 234" ou "mAb de comprimento completo anti-Fator D humanizado 234") (Quadro 2). As variantes de anticorpo Fab anti-Fator D humanizado 238 e 238-1 foram também testadas no ensaio de inibição hemolitica (Figura 11) para avaliar a inibição da via alternativa (veja-se o Exemplo 3) .

Exemplo 2: Ensaio de Hemólise da AP

Foi determinada a função biológica de Abs anti-Fator D modificados utilizando o ensaio de inibição hemolitica utilizando soro humano empobrecido de Clq e análise BiaCore (veja-se o Exemplo 3 abaixo). O ensaio hemolitico foi realizado como se segue.

Para determinar a atividade da via alternativa, eritrócitos de coelho (Er, Colorado Serum) foram lavados 3x em GVB e ressuspendidos até 2 x 109/ml. Inibidores (50 μΐ) e 20 μΐ de suspensão de Er foram misturados a 1:1 com GVB/EGTA a 0,1 M/MgCl2 a 0,1 Μ. A ativação do complemento foi iniciada pela adição de soro humano empobrecido de Clq (para evitar qualquer ativação do complemento através da via clássica) (CompTech; 30 μΐ diluídos a 1:3 em GVB). Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, 200 μΐ de GVB/EDTA a 10 mM foram adicionados para parar a reação e as amostras foram centrifugadas durante 5 min. a 500 g. A hemólise foi determinada em 200 μΐ de sobrenadante, medindo a absorção a 412 nm. Os dados foram expressos como % de hemólise induzida na ausência do inibidor. A Figura 11 mostra a inibição do clone Fab anti-Fator D humanizado n.° 111 (CI50 = 4,7 ± 0,6 nM), Fab anti-Fator D modificado 238 (CI50 = 6,4 ± 0,6 nM) e Fab anti-Fator D modificado 238-1 (CI50 = 3,5 ± 0,5 nm) em hemólise pela via alternativa utilizando o ensaio de hemólise em glóbulos vermelhos de coelho utilizando soro humano empobrecido de Clq como fonte de complemento. Os controlos foram Fator H ("fH Humano") (de CompTech) e anticorpos anti-glicoproteina 120 ( "xgpl20") .

Exemplo 3: Análise Cinética de FAB anti-Fator D humano por BiaCore

As constantes cinéticas e de afinidade para a ligação do Fator D humano (Advanced Research, Inc.) a Fab anti-Fator D modificado 238 imobilizado (referido no presente documento como "238"; veja-se o Exemplo 1) foram determinadas por medições de ressonância de plasmón de superfície em ambos os aparelhos BiaCore 3000 e BiaCore A100. Para os valores no Quadro 2 que estão enumerados como resultados "Biacore 3000/BiaCore A100", experiências separadas foram efetuadas em cada aparelho, os dados das experiências separadas foram analisados para obter constantes cinéticas, e foi realizada a média das constantes cinéticas para obter os valores mostrados no Quadro 2. Em alternativa, as constantes cinéticas e de afinidade para a ligação do Fator D humano podem ser medidas por imobilização do Fator D humano e medindo a ligação do mAb ou Fab, podem ser medidas utilizando diferentes condições de regeneração (por exemplo, compreendendo MgCl2 a 4 M) e/ou podem ser medidas utilizando diferentes tampões de ligação (por exemplo, compreendendo PBS). Também foi analisada a versão do clone de mAb de comprimento completo anti-Fator D humanizado n.° 111 (referida no presente documento como "234" ou "mAb de comprimento completo anti-Fator D 234" ou "mAb de comprimento completo anti-Fator D humanizado 234") . 1. Imobilização mAb ou Fab foram imobilizados através de acoplamento de amina utilizando um protocolo padrão fornecido pelo fabricante. A densidade do acoplamento foi regulada pelo ajuste da concentração ou pH das soluções de mAb ou Fab injetadas de tal modo que o sinal total para ligação de saturação do Fator D humano foi de entre 50 e 150 unidades de ressonância (RU). Após o acoplamento da quantidade desejada de mAb ou Fab, grupos funcionais que não reagiram sobre o chip sensor foram bloqueados por injeção de etanolamina. 2. Análise Cinética

Experiências de ligação foram conduzidas através de injeção de alíquotas de 60 μΐ de uma série de soluções de Fator D humano, variadas em concentração desde 500 nM a 0,98 nM em incrementos de 2 vezes. Todas as amostras foram diluídas em tampão de corrida constituído por NaCl a 150 mM, Tween-20 a 0,01% e uma dos seguintes componentes do tampão: (a) pH 7,2 (HEPES a 10 mM (ácido 4 — (2 —

hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico); (b) pH 6,0 (MES a 10 mM (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfónico) ; ou pH 5,0 (acetato de sódio a 10 mM) . A taxa de fluxo foi de 30 μΐ/min. e dissociação foi monitorizada durante 10 minutos para cada concentração de Fator D humano testada. O sinal (sensorgrama) observado para injeção das mesmas soluções sobre uma célula de referência (etanolamina bloqueada) foi subtraído do sensorgrama. Entre sensorgramas a superfície foi regenerada por injeção de 30 μΐ de MgCl2 a 4 M para causar dissociação de qualquer Fator D humano que permaneça ligado ao anticorpo imobilizado. Um sensorgrama de controlo registado para injecção de tampão apenas sobre a superfície do chip sensor foi subtraído dos sensorgramas de Fator D humano. Estes dados foram analisados por regressão não linear de acordo com um modelo de ligação de Langmuir 1:1 1 utilizando o programa BIAevaluation v4.1. As constantes de cinética e de afinidade são proporcionadas no Quadro 2 abaixo. A tecnologia BiaCore é limitada e não é capaz de medir com precisão taxas que são demasiado rápidas (isto é, valores de KD menores que cerca de 10 pM) (Safsten et al., Anal. Biochem., 353:181 (2006)).

Exemplo 4: Ensaio de Hemólise da AP com Concentrações variadas de Fator D A função biológica de Abs anti-Fator D modificados, de incluindo Fab anti-Fator D 238, foi determinada utilizando o ensaio de inibição hemolítica utilizando soro humano empobrecido de Clq e análise BiaCore (veja-se o Exemplo 2 acima), na presença de três concentrações séricas de Fator D.

Soro humano empobrecido de Clq (CompTech) bem como fluido vítreo e tecido a partir da membrana de Bruch de olhos de pacientes com AMD (obtidos através de uma colaboração com o Cole Eye Institute, Cleveland, OH) foram analisados num ELISA quantitativo para o Fator D (veja-se abaixo) . A concentração do Fator D no soro empobrecido de Clq foi de 97 nM, enquanto o nível no fluido vítreo e no tecido da membrana de Bruch de pacientes com AMD foi de 16,2 ± 10,3 nM (média ± desvio padrão, n = 10). O ELISA de Fator D quantitativo foi realizado por diluição de anticorpo policlonal de cabra anti-fator D do complemento humano (R & D Systems, Minneapolis, MN) até 1 pg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e revestimento do anticorpo policlonal anti-factor D (R&D Systems, Minneapolis, MN) sobre placas de ELISA de 384 poços (placas de elevada ligação; Greiner Bio One através da VWR International, Bridgeport, NJ) durante uma incubação durante a noite a 4 °C. Depois de lavagem 3 vezes com tampão de lavagem (PBS/Tween-20 a 0,05%), as placas foram bloqueadas durante 1 - 2 h com PBS/albumina de soro bovino (BSA) a 0,5%. Esta e todas as outras incubações foram realizadas à temperatura ambiente num agitador orbital. Uma curva padrão de fator D (Complement Technology, Inc., Tyler, Texas) foi preparada em PBS/BSA a 0,5% /Tween-20 a 0,05% ao longo de um intervalo de 15,6-1.000 pg/ml. Amostras de controlo congeladas, diluídas previamente para quantificar nas regiões alta, média e baixa da curva padrão foram descongeladas. Soro humano empobrecido de Clq e fluido vítreo humano e amostras de lisados de membrana de Bruch foram diluídos utilizando Diluente de Ensaio (PBS/BSA a 0,5%/Tween-20 a 0,5%). Depois da etapa de bloqueio, as placas foram lavadas e as amostras diluídas (soro, fluido vítreo e lisados de membrana de Bruch) padrões e controlos foram adicionados e incubados durante 2 horas. Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas, e o fator D ligado foi detetado durante 1 a 2 horas de incubação com um anticorpo monoclonal anti-fator D biotinilado (clone 9G7.1.16, produzido em Genentech, diluído até 62,5 ng/ml) seguido por uma incubação de 30 min. com estreptavidina-peroxidase de rábano (SA-HRP)_(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), diluída a 1/10.000 em Diluente de Ensaio. Após uma etapa final de lavagem, foi adicionada tetrametilbenzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) e cor foi deixada desenvolver durante 5 a 7 minutos. A reação foi parada pela adição de ácido fosfórico a 1 Μ. A densidade ótica foi lida utilizando um leitor de microplacas (450 nm, 650 nm de referência) e as concentrações da amostra foram calculadas a partir de ajustes de quatro parâmetros das curvas padrão. As concentrações mínimas quantificáveis de factor D no fluido vítreo humano e amostras de lisados de membrana de Bruch foram de 780 pg/ml (diluição mínima de 1/50) e 156 pg/ml (diluição mínima de 1/10), respetivamente.

A fim de determinar os valores de CI50 e CI90 para inibição da via alternativa do complemento utilizando Fab anti-Fator D 238 modificado na presença de concentrações de fator D semelhantes às concentrações de fator D observadas no fluido vítreo e tecidos da membrana de Bruch de olhos de pacientes com AMD, o ensaio hemolítico foi realizado como descrito no Exemplo 2, utilizando soro empobrecido de Clq a 10% (fator Da 9,7 nM) ou utilizando soro empobrecido de Clq a 10% suplementado com fator D adicional (CompTech) para atingir concentrações de fator D que representam a concentração média (16,2 nM) ou média ± desvio padrão (26,5 nM) observada no fluido vítreo e tecidos da membrana de Bruch de olhos de pacientes com AMD. Os dados foram expressos como % de hemólise induzida na ausência do inibidor (Figura 12) . As concentrações de Fab anti-Fator D 238 que causa 50% e 90% de inibição da reação hemolítica (valores de CI50 e CI90, respetivamente) foram determinados para três experiências de repetição por meio de regressão não linear das curvas de inibição utilizando um modelo de ajuste de quatro parâmetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA) . As razões molares dos valores de CI50 e CI90 frente à concentração relativa do Fator D também foram calculadas. A média dos valores de CI50 e CI90 e as razões molares são mostradas no Quadro 3.

Exemplo 5: Duração da Inibição da Ativação da Via Alternativa do Complemento

Foi medida a duração simulada da inibição da ativação da via alternativa (AP) do complemento num olho de um ser humano, utilizando uma única injeção intravitrea (IVT) de Fab anti-Fator D 238 a uma dose de 2,5 mg (assumindo uma semivida (ti/2) de Fab anti-Fator D 238 de 11,5 dias, com base na escala interespécies a partir do coelho), (Exemplo 13) . Os dados simulados são baseados em escala a partir de um estudo de PK de dose intravitrea única de Fab 238 no coelho branco da Nova Zelândia.

Para estimar a semivida do Fab anti-Fator D 238 em seres humanos, foi calculada a semivida de 238 anti-Fator D em coelhos. Foi administrada a doze (12) coelhos brancos da Nova Zelândia uma única dose intravitrea de 1 mg de Fab 238 em cada olho. Foram recolhidas amostras de humor vítreo e tecido de retina de ambos os olhos do número especificado de animais nos seguintes pontos temporais; 3 animais às 4, 24 e 96 horas (η = 6 amostras em cada um destes pontos de tempo) e um animal às 216 horas (n = 2 amostras neste ponto de tempo) e 2 animais às 240 horas (n = 4 amostras neste ponto de tempo) . As concentrações de Fab 238 nas matrizes oculares foram medidas num ELISA de ligação ao factor de D.

Os dados de concentração-tempo do humor vítreo de todos os animais foram analisados para calcular as estimativas dos parâmetros farmacocinéticos usando uma abordagem de agrupamento naive (naive pooled approach) com o modelo de entrada de bolus IV (Models 201, WinNonlin Pro versão 5.2.1; Pharsight Corporation, Mountain View, CA) para proporcionar uma estimativa de semivida terminal (Ύ1/2) de 3,83 dias. O coeficiente de partição retiniano foi calculado como a razão da concentração no tecido da retina para humor vítreo com a média realizada para todos os olhos em todos os pontos de tempo e era igual a 0,24. Os parâmetros de PK para o humor vítreo foram escalados para seres humano utilizando os mesmos fatores de escala observados para ranibizumab. Assume-se que o olho humano tem um Vi de 4 ml, a razão de semivida no ser humano para o coelho é assumida como sendo 3, o que produz uma estimativa de 11 /2 num ser humano de 11,5 dias. Isto produziu a estimativa para a concentração vítrea e concentrações no tecido retiniano como uma função do tempo como:

Concentração Vítrea = (Dose/Vi) *exp ([-ln (2) /ti/2/] *tempo)

Concentração do tecido retiniano = (Dose/Vi) *exp ([- ln (2) /11/2] *tempo) * (coeficiente de partição retiano)

Na Figura 13, o gráfico foi produzido para uma dose ITV única de 2,5 mg/olho, e representa o tempo desde t=0 até t=112 dias. A CI90 representa a concentração de Fab 238 que produz um efeito inibidor de 90% no ensaio de hemólise realizado conforme mostrado no Exemplo 2 e 4, no qual 10% de soro humano agrupado foi suplementado até uma concentração de Fator D de 16,2 nM. 0 resultado do ensaio foi CI90 = 38 nM para Fab 238. Para comparar com as concentrações da retina e vítreas, uma conversão de molar para massa foi feita utilizando a seguinte equação: CI9o = 38 x IO-9 moles/1 MM de Fab 238 = 50.000 gramas/mole

CI90 (ug/mL) = (38 X IO-9 moles/L) x (50 xlO3 gramas/mole) = 1,9 x IO-9 gramas/L ou 1,9 ug/mL

Como mostrado na Figura 13, os "dias acima da CI90" foi estimado como a quantidade de tempo durante a qual seria previsto que a concentração vítrea ou retiniana estivesse acima de 1,9 ug/ml após uma dose ITV única a 2,5 mg/olho, e foi observado como o ponto onde o gráfico das concentrações vítrea ou retiniana cruzam a linha a 1,9 ug/ml. Foi estimado que uma única injeção IVT de Fab anti-Fator D 238 inibe a ativação da AP do complemento no tecido da retina durante pelo menos cerca de 74 dias e no humor vítreo durante pelo menos cerca de 97 dias. A linha tracejada na Figura 13 mostra a concentração simulada de Fab anti-Fator D 238 no humor vítreo após a administração intravítrea. A linha contínua na Figura 13 mostra a concentração simulada de Fab anti-Fator D 238 no tecido da retina, após a administração intravítrea. A diferença na concentração no humor vítreo e tecido da retina baseia-se numa estimativa do coeficiente de partição do tecido retiniano de 20%; por outras palavras, 20% do fármaco total administrado ao humor vítreo terá acesso ao tecido retiniano.

Os peritos na especialidade reconhecerão, ou serão capazes de averiguar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às formas de realização específicas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalentes destinam-se a ser abrangidos pelas reivindicações seguintes.

Embora a invenção supracitada tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitando o âmbito da invenção. A memória descritiva escrita supracitada é considerada suficiente para permitir que um perito na especialidade pratique a invenção. A presente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pelo documento depositado, pois a forma de realização depositada destina-se a ser uma simples ilustração de certos aspetos da invenção.

Lista De Sequências <110> GENENTECH, INC. HUANG, Arthur J. KELLEY, Robert F. LOWMAN, Henry VAN LOOKEREN CAMPAGNE, Menno WINTER, Charles M.

<120> ANTICORPOS ANTI-FATOR D HUMANIZADOS E UTILIZAÇÕES

DOS MESMOS

<130> P4188R1 WO <150> US 61/048.431 <151> 28-04-2008 <150> US 61/048.689 <151> 29-04-2008 <160> 74

<210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável do clone humanizado η . 0 ill <4 0 0> 1

Asp He Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu He Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin

80 85 SO

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105

He Lys

<210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável do clone humanizado n.° 111 <4Ο0> 2

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin He Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> A sequência está sintetizada (FR3 da região estrutural aceitadora de VH) <400> 3

Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 15 10 15

Gin He Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ser <210> 4

<211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> A sequência está sintetizada (FR3 da região estrutural aceitadora de VH) <400> 4

Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser Vai Ser Thr Ala Tyr Leu 15 10 15

Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 20 25 30

Ser Arg

<210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> A sequência está sintetizada (FR4 da região estrutural aceitadora de VL) <400> 5

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 5 10

<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 6

Asp Ile Gin Vai Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Vai Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin S0 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <400> 7

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-2 <400> 8

Asp He Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu He Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin SO 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-3 <400> 9

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp lie Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-4 <4 0 0> 10

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys He Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-5 <4 0 0> 11

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 Sér Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-6 <4 0 0> 12

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Ser Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-7 <4 0 0> 13

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Ala Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-8 <4 0 0> 14

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin. Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-9 <4 0 0> 15

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-10 <4 0 0> 16

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-11 <4 0 0> 17

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu He Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 lie Lys

<210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <4 0 0> 18

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Vai Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115

<210> 19 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <4 0 0> 19

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai-Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Vai Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115

<210> 20 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-2 <400> 20

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 21 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-3 <400> 21

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 50

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-4 <400> 22

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp He Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 23 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-5 <400> 23

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Vai Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115

<210> 24 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-6 <400> 24

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin He Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 25 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-7 <400> 25

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 26 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-8 <400> 26

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 TO 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Ala Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 27 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-9 <400> 27

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Gin Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 28 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-10 <400> 28

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Ala Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 29 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada variável de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-11 <400> 29

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Gin Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L1 de n.° 111 e 238 a 238-1, 238-6 a 238-11 <400> 30

He Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp Met Asn 5 10

<210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L1 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-2 <400> 31 lie Thr Ser Thr Asp He Asp Asp Asp Leu Asn 5 10

<210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L1 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-3 <400> 32

He Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp He Asn 5 10

<210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L1 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-4 <400> 33

He Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp Met Ala 5 10

<210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L1 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-5 <4Ο0> 34 lie Thr Ser Thr Asp lie Asp Asp Asp Met Gin 5 10

<210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L2 de n.° 111 e 238 a 238-5 y 238-8 a 238-11 <400> 35

Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro 5

<210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L2 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-6 <400> 36

Gly Gly Ser Thr Leu Arg Pro 5

<210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L2 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-7 <400> 37

Gly Gly Ala Thr Leu Arg Pro 5

<210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-L3 de n.° 111 e 238 a 238-11 <400> 38

Leu Gin Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr 5

<210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H1 de n.° 111 e 238 a 238-11 <400> 39

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 5 10

<210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H2 de n.° 111 e 238 a 238-11 <400> 40

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 1 5 10 15

Lys Gly

<210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H3 de n.° 111 e 238 a 238-7 <400> 41

Glu Gly Gly Val Ala Asn 5

<210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H3 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-8 <4Ο0> 42

Glu Gly Gly Vai Ala Asn 5

<210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H3 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-9 <400> 43

Glu Gly Gly Vai Gin Asn

<210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H3 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-10 <400> 44

Glu Gly Gly Vai Asn Ala 5

<210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> HVR-H3 de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-11 <400> 45

Glu Gly Gly Val Asn Gin 5

<210> 46 <211> 714 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 46 atgaagaaga atattgcgtt cctacttgcc tctatgtttg tcttttctat 50 agctacaaac gcgtatgctg atatccaggt gacccagtct ccatcctccc 100 tgtctgcatc tgtaggagac cgcgtcacca tcacttgcat taccagcact 150 gatattgatg atgatatgaa ctggtatcag cagaaaccag ggaaagttcc 200 taagctcctg atctctggag gcaatactct tcgtcctggg gtcccatctc 250 ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagc 300 ctgcagcctg aagatgttgc aacttattac tgtttgcaaa gtgattcttt 350 gccgtacacg tttggccagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg 400 ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 450 ggaactgctt ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc 500 caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg 550 agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg 650 cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca 700 ggggagagtg ttaa 714

<210> 47 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 47

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-LC de domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 48

Asp Ile Gin Vai Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 15 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 20

<210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-LC de domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 49

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Vai Pro Lys Leu Leu Ile Ser 15 10 15

<210> 50 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-LC de domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 50

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15

Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr 20 25 30

Tyr Cys

<210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-LC de domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 51

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 5 10

<210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> CL1 de domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 a 238-1 <400> 52

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 15 10 15

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 20 25 30

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 35 40 45

Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 50 55 60

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 65 70 75

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 80 85 90

His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 95 100 105

Glu Cys

<210> 53 <211> 741 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 53 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat 50 tgctacaaac gcgtacgctc aggtccagct ggtgcaatct gggcctgagt 100 tgaagaagcc tggggcctca gtgaaggttt cctgcaaggc ttctggatac 150 accttcacta actatggaat gaactgggtg cgccaagccc ctggacaagg 200 gcttgagtgg atgggatgga ttaacaccta cactggagag acaacatatg 250 ctgatgactt caagggacgg tttgtcttct ccttggacac ctctgtcagc 300 acggcatatc tgcagatcag cagcctcaag gctgaggaca ctgccgtgta 350 ttactgtgag cgcgaggggg gggttaataa ctggggccaa gggaccctgg 400 tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 450 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 500 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 550 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca 650 gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca 700 agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacata a 741

<210> 54 <211> 223 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 54

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 110 115 120

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 125 130 135

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 140 145 150

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 155 160 165

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 170 175 180

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 185 190 195

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 200 205 210

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 215 220

<210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-HC de domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 55

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

<210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR2-HC de domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 56

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 5 10

<210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR3-HC de domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 57

Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 15 10 15

Gin He Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

Glu Arg

<210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR4-HC de domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 <400> 58

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10

<210> 59 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> CHI de domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238 a 238-1 <400> 59

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 1 5 10 15

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 20 25 30

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 35 40 45

Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 50 55 60

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 65 70 75

Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 80 85 90

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 95 100 105

Thr His Thr

<210> 60 <211> 714 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <400> 6 0 atgaagaaga atattgcgtt cctacttgcc tctatgtttg tcttttctat 50 agctacaaac gcgtatgctg atatccaggt gacccagtct ccatcctccc 100 tgtctgcatc tgtaggagac cgcgtcacca tcacttgcat taccagcact 150 gatattgatg atgatatgaa ctggtatcag cagaaaccag ggaaagttee 200 taagctcctg atctctggag gcaatactct tcgtcctggg gtcccatctc 250 ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagc 300 ctgcagcctg aagatgttgc aacttattac tgtttgcaaa gtgattcttt 350 gccgtacacg tttggccagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg 400 ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 450 ggaactgctt ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc 500 caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg 550 agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg 650 cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca 700 ggggagagtg ttaa 714

<210> 61 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadena leve de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <400> 61

Asp lie Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys lie Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 62 <211> 741 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <400> 62 atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat 50 tgctacaaac gcgtacgctg aagtccagct ggtgcaatct gggcctgagt 100 tgaagaagcc tggggcctca gtgaaggttt cctgcaaggc ttctggatac 150 accttcacta actatggaat gaactgggtg cgccaagccc ctggacaagg 200 gcttgagtgg atgggatgga ttaacaccta cactggagag acaacatatg 250 ctgatgactt caagggacgg tttgtcttct ccttggacac ctctgtcagc 300 acggcatatc tgcagatcag cagcctcaag gctgaggaca ctgccgtgta 350 ttactgtgag cgcgaggggg gggttaataa ctggggccaa gggaccctgg 400 tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 450 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 500 eaaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaae tcaggcgccc 550 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 500 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca 650 gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca 700 agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacata a 741

<210> 63 <211> 223 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Domínio de cadeia pesada de Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <400> 63

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Vai Asn. Asn Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 110 115 120

Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 125 130 135

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 140 145 150

Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai 155 160 165

His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 170 175 180

Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 185 190 195

Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp 200 205 210

Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 215 220

<210> 64 <211> 25 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> FR1-HC de domínio de cadeia pesada para Fab anti-Fator D humanizado modificado 238-1 <400> 64

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

<210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de consenso de VL Capa I <400> 65

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser 20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg

<210> 66 <211> 109 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Secuencia de consenso de VH7 subgrupo VII <400> 6 6

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr 50 55 60

Ala Gin Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr Ser Leu 95 100 105

Thr Val Ser Ser

<210> 67 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Iniciador oligonucleotídico sintetizado para pAEPl-2 83 VL <400> 67 tttccctttg atatccaggt gacccagtct ccatcct 37

<210> 68 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Iniciador oligonucleotidico sintetizado para pAEPI-238-VL <400> 6 8 tttccctttg gtaccctggc caaacgtgta cggcaaagaa tc 42

<210> 69 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico sintetizado para p238 <400> 6 9 tttgggtttc gtacgctcag gtccagctgg tgcaatctgg g 41

<210> 70 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico sintetizado para p238 <400> 70 tttgggtttg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ccagggt 47

<210> 71 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotídico sintetizado para p238-l <400> 71 tttgggtttc gtacgctgaa gtccagctgg tgcaatctgg g 41

<210> 72 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotídico sintetizado para p238-l <400> 72 tttgggtttg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ccagggt 47

<210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Material composto de cadeia pesada variável de clones de Fab anti-Fator D humanizados <22 0> <221> Xaa <222> 33-34 <223> Aminoácido desconhecido <22 0> <221> Xaa <222> 52 <223> Aminoácido desconhecido <22 0> <221> Xaa <222> 104 <223> Aminoácido desconhecido <400> 73

Asp Ile Gin Vai Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp lie Asp 20 25 30

Asp Asp Xaa Xaa Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Vai Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Ser Gly Gly Xaa Thr Leu Arg Pro Gly Vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Xaa Glu 95 100 105

Ile Lys

<210> 74 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Material composto de cadeia pesada variável de clones de Fab anti-Fator D humanizados <22 0> <221> Xaa <222> 1 <223> Aminoácido desconhecido <22 0> <221> Xaa <222> 103 <223> Aminoácido desconhecido <22 0> <221> Xaa <222> 104 <223> Aminoácido desconhecido <400> 74

Xaa Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Tyr Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr 50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Vai Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75

Vai Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Glu Arg Glu Gly Gly Vai Xaa Xaa Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 110 115

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2008055206 A [0006] • US 60640323 B [0069] • US 5534615 A [0071] • US 5634615 A [0072] • WO 0042072 A [0087] • US 4816567 A [0097] • EP 239400 Bi [0113] • WO 2000042072 A [0114] • US 6956107 B [0147] • WO 8905859 A [0156] • US 4399216 A [0156] • DD 266710 [0157] • US 5639635 A [0157] • US 4946783 A [0157] • US 5648237 A, Carter [0158] • US 5789199 A, Joly [0158] • US 5840523 A, Simmons [0158] • US 5010182 A [0164] • EP 362179 A [0164] • WO 9013646 A [0164] • US 6083715 A, Georgiou [0174] • US 6027888 A, Georgiou [0174] • US 5264365 A, Georgiou [0175] • US 5508192 A, Georgiou [0175] • US 4767704 A [0177] • US 4687866 A [0177] • US 4560655 A [0177] • US 5122469 A [0177] • US 5712163 A [0177] • US 6048728 A [0177] • US 3773919 A [0190] • US 4737456 A [0202] • US 4376110 A [0207] • WO 9404188 A [0214] • US 61048431 B [0244] • US 61048689 B [0244]

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Lisboa, 11 de Novembro de 2015

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo anti-Fator D que compreende um domínio variável de cadeia leve que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 7 e um domínio variável de cadeia pesada que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.0 19, em que (i) o domínio variável de cadeia leve compreende HVR- 1 que compreende ITSTDIDDDMN (SEQ. ID N.° 30), HVR-2 que compreende GGNTLRP (SEQ. ID N.° 35) e HVR-3 que compreende LQSDSLPYT (SEQ. ID N.° 38); e (ii) o domínio variável de cadeia pesada compreende HVR-1 que compreende GYTFTNYGMN (SEQ. ID N.° 39), HVR-2 que compreende WINTYTGETTYADDFKG (SEQ. ID N.° 40) e HVR-3 que compreende EGGVNN (SEQ. ID N.° 41); e em que o aminoácido na posição 1 do domínio variável de cadeia pesada é E.
2. 2. O anticorpo anti-Fator D da reivindicação 1, em que o aminoácido na posição 104 da sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve é V.
3. 3. O anticorpo anti-Fator D das reivindicações 1 ou 2, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 19 e o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 7.
4. 4. O anticorpo anti-Fator D da reivindicação 3, em que o anticorpo anti-Fator D compreende uma sequência de cadeia pesada de SEQ. ID N.° 63.
5. 5. 0 anticorpo anti-Fator D da reivindicação 3, em que o anticorpo anti-Fator D compreende uma sequência de cadeia leve de SEQ. ID N.0 61.
6. 6. 0 anticorpo anti-Fator D da reivindicação 3, em que o anticorpo anti-Fator D compreende uma sequência de cadeia pesada de SEQ. ID N.° 63 e uma sequência de cadeia leve de SEQ. ID N.0 61.
7. 7. 0 anticorpo anti-Fator D de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o Fator D é Fator D de mamífero.
8. 8. 0 anticorpo anti-Fator D da reivindicação 7, em que o Fator D é Fator D humano.
9. 9. Um polinucleótido que codifica o anticorpo anti-Fator D de qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. 10. O polinucleótido da reivindicação 9, que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ. ID N.° 60 ou SEQ. ID N.0 62.
11. 11. Um vetor que compreende o polinucleótido da reivindicação 9 ou reivindicação 10.
12. 12. Uma célula hospedeira que compreende o vetor da reivindicação 11.
13. 13. A célula hospedeira da reivindicação 12, em que a célula hospedeira é eucariótica.
14. 14. A célula hospedeira da reivindicação 12, em que a célula hospedeira é uma célula CHO.
15. 15. Um método de produzir um anticorpo anti-Fator D, em que o método compreende (a) cultivar a célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 12 a 14 sob condições adequadas para expressão do polinucleótido que codifica o anticorpo e (b) isolar o anticorpo.
16. 16. 0 anticorpo anti-Fator D de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em que o anticorpo anti-Fator D é um anticorpo monoclonal.
17. 17. 0 anticorpo anti-Fator D de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o anticorpo anti-Fator D é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2·
18. 18. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-Fator D de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 16 e 17 e um diluente, veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
19. 19. 0 anticorpo anti-Fator D ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 16 a 18 para utilização num método de tratamento de um distúrbio associado ao complemento selecionado a partir do grupo que compreende distúrbios inflamatórios ou doenças oculares.
20. 20. O anticorpo anti-Fator D ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o distúrbio inflamatório é uma doença autoimune.
21. 21. O anticorpo ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 20, em que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que compreende lúpus eritematoso sistémico, miastenia grave, artrite reumatoide, doença de Alzheimer e esclerose múltipla.
22. 22. 0 anticorpo anti-Fator D ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que compreende degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, neovascularização coroideia (CNV), uveite, edema macular diabético, miopia patológica, doença de von Hippel-Lindau, histoplasmose do olho, Oclusão da Veia Central da Retina (CRVO), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.
23. 23. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a degeneração macular relacionada com a idade é selecionada a partir do grupo que compreende AMD seca intermediária e atrofia geográfica. Lisboa, 11 de Novembro de 2015