BR112015022260B1 - Anticorpo monoclonal que se liga ao tau, polinucleotídeo, composição farmacêutica e uso de um anticorpo - Google Patents

Anticorpo monoclonal que se liga ao tau, polinucleotídeo, composição farmacêutica e uso de um anticorpo Download PDF

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Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL QUE SE LIGA AO TAU, POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UM ANTICORPO. A invenção fornece anticorpos a tau. Os anticorpos inibem ou atrasam patologias associadas a tau e deterioração sintomática associada.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido é não-provisório de 61/780.624, depositado em março 13, depositado em 2013 e 61/800.382, depositado em 15 de março de 2013, cada um incorporado por referência, na sua totalidade para todos os efeitos.
FUNDAMENTOS
[0002] Tau é uma proteína humana bem conhecida que pode existir na forma fosforilada (ver, ex., Goedert, proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4051- 4055(1988); Goedert, EMBO J. 8:393-399(1989); Lee, Neuron 2:1615- 1624(1989); Goedert, Neuron 3:519-526(1989); Andreadis, Biochemistry 31:10626-10633(1992). Tau foi relatado tendo um papel na estabilização de microtúbulos, particularmente no sistema nervoso central. Tau total (t-tau, ou seja, formas fosforilada e não fosforilada) e fosfo-tau (ou seja, tau fosforilada) são liberados pelo cérebro em resposta à lesão neuronal e neurodegeneração e foram relatados ocorrendo em níveis aumentados nos pacientes de Alzheimer de CSF em relação à população em geral (Jack et al., Lancet Neurol 9: 119-28 (2010)).
[0003] Tau é o principal constituinte de emaranhados neurofibrilares, que, juntamente com placas, são uma marca característica da doença de Alzheimer. Os emaranhados constituem fibrilas anormais medindo 10 nm de diâmetro, ocorrendo em pares enrolados de forma helicoidal com uma periodicidade regular de 80 nm. O tau dentro de emaranhados neurofibrilares é anormalmente fosforilada (hiperfosforilada) com grupos de fosfato ligados a sítios específicos na molécula. Grande envolvimento de emaranhados neurofibrilares é visto nos neurônios de camada II das regiões subiculares do hipocampo e CA1 e córtex entorrinal, a amígdala e as camadas mais profundas (camadas III, V e VI superficial) do neocórtex na doença de Alzheimer. Tau hiperfosforilado também foi relatado interferindo na montagem de microtúbulos, o que pode promover o colapso da rede neuronal.
[0004] Inclusões de tau integram a definição neuropatológica de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva e a doença de Pick.
RESUMO DA INVENÇÃO REIVINDICADA
[0005] A invenção fornece anticorpos monoclonais que competem pela ligação com tau com anticorpo monoclonal 16B5. Alguns anticorpos são anticorpos humanizados, quiméricos, com superfície modificada (veneer) ou anticorpos humanos. Alguns anticorpos são de isotipo IgG humano (por exemplo, IgG1, IgG2 e IgG4). Alguns desses anticorpos têm uma região constante de IgG1 humano tendo a sequência de SEQ ID NO: 29. Alguns desses anticorpos têm uma região constante kappa humana tendo a sequência de SEQ ID NO: 32. Alguns anticorpos têm pelo menos uma mutação na região constante.
[0006] Alguns dos anticorpos são uma forma humanizada, quimérico ou com superfície modificada do anticorpo monoclonal 16B5. Alguns anticorpos têm três CDRs de cadeia leve conforme definido por Kabat e três CDRs de cadeia pesada conforme definido por Kabat de anticorpo monoclonal 16B5. Alguns anticorpos ligam-se a formas de tau fosforilada e não fosforilada.
[0007] A invenção ainda fornece anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a um epítopo dentro dos resíduos 24-46 de SEQ ID NO:1 (Swiss- Prot. P10636-8). Alguns tais anticorpos são anticorpos humanizados, quiméricos, com superfície modificada ou humanos. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 25-44 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 3039 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se a formas de tau fosforilada e não fosforilada.
[0008] A invenção ainda fornece anticorpos monoclonais compreendendo uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos, 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve madura, pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos, 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%) idêntica à SEQ ID NO: 22. Em determinadas incorporações, o anticorpo monoclonal compreende três CDRs de Kabat de SEQ ID: 15 e três CDRs de Kabat de SEQ ID NO: 22. Em alguns anticorpos, região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácido designada SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 21, 22 ou 23.
[0009] Em alguns anticorpos, pelo menos uma das posições H13, H48 e H91 é ocupada por K, M e F, respectivamente, e pelo menos uma das posições L1, L4, L36 e L43 é ocupada por N, L, F e S, respectivamente. Em alguns anticorpos, posições H13, H48 e H91 são ocupadas por K, M e F,respectivamente, e pelo menos duas das posições L1, L4, L36 e L43 são ocupadas por N, L, F e S, respectivamente. Em alguns anticorpos, posições H13, H48 e H91 são ocupadas por K, M e F, respectivamente e pelo menos três das posições L1, L4, L36 e L43 são ocupadas por N, L, F e S, respectivamente. Em alguns anticorpos, posições H13, H48 e H91 são ocupadas por K, M e F,respectivamente, posições L1, L4, L36 e L43 são ocupadas por N, L, F e S, respectivamente.
[0010] Em alguns anticorpos, região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região constante de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região constante de cadeia leve. Em alguns anticorpos, região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de uma região constante humana natural, que tem ligação reduzida a um receptor de FCY em relação à região constante humana natural. Em alguns anticorpos, região constante de cadeia pesada é de isotipo IgG1.
[0011] Em alguns anticorpos, diferenças nas CDRs da região variável de cadeia pesada madura e região variável leve madura de SEQ ID NOs: 15 e 22, respectivamente, residem em posições H60-H65.
[0012] Os anticorpos podem ser anticorpos intactos ou fragmentos, como um fragmento Fab.
[0013] Qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmentos pode ser conjugado com um agente citostático ou citotóxico.
[0014] A invenção ainda fornece métodos de humanizar um anticorpo. Alguns métodos incluem determinar as sequências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de camundongo; síntese de ácidos nucléicos que codifica uma cadeia pesada humanizada compreendendo CDRs de cadeia pesada do anticorpo de camundongo e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve humanizada compreendendo CDRs de cadeia leve do anticorpo do camundongo; e expressar os ácidos nucléicos em uma célula hospedeira para produzir um anticorpo humanizado, em que o anticorpo de camundongo é 16B5.
[0015] A invenção ainda fornece métodos de produção de um anticorpo humanizado, quimérico ou com superfície modificada. Alguns métodos incluem cultivo das células transformadas com ácidos nucleicos codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo para que a célula secrete o anticorpo; e purificar o anticorpo de meios de cultura celular, em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérico ou com superfície modificada de 16B5.
[0016] A invenção ainda fornece métodos de produção de uma linha celular que produz anticorpo humanizado, quimérico ou com superfície modificada. Alguns métodos compreendem a introdução de um vetor codificando cadeias pesadas e leves de um anticorpo e um marcador selecionável em células; propagação das células sob condições para selecionar células tendo aumentado o número de cópia do vetor; isolamento de células únicas de células selecionadas; e preservação em banco de células clonadas a partir de uma única célula selecionada com base no rendimento do anticorpo; em que o anticorpo é uma forma humanizada, quimérica ou com superfície modificada de 16B5.
[0017] A invenção ainda fornece composições farmacêuticas, compreendendo qualquer anticorpo divulgado neste documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0018] A invenção ainda fornece ácidos nucleicos compreendendo um segmento codificando uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de SEQ ID NO: 10.
[0019] A invenção ainda fornece ácidos nucleicos compreendendo um segmento codificando uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de SEQ ID NO: 15. Em alguns ácidos nucléicos, o segmento tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25. Alguns ácidos nucleicos ainda compreendem um segmento codificando uma região constante de IgG1, opcionalmente uma região constante de IgG1 humano, por exemplo, com uma sequência de SEQ ID NO: 29 desde que a lisina de C-terminal possa ser omitida. Em alguns ácidos nucléicos, o segmento de codificação da região constante IgG1 tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 30. Alguns desses ácidos nucleicos ainda compreendem um íntron ligando os segmentos codificando a região variável de cadeia pesada e a região de IgG1 constante. Por exemplo, o íntron pode ter a sequência de íntron encontrada em SEQ ID NO: 31. Assim, o íntron e o segmento de codificação da região constante de IgG1 podem ter uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31.
[0020] A invenção ainda fornece ácidos nucleicos compreendendo um segmento codificando uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de SEQ ID NO: 16.
[0021] A invenção ainda fornece ácidos nucleicos compreendendo um segmento codificando uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de SEQ ID NO: 21, 22 ou 23. Em alguns ácidos nucléicos, o segmento de codificação da região variável de cadeia leve tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 26, 27 ou 28. Alguns desses ácidos nucleicos ainda compreendem um segmento codificando uma região constante de kappa. A região constante de kappa pode ser uma região constante humana de kappa e pode ter a sequência de SEQ ID NO: 32. Opcionalmente, o ácido nucleico que codifica a região constante de kappa tem a sequência de SEQ ID NO: 33. Alguns desses ácidos nucleicos ainda compreendem um íntron ligando o segmento codificando a região variável de cadeia leve e o segmento que codifica a região constante de kappa. Por exemplo, o íntron pode ter a sequência de íntron encontrada em SEQ ID NO: 34. Assim, o íntron e o segmento de codificação da região constante de kappa podem ter uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 34.
[0022] Qualquer um dos anticorpos acima mencionados pode incluir uma cadeia pesada compreendendo uma região constante de IgG1 humana tendo a sequência de SEQ ID NO: 29 e/ou uma cadeia leve compreendendo uma região constante de kappa humana tendo a sequência de SEQ ID NO: 32.
[0023] A invenção ainda fornece um fragmento isolado de tau, incluindo 310 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss- Prot. P10636-8). Alguns fragmentos incluem 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos 30-39 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8). Alguns fragmentos incluem resíduos 33-37 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8). Alguns fragmentos são ligados a uma molécula transportadora, opcionalmente, através de um espaçador que ajuda a provocar anticorpos contra o fragmento. Alguns fragmentos são parte de uma composição farmacêutica compreendendo um adjuvante aceitável para a administração aos seres humanos.
[0024] A invenção ainda fornece métodos de tratamento ou efetuar a profilaxia da doença de Alzheimer. Alguns métodos incluem administrar um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo para um paciente com ou em risco de doença de Alzheimer e, assim, tratar ou efetuar a profilaxia da doença. De preferência, o anticorpo é um anticorpo aqui descrito. Em alguns métodos, o agente que induz o anticorpo é um fragmento de tau que inclui 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos de 24-46 de SEQ ID NO: 1. Em alguns métodos, o paciente é um portador de ApoE4.
[0025] A invenção ainda fornece métodos de tratamento ou efetuar a profilaxia da doença associada com tau. Alguns métodos incluem administrar um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo para um paciente com ou em risco de doença de Alzheimer e, assim, tratar ou efetuar a profilaxia da doença. De preferência, o anticorpo é um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo humanizado 16B5). Em alguns métodos, o agente que induz o anticorpo é um fragmento de tau que inclui 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos de 24-46 de SEQ ID NO:1. Em alguns métodos, a doença é uma doença neurológica.
[0026] A invenção ainda fornece métodos de redução de transmissão aberrante de tau. Alguns métodos incluem administrar um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo para um paciente com ou em risco de uma doença associada com transmissão aberrante de tau e, assim, tratar ou efetuar a profilaxia da doença. De preferência, o anticorpo é um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo humanizado 16B5). Em alguns métodos, o agente que induz o anticorpo é um fragmento de tau que inclui 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos de 24-46 de SEQ ID NO: 1.
[0027] A invenção ainda fornece métodos de indução de fagocitose de tau. Alguns métodos incluem administrar um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss- Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo para um paciente com ou em risco de uma doença associada com acumulação de tau. De preferência, o anticorpo é um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo humanizado 16B5). Em alguns métodos, o agente que induz o anticorpo é um fragmento de tau que inclui 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos de 24-46 de SEQ ID NO: 1. Em alguns métodos, a doença é uma doença neurológica.
[0028] A invenção ainda fornece métodos de inibição da agregação ou deposição de tau. Em certas modalidades os métodos incluem administrar um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo para um paciente com ou em risco de uma doença associada com agregação ou deposição de tau. De preferência, o anticorpo é um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo humanizado 16B5). Em alguns métodos, o agente que induz o anticorpo é um fragmento de tau que inclui 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos de 24-46 de SEQ ID NO: 1. Em alguns métodos, a doença é uma doença neurológica.
[0029] A invenção ainda fornece métodos de inibir a formação de emaranhados de tau. Alguns métodos incluem administrar um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo para um paciente com ou em risco de uma doença associada com formação de emaranhados de tau. De preferência, o anticorpo é um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo humanizado 16B5). Em alguns métodos, o agente que induz o anticorpo é um fragmento de tau que inclui 3-10 resíduos contíguos de tau dentro de resíduos de 24-46 de SEQ ID NO: 1. Em alguns métodos, a doença é uma doença neurológica.
[0030] A invenção ainda fornece métodos de triagem de um agente para a atividade contra a doença de Alzheimer. Alguns métodos incluem administrar o agente a um animal transgênico expressando um transgene tau e determinar se o agente inibe ou retarda pelo menos um sinal ou sintoma de doença de Alzheimer, em que o agente é um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo dentro de resíduos 24-46 de SEQ ID NO: 1 (Swiss-Prot. P10636-8), ou um agente que induz um tal anticorpo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0031] A Figura 1 mostra os resultados de experimentos projetados para mapear o(s) epítopo(s) ligados pelo anticorpo monoclonal 16B5. Western blots contendo Tau completo ou mutantes de deleção de Tau (Δ5-24 ou Δ25-44) foram corados com anticorpos 16B5 (painel esquerdo) ou anticorpos Tau46 (painel direito). O anticorpo Tau46 liga o epítopo do C-terminal de Tau.
[0032] A Figura 2 mostra os resultados de experimentos projetados para mapear o(s) epítopo(s) ligados pelo anticorpo monoclonal 16B5. Western blots contendo Tau completo ou mutantes de deleção de Tau foram corados com anticorpos 16B5 (painel esquerdo) ou anticorpos Tau46 (painel direito). Uma exposição mais longa do blot corado com anticorpos 16B5 é mostrada no painel esquerdo inferior. Os mutantes de deleção de Tau analisados neste experimento incluem Δ25-44, Δ5-24, Δ23-32, Δ30-39 e Δ37-46.
[0033] A Figura 3 mostra os resultados de um experimento de varredura de alanina projetados para mapear o(s) epítopo(s) ligados pelo anticorpo monoclonal 16B5. Western blots contendo Tau de tipo selvagem (WT) ou mutantes de ponto de alanina de Tau foram corados com anticorpos 16B5 (painel esquerdo) ou anticorpos Tau46 (painel direito). Os mutantes de alanina de Tau analisados neste experimento incluem T30A, M31A, H32A, Q33A, D34A, Q35A, E36A, G37A, D38A, T39A, D40A, A41L e G42A.
[0034] A Figura 4 mostra relativas quantidades de proteína tau detectado em uma fração de sarkosil insolúvel do tronco cerebral de camundongos transgênicos que expressam a proteína de tau humana P301L. Os camundongos foram passivamente imunizados com o anticorpo 16B5 ou o anticorpo 6F10, um controle de isotipo de IgG1 não imune. As amostras foram analisadas por Western blotting, coloração do anticorpo e quantificação do sinal resultante. Os anticorpos usados para detectar tau incluíam anticorpos específicos anti-fosfo-tau (AT8, painel esquerdo superior; AT100, painel inferior esquerdo; ou 1F5, painel superior direito) e um anticorpo de tau de pan (HT7, painel canto inferior direito).
[0035] A Figura 5 mostra a relação entre fosfo-tau e a proteína tau total (painel esquerdo) e uma quantidade normalizada de tau total (painel direito) detectado nos homogenatos de tronco cerebral totais de camundongos transgénicos que expressam a proteína de tau humana P301L. Os camundongos foram passivamente imunizados com o anticorpo 16B5 ou o anticorpo 6F10, um controle de isotipo de IgG1 não imune. As amostras foram analisadas por Western blotting, coloração do anticorpo e quantificação do sinal resultante. O anticorpo AT8 foi usado para detectar fosfo-tau e o anticorpo HT7 foi usado para detectar tau total. Um anticorpo anti-GAPDH foi usado para normalizar a quantidade de tau detectado em camundongos tratados com anticorpo 16B5 versus o anticorpo 6F10 de controle.
[0036] A Figura 6 retrata seções dos núcleos cerebelares de camundongos transgénicos que expressam a proteína tau humana-P301L, imunohistoquimicamente corada usando o anticorpo anti-fosfo-tau AT8. Os camundongos foram passivamente imunizados com o anticorpo 16B5 (painel esquerdo superior) ou o anticorpo 6F10 (painel esquerdo inferior), um controle de isotipo de IgG1 não imune. Quantificação do montante de tau coloração detectado com o anticorpo AT8 no núcleo interposto do cerebelo, parte anterior e posterior, anexo ao núcleo cerebelar lateral (IntA/P/LAT) e o núcleo subtalâmico anexo à zona incerta (STH/ZI) de camundongos passivamente imunizados com anticorpos 16B5 ou 6F10 é mostrada nos painéis de gráfico de barra superiores. Quantificação do montante de coloração fosfo-tau detectado usando o anticorpo anti-fosfo-tau AT100 nas seções IntA/P/LAT e STH/ZI de camundongos passivamente imunizados com anticorpos 16B5 ou 6F10 é mostrada nos painéis de gráfico de barra inferiores. Significância estatística foi avaliada utilizando o teste t de Student, p < 0,05.
[0037] A Figura 7 mostra resultados de imunoprecipitação de tau obtidos com anticorpos 16B5 quimérico e anticorpos 16B5 humanizados (versões H1L2 e H1L3). Tau foi imunoprecipitado de frações solúveis e insolúveis de amostras do córtex frontal pós-morte obtidas de um paciente de doença de Alzheimer. Tau presente em imuno-precipitados em blot foi detectado usando um anticorpo policlonal anti-tau (tau pAb).
DEFINIÇÕES
[0038] Os anticorpos monoclonais e outros agentes terapêuticos são normalmente fornecidos na forma isolada. Isto significa que o agente é, normalmente, pelo menos 50% p/p puro de proteínas interferentes e outros contaminantes decorrentes de sua produção ou purificação, mas não exclui a possibilidade de que o agente é combinado com um excesso de transportadores farmacêuticos aceitáveis ou outro veículo destinado a facilitar o seu uso. Às vezes, os anticorpos monoclonais (ou outros agentes terapêuticos) são pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% p/p puros de proteínas interferentes e contaminantes de produção ou purificação.
[0039] Anticorpos da invenção geralmente se ligam a seu alvo designado com uma constante de associação de pelo menos 106, 107, 108, 109 ou 1010 M-1. Tal ligação é de ligação específica no sentido em que é detectavelmente maior em magnitude e distinguível de ligação inespecíficas ocorrendo para pelo menos um alvo independente. Ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre grupos funcionais específicos ou encaixe espacial particular (por exemplo, tipo "chave e cadeado") enquanto a ligação não específica é geralmente o resultado de forças de van der Waals. Ligação específica não implica necessariamente, no entanto que um anticorpo monoclonal se a liga a apenas um alvo.
[0040] Sabe-se que a unidade estrutural básica de anticorpo é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A parte amino-terminal de cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis por reconhecimento de antígeno. Esta região variável é expressa inicialmente ligada a um peptídeo de sinal clivável. A região variável sem o peptídeo de sinal é por vezes referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, uma região variável madura de cadeia leve significa uma região variável de cadeia leve sem o peptídeo de sinal de cadeia leve. A parte carboxi- terminal de cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Uma região constante pode incluir qualquer ou todos dentre uma região CH1, região de dobradiça, região CH2 e região CH3.
[0041] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos ou mais. (Em geral, ver Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7) (incorporado neste documento por referência na sua totalidade e para todos os efeitos).
[0042] As regiões variáveis maduras de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação de anticorpo. Assim, um anticorpo intacto tem dois sítios de ligação. Exceto em anticorpos bifuncionais ou bi-específicos, os dois sítios de ligação são os mesmos. Todas as cadeias apresentam a mesma estrutura geral das regiões de framework relativamente conservadas (FR) juntas às três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões de framework, permitindo ligação a um epítopo específico. Do N-terminal ao C-terminal, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and1991), ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabattambém fornece uma convenção de numeração amplamente utilizada (numeração Kabat) na qual a resíduos correspondentes entre diferentes cadeias pesadas ou entre diferentes cadeias leves são atribuídos os mesmos números.
[0043] O termo "anticorpos" inclui anticorpos intactos e respectivos fragmentos de ligação. Normalmente, fragmentos competem com o anticorpo intacto do qual eles foram derivados por ligação específica para o destino. Fragmentos incluem cadeias pesadas separadas, cadeias Fab, Fab', (ab')2, F(ab)c, Fv e anticorpos de domínio único. Anticorpos de domínio único (variável) incluem regiões VH separadas de seus parceiros de VL (ou vice-versa) em anticorpos convencionais (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546) bem como regiões VH (às vezes conhecidas como VHH) de espécies como camelídeos ou peixes cartilaginosos (por exemplo, um tubarão-enfermeiro) no qual regiões VH não estão associadas com regiões VL (ver, por exemplo, WO 9404678). Anticorpos de domínio único, nos quais uma cadeia é separada de seus parceiros naturais que são às vezes conhecidos como Dabs e anticorpos de domínio único de camelídeo ou peixes cartilaginosos são às vezes conhecidos como nanocorpos. Regiões constantes ou partes das regiões constantes podem ou não estar presentes em anticorpos de domínio único. Por exemplo, os anticorpos naturais de única região variável de camelídeos incluem uma região variável VHH e regiões constantes CH2 e CH3. Anticorpos de domínio único podem ser objeto de humanização por abordagens análogas aos anticorpos convencionais. Os tipos Dabs de anticorpos são geralmente obtidos de anticorpos de origem humana. Os tipos nanocorpo de anticorpo são de origem de camelídeos ou tubarão e podem estar sujeitos a humanização. Fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinantes ou por separação química ou enzimática de imunoglobinas intactas. O termo "anticorpos" também inclui um anticorpo bi-específico. Um anticorpo bi-específico ou bifuncional é um anticorpo artificial híbrido com dois pares de diferentes cadeias pesadas/leves e dois sítios de ligação diferentes. (Ver, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clin Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al, J. Immunol., 148:1547-53 (1992)).
[0044] O termo "epítopo" se refere ao sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não-contíguos justapostos por dobramento terciário de uma ou mais proteínas. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos normalmente são mantidos em exposição a solventes de desnaturação, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são normalmente perdidos após tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3 e mais geralmente, pelo menos, 5 ou 8-10 aminoácidos em uma única conformação espacial. Quando um epítopo é dito dentro de um intervalo de resíduos de aminoácidos em uma proteína (por exemplo, dentro de 25 a 44 de resíduos de tau), o intervalo é inclusive dos resíduos definindo das suas fronteiras. Determinados resíduos dentro da escala contribuem para o epítopo, enquanto outros podem não o fazer. Os resíduos que formam o epítopo podem ou não ser contíguos um com o outro. Da mesma forma, quando um anticorpo se liga a um epítopo encontrado dentro de um intervalo específico de aminoácidos, o anticorpo não precisa entrar em contato com todos os resíduos de aminoácidos dentro do intervalo, e os resíduos do epítopo que são contatados pelo anticorpo podem ou não ser contíguos um com o outro. Métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios x e da ressonância magnética nuclear 2-dimensional. Veja, p. ex., Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
[0045] Anticorpos que reconhecem os epítopos iguais ou sobrepostos podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo de competir com a ligação de um outro anticorpo a um antígeno alvo. O epítopo de um anticorpo também pode ser definido por cristalografia de raios x do anticorpo ligado a seu antígeno para identificar resíduos de contato. Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutações do aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. A invenção inclui anticorpos que competem com 16B5 e/ou que se ligam ao mesmo epítopo em tau como 16B5.
[0046] Concorrência entre anticorpos é determinada por um ensaio no qual um anticorpo em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência (por exemplo, 16B5) para um antígeno comum (ver, por exemplo, Junghans et al, Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste concorre com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) inibe a ligação do anticorpo de referência por pelo menos 50%, mas de preferência 75%, 90% ou 99% como medido em um ensaio de ligação competitiva. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que o bloqueio estérico ocorra.
[0047] O termo "paciente" inclui sujeitos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.
[0048] Para fins de classificação das substituições de aminoácidos como conservadoras ou não conservadoras, aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos influenciando orientação de cadeia): gly, pro; e grupo VI (cadeias aromáticas laterais): trp, tyr, phe. Substituições conservadoras envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não- conservativas constituem a troca de um membro de uma dessas classes por membro de outra classe.
[0049] Identidades de sequência de porcentagem são determinadas com sequências de anticorpo maximamente alinhadas pela Convenção de numeração de Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo do sujeito (por exemplo, toda a região variável madura de uma cadeia leve ou pesada) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência de percentual entre as regiões de anticorpo do sujeito e da referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido na região de anticorpo de referência e do sujeito dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter em porcentagem.
[0050] O termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando administrado em conjunto com um antígeno aumenta e/ou redireciona a resposta imune ao antígeno, mas quando administrado sozinho não gera uma resposta imune ao antígeno. Adjuvantes podem aumentar uma resposta imune por vários mecanismos, incluindo o recrutamento de linfócitos, estimulação de células B ou T e estimulação de macrófagos.
[0051] A doença está associada com tau se uma população de pacientes com a doença tem níveis aumentados de tau no cérebro, ou aumento da deposição ou inclusões de tau, ou a presença de emaranhados de tau no cérebro, ou aumento da fosforilação de tau no cérebro (número médio de grupos de fosfato por molécula de tau), ou transmissão intercelular ou intracelular aberrante de tau em comparação com uma população de indivíduos não conhecidos por terem uma doença neurológica. Uma doença também está associada com tau se os pacientes com uma forma variante de um gene de tau têm um risco aumentado de desenvolver a doença em relação a pacientes com um gene de tau de tipo selvagem (variante mais frequentemente ocorrendo em uma população humana).
[0052] Um indivíduo está em risco aumentado de doença se o sujeito tem pelo menos um conhecido fator de risco (por exemplo, genética, história familiar, bioquímica, exposição situacional), colocando indivíduos com esse fator de risco em um risco maior estatisticamente significativo de desenvolver a doença do que indivíduos sem o fator de risco.
[0053] O termo "sintoma" refere-se a uma evidência subjetiva de doença, tal como alterada marcha, como percebida pelo paciente. Um "sinal" refere-se a provas objetivas de uma doença como observada por um médico.
[0054] Significância estatística significa p<0,05.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Geral
[0055] A invenção fornece anticorpos que se ligam a tau. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 23-46 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se a tau independentemente do estado de fosforilação. Alguns anticorpos da invenção servem para inibir ou retardar patologias associadas a tau e deterioração sintomática associada. Embora a compreensão do mecanismo não seja necessária para a prática da invenção, uma redução de toxicidade pode ocorrer como resultado do anticorpo induzindo a fagocitose de tau, inibindo tau de agregação inter ou intramolecular ou de ligação a outras moléculas, por estabilização de uma conformação atóxica, ou inibindo a transmissão intercelular ou intracelular de formas patogénicas de tau, entre outros mecanismos. Os anticorpos da invenção ou agentes que induzem tais anticorpos podem ser usados em métodos de tratamento ou efetuando a profilaxia da doença de Alzheimer e outras doenças associadas com tau.
II. Tau
[0056] A menos que caso contrário aparente do contexto, referência a tau significa uma forma humana natural de tau, incluindo todas as isoformas independentemente de modificação pós-traducional (por exemplo, fosforilação, glicação ou acetilação) estar presente. Existem seis principais isoformas (variantes de splice) de tau ocorrendo no cérebro humano. A mais longa dessas variantes tem 441 aminoácidos, dos quais o resíduo de met inicial é clivado. Resíduos são numerados de acordo com a isoforma 441. Assim, por exemplo, referência a uma fosforilação na posição 404 significa posição 404 da isoforma 441, ou posição correspondente de qualquer outra isoforma quando maximamente alinhada com a isoforma 441. As sequências de aminoácidos das isoformas e números Swiss-Prot são indicados abaixo.
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[0057] Referência a tau inclui variações naturais conhecidas, cerca de 30 das quais são listadas no banco de dados Swiss-pro e permutações respectivas, bem como mutações associadas com patologias de tau, tais como a doença de Pick, demência, paralisia supranuclear, etc. (Veja, por exemplo, banco de dados Swiss-Pro e Poorkaj, et al. Ann Neurol. 43:815-825 (1998)). Alguns exemplos de mutações de tau numeradas pela isoforma 441 são uma mutação de lisina para treonina em resíduo de aminoácido 257 (K257T), uma mutação de isoleucina para valina na posição de aminoácido 260 (I260V); uma mutação de glicina para valina na posição do aminoácido 272 (G272V); uma mutação de asparagina a lisina na posição do aminoácido 279 (N279K); uma mutação de asparagina a histidina na posição do aminoácido 296 (N296H); uma mutação de prolina a serina na posição do aminoácido 301 (P301S); uma mutação de glicina a valina na posição do aminoácido 303 (G303V); uma mutação de serina a asparagina na posição 305 (S305N); uma mutação de glicina a serina na posição do aminoácido 335 (G335S); uma mutação de valina a metionina na posição 337 (V337M); uma mutação de ácido glutâmico para valina na posição 342 (E342V); uma mutação de lisina para isoleucina na posição do aminoácido 369 (K3691); uma mutação de glicina a arginina na posição do aminoácido 389 (G389R); e uma mutação de arginina para triptofano na posição do aminoácido 406 (R406W).
[0058] Tau pode ser fosforilada em um ou mais resíduos de aminoácidos, incluindo tirosina em posições de aminoácido 18, 29, 97, 310 e 394 serina em posições de aminoácido 184, 185, 198, 199, 202, 208, 214, 235, 237, 238, 262, 293, 324, 356, 396, 400, 404, 409, 412, 413 e 422; e treonina nas posições de aminoácidos, 175, 181, 205, 212, 217, 231 e 403.
III. Anticorpos A. Especificidade de ligação e propriedades funcionais
[0059] A invenção fornece anticorpos que se ligam a tau. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 23-46 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 25-44 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 28-41 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 30-39 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 3036 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 33-39 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos 33-36 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos se ligam especificamente a um epítopo incluindo resíduos 2830, 28-31, 28-32, 28-33, 28-34, 28-35, 28-36, 28-37, 28-38, 28-39, 28-40, 28-41, 29-31, 29-32, 29-33, 29-34, 29-35, 29-36, 29-37, 29-38, 29-39, 29-40, 29-41, 3032, 30-33, 30-34, 30-35, 30-36, 30-37, 30-38, 30-39, 30-40, 30-41, 31-33, 31-34, 31-35, 31-36, 31-37, 31-38, 31-39, 31-40, 31-41, 32-34, 32-35, 32-36, 32-37, 3238, 32-39,32-40, 32-41, 33-35, 33-36, 33-37, 33-38, 33-39, 33-40, 33-41, 34-36, 34-37, 34-38, 34-39, 34-40, 34-41, 35-37, 35-38, 35-39, 35-40, 35-41, 36-38, 36- 39, 36-40, 36-41 de SEQ ID NO: 1. Alguns anticorpos ligam-se a tau independentemente do estado de fosforilação. Alguns anticorpos ligam-se a um epítopo não incluindo um resíduo sujeito a fosforilação. Estes anticorpos podem ser obtidos por imunização com um polipeptídio tau purificado a partir de uma fonte natural ou recombinantemente expresso. Anticorpos podem ser selecionados para ligação a tau na forma não fosforilada, bem como numa forma em que um ou mais resíduos suscetíveis a fosforilação são fosforilados. Esses anticorpos ligam-se de preferência com afinidades indistinguíveis, ou pelo menos dentro de um fator 1.5, 2 ou 3 vezes mais a tau fosforilada em comparação com tau não-fosforilada (, ou seja, são "pan-específicas). 16B5 é um exemplo de um anticorpo monoclonal pan-específico. A invenção também fornece a ligação de anticorpos ao mesmo epítopo como qualquer um dos anticorpos precedentes, tais como, por exemplo, o epítopo de 16B5. Também incluídos são anticorpos competindo por ligação a tau com qualquer um dos anticorpos precedentes, tais como, por exemplo, para competir com 16B5.
[0060] Os anticorpos acima mencionadas podem ser gerados de novo por imunização com um peptídeo incluindo resíduos 23-46, 25-44, 28-30, 28-31, 2832, 28-33, 28-34, 28-35, 28-36, 28-37, 28-38, 28-39, 28-40, 28-41, 29-31, 29-32, 29-33, 29-34, 29-35, 29-36, 29-37, 29-38, 29-39, 29-40, 29-41, 30-32, 30-33, 3034, 30-35, 30-36, 30-37, 30-38, 30-39, 30-40, 30-41, 31-33, 31-34, 31-35, 31-36, 31-37, 31-38, 31-39, 31-40, 31-41 , 32-34, 32-35, 32-36, 32-37, 32-38, 32-39, 3240, 32-41, 33-35, 33-36, 33-37, 33-38, 33-39, 33-40, 33-41, 34-36, 34-37, 34-38, 34-39, 34-40, 34-41, 35-37, 35-38, 35-39, 35-40, 35-41, 36-38, 36-39, 36-40, 3641 de SEQ ID NO:1 ou por imunização com um polipeptídio de tau de comprimento total ou fragmento dele que compreende resíduos e triagem por ligação específica ao peptídeo incluindo tais resíduos. Esses peptídeos de preferência estão ligados a uma molécula conjugada heteróloga que ajuda a trazer uma resposta de anticorpo para o peptídeo. Anexação pode ser direta ou através de um peptídeo de espaçador ou aminoácido. Cisteína é usada como um aminoácido de espaçador porque seu grupo SH livre facilita a anexação de uma molécula transportadora. Também pode ser usado um ligante de poliglicina (por exemplo, 2-6 glicinas), com ou sem um resíduo de cisteína entre as glicinas e o peptídeo. A molécula transportadora serve para fornecer um epítopo de célula T que ajuda a eliciar uma resposta de anticorpos contra o peptídeo. Diversos transportadores são comumente usados particularmente a hemocianina de keyhole limpet (KLH), a ovalbumina e a albumina de soro bovino (BSA). Espaçadores de peptídeo podem ser adicionados ao imunógeno de peptídeo como parte da síntese do peptídeo de fase sólida. Transportadores são normalmente adicionados pela química de reticulação. Alguns exemplos de reticuladores químicos que podem ser usados incluem éster cruz-N-maleimido-6- aminocaproil ou éster m-maleimidobenzoil-N-hdroxisuccinimida (MBS) (ver, por exemplo, Harlow, E. et al, Antibodies: A Labocamundongory Manual, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988; Sinigaglia et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz et al., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230242 (1994); WO 98/23635; e Southwood et al. J. Immunology, 160:3363-3373 (1998)). O transportador e o espaçador se presentes podem ser anexados a cada extremidade do imunógeno.
[0061] Um peptídeo com espaçador opcional e transportador pode ser usado para imunizar animais de laboratório ou B-células, conforme descrito em mais detalhes abaixo. Sobrenadantes de hibridoma podem ser testados em habilidade de ligação a um ou mais peptídeos incluindo resíduos 24-46, 25-44, 28-30, 28-31, 28-32, 28-33, 28-34, 28-35, 28-36, 28-37, 28-38, 28-39, 28-40, 2841, 29-31, 29-32, 29-33, 29-34, 29-35, 29-36, 29-37, 29-38, 29-39, 29-40, 29-41, 30-32, 30-33, 30-34, 30-35, 30-36, 30-37, 30-38, 30-39, 30-40, 30-41, 31-33, 3134, 31-35, 31-36, 31-37, 31-38, 31-39, 31-40, 31-41, 32-34, 32-35 , 32-36, 32-37, 32-38, 32-39, 32-40, 32-41, 33-35, 33-36, 33-37, 33-38, 33-39, 33-40, 33-41, 3436, 34-37, 34-38, 34-39, 34-40, 34-41, 35-37, 35-38, 35-39, 35-40, 35-41, 36-38, 36-39, 36-40, 36-41 de SEQ ID NO:1 e/ou formas fosforiladas ou não fosforiladas de tau, como, por exemplo, uma isoforma de tau de comprimento total com posição 404 na forma fosforilada. O peptídeo pode ser anexado a um transportador ou outro marcador para facilitar o teste de triagem. Neste caso, o transportador ou marcador é preferencialmente diferente da combinação de espaçador e molécula transportadora usada para imunização para eliminar anticorpos específicos ao espaçador ou transportador, ao invés do peptídeo de tau. Qualquer uma das isoformas de tau pode ser usada.
[0062] Anticorpos tendo a especificidade de ligação de um anticorpo murino selecionado (por exemplo, 16B5) também podem ser produzidos usando uma variante do método de visualização de fago. Veja Winter, WO 92/20791. Este método é particularmente apropriado para a produção de anticorpos humanos. Neste método, a região variável de cadeia leve ou pesada do anticorpo murino selecionada é usada como matéria-prima. Se, por exemplo, uma região variável de cadeia leve é selecionada como matéria-prima, uma biblioteca de fago é construída em que membros exibem a mesma região variável de cadeia leve (ou seja, a matéria-prima murina) e uma região variável de cadeia pesada diferente. As regiões variáveis de cadeia pesada por exemplo podem ser obtidas de uma biblioteca de regiões variáveis rearranjadas de cadeia pesada humana. Um fago mostrando forte ligação específica para o destino desejado (por exemplo, um peptídeo de tau) (por exemplo, pelo menos 108 e de preferência pelo menos 109 M-1de) é selecionado. Região variável de cadeia pesada deste fago então serve como matéria-prima para a construção de uma biblioteca de fago mais. Nesta biblioteca, cada fago exibe a mesma região variável de cadeia pesada (ou seja, região identificada da primeira biblioteca de exibição) e uma região variável de cadeia leve diferente. As regiões variáveis de cadeia leve por exemplo podem ser obtidas de uma biblioteca de regiões variáveis rearranjadas de cadeia leve humana. Seleciona-se novamente fago mostrando forte ligação específica ao destino desejado. Os anticorpos resultantes geralmente têm especificidade de epítopo igual ou similar àquela da matéria-prima murina.
[0063] Outros anticorpos podem ser obtidos por mutagênese do cDNA que codifica as cadeias pesadas e leves de um anticorpo exemplar, tal como 16B5. Os anticorpos monoclonais que são pelo menos 90%, 95% ou 99% idênticos a 16B5 na sequência de aminoácidos das regiões variável de cadeia pesada e/ou leve madura e mantêm suas propriedades funcionais e/ou que diferem dos respectivos anticorpos por um pequeno número de substituições de aminoácidos funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservadoras), deleções ou inserções, também estão incluídos na invenção. Anticorpos monoclonais tendo pelo menos uma e de preferência todas as seis CDR(s) conforme definido por Kabat que são 90%, 95%, 99% ou 100% idênticas às correspondentes CDRs de 16B5 também estão incluídos.
B. Anticorpos não humanos
[0064] A produção de outros anticorpos monoclonais não-humanos, por exemplo, murino, de porquinho-da-índia, primata, coelho ou rato, contra um imunógeno pode ser realizada por, por exemplo, imunizando o animal com um imunógeno, como descrito acima. Ver Harlow & Lane, Antibodies, A Labocamundongory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporado por referência para todos os propósitos). Um tal imunógeno pode ser obtido de uma fonte natural, pela síntese do peptídeo ou pela expressão recombinante.
[0065] Opcionalmente, o antígeno pode ser administrado com um adjuvante. Vários tipos de adjuvante podem ser usados conforme descrito abaixo. Adjuvante de Freund completo seguido de adjuvante incompleto é preferencial para a imunização de animais de laboratório. Coelhos ou porquinhos da Índia são tipicamente usados para fazer anticorpos policlonais. Camundongos são tipicamente usados para fazer anticorpos monoclonais. Os anticorpos são triados para a vinculação específica opcional, anticorpos são ainda triados para ligação a uma região específica de tau. Esta triagem pode ser realizada através de determinação da ligação de um anticorpo a uma coleção de mutantes de deleção de tau e determinação de quais mutantes de deleção se ligam ao anticorpo. Ligação pode ser avaliada, por exemplo, por Western blot, FACS™ ou ELISA.
C. Anticorpos Humanizados
[0066] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado, no qual CDRs de um anticorpo não-humano de "doador" (, por exemplo, 16B5) são enxertadas em sequências de anticorpo humano de "aceptor" (ver, por exemplo, Queen, U.S. 5.530.101 e 5.585.089; Winter, U.S. 5.225.539, Carter, U.S. 6.407.213, Adair, U.S. 5.859.205, Foote, U.S. 6.881.557, 6.881.557). As sequências de anticorpo aceptor podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humano maduro, um composto de tais sequências, uma sequência de consenso de sequências de anticorpo humano ou uma sequência de região de linha genética. Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo tendo algumas ou todas as CDRs inteiramente ou substancialmente de um anticorpo doador e sequências de framework de região variável e regiões constantes, se presente, inteiramente ou substancialmente de sequências de anticorpo humano. Da mesma forma uma cadeia pesada humanizada tem pelo menos uma, duas e geralmente todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente de uma cadeia pesada do anticorpo de doador e uma sequência de framework de região variável de cadeia pesada e região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente de framework de região variável de cadeia pesada humana e sequências de região constante. Da mesma forma, uma cadeia leve humanizada tem pelo menos uma, duas e geralmente todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente de uma cadeia leve do anticorpo doador e uma sequência de framework de região variável de cadeia leve e região constante de cadeia leve, se presente, substancialmente, do framework de região variável de cadeia humana leve e sequências de região constante. Além de nanocorpos e Dabs, um anticorpo humanizado é composto por uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. Uma CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente em um anticorpo não-humano quando pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos correspondentes (como definido por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs. As sequências de framework de região variável de uma cadeia de anticorpo ou região constante de uma cadeia anticorpo são substancialmente de uma sequência de framework de região variável humana ou região constante humana respectivamente quando pelo menos 85, 90, 95 ou 100% de resíduos correspondentes definidos por Kabat são idênticos.
[0067] Embora anticorpos humanizados frequentemente incorporem todas as seis CDRs (de preferência conforme definido por Kabat) de um anticorpo do camundongo, também podem ser feitos com menos de todas as CDRs (por exemplo, pelo menos, 3, 4 ou 5) CDRs de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:10791091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).
[0068] Em alguns anticorpos apenas uma parte das CDRs, nomeadamente o subconjunto de resíduos de CDR exigido para ligação, denominada as SDRs, é necessária para manter a ligação de um anticorpo humanizado. Resíduos de CDR não em contato com o antígeno e não nas SDRs podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, resíduos H60-H65 em CDR H2 muitas vezes não são necessários), de regiões de CDRs de Kabat fora loops hipervariáveis de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelagem molecular e/ou empiricamente, ou conforme descrito em Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. Em tais anticorpos humanizados em posições nas quais um ou mais resíduos de CDR de doador estão ausentes ou em que um CR de doador todo for omitido, o aminoácido ocupando a posição pode ser um aminoácido que ocupa a posição correspondente (por numeração de Kabat) na sequência de anticorpo de aceptor. O número de tais substituições de aminoácidos de aceptor para doador nas CDRs para incluir reflete um equilíbrio de considerações concorrentes. Tais substituições são potencialmente vantajosas em diminuir o número de aminoácidos do camundongo em um anticorpo humanizado e consequentemente diminuir a imunogenicidade potencial. No entanto, substituições também podem causar alterações de afinidade, e reduções significativas na afinidade de preferência são evitadas. Posições de substituição dentro de CDRs e aminoácidos para substituir também podem ser selecionadas empiricamente.
[0069] As sequências de anticorpo humano de aceptor podem opcionalmente ser selecionadas dentre as muitas sequências de anticorpo humano conhecidas para fornecer um alto grau de identidade de sequência (por exemplo, 65-85% de identidade) entre um framework de região variável de sequência aceptor humana e frameworks de região variável correspondentes de uma cadeia de anticorpos de doador.
[0070] Certos aminoácidos dos resíduos do quadro de região variável humanos podem ser selecionados para substituição com base em sua possível influência na conformação e/ou ligação do CDR ao antígeno. Investigação de tais influências possíveis é por modelagem, análise das características dos aminoácidos em locais específicos, ou observação empírica de efeitos de substituição ou mutagênese de aminoácidos específicos.
[0071] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo de framework de região variável murina e um resíduo de framework de região variável humana selecionado, o aminoácido de framework humano pode ser substituído pelo aminoácido de framework equivalente do anticorpo do camundongo quando é razoavelmente esperado que o aminoácido: (1) não covalentemente ligue-se a antígeno diretamente, (2) seja adjacente à região CDR, (3) de outra forma interaja com uma região de CDR (por exemplo, é dentro de aproximadamente 6 A de uma região de CDR), (, por exemplo, identificado pela modelagem de cadeia leve ou pesada na estrutura solvida de uma cadeia homóloga imunoglobulina conhecida); e (4) um resíduo que participa na interface VL-VH.
[0072] Resíduos de framework de classes (1)-(3), conforme definido por Queen, US5.530, 101 são alternadamente às vezes referidos como resíduoscanônicos e de vernier. Resíduos de framework definindo classe canônica dos loops de CDR de doador determinando a conformação de um loop de CDR são muitas vezes referidos como resíduos canônicos (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987), Thornton & Martin J. Mol. Biol, 263, 800-815, 1996). Uma camada de resíduos de framework que suporta conformações de loop que liga antígeno desempenha um papel em ajustar o encaixe de um anticorpo ao antígeno e eles são muitas vezes referidos como resíduos vernier (Foote & Winter, 1992, J Mol Bio. 224, 487-499). Outros candidatos para substituição são resíduos criando um sítio potencial de glicosilação. Outros candidatos para substituição são aminoácidos de framework humano de aceptor que são incomuns para uma imunoglobulina humana naquela posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos com aminoácidos da posição equivalente do anticorpo doador do camundongo ou de posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais típicas. Outros candidatos para substituição são aminoácidos de framework humano de aceptor que são incomuns para uma imunoglobulina humana naquela posição.
[0073] A invenção fornece formas humanizadas do anticorpo do camundongo 16B5. O anticorpo do camundongo compreende regiões variáveis de cadeia leve e pesada com sequências de aminoácidos que compreendem SEQ ID NOs. 10 e 16, respectivamente). A invenção fornece uma região variável de cadeia pesada madura humanizada exemplificada (H1) e três regiões variáveis de cadeia leve madura humanizada exemplificadas (L1, L2 e L3). A variante de H1L2 tem a mesma ou melhor afinidade como um 16B5 quimérico e sete mutações reversas. H1L1 e H1L3 têm afinidade similar para 16B5 quimérico e seis mutações reversas
[0074] A invenção fornece variantes do anticorpo humanizado 16B5 H1L2 em que a região variável de cadeia pesada madura humanizada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:15 e a região variável de cadeia leve madura humanizada mostra pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% a 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22. De preferência, em tais anticorpos algumas ou todas as mutações reversas em H1L2 são retidas. Em outras palavras, pelo menos, 1, 2 ou 3 de posições H13 são ocupadas por K, posição H48 é ocupada por M e posição H91 é ocupada por F. De preferência, pelo menos, 1, 2, 3 ou todas as quatro posições de L1 é ocupada por N, posição L4 é ocupada por L, posição L36 é ocupada por F e posição L43 é ocupada por S. As regiões de CDR de tais anticorpos humanizados são preferencialmente idênticas ou substancialmente idênticas às regiões de CDR de H1L2, que são as mesmas que as do anticorpo de doador do camundongo. As regiões de CDR podem ser definidas por qualquer definição convencional (por exemplo, Chothia), mas são de preferência conforme definido por Kabat.
[0075] Uma possibilidade de variação adicional em variantes de 16B5 é mutações reversas adicionais nos frameworks de região variável. Muitos dos resíduos de framework não em contato com CDRs no mAb humanizado podem acomodar substituições de aminoácidos de posições correspondentes do mAb do camundongo de doador ou outro anticorpo de camundongo ou humano, e mesmo muitos resíduos de CDR-contato potenciais também são passíveis de substituição ou mesmo aminoácidos dentro de CDRs pode ser alterados, por exemplo, com resíduos encontrados na posição correspondente da sequência de aceptor humano usada para fornecer frameworks de região variável. Além disso, sequências de aceptor humano alternativas podem ser usadas, por exemplo, para a cadeia pesada e/ou leve. Se sequências de aceptor diferentes são usadas, um ou mais das mutações reversas recomendadas acima podem não ser executadas porque os resíduos correspondentes de doador e aceptor já são a mesma coisa sem mutação reversa. Por exemplo, quando usando uma sequência de aceptor de cadeia pesada em cuja posição H13 já é ocupada por K mutação reversa não é necessária.
[0076] A invenção também inclui anticorpos humanizados, nos quais as regiões variáveis de cadeia leve e pesada madura mostram pelo menos 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com as regiões de cadeia leve e pesada maduras do anticorpo humanizado 16B5 H1L1 (SEQ ID NOs: 21 e 15, respectivamente) ou anticorpo humanizado 16B5 H1L3 (SEQ ID NOs: 23 e 15, respectivamente.
D. Anticorpos quimérico e com superfície modificada
[0077] A invenção ainda fornece formas quiméricas e com superfície modificada de anticorpos não-humanos, particularmente anticorpo 16B5.
[0078] Um anticorpo quimérico é um anticorpo no qual as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas maduras de um anticorpo não-humano (por exemplo, um camundongo) são combinadas com regiões constantes de cadeia humana pesada e leve. Tais anticorpos substancialmente ou inteiramente mantém a especificidade de ligação do anticorpo do camundongo e são cerca de dois terços de sequência humana.
[0079] Um anticorpo com superfície modificada é um tipo de anticorpo humanizado que mantém algumas e normalmente todas as CDRs e alguns dos resíduos estruturais da região variável não-humana de um anticorpo não-humano, mas substitui outros resíduos estruturais da região variável que podem contribuir para os epítopos de célula T- ou B-, por exemplo, resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com resíduos de posições correspondentes de umasequência de anticorpo humano. O resultado é um anticorpo no qual CDRs são inteiramente ou substancialmente de um anticorpo não-humano e as estruturas da região variável do anticorpo não-humano são mais semelhantes às humanas pelas substituições. Formas com superfície modificada do anticorpo 16B5 são incluídas na invenção.
E. Anticorpos humanos
[0080] Anticorpos humanos contra tau são fornecidos por uma variedade de técnicas descritas abaixo. Métodos para a produção de anticorpos humanos incluem o método de trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente U.S. No. 4,634,664; e Engleman et al., Patente U.S. 4,634,666, uso de camundongos transgênicos, incluindo genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Lonberg et al, WO93/12227 (1993); U.S. 5.877.397, U.S. 5.874.299, U.S. 5.814.318, U.S. 5.789.650, U.S. 5.770.429, U.S. 5.661.016, U.S. 5.633.425, U.S. 5.625.126, U.S. 5.569.825, U.S., 5.545.806, Nature148, 1547- 1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) e métodos de exibição de fago (ver, por exemplo, Dower et al, WO 91/17271 e McCafferty et al, WO 92/01047, U.S. 5.877.218 , U.S. 5.871.907, U.S. 5.858.657, U.S. 5.837.242, U.S. 5.733.743 e U.S. 5.565.332.
F. Seleção de região constante
[0081] As regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos quiméricos, humanizados (incluindo com superfície modificada), ou anticorpos humanos podem estar ligados a pelo menos uma porção de uma região humana constante. A escolha da região constante depende, em parte, se o complemento dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade mediada por celular é desejado. Por exemplo, isótopos humanos IgG1 e IgG3 têm citotoxicidade mediada por complemento enquanto isótopos humanos IgG2 e IgG4 têm citotoxicidade pobre ou não mediada por complemento. Regiões constantes de cadeia leve podem ser lambda ou kappa. Anticorpos podem ser expressos como tetrâmeros contendo duas cadeias leves e duas pesadas, como distintas cadeias pesadas, leves, como Fab, Fab' F(ab') 2 e Fv, ou como anticorpos de cadeia única, em que regiões variáveis de cadeia leve e pesada são ligadas através de um espaçador.
[0082] Regiões constantes humanas mostram variação alotípica e isoalotípica entre diferentes indivíduos, ou seja, as regiões constantes podem ser diferentes em indivíduos diferentes em uma ou mais posições polimórficas. Isoalótipos diferem dos alótipos no sentido em que soros reconhecendo um isoalótipo ligam-se a uma região não polimórfica de um ou mais outros isótopos. Referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alótipo natural ou qualquer permutação de resíduos ocupando posições polimórficas em alótipos naturais ou até 3, 5 ou 10 substituições para reduzir ou aumentar a função efetora, conforme descrito abaixo.
[0083] Um ou vários aminoácidos no amino ou carboxi terminal de cadeia leve e/ou pesada, como a lisina de C-terminal de cadeia pesada, pode estar ausente ou derivada em uma parte ou todas as moléculas. Substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora como citotoxicidade mediada por complemento ou ADCC (Veja, por exemplo, Winter et al, Patente U.S. N° 5.624.821; Tso et al, Patente U.S. N° 5.834.597; e Lazar et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia-vida em humanos (ver, por exemplo, Hinton et al, J. Biol. Chem. 279:6213, 2004).Exemplares substituições incluem um Gln na posição 250 e/ou um Leu na posição 428 (numeração EU é usada neste parágrafo para a região constante) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. Substituição em qualquer ou todas as posições, 234, 235, 236 e 237 / reduzem afinidade a receptores de FCY,particularmente receptor de FCYRI (ver, por exemplo, U.S. 6.624.821). Uma substituição de alanina em posições 234, 235 e 237 da IgG1 humana é preferida para reduzir funções efetoras. Opcionalmente, posições 234, 236 e/ou 237 em IgG2 humana são substituídas com alanina e posição 235 com glutamina. (Ver, por exemplo, U.S. 5.624.821.)
G. Expressão de Anticorpos Recombinantes
[0084] Anticorpos quiméricos, humanizados (incluindo com superfície modificada) e humanos são normalmente produzidos pela expressão recombinante. Ácidos nucleicos codificando os anticorpos podem ser códon- otimizados para expressão no tipo de célula desejado (por exemplo, CHO ou Sp2/0). Ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de cadeia leve e pesada de 16B5 humanizado divulgadas neste documento têm sequências compreendendo ou constituída de, por exemplo, SEQ ID NO: 25 (codificando Hu16B5 H1), SEQ ID NO: 26 (codificando Hu16B5 L1), SEQ ID NO: 27 (codificando Hu16B5 L2), SEQ ID NO: 28 (codificando Hu16B5 L3). Para as regiões variáveis incluindo peptídeos de sinal como SEQ ID NOs. 10 e 16, o ácido nucleico pode codificar a região variável com ou sem o peptídeo de sinal. Segmentos de ácido nucleico codificando cadeia leve e pesada podem estar presentes na mesma molécula contígua de ácido nucleico ou em moléculas separadas. As cadeias leves e pesadas podem ser expressas do mesmo vetor ou de vetores diferentes. Ácidos nucleicos são normalmente fornecidos na forma isolada.
[0085] Ácidos nucleicos codificando uma região variável de cadeia pesada de 16B5 humanizada podem ser ligados a um segmento de ácido nucleico codificando uma região constante de IgG1 humana, por exemplo, tendo a sequência de SEQ ID NO: 30. Esses ácidos nucléicos também podem incluir um íntron localizado entre os segmentos codificando a região variável de cadeia pesada e a região constante de IgG1, ou seja, 5' para o segmento de codificação da região constante. Uma sequência de ácido nucleico exemplar codificando uma região constante de IgG1 humana e tendo um íntron de camundongo em sua extremidade 5' é mostrada em SEQ ID NO: 31.
[0086] Ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de cadeia leve de 16B5 humanizada podem ser ligados a um segmento de ácido nucleico codificando uma região constante de kappa humana, por exemplo, tendo a sequência de SEQ ID NO: 33. Esses ácidos nucléicos também podem incluir um íntron localizado entre os segmentos codificando a região variável de cadeia leve e a região constante de kappa, ou seja, 5' para a região constante de kappa). Uma sequência de ácido nucleico exemplar codificando uma região constante de kappa humana e tendo um íntron humano em sua extremidade 5' é mostrada em SEQ ID NO: 34.
[0087] Construtos de polinucleotídio recombinante tipicamente incluem uma sequência de controle de expressão de forma operável ligada às sequências de codificação das cadeias de anticorpo, incluindo regiões do promotor naturalmente associadas ou heterólogas. De preferência, as sequências de controle de expressão são sistemas eucarióticos promotores em vetores capazes de transformar ou transfectar células eucariontes hospedeiras. Uma vez que o vetor foi incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para expressão de nível alto das sequências de nucleotídeos, e a coleção e a purificação dos anticorpos em reação cruzada. O vetor ou vetores codificando as cadeias de anticorpo também podem conter um gene selecionável, tais como dihidrofolato redutase ou glutamina sintase, para permitir a ampliação do número de cópia dos ácidos nucleicos codificando as cadeias de anticorpo.
[0088] E. coli é um hospedeiro procariótico particularmente útil para expressar os anticorpos, particularmente os fragmentos de anticorpos. Micróbios, tais como levedura, também são úteis para expressão. Saccharomyces é um hospedeiro preferencial, com vetores adequados tendo sequências de controle de expressão, uma origem de replicação, sequências de terminação semelhantes como desejado. Promotores típicos incluem 3-fosfoglicecamundongo quinase e outras enzimas glicolíticas. Promotores de levedura indutíveis incluem, dentre outros, promotores a partir de álcool desidrogenase, isocitocromo C e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e a galactose.
[0089] Células de mamíferos são um hospedeiro preferencial para expressar os segmentos de nucleotídeo codificando imunoglobulinas ou fragmentos delas. Vide Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., (1987). Um número de linhas de células de hospedeiro adequadas capazes de secretar proteínas heterólogas intactas foram desenvolvidas na técnica e incluem linhas de células CHO, várias linhas de células COS, as células HeLa, células HEK293, células L e mielomas não-produtores de anticorpos, incluindo Sp2/0 e NS0. De preferência, as células são não-humanas. Vetores de expressão para essas células podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um potencializador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), e locais de informação de processamento necessários, tais como locais de vinculação de ribossomo, locais de splicing de RNA, locais de poliadenilação e sequências de terminação transcricional. Sequências de controle de expressão preferenciais são promotores derivados de genes endógenos, de citomegalovírus, SV40, adenovírus, papilomavírus bovino, e afins. Vide Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[0090] Tendo introduzido vetor(es) codificando cadeias de anticorpo pesada e leve em cultura de células, agrupamentos de célula podem ser triados para produtividade de crescimento e qualidade de produto em meios livres de soro. Agrupamentos de células as mais produtoras podem então ser submetido a clonagem baseada em FACS monocelular para gerar linhas monoclonais. Produtividades específicas acima de 50 pg ou 100 pg por célula por dia, que correspondem aos títulos de produto de maior cultura de 7,5 g/L, são preferidas. Anticorpos produzidos por clones de única célula também podem ser testados para turbidez, propriedades de filtragem, PAGE, IEF, varredura UV, HP-SEC, mapeamento de carboidrato-oligossacarídeo, espectometria em massa e ensaio de bining, tais como ELISA ou Biacore. Um clone selecionado pode ser preservado em vários frascos e armazenado congelado para uso posterior.
[0091] Uma vez expressos, anticorpos podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo captura de proteína A, cromatografia de coluna (por exemplo, interação hidrofóbica ou troca iônica), baixo-pH para inativação viral e afins (consulte geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
[0092] Metodologia para a produção comercial de anticorpos pode ser empregada, incluindo otimização de códon, seleção de promotores, elementos de transcrição, e terminadores, clonagem de célula isenta de soro de única célula, preservação em banco de célula, uso de marcadores de seleção para a amplificação do número de cópia, terminador de CHO, clonagem de célula única livre de soro, melhoria das titulações de proteína (ver, por exemplo, U.S. 5.786.464 U.S. 6.114.148, U.S. 6.063.598, U.S., 7.569.339, WO2004/050884,WO2008/012142 WO2008/012142, WO2005/019442, WO2008/107388 e WO2009/027471 e U.S. 5.888.809).
IV. Imunógenos Ativos
[0093] Um agente usado para imunização ativa serve para induzir em um paciente os mesmos tipos de anticorpos descritos em conexão com a imunização passiva acima. Agentes usados para imunização ativa podem ser os mesmos tipos de imunógenos usados para a geração de anticorpos monoclonais em animais de laboratório, por exemplo, um peptídeo de 3-15, 3-12 ou 5-12, ou 5-8 aminoácidos contíguos de uma região de tau correspondente a resíduos 23-46, 25-44, 28-41 ou 30-39 de SEQ ID NO: 1, tais como, por exemplo um peptídeo incluindo resíduos 28-30, 28-31, 28-32, 28-33, 28-34, 28-35, 28-36, 28-37, 28-38, 28-39, 28-40, 28-41, 29-31, 29-32, 29-33, 29-34, 29-35, 29-36, 29-37, 29-38, 2939,29-40, 29-41, 30-32, 30-33, 30-34, 30-35, 30-36, 30-37, 30-38, 30-39, 30-40, 30-41, 31-33, 31-34, 31-35, 31-36, 31-37, 31-38, 31-39, 31-40, 31-41, 32-34, 3235, 32-36, 32-37, 32-38, 32-39, 32-40, 32-41, 33-35, 33-36, 33-37, 33-38, 33-39, 33-40, 33-41, 34-36, 34-37, 34-38, 34-39, 34-40, 34-41, 35-37, 35-38, 35-39, 3540, 35-41, 36-38, 36-39, 36-40, 36-41 de SEQ ID NO:1. Para induzir a ligação de anticorpos ao mesmo epítopo ou sobreposto como 16B5, a especificidade de epítopo destes anticorpos pode ser mapeada (por exemplo, através do teste de ligação a uma série de peptídeos sobrepostos abrangendo tau). Um fragmento de tau constituído de ou incluindo ou sobrepondo o epítopo pode ser usado como um imunógeno. Esses fragmentos são normalmente usados em forma não fosforilada.
[0094] O transportador heterólogo e adjuvante, se usados, podem ser os mesmos usados para gerar o anticorpo monoclonal, mas também podem ser selecionados para melhor adequação farmacêutica para uso em seres humanos. Transportadores apropriados incluem albuminas de soro, hemocianina de keyhole limpet, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxóide tetânico ou um toxóide de outras bactérias patogênicas, tais como difteria (por exemplo, CRM197), e. coli, cólera, ou H. pylori, ou um derivado da toxina atenuada. Epítopos de célula t também são moléculas transportadoras adequadas. Alguns conjugados podem ser formados por ligação de agentes da invenção a uma molécula de polímero imunoestimulatória (por exemplo, tripalmitoil-S-glicerina cisteína (Pam3Cys), mannano (um polímero de manose) ou glucano (um polímero de β 1^2), citocinas (por exemplo, IL-1, alfa IL-1 e β peptídeos, Il-2, /Y-INF, IL-10, GM-CSF) e quimiocinas (por exemplo, MIP1-α e β e RANTES). Imunógenos podem estar ligados aos transportadores com ou sem aminoácidos espaçadores (por exemplo, gly-gly). Transportadores adicionais incluem partículas similares a vírus. Partículas similares a vírus (VLPs), também chamadas de pseudovirions ou partículas vírus-derivadas, representam estruturas de subunidade compostas de várias cópias de uma proteína de capsídeo e/ou de envelope viral capaz de automontagem em VLPs de simetria esférica definida in vivo. (Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415.) Alternativamente, imunógenos de peptídeo podem ser ligados a pelo menos um epítopo de célula T artificial capaz de ligação a uma grande proporção de moléculas de MHC classe II, tais como o pan epítopo DR ("PADRE"). PADRE é descrito em U.S. 5.736.142 WO 95/07707 e Alexander J et al, Immunity, 1:751-761 (1994). Imunógenos ativos podem ser apresentados sob forma multimérica em que várias cópias de um imunógeno e/ou seu transportador são apresentadas como uma única molécula covalente.
[0095] Fragmentos são muitas vezes administrados com adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. O adjuvante aumenta o título de anticorpos induzidos e/ou a afinidade de ligação de anticorpos induzidos em relação à situação de o peptídeo ter sido usado sozinho. Uma variedade de adjuvantes pode ser usada em combinação com um fragmento imunogênico de tau para eliciar uma resposta imune. Os adjuvantes preferidos para aumentar a resposta intrínseca a um imunógeno sem causar mudanças conformacionais do imunógeno que afetam a forma qualitativa da resposta. Adjuvantes preferenciais incluem sais de alumínio, como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, 3 De-O-acilado monofosforil lipídio A (MPLTM) (ver GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, agora parte da Corixa). StimulonTM QS-21 é um triterpeno glicosídeo ou saponina isolada da casca da árvore de Quillaja Saponaria Molina, encontrada na América do Sul (ver Kensil et al., Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. 5.057.540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA; now Antigenics, Inc., New York, NY). Outros adjuvantes são óleo em emulsões de água (como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente, em combinação com estimulantes imunes, tais como monofosforil lipídio A (veja Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), polímeros plurônicos e micobactérias mortas. Adjuvantes Ribi são emulsões óleo-em-água. RIBI contém um óleo metabolizável (esqualeno) emulsionado com solução salina contendo Tween 80. RIBI também contém produtos refinados de micobactérias que atuam como imunoestimuladores e monofosforil lipídico bacteriano A. Outro adjuvante é CpG (WO 98/40100). Adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição terapêutica com agente ativo ou podem ser administradas separadamente, antes, concorrentemente com ou após a administração do agente terapêutico.
[0096] Análogos de fragmentos naturais de tau que induzem anticorpos contra tau também podem ser usados. Por exemplo, um ou mais ou todos L- aminoácidos podem ser substituídos com D aminoácidos em tais peptídeos. Também a ordem dos aminoácidos pode ser revertida (retropeptídeo). Opcionalmente, um peptídeo inclui todos os D-aminoácidos em ordem inversa (peptídeo retro-inverso). Peptídeos e outros compostos que não têm necessariamente uma similaridade de sequência de aminoácido significativa com peptídeos de tau, mas, no entanto, servem como miméticos de peptídeos de tau e induzem uma resposta imune semelhante. Anticorpos anti-idiotípicos contra anticorpos monoclonais para tau como descrito acima também podem ser usados. Tais anticorpos anti-Id mimetizam o antígeno e geram uma resposta imune a isso (ver Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6a ed., p. 181).
[0097] Peptídeos (e, opcionalmente, um transportador fundido a peptídeo) também podem ser administrados sob a forma de um ácido nucleico codificando o peptídeo e expresso in situ em um paciente. Um segmento de ácido nucleico codificando um imunógeno é tipicamente ligado a elementos de regulamentação, tais como um promotor e potenciador que permitem a expressão do segmento de DNA nas células alvo pretendidas de um paciente. Para expressão em células do sangue, como é desejável para a indução de uma resposta imune, promotor e potenciador de elementos de genes de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve ou o promotor e potenciador inicial intermediário maior do CMV são adequados para a expressão direta. Os elementos de regulação ligados e sequências de codificação são frequentemente clonados em um vetor. Anticorpos também podem ser administrados sob a forma de ácidos nucleicos codificando as cadeias de anticorpo pesada e/ou leve. Se ambas as cadeias pesada e leve estão presentes, as cadeias de preferência estão ligadas como um anticorpo de cadeia única. Anticorpos para administração passiva podem também ser preparados, por exemplo, por cromatografia de afinidade de soros de pacientes tratados com imunógenos de peptídeo.
[0098] O DNA pode ser entregue em forma nua (, ou seja, sem materiais coloidais ou de encapsular). Uma série de sistemas de vetor viral pode ser usado alternativamente incluindo sistemas retrovirais (Veja, por exemplo, Lawrie e Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); vetores de adenovírus {ver, por exemplo, Bett et al, J. Virol. 67, 5911 (1993)); vetores de vírus adeno- associados {ver, por exemplo, Zhou et al, J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), vetores virais da família de varíola, incluindo vírus vaccinia e o vírus da varíola aviária, vetores virais do gênero alfa vírus tais como os derivados de Sindbis e vírus de floresta de Semliki (Veja, por exemplo, Dubensky et al, J. Virol. 70, 508-519 (1996)), vírus da encefalite equina venezuelana (ver EUA 5.643.576) e rabdovírus, como o vírus da estomatite vesicular (ver WO 96/34625) e o papilomavírus (Ohe et al, Human GeneTherapy 6, 325-333 (1995); Woo et al, WO 94/12629 e Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).
[0099] DNA codificando um antígeno ou um vetor contendo o mesmo, pode ser embalado em lipossomas. Lipídios adequados e análogos relacionados são descritos pelas U.S. 5.208.036, EUA 5.264.618, U.S. 5.279.833 e U.S. 5.283.185. Vetores e DNA codificando um antígeno também podem ser adsorvidos ou associado com partículas transportadoras, exemplos das quais incluem polímeros de polimetil metacrilato e polilactactos e poli(lactido-co-glicólidos), (Veja, por exemplo, McGee et al, J. Micro Encap. 1996).
V. Métodos de Triagem
[0100] Anticorpos pode inicialmente ser triados para a especificidade de ligação pretendida conforme descrito acima. Imunógenos ativos da mesma forma podem ser triados por capacidade de induzir anticorpos com tal especificidade de ligação. Neste caso, um imunógeno ativo é usado para imunizar um animal de laboratório e os soros resultantes testados para a especificidade de ligação apropriada.
[0101] Anticorpos tendo a especificidade desejada de ligação então podem ser testados em modelos de celulares e animais. As células utilizadas para tal triagem são células neuronais preferencialmente. Um modelo celular de patologia de tau foi relatado no qual células de neuroblastoma são transfectadas com um domínio de quatro repetições de tau, opcionalmente com uma mutação associada com patologia de tau (por exemplo, delta K280, ver Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544-546 (2007)). Em outro modelo, tau é induzido na linhagem de células N2a de neuroblastoma pela adição de doxiciclina. Os modelos de célula permitem que se estude a toxicidade de tau para células em estado solúvel ou agregado, a aparência dos agregados de tau após a mudança na expressão do gene de tau, a dissolução dos agregados de tau após desligar novamente a expressão do gene e a eficiência dos anticorpos na inibição da formação de agregados de tau ou desagregar-lhes.
[0102] Anticorpos ou imunógenos ativos também podem ser triados em modelos animais transgênicos das doenças associadas com tau. Tais animais transgênicos podem incluir um transgene de tau (, por exemplo, qualquer uma das isoformas humanas) e, opcionalmente, um transgene humano APP entre outros, tais como uma quinase que fosforila tau, ApoE, alfa sinucleína ou presenilina. Tais animais transgénicos estão dispostos a desenvolver pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença associada com tau.
[0103] um animal transgênico exemplar é a linha K3 de camundongos (Itner et al, proc. Natl. Acad. Sci. US 105(41):15997-6002 (2008)). Estes camundongos têm um transgene humano de tau com uma mutação K 369 I (a mutação está associada com a doença de Pick) e um promotor de Thy 1.2. Este modelo mostra um curso rápido de neurodegeneração, déficit motor e degeneração de fibras aferentes e células de grânulo cerebelar. Um outro animal exemplar é a linha de pR5 dos camundongos. Estes camundongos têm um transgene humano de tau com uma mutação de P301L (a mutação é associada com demência frontotemporal) e um promotor de Thy 1.2 (Taconic, Germantown, N.Y., Lewis et al, Nat Genet. 25:402-405 (2000)). , Esses camundongos têm um curso mais gradual de neurodegeneração. Os camundongos desenvolvem emaranhados neurofibrilares em várias regiões do cérebro e da medula espinhal, que por este meio é incorporada por referência, na sua totalidade). Este é um excelente modelo para estudar as consequências do desenvolvimento de emaranhado e para a triagem de terapia que pode inibir a geração destes agregados. Outra vantagem destes animais é o início relativamente precoce da patologia. Na linha de homozigoto, anormalidades comportamentais associadas à patologia de tau podem ser observadas pelo menos tão cedo quanto em 3 meses, mas os animais permanecem relativamente saudáveis, pelo menos, até 8 meses de idade. Em outras palavras, aos 8 meses os animais deambulam, alimentam-se e podem executar tarefas comportamentais suficientemente bem para permitir que o efeito do tratamento seja monitorado. Imunização ativa destes camundongos por 6-13 meses com - AI wI KLH-PHF-1 gerou títulos de cerca de 1.000 e mostraram menos emaranhados neurofibrilares, menos pSer422 e perda de peso reduzida em relação ao gelo de controle não tratado.
[0104] A atividade de anticorpos ou agentes ativos pode ser avaliada por vários critérios, incluindo a redução na quantidade de tau total ou tau fosforilado, redução em outras características patológicas, tais como depósitos amilóides de um Aβ e inibição ou atraso ou défices comportamentais. Imunógenos ativos também podem ser testados para indução de anticorpos nos soros. Imunógenos ativos e passivos podem ser testados para a passagem de anticorpos através da barreira hemato-encefálica para o cérebro de um animal transgênico. Anticorpos ou fragmentos induzindo um anticorpo também podem ser testados em primatas não-humanos que naturalmente ou através de indução desenvolvem sintomas de doenças caracterizadas por tau. Testes em um anticorpo ou agente ativo geralmente são realizados em conjunto com um controle no qual uma experiência paralela é conduzida, exceto que o anticorpo ou o agente ativo é ausente (por exemplo, substituído por veículo). Redução, atraso ou inibição de sinais ou sintomas de doença atribuível a um anticorpo ou agente ativo em teste então pode ser avaliada em relação ao controle.
VI. Pacientes passíveis de tratamento
[0105] A presença de emaranhados neurofibrilares foi encontrada em várias doenças, incluindo a doença de Alzheimer, síndrome de Down, transtorno cognitivo leve, parkinsonismo pós-encefalite, demência pós-traumática ou demência pugilística, doença de Niemann-Pick tipo C, degeneração lobar frontotemporal, complexo de demência esclerose lateral amiotrófica/parkinsonismo de Guam, paralisia supranuclear, demência frontotemporal e paralisia supranuclear progressiva de PSP. Os regimes presentes também podem ser usados no tratamento ou profilaxia de uma dessas doenças. Por causa da associação generalizada entre condições e doenças neurológicas e tau, os regimes presentes podem ser usados no tratamento ou profilaxia de qualquer sujeito mostrando níveis elevados de tau ou tau fosforilada (por exemplo, no CSF) comparados com um valor médio em indivíduos sem doença neurológica. Os regimes presentes também podem ser usados no tratamento ou profilaxia de doença neurológica em indivíduos que possuem uma mutação em tau associada com doença neurológica. Os métodos presentes são particularmente adequados para tratamento ou profilaxia da doença de Alzheimer e especialmente em pacientes.
[0106] Pacientes passíveis de tratamento incluem os indivíduos em risco de doença, mas não apresentando sintomas, bem como pacientes atualmente apresentando os sintomas. Pacientes em risco da doença incluem aqueles que têm um risco genético conhecido da doença. Tais indivíduos incluem aqueles que têm parentes que experimentaram esta doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores bioquímicos ou genéticos. Marcadores genéticos de risco incluem mutações em tau, tais como aquelas discutidos acima, bem como as mutações nos outros genes associados à doença neurológica. Por exemplo, o alelo ApoE4 em heterozigotos e mais ainda na forma homozigótica é associado com o risco de doença de Alzheimer. Outros marcadores de risco de doença de Alzheimer incluem mutações no gene da APP, particularmente as mutações na posição 717 e posições 670 e 671 referidas como as mutações Hardy e Swedish, respectivamente, mutações nos genes de presenilina, PS1 e PS2, uma história familiar de AD, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Indivíduos que atualmente sofrem de doença de Alzheimer podem ser reconhecidos por imagens de PET, de demência característica, bem como a presença de fatores de risco descritos acima. Além disso, um número de testes de diagnóstico está disponível para a identificação de indivíduos que têm AD. Estes incluem a medição dos níveis de Aβ42 ou fosfo-tau e tau CSF. Elevadas tau ou fosfo-tau e diminuição dos níveis de Aβ42 significam a presença de AD. Algumas mutações associadas com a doença de Parkinson. Ala30Pro ou Ala53 ou mutações nos outros genes associados com a doença de Parkinson como quinase de repetição rica em leucina, PARK8. Os indivíduos também podem ser diagnosticados com doenças neurológicas, mencionado acima pelos critérios do DSM IV TR.
[0107] Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade por exemplo, 10, 20, 30). Geralmente, no entanto, não é necessário começar o tratamento, até que um paciente atinge 40, 50, 60 ou 70 anos de idade. Tratamento geralmente envolve múltiplas doses durante um período de tempo. Tratamento pode ser monitorado por níveis de anticorpos em análise ao longo do tempo. Se a resposta cai, uma dose de reforço é indicada. No caso de potenciais pacientes de síndrome de Down, o tratamento pode começar pela administração de agente terapêutico para a mãe, ou logo após o nascimento.
VII. Composições farmacêuticas e métodos de tratamento
[0108] Em aplicações profiláticas, um anticorpo ou agente para induzir a um anticorpo ou uma composição farmacêutica é administrado a um paciente suscetível a, ou de outra forma, em risco de uma doença (por exemplo, a doença de Alzheimer), no regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou retardar o aparecimento de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em particular, o regime é de preferência eficaz para inibir ou atrasar a tau ou fosfo-tau e filamentos emparelhados formados a partir dela no cérebro, e/ou inibir ou atrasar seus efeitos tóxicos e/ou inibir / ou retardar o desenvolvimento dos défices comportamentais. Em aplicações terapêuticas, um anticorpo ou agente para induzir a um anticorpo é administrado a um paciente suspeito de ter ou que já sofre de uma doença (por exemplo, a doença de Alzheimer), em um regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para amenizar ou pelo menos inibir ainda mais a deterioração de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em particular, o regime é de preferência eficaz para reduzir ou pelo menos inibir o aumento dos níveis de tau, fósforo-tau ou filamentos pareados formados dela, toxicidades associadas e/ou déficits comportamentais.
[0109] Um regime é considerado terapêutica ou profilaticamente eficaz se um paciente tratado individual alcança um resultado mais favorável do que o resultado médio em uma população de controle dos pacientes comparáveis não tratados pelos métodos da invenção, ou se um resultado mais favorável é demonstrado em pacientes tratados contra pacientes de controle em um ensaio clínico controlado (por exemplo, um teste de fase II, fase II/III ou fase III) no nível de 0,01 ou 0,001 mesmo ou o p < 0,05.
[0110] Doses eficazes das composições da presente invenção variam dependendo de diversos fatores, incluindo os meios de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é um portador de ApoE, paciente humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico.
[0111] Um intervalo de dosagem exemplar para detecção de anticorpos é de cerca de 0,01 a 5 mg/kg e mais geralmente 0,1 a 3 mg/kg ou 0.15-2 mg/kg ou 0.15-1,5 mg/kg, de peso corporal de paciente. Anticorpos podem ser administrados com tais doses diariamente, em dias alternativos, semanalmente, a cada duas semanas, mensalmente, a cada três meses ou de acordo com qualquer outro horário determinado pela análise empírica. Um tratamento exemplar envolve a administração de doses múltiplas durante um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Exemplos de adicionais regimes de tratamento implicam a administração uma vez a cada duas semanas, ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 até 6 meses.
[0112] A quantidade de um agente para administração ativa varia de 0,1500 μg por paciente e, mais geralmente, de 1-100 ou 1-10 μg por injeção para a administração humana. O timing das injeções pode variar significativamente desde uma vez por dia, uma vez por ano, a uma vez em uma década. Um regime típico consiste de uma imunização seguida por injeções de reforço em intervalos de tempo, tais como intervalos de 6 semanas ou dois meses. Outro regime consiste de uma imunização seguida de injeções de reforço 1, 2 e 12 meses mais tarde. Outro regime implica uma injeção a cada dois meses por toda a vida. Alternativamente, injeções de reforço podem ser de forma irregular, conforme indicado pelo monitoramento da resposta imune.
[0113] Anticorpos ou agentes para indução de anticorpos são administrados de preferência através da rota periférica (ou seja, uma na qual um anticorpo administrado ou induzido atravessa a barreira hemato-encefálica para alcançar um local pretendido no cérebro. Vias de administração incluem, mas não são limitadas a intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intracranial subcutânea, intravenosa, intraarterial ou oral. Rotas preferenciais para a administração de anticorpos são intravenosa e subcutânea. Rotas preferenciais para a imunização ativa são subcutânea e intramuscular. Este tipo de injeção mais geralmente é executado em músculos do braço ou perna. Em alguns métodos, agentes são injetados diretamente em um determinado tecido onde depósitos têm acumulado, por exemplo por injeção intracraniana.
[0114] Composições farmacêuticas para a administração parenteral de preferência são estéreis e substancialmente isotônicas e fabricadas sob condições de GMP. Composições farmacêuticas podem ser fornecidas sob forma de dosagem de unidade (ou seja, a dose para uma única administração). Composições farmacêuticas podem ser formuladas usando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares. A formulação depende da via de administração escolhida. Para injeção, anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou soro fisiológico ou tampão de acetato (para reduzir o desconforto no local da injeção). A solução pode conter agentes formulatórios, como agentes de dispersão, suspensão e/ou estabilização. Alternativamente, anticorpos podem estar na forma liofilizada para a constituição antes do uso com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio.
[0115] Os regimes presentes podem ser administrados em combinação com outro agente eficaz no tratamento ou profilaxia da doença a ser tratada. Por exemplo, no caso de doença de Alzheimer, os regimes presentes podem ser combinados com imunoterapia contra um Aβ (WO/2000/072880), inibidores da colinesterase ou memantina ou, no caso de doença de Parkinson, imunoterapia contra alfa sinucleína WO/2008/103472, Levodopa, agonistas da dopamina, inibidores de COMT, inibidores de MAO-B, amantadina ou agentes anticolinérgicos.
VIII. Imageamento In Vivo, métodos de diagnóstico e otimização de imunoterapia
[0116] A invenção fornece métodos de imageamento in vivo de depósitos de proteína de tau (por exemplo, emaranhados neurofibrilares e inclusões de tau) em um paciente. Os métodos funcionam através da administração de um reagente, tais como anticorpos que ligam tau (por exemplo, um anticorpo de camundongo, humanizado, quimérico ou com superfície modificada 16B5), para o paciente e então detecção do agente depois que se ligou. Anticorpos que se ligam a um epítopo de tau dentro de aminoácidos 24 a 46 são preferidos. Em alguns métodos, o anticorpo liga-se a um epítopo em aminoácidos 25 a 44, ou dentro de aminoácidos 30 a 39. Uma resposta de compensação para os anticorpos administrados pode ser evitada ou atenuada usando fragmentos de anticorpos faltosos de uma região constante completa, como Fabs. Em alguns métodos, o mesmo anticorpo pode servir como um reagente de diagnóstico e tratamento.
[0117] Reagentes de diagnóstico podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente, ou diretamente no cérebro por injeção intracraniana ou perfurando um buraco através do crânio. A dosagem do reagente deve ser dentro dos mesmos intervalos que para métodos de tratamento. Normalmente, o reagente é rotulado, embora em alguns métodos o reagente primário com afinidade para tau é sem rótulo e um agente de rotulagem secundário é usado para ligar o reagente primário. A escolha do rótulo depende dos meios de detecção. Por exemplo, um rótulo fluorescente é adequado para detecção óptica. Utilização de rótulos paramagnéticos é apropriada para a detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. Rótulos radioativos também podem ser detectados usando PET ou SPECT.
[0118] Os métodos de imagem in vivo dos depósitos de proteína tau são úteis para diagnosticar ou confirmar o diagnóstico de uma taupatia, tais como a doença de Alzheimer, degeneração lobar frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva e doença de Pick ou susceptibilidade a uma tal doença. Por exemplo, os métodos podem ser usados em um paciente apresentando sintomas de demência. Se o paciente tem emaranhados anormais neurofibrilares, então o paciente provavelmente sofre de doença de Alzheimer. Alternativamente, se o paciente tem inclusões anormais de tau, então dependendo da localização das inclusões o paciente pode estar sofrendo de degeneração lobar frontotemporal. Os métodos também podem ser usados em pacientes assintomáticos. Presença de depósitos de proteína tau anormal indica susceptibilidade à futura doença sintomática. Os métodos também são úteis para monitorização de progressão da doença e/ou resposta ao tratamento em pacientes que foram previamente diagnosticados com uma doença relacionada a tau.
[0119] Diagnóstico pode ser executado, comparando o número, tamanho, e/ou intensidade dos loci rotulados com valores de base correspondentes. Os valores de linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos sem doença. Valores de linha de base também podem representar níveis anteriores determinados no mesmo paciente. Por exemplo, valores de linha de base podem ser determinados em um paciente antes do início do tratamento de imunoterapia com tau e posteriormente comparados com os valores basais de valores medidos. Uma diminuição de valores em relação à linha de base sinaliza uma resposta positiva ao tratamento.
[0120] Em alguns pacientes, o diagnóstico de uma taupatia pode ser auxiliado através da realização de uma tomografia. Uma tomografia pode ser executada usando, por exemplo, um Imageador de PET convencional e equipamentos auxiliares. A varredura geralmente inclui uma ou mais regiões do cérebro conhecidas em geral por serem associadas com depósitos de proteína tau e uma ou mais regiões em que poucos ou nenhum depósito estão geralmente presentes para servir como controles.
[0121] O sinal detectado em uma tomografia pode ser representado como uma imagem multidimensional. A imagem multidimensional pode ser em duas dimensões que representam um corte transversal através do cérebro, em três dimensões, que representam as três dimensões do cérebro, ou em quatro dimensões que representam as alterações no cérebro tridimensional ao longo do tempo. Uma escala de cores pode ser usada com cores diferentes indicando quantidades diferentes de rótulo e, inferencialmente, depósito de proteína de tau detectado. Os resultados da varredura podem também ser apresentados numericamente, com números relacionados com a quantidade de rótulo detectada e, consequentemente, a quantidade de depósitos de proteína tau. O rótulo presente em uma região do cérebro conhecida por ser associadas com depósitos para um taupatia particular (por exemplo, a doença de Alzheimer) pode ser comparado com o rótulo presente em uma região conhecida por não ser associada com depósitos para fornecer uma relação indicativa do grau de depósitos dentro da antiga região. Para o mesmo ligante radio-rotulado tais relações fornecem uma medida comparável de depósitos de proteína tau e alterações respectivas entre diferentes pacientes.
[0122] Em alguns métodos, uma tomografia é executada simultânea com ou na mesma visita de paciente que uma ressonância magnética ou tomografia computadorizada. Uma ressonância magnética ou tomografia computadorizada fornece mais detalhes anatômicos do cérebro do que uma tomografia (PET). No entanto, a imagem de uma tomografia (PET) pode ser sobreposta a uma imagem de ressonância magnética ou tomografia computadorizada mais precisamente indicando a localização do ligante de PET e inferencialmente depósitos de tau em relação a estruturas anatômicas no cérebro. Algumas máquinas podem realizar tanto tomografia PET e MRI ou tomografia computadorizada sem o paciente mudar posições entre os exames, facilitando a sobreposição de imagens.
[0123] Ligantes de PET apropriados incluem anticorpos radio-rotulados da invenção (por exemplo, um anticorpo de camundongo, humanizado, quimérico ou com superfície modificada 16B5). O radioisótopo usado pode ser, por exemplo, C11, N13, O15, F18 ou I123. O intervalo entre a administração do ligante de PET e executar a varredura pode depender do ligante de PET e particularmente sua taxa de absorção e depuração no cérebro e a meia-vida de seu radio-rótulo.
[0124] Tomografias PET também podem ser realizadas como uma medida profilática em pacientes assintomáticos ou em pacientes que apresentam sintomas de transtorno cognitivo leve mas ainda não foram diagnosticados com uma taupatia mas estão em risco elevado de desenvolver uma taupatia. Para pacientes assintomáticos, varreduras são particularmente úteis para os indivíduos considerados de risco elevado de taupatia por causa de história familiar, fatores de risco genéticos ou bioquímicos ou idade madura. Exames profiláticos podem começar por exemplo, em um paciente de idade entre 45 e 75 anos. Em alguns pacientes, uma primeira varredura é executada na idade de 50 anos.
[0125] varreduras profiláticas podem ser executadas em intervalos de, por exemplo, entre seis meses e dez anos, de preferência entre 1-5 anos. Em alguns pacientes, exames profiláticos são realizados anualmente. Se uma tomografia realizada como uma medida profilática indica níveis anormalmente elevados de depósitos de proteína tau, imunoterapia pode ser iniciada e subsequentes tomografias PET realizadas como em pacientes diagnosticados com uma taupatia. Se uma tomografia realizada como uma medida profilática indica os níveis de depósitos de proteína tau dentro dos níveis normais, ainda mais tomografias podem ser executadas em intervalos de entre seis meses e 10 anos e de preferência 1-5 anos, como antes, ou em resposta ao aparecimento de sinais e sintomas de uma taupatia ou transtorno cognitivo leve. Combinando varreduras profiláticas com a administração de imunoterapia tau-dirigida se e quando examina um nível acima do normal de depósitos de proteína tau é detectado, os níveis de depósitos da proteína tau podem ser reduzidos para, ou mais perto de, níveis normais, ou pelo menos inibidos de aumentar ainda mais, e o paciente pode permanecer livre da taupatia por um período mais longo do que se não receber exames profiláticos e imunoterapia tau-dirigida (por exemplo, pelo menos, 5, 10, 15 ou 20 anos, ou para o resto da vida do paciente).
[0126] Os níveis normais de depósitos de proteína tau podem ser determinados pela quantidade de emaranhados neurofibrilares ou inclusões de tau nos cérebros de uma amostra representativa de indivíduos na população em geral que não foram diagnosticados com uma taupatia especial (por exemplo, a doença de Alzheimer) e não são considerados em risco elevado de desenvolver tal doença (por exemplo, uma amostra representativa de indivíduos livres de doença de menos de 50 anos de idade). Alternativamente, um nível normal pode ser reconhecido em um paciente individual, se o sinal de PET de acordo com os métodos presentes em uma região do cérebro em que depósitos de proteína tau são conhecidos por desenvolver não é diferente (dentro da precisão da medição) do sinal de uma região do cérebro em que se sabe que tais depósitos não se desenvolvem normalmente. Um nível elevado em um indivíduo pode ser reconhecido em comparação aos níveis normais (por exemplo, média exterior e a variância de um desvio-padrão), ou simplesmente de um sinal elevado além do erro experimental em uma região do cérebro associada com depósitos de proteína tau comparados com uma região que não é conhecida por ser associada com depósitos. Para fins de comparar os níveis de depósitos de proteína tau em um indivíduo e população, os depósitos de proteína tau devem de preferência ser determinados na mesma região ou regiões do cérebro, nestas regiões incluindo pelo menos uma região em que depósitos de proteína tau associados com uma determinada taupatia (por exemplo, a doença de Alzheimer) são, sabe-se, formados. Um paciente com um elevado nível de depósitos de proteína tau é um candidato para dar início à imunoterapia.
[0127] Após iniciar a imunoterapia, uma diminuição do nível de depósitos de proteína tau pode ser vista primeiro como uma indicação de que o tratamento está tendo o efeito desejado. A diminuição observada pode ser, por exemplo, na faixa de 1-100%, 1-50% ou 1-25% do valor de linha base. Tais efeitos podem ser medidos em uma ou mais regiões do cérebro em que os depósitos são conhecidos por serem formados ou podem ser medidos de uma média de tais regiões. O efeito total do tratamento pode ser aproximado, adicionando a percentagem de redução em relação à linha de base para o aumento de depósitos de proteína tau que caso contrário ocorreria em um paciente não tratado médio.
[0128] Manutenção de depósitos de proteína tau em um nível aproximadamente constante, ou mesmo um pequeno aumento em depósitos de proteína tau, também pode ser uma indicação de resposta ao tratamento, embora uma resposta de qualidade inferior. Tais respostas podem ser comparadas com um curso de tempo dos níveis dos depósitos de proteína tau em pacientes com uma taupatia especial (por exemplo, a doença de Alzheimer) que não receberam tratamento, para determinar se a imunoterapia está tendo um efeito em inibir ainda mais aumentos de depósitos de proteína tau.
[0129] Monitoramento de alterações em depósitos de proteína tau permite o ajuste da imunoterapia ou outro regime de tratamento em resposta ao tratamento. Monitoramento PET fornece uma indicação da natureza e a extensão da resposta ao tratamento. Então, uma determinação pode ser feita se se deseja ajustar o tratamento e se tratamento desejado pode ser ajustado em resposta ao monitoramento PET. Monitoramento PET assim permite imunoterapia tau-dirigida ou outro regime de tratamento ser ajustado antes de outros biomarcadores, ressonância magnética ou medidas cognitivas terem respondido detectavelmente. Uma mudança significativa significa que comparação entre o valor de um parâmetro após tratamento em relação à base fornece evidências de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em alguns casos, uma mudança de valores de um parâmetro em um paciente em si fornece evidências de que o tratamento resultou ou não em um efeito benéfico. Em outros casos, a mudança de valores, se houver, em um paciente, é comparada com a mudança de valores, se houver, em uma população representativa de controle de pacientes não submetidos à imunoterapia. Uma diferença na resposta em um determinado paciente da resposta normal no paciente controle (por exemplo, média mais variância de um desvio-padrão) também pode fornecer provas de que um regime de imunoterapia está ou não conseguindo um efeito benéfico em um paciente.
[0130] Em alguns pacientes, monitoramento indica um declínio detectável em depósitos de proteína tau, mas que o nível de depósitos de proteína tau permanecem acima do normal. Em tais pacientes, se não houver nenhum efeito colateral inaceitável, o regime de tratamento pode ser continuado como está ou até mesmo aumentado na frequência de administração e/ou dose, se não já estiver com a dose máxima recomendada.
[0131] Caso o monitoramento indique que os níveis de depósitos de proteína tau em um paciente já tenham sido reduzidos a níveis normais, ou próximo aos normais, de depósitos de proteína tau, o regime de imunoterapia poderá ser ajustado a partir de um dentre a indução (isto é, isso reduz o nível dos depósitos de proteína tau) até um dentre a manutenção (isto é, isso mantém os depósitos de proteína tau em um nível aproximadamente constante). Tal um regime pode ser afetado mediante a redução da dose e/ou frequência de administração de imunoterapia.
[0132] Em outros pacientes, o monitoramento pode indicar que a imunoterapia está tendo algum efeito benéfico, mas um efeito abaixo do ideal. Um efeito ideal pode ser definido como uma redução percentual no nível dos depósitos de proteína tau dentro da metade de topo ou quartil da alteração nos depósitos de proteína tau (medidos ou calculados através de todo o cérebro ou região(ões) representativas dos mesmos nos quais os depósitos de proteína tau são conhecidos por se formarem) experimentados por meio de uma amostra representativa de pacientes de taupatia submetidos à imunoterapia em um dado ponto no tempo após começo da terapia. Um paciente que experimentar um declínio inferior ou um paciente cujos depósitos de proteína tau permanecem constantes ou mesmo aumentam, porém, em menor grau que o esperado na ausência de imunoterapia (por exemplo, conforme inferido a partir de um grupo de controle dos pacientes não administrados a imunoterapia) pode ser classificado como que experimentando uma resposta positiva, porém, abaixo do ideal. Tais pacientes podem ser, idealmente, submetidos a um ajuste do regime no qual a dose e ou a frequência de administração de um agente é aumentada.
[0133] Em alguns pacientes, os depósitos de proteína tau podem aumentar de maneira similar ou maior a depósitos de proteína tau em pacientes que não recebem imunoterapia. Se tais aumentos persistirem ao longo de um período de tempo, como, por exemplo, 18 meses ou 2 anos, mesmo após qualquer aumento na frequência ou dose dos agentes, a imunoterapia pode, se desejado, ser descontinuada em favor de outros tratamentos.
[0134] A descrição supracitada do diagnóstico, monitoramento, e ajuste de tratamento para taupatias têm sido amplamente focados no uso de varreduras PET. No entanto, qualquer outra técnica para visualizar e/ou medir os depósitos de proteína tau que seja propícia ao uso de anticorpos tau da invenção (por exemplo, um camundongo, humanizado, quimérico ou de anticorpo com superfície modificada 16B5) pode ser usada em vez de varreduras PET para desempenhar tais métodos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1. Geração de anticorpo 16B5
[0135] Pan anticorpo 16B5, que reconhece tau estando ou não fosforilado, foi elevado a tau purificado e selecionado com base em suas propriedades de captura de alta afinidade em um ensaio ELISA.
EXEMPLO 2. Clonagem e sequenciamento de anticorpo 16B5
[0136] RNA foi extraído a partir das células peletizadas que expressam o anticorpo 16B5 com uso de Trizol LS (Invitrogen). As concentrações de RNA foram medidas com o uso de Quant-IT kit (Invitrogen).
[0137] 5’-RACE foi usado para ampliar a extremidade 5’ de mRNA de IgG com uso do kit Smart RACE (Clontech). Cerca de 1 μg de RNA foi usado para a reação RT e pools de cDNA forma ampliados adicionalmente como uso de primer Universal fornecido com o kit Smart RACE e os primers específicos de gene (GSPs) projetados em ExonBIO.
[0138] Sequências de Primer: Primer Universal: CTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 7) GSPs: IgG1 e IgG2a: CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC (SEQ ID NO: 8) IgG2b: CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC (SEQ ID NO: 9)
[0139] Os produtos de PCR foram clonados e purificados em gel no vetor pSUPER-blunt (Adexon, www.adexonbiotech.com). Para a cadeia pesada, 15 colônias foram mini-preparadas e sequenciadas. Para a cadeia leve, se desempenhou PCR de colônia para distinguir cadeia leve anormal endógena, e apenas os clones que não foram ampliados a partir de PCR de colônia foram sequenciados. Os resultados de sequenciamento foram analisados em vetor NTI. Marcou-se as sequencias de primer de GSP e adaptador no mapa. As regiões entre as sequências de GSP e adaptador são sequencias de cadeia pesada IgG que incluem peptídeo líder, peptídeo de sinal e região V, e parte da região constante. Marcou-se ORFs no mapa.
EXEMPLO 3. Mapeamento epitopo de anticorpo 16B5
[0140] Identificação de epitopo através de análise de fragmento de peptídeo. A sequência tau humana com 4 repetições de ligação de microtúbulos e sem insertos de terminal N, e que contém uma mutação P301L (rTau), foi expressa em E. coli e purificada. Essa forma de tau tem a sequência da SEQ ID NO:3, com a substituição de leucina por prolina na posição 243 (que corresponde a P301L usando a convenção de numeração com base a isoforma mais longa de tau). As digestões enzimáticas de 200 μg de tau foram executadas com um dentre quatro proteases diferentes: tripsina (que cliva a extremidade de carboxilo de arginina e lisina), quimotripsina (que primariamente cliva na extremidade de carboxilo de tirosina, triptofano, fenilalanina e leucina), LysC (que cliva na extremidade de carboxilo de lisina), ou GluC (que cliva após os resíduos de glutamato e raramente após os resíduos de aspartato). Todas as proteases foram obtidas junto à Thermo Scientific, e as digestões foram desempenhadas por 16 horas a 37°C. Os fragmentos de peptídeo resultantes foram incubados com 10μg de 16B5, e precipitados com uso de microesferas magnéticas de Proteína G (NEB). Os precipitados foram minuciosamente lavados em PBS contendo 300 mM de NaCl e 0,5% de NP-40, então, eluído com 1 M de NaCl em 100 mM de glicina, pH 2,8. Os eluentes foram secos sob vácuo e resuspensos em 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). Os eleuentes resuspensos foram carregados em um 4,6 x 50mm de coluna de C18, então, fracionados através de HPLC (Agilent 1260 Infinity System) usando um gradiente linear de acetonitrilo com 0,075% TFA. As frações de pico foram coletadas, secas e resuspensa em água destilada. As identidades e massas de peptídeo foram determinadas por MALDI-TOF/TOF. Um pico que corresponde aos resíduos 25-44 da SEQ ID NO:1 foi identificado em LysC MS Spectrum. Os picos que correspondem aos resíduos 25-44 da SEQ ID NO:1 e 24-44 foram identificados em Trypsin MS Spectrum. Nenhum sinal foi obtido a partir de digestões de GluC e quimotripsina, sugerindo que alguns epitopos podem compreender resíduo 29 da SEQ ID NO:1 e/ou resíduo 37 da SEQ ID NO:1.
[0141] Identificação de epitopo por meio de análise de mutação. Usando os resultados determinados por meio da análise de peptídeo fragmento (descrita acima), a mutagênese de deleção de rTau foi executada por meio de amplificação plasmídica inteira com uso dos métodos de biologia molecular padrão. A proteína foi expressa em volumes pequenos de cultura de bactéria, e volumes iguais de lisado bacteriano clarificado foram submetidos à eletroforese, submetidos a blot, e coloridos com o anticorpo 16B5. Para controlar o carregamento de amostra, Tau46, um anticorpo com especificidade para a região de terminal C de tau (epitopo de terminal C), foi usado para colorir blots duplicados. Ambos anticorpos foram usados em uma concentração de 0,2 μg/mL. As imagens foram capturadas com uso de um Licor Odyssey Fluorescent Scanner. Os seguintes mutantes de deleção de tau produzidos e analisados dessa maneira: Δ5-24, Δ23-32, Δ25-44, Δ30-39, e Δ37-46. Conforme mostra nas Figuras 1 e 2, os mutantes de deleção Δ25-44 e Δ30-39 de tau não foram detectados pelo anticorpo 16B5, fornecendo evidência de que um epitopo reconhecido por 16B5 se estabelece dentro desses resíduos. O mutante de deleção Δ37-46 de tau foi apenas ligeiramente detectável com 16B5, fornecendo evidência de que para dos resíduos dentro de 37-46 (por exemplo, resíduo 37) pode ter um papel na ligação de 16B5 a tau. O anticorpo 16B5 coloriu o mutante de deleção Δ23-32 de tau em uma menor extensão que Δ5-24 e em uma maior extensão que os mutantes de deleção Δ25-44 e Δ30-39, fornecendo evidência de que 16B5 o mesmo também pode se ligar a um peptídeo que compreende os resíduos 33-36, 30-36, 33-37, 30-37 ou 33-39. Tomado como um todo, os dados obtidos a partir dos mutantes de deleção de tau sugerem que um epitopo reconhecido por meio de 16B5 pode compreender parte ou todos dos resíduos 23-32 da SEQ ID NO:1 e parte ou todos dos resíduos 37-46 da SEQ ID NO:1. Por exemplo, 16B5 pode reconhecer um epitopo dentro dos resíduos 32-38 ou 28-41 da SEQ ID NO:1.
[0142] Identificação de epitopo por meio de varredura de alanina. Os resíduos individuais dentro da região de tau que abrangem resíduos 30-42 foram, em seguida, mutados para alanina usando mutagênese de PCR. As proteínas mutadas foram expressas, e os lisatos foram resolvidos por meio de eletroforese e submetidos a blot ou com o anticorpo 16B5 ou o anticorpo Tau46, conforme descrito acima. Os resultados dessa análise são mostrados na Figura 3. Os mutantes de ponto específico analisados, que incluem T30A, M31A, H32A, Q33A, D34A, Q35A, E36A, G37A, D38A, T39A, D40A, A41L, e G42A, são listados acima de blots. Os resíduos de interesse específico são delimitados em caixas em cada blot. A ligação detectável de 16B5 foi completamente eliminada por meio do mutante tau Q33A e substancialmente reduzida pelo mutante tau G37A, fornecendo evidência de que o resíduo 33 e, em uma menor extensão, o resíduo 37, podem ser componentes importantes de um epitopo reconhecido por 16B5. Outros resíduos podem ser componentes importantes de um epitopo reconhecido por 16B5 em uma análise de Biacore.
EXEMPLO 4. Imunização passiva no modelo de camundongo de hTau.P301L de taupatía
[0143] Imunização. Usou-Se camundongos fêmea de 3 meses de idade C3 hTau.P301L-Tg em antecedentes genéticos de FVB/N para esse estudo. A administração de 10mg/kg de anticorpos de teste e controle foi desempenhada via intraperitoneal, uma vez por semana. A duração de tratamento foi cerca de 5 meses. Seguido 23 injeções, o estudo terminou com o sacrifício dos camundongos. A Tabela 1 descreve os anticorpos de teste e controle administrados nesse estudo. Tabela 1 Esquema de Dosagem
Figure img0004
[0144] Morte prematura é um fenótipo observado em modelos taupáticos de murina transgênica. O modelo em particular usado nesse estudo desenvolve Tau hiperfosforilado na idade de 6 meses, embora com uma alta variabilidade de aparecimento. Os camundongos também sofreram defeitos motores como recolhimento dos membros traseiros e mobilidade reduzida em geral, e morrem de maneira prematura na idade de 8-11 meses (reMYND unpublished data, Terwel et al., 2005). Os camundongos que desenvolveram os sintomas de doença de estágio final, caracterizada pela presença do fenótipo de recolhimento e perda de peso, foram sacrificados. Um número inesperadamente alto de camundongos morreu de forma prematura sem a presença desses sintomas. A causa de morte em tais casos é considerada como não sendo relacionada à taupatia de estágio tardio ou o anticorpo de teste e, em vez disso, acredita-se estar relacionado aos antecedentes de FVB/N cosanguíneos.
[0145] A Tabela 2 mostra uma vista geral da sobrevivência geral de todos os camundongos durante o curso do estudo.Tabela 2 Tratamento durante sobrevivência (todas as causas de morte)
Figure img0005
*Um camundongo no Grupo K foi substituído no começo do estudo. Os dados podem ser analisados com ou sem esse camundongo substituído.
[0146] Seguinte ao sacrifício, os camundongos foram dissecados e os troncos cerebrais e mesencéfalos foram homogeneizados com uso de um homogeneizador mecânico do tipo potter (VOS 14 S40, taxa de 750 rpm; VWR) em 10 de peso-volumes de tampão de inibidor de Tris-proteinase-fosfatase de gelo frio (TPPI-buffer) contendo: 20 mM Tris-HCl (pH 8,1); 150 Mm de NaCl; 1 mM de ácido tetraacético de diamina etileno (EDTA, Merck); 1 mM de ácido tetraacético de glicol etileno (EGTA, Sigma-Aldrich); 5 mM de pirofosfato de sódio (Sigma); 30 mM de fluoreto de sódio (Sigma-Aldrich); 1 mM de PMSF (Sigma); 2 mM de vanadato de sódio (Sigma); 10 mM de 1,10-orto-fenantrolinamonohidrato (Sigma-Aldrich); 5 μg/ml de inibidor de tripsina de feijão de soja; 5 μg/ml de pepstatina; e um coquetel de inibidores de proteinase (CPI, Roche Diagnostics GmbH, Germany). Os volumes fixos de 140 μl e 100 μl dos homogeneizados de tronco cerebral e mesencéfalo (TotH), respectivamente, (aproximadamente metade dos volumes totais) foram centrifugados em 136000xg, por 60 min a 4°C (TLA-55 rotor, OptimaTMTLX Ultracentrifuge, Beckman Coulter) para gerar uma fração de Tris-solúvel (SF), com o restante dos homogeneizados totais sendo armazenados a -80°C. Devido a uma quantidade limitada de seguradores centrífugos (N=12), as amostras foram aleatorizadas para equilibras o centrifugador e dividir os diferentes grupos de tratamentos através de sessões de centrifugação diferentes.
[0147] O sobrenadante (S1, também referido como “fração solúvel” ou “SF”) foi separado a partir do pellet (P1), aliquotado e armazenado a -80°C. O pellet P1 foi estabilizado em 10 de peso-volumes de uma solução altamente salina (0,85 M de NaCl contendo TPPI-buffer) e centrifuga a 20000xg, por 30 min a 4 °C. O pellet altamente salino resultante (P2) foi armazenado a -80 °C. O sobrenadante (S2) foi trazido ao 1% de Sarcosil com um décimo de 10% de Sarcosil e incubado a temperatura ambiente por 60 min em um tambor rotativo topo-sobre-topo, então, centrifugado em 136000xg, por 60 min a 4 °C. O sobrenadante solúvel Sarcosil (S3) foi armazenado a -80 °C e o pellet insolúvel de Sarcosil (P3, também referido como “fração insolúvel” ou “IF”) foi resuspenso em 30 μl de buffer TPPI e aliquotado. As frações do tronco cerebral homogeneizado total (TotH), Tris-solúvel (SF), e Sarcosil-insolúvel (IF) geradas pelo protocolo de fracionamento descrito acima foram usadas em eletroforese em gel poli-acrilamida subsequente e análise de Western blotting.
[0148] Eletroforese em gel poli-acrilamida subsequente e o Western blotting. Para aplicação de SDS-PAGE e Western blotting convencionais, as amostras foram desnaturadas e reduzidas por meio de incubação a 95 °C por 10 min, então, separadas em 7,5% de géis de Tris-HCl (Criterion XT Precast Gel, 26- well comb, 15 μl, 1,0 mm; Biorad). Após eletrotransferência seca (iBlot™ Invitrogen) às membranas PVDF (iBlot™ Gel Transfer Stacks, PVDF, Regular, Invitrogen), as membranas foram lavadas em 0,4% de PFA por 30 min e, então, lavadas em solução salina de Tris-tamponado. Em seguida, as membranas foram incubadas em solução salina de Tris-tamponado (TBS, pH 7,6) contendo 5% de (p/v) de leite seco sem gordura e 0,1 % (v/v) de Tween-20 por 1 hora. Os blots foram incubados com vários anticorpos primários anti-tau durante a noite, nas concentrações de trabalho mostradas na Tabela 3. Após a lavagem e incubação com um anticorpo secundário de conjugado com anti-camundongo ou anti-coelho HRP (goat-anti-mouse ou goat-anti-rabbit IgG, DAKO), os blots foram desenvolvidos pelo sistema de detecção ECL (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, produto 34096, Thermo Scientific). As imagens foram gravadas digitalmente (VisionWorks Acquisition, UVP) com diferentes tempos de exposição, e software dedicado (VisionWorks Analysis, UVP) foi usado para análise dos blots. Para comparação, um gel de referência inter-gel foi testado com alíquotas de quatro frações sendo testadas em cada gel a ser comparado. Os anticorpos monoclonais primários de anti-tau usados para detecção incluíam AT100 (fosfo-Tau, Thermo Scientific; diluição 1:250), AT8 (fosfo-Tau, Thermo Scientific; diluição 1:500), HT7 (pan Tau, Pierce; diluição 1:1000), e 1F5 (epitopo conhecido junto à Testing Facility, Neotope, diluição 3:500). Os blots foram re- sondados com anti-GAPDH (Abcam 9485; diluição 1:2500) como um controle de carregamento. Os anticorpos de Pan Tau não são específicos para fosfo-Tau. Tabela 3 Sumário de anticorpos usados para análise bioquímica
Figure img0006
[0149] Conforme mostrado na Figura 4, uma redução estatisticamente significante na quantidade de tau foi observada em frações de tronco cerebral insolúvel em sarcosil a partir de animais tratados com o anticorpo 16B5, em comparação aos animais tratados com o anticorpo de controle 6F10. A significância estatística foi avaliada como do teste t de Student, p<0,05. Essa redução foi observada com ambos os anticorpos específicos de fosfo-tau (AT8, painel esquerdo superior; AT100, painel esquerdo inferior; 1F5, painel direito superior) como anticorpos de pan-tau (HT7, painel direito inferior). Os Western blots do homogeneizado total também indicou uma redução significante na razão de fosfo-tau em relação ao tau total nos animais tratados 16B5 em relação aos animais de controle tratados com o anticorpo 6F10, quando detectou-se com um anticorpo fosfo-específico. Consulte Figura 5, painel esquerdo (que mostra o sinal detectado com o anticorpo anti-fosfo-tau AT8 dividido pelo sinal detectado com o Anticorpo pan tau HT7). Em contraste, não há alteração significante na razão de tau total em relação aos níveis de GAPDH nos homogeneizados totais dos animais tratados com 16B5 em comparação aos animais de controle tratados com o anticorpo 6F10. Consulte Figura 5, painel direito (que mostra o sinal detectado com o anticorpo pan tau HT7 dividido pelo sinal detectado com o anticorpo GAPDH). Esses dados fornecidos evidenciam que o nível de fosfo-Tau, mas não que o tau total foi reduzido os homogeneizados.
[0150] Análise Histológica. A análise imuno-histoquímica com uso de anticorpos anti-fosfo-tau foi desempenada na zona incerta anexa ao núcleo subtalâmico (STH/ZI) e no núcleo cerebelar lateral anexo de parte anterior e posterior de núcleo interposto do cerebelo (IntA/P/LAT). As seções de vibratome sagital (40 μm) foram armazenadas em PBS com 0,1% de azida de sódio a 4 °C até o uso. Oito seções por camundongo, em bregma indicado, foram colorida de livre flutuação com mAbs AT8, AT100 ou 1F5. As seções forma selecionada para coloração com os anticorpos indicados conforme listados na Tabela 4 abaixo. As seções de todos os animais selecionados para uma coloração em particular foram aleatorizadas para coloração e quantificação cega.
[0151] As seções de livre flutuação foram incubadas em NetwellsTM. As seções foram, então, lavadas duas vezes em PBS e incubadas por 20 minutos em peróxido de hidrogênio 1,5% em PBS e metanol (1:1) para removera atividade de peroxidase endógena. Após lavar as seções três vezes no PBS contendo 0,1% de Triton X100 (PBST), as seções foram bloqueadas por 30 min em 10% de Fetal Calf Serum (FCS) em PBST seguido por uma incubação durante a noite com anticorpos primários AT8, AT100 (Thermo scientific), usando concentrações de 0,4 μg/ml e 0,05 μg/ml, respectivamente, em PBST com 10% de FCS. Depois de enxague, as seções foram incubadas com anticorpo secundário (GAMPO) rotulado de peroxidase anti-camundongo de cabra (DAKO, 1/500 em PBST, 10% de FCS) e o sinal foi desenvolvido com 3,3’-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB, 1 comprimido por 10 ml de Tris-HCl com 3 μl de H2O2 por 10 ml). As seções foram contra-coloridas com hematoxilina do Mayer, desidratadas em cinco etapas (50, 70, 95 e 2x100%) em etanol e xileno (Merck Eurolab) e montadas em Depex (Depex mounting medium, BDH Laboratory).Tabela 4 Sumário de anticorpos usados para análise imuno-histoquímica
Figure img0007
[0152] As imagens foram adquiridas com um microscópio Olympus BX41 equipado com uma câmera Color view II Olympus e analisadas com um computador usando software AnalySIS Five - CelKD. A intensidade de luz e as configurações de condensador para o microscópio foram mantidas constante por todo o processo de aquisição de imagem. Todas as imagens adquiridas foram submetidas às mesmas sub-rotinas de computador para minimizar tendências do investigador. Limitação de corte de densidade foi aplicada de maneira uniforme por toda a análise.
[0153] A região de interesse conforme definido abaixo foi selecionada para quantificação automática do(s) sinal(ais) de coloração. O núcleo subtalâmico e a zona incerta foram delineados por meio de pedúnculo cerebral por via ventral e por meio de substância branca por via dorsal, respectivamente, assim como com base nas diferenças na densidade de célula (seções bregma cerebelares sagitais 1,32-1,92). O núcleo interposto do cerebelo, parte anterior e posterior, e núcleo cerebelar lateral foram delineados por meio de substância branca e alterações na densidade de célula e o terceiro ventrículo (seções cerebelares sagitais, bregma 1,92-2,64 para LAT e 0,84-1,8 para IntA/P). Para cada coloração, 6 seções de cérebro contendo STH/ZI e 16 seções contendo IntA/P/LAT por camundongo foram incluídas na análise.
[0154] Conforme mostrado na FIG. 6, a quantidade de fosfo-tau detectada nos núcleos cerebelares e a região subtalâmica de animais tratada com o anticorpo 16B5 foi significativamente reduzida em comparação à quantidade de fosfo-tau detectada nas mesmas estruturas em animais de controle tratados com o anticorpo 6F10. A significância estatística foi avaliada como uso de teste t de Student, p<0,05.
EXEMPLO 5. Humanização de 16B5
[0155] A análise de sequência mostra que o anticorpo 16B5 tem um domínio kappa variável (Vk) que tem a sequência da SEQ ID NO:16, que pertence a subgrupo Kabat de camundongo 1, e corresponde ao subgrupo Kabat humano 4. Destacam-se CDRs Kabat. O domínio pesado variável (Vh) do anticorpo 16B5 tem a sequência da SEQ ID NO:10, que pertence a subgrupo de Kabat de camundongo 2b, e corresponde ao subgrupo de Kabat humano 1 (Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição; NIH Publication NO. 91-3242). Destacam-se CDRs Kabat.
[0156] O domínio Vk 16B5 inclui uma sequência CDR-L1 de 17 resíduos (KSSQSLLNSRTRKNYLA, SEQ ID NO: 17), uma sequência CDR-L2 de 7 resíduos (WASTRES, SEQ ID NO: 18), e CDR-L3 de 8 resíduos (KQSYTLRT, SEQ ID NO: 19). A sequência CDR-L1 pertence à classe 3 canônica, e as sequencias de CDR-L2 e CDR-L3 pertencem à classe 1 (Martin & Thornton (1996), J. Mol. Biol. 263:800-15).
[0157] O domínio Vh 16B5 inclui uma sequência CDR-H1 de 5 resíduos (YHGMD, SEQ ID NO: 11) com base na numeração de Kabat ou uma sequência CDR-H1 de 10 resíduos (GYPFTYHGMD, SEQ ID NO: 24) com base na numeração Kabat e Chothia combinada, uma sequência CDR-H2 de 17 resíduos (WINTYSGVPTYADDFKG, SEQ ID NO: 12), e uma sequência CDR-H3 de 8 resíduo (RRDFTMDF, SEQ ID NO: 13). A sequência CDR-H1 pertence à classe 1 canônica e a sequência CDR-H2 pertence à classe 2 (Martin & Thornton (1996), J. Mol. Biol. 263:800-15). A sequência CDR-H3 não tem classe canônica, mas provavelmente tem uma base kinked de acordo com as regras de Shirai et al. (1999), FEBS Lett. 455:188-97.
[0158] Os resíduos na interface entre os domínios Vk e Vh são resíduos usuais para essas posições em camundongos.
[0159] Uma busca foi desempenada através das sequências de proteína no banco de dados de PDB (Deshpande et al. (2011), J. Virol. 85:1820-33) para encontrar as estruturas que forneceriam um modelo estrutural aproximado do anticorpo 16B5. A estrutura do fragmento Te33 de anticorpo Fab de tóxina anti- cólera (código pdb 1ZEA_H) foi usada para VL com uma resolução de 1,78 A. Retendo a mesma estrutura canônica para os ciclos como 16B5. A estrutura de cristal Fab no Complexo Dsbb-Fab (código pdb 2ZUQ_B) foi usada para modelar o domínio VH de 16B5. Resolvendo-se em uma resolução de 3,3 A e contendo as mesmas estruturas canônicas para CDR-H1 e CDR-H2, e também no CDR-H3 de mesmo comprimento com uma com base kinked. O programa BioLuminate foi usado para modelar uma estrutura aproximada de 16B5 Fv.
[0160] Uma busca do banco de dados de sequência de proteína não redundante a partir de NCBI com uma sequência Fv 16B5 em CDR“X” permitiu a seleção de enquadramentos humanos adequados nos quais enxertar as CDRs murina. Para Vk, uma cadeia leve kappa humana com NCBI de código de adesão ACJ71718.pro foi escolhida (SEQ ID NO:20). Essa sequência de cadeia leve kappa humana tem as mesmas classes canônicas para CDR-L2 e L3. Para Vh, a cadeia de pesada Ig humana com BAC02002.1 foi escolhida (SEQ ID NO:14). A mesma compartilha a forma canônica de CDR-H1 e H2, e H3 16B5 e é de 8 resíduos de comprimento com uma base kinked prevista.
[0161] As retromutações e projetos de cadeia pesada e cadeia leve humanizada com base nesse enquadramento humano são conhecidos nas Tabelas 5 e 6, respectivamente.
[0162] Uma cadeia pesada variável 16B5 humanizada (H1) que te a sequência da SEQ ID NO: 15 foi projetada. O projeto inclui três retromutações: R13K; V48M; e Y98F. O K em posição 13 foi selecionado devido ao fato de que é mais frequente que R em seres humanos. O M em posição 48 foi selecionado devido ao fato de que é mais frequente que V em seres humanos. O F em posição 98 foi selecionado devido ao fato de que está localizado em uma interface, tornando o mesmo desejável para manter o resíduo de camundongo.
[0163] Três sequências de cadeia leve variáveis 16B5 humanizadas foram projetadas: Versão 1 (L1) tem a sequência da SEQ ID NO: 21 e inclui três retromutações: D1N; M4L; e Y36F. O N em posição 1 foi selecionado devido ao fato de que forma uma ligação por hidrogênio potencial com N61 em HCDR2. O L em posição 4 foi selecionado devido ao fato de que entra em contato com K96, Q97 e S98 em LCDR3; também entrando em contato com F104, um resíduo de interface. O F em posição 36 foi selecionado devido ao fato de que Y pode se ligar por hidrogênio com D106 em HCDR3, enquanto F não pode. A ligação de hidrogênio constituiria uma interação extra que pode afetar a função HCDR3 e, dessa forma, é preferivelmente evitada.
[0164] Versão 2 (L2) tem a sequência da SEQ ID NO: 22 e inclui quatro retromutações: D1N; M4L; Y36F; e P43S. A base lógica para D1N, M4L, e Y36F são as mesmas que para Versão 1. O S em posição 43 foi selecionado devido ao fato de que S forma uma ligação de hidrogênio com Q110 em VH, que é fechada a HCDR3.
[0165] Versão 3 (L3) tem a sequência da SEQ ID NO: 23 e inclui três retromutações: M4L; Y36F; e P43S. A base lógica para cada uma dessas mutações é a mesma que para as Versões 1 e 2. Tabela 5 Sequências para humanização de cadeia pesada 16B5
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EXEMPLO 6. Afinidade de Tau de Anticorpos 16B5 Humanizados
[0166] Os dados de ligação para anticorpos 16B5 humanizado que têm um projeto H1L1 ou H1L2 são mostrados na Tabela 7, abaixo. Por comparação, os dados de ligação para 16B5 quimérico também são mostrados. Os dados foram gerados com uso de um instrumento Biacore. Concluiu-se que a versão H1L2 tem a afinidade mais forte - essencialmente o mesmo que aquele de quimérico 16B5. As versões H1L1 e H1L3 16B5 humanizadas também têm afinidade adequada.
[0167] As medidas de Ressonância de Plasmon de Superfície foram desempenhadas usando um Biacore T200 (GE Lifesciences). Todos os experimentos foram desempenhados usando uma fase móvel de 10 mM de HEPES de pH 7,4, 150 mM de NaCl, e 0,05% de Tween-20 em 30 μl/min, através de um chip de sensor CM5 preparados por meio de um acoplamento de amina de um anticorpo de captura de anti-camundongo ou anti-humano. 16B5 (forma quimérica ou humanizada) foi ligado ao anticorpo capturado imobilizado, e concentrações variadas de hTau-P301L purificado recombinante foram aplicadas ao anticorpo em interações sucessivas. As etapas iterativas foram separadas com etapas de regeneração de alto sal ou baixo pH. Os experimentos foram repetidos com preparações diferentes de anticorpo e antígeno. A análise foi desempenhada com software Biacore embutido.Tabela 7 Dados de Biacore
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EXEMPLO 7. Detecção de imunoprecipitação de Tau com Anticorpos 16B5 Humanizados
[0168] Uma amostra postmortem do córtex frontal a partir de um paciente de doença de Alzheimer com uma pontuação de Braak de 6 foi sequencialmente extraída em tampões de força de solubilização crescente, na seguinte ordem: (i) Tampão de alto sal (20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 10% de sacarose, 7500 mM de NaCl de pH 7,4), (ii) Tampão Triton (20 mM de Tris, 5 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 10% de sacarose, 1% de Triton X100, 500 mM de NaCl de pH 7.4), e (iii) Tampão de Sarcosil (10 mM de Tris, 5 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 10% de sacarose, 500 mM de NaCl, 1% de Sarcosil, de pH 7,4).
[0169] Para cada amostra, 200 microgramas de sal altamente solúvel, ou 20 microgramas de sarcosil insolúvel, as frações foram diluídas em 400 microlitros de tampão de imunoprecipitação (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,5% de Triton X100, 1 mM de EGTA, 1 mM de EDTA, de pH 7,4). As amostras foram pré- limpas com microesferas magnéticas de proteína G (New England Biolabs), e 5 microgramas de anticorpo foram adicionados a cada tubo. Os anticorpos usados incluíam: 1) anticorpo IgG não imune de camundongo (mIgG), conforme controle; 2) anticorpo IgG não imune de humano (hIgG), conforme controle; 3) anticorpo 16B5 quimérico (Chi16B5); 4) 16B5humanizado, versão H1L2 (h16B6-H1L2); e 16B5 humanizado, versão H1L3 (h16B6-H1L3). Os anticorpos e lisatos pré limpos foram incubados por 2 horas a 4°C. Os complexos de anticorpo/antígeno foram precipitados usando-se microesferas magnéticas de proteína G, e os precipitados foram lavados minuciosamente com PBS/350 mM de NaCl. Após a eluição usando tampão Laemmli, os eluatos foram resolvidos por meio de SDS-PAGE e submetidos a blot usando um anticorpo tau policlonal (DAKO).
[0170] Conforme mostrado na Fig. 7, H1L2 e H1L3 16B5 quimérico e 16B5 humanizado reconhecidos por tau em frações tanto solúveis como insolúveis do cérebro com Alzheimer.
EXEMPLO 8. Caracterização imuno-histoquímica de murina e Anticorpos tau 16B5 humanizados em Doença Cerebral de Alzheimer
[0171] O 16B5 de anticorpo anti-tau monoclonal de murina e suas variantes humanizadas, h16B5-H1L2 e h16B5-N1D, também foram testados de maneira imuno-histoquímica em seções recém-congeladas de córtex de cérebro humano de doadores de Doença de Alzheimer e controles envelhecidos não doentes.
Métodos: Tecido de cérebro humano
[0172] Os córtices frontais foram obtidos a partir de Sun Health Research Institute. Os casos incluam seis pacientes (idade média 86,8 ± 0,40 SEM) diagnosticados com a Doença de Alzheimer e confirmados mediante avaliação neuropatológica post mortem, e três controles envelhecidos não doentes (idade média 77 ± 9,7 SEM). A demografia dos casos é listada na Tabela 8, abaixo. A imuno-histoquímica foi desempenhada em crioseções montadas em lâminas fixadas levemente com acetona de 10 μm. Tabela 8 Demografia para casos examinados de maneira imuno-histoquímica
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Imuno-histoquímica
[0173] O método de imunoperoxidase foi o sistema de detecção principal, que consistiu de ou um polímero rotulado peroxidase conjugado às imunoglobulinas anti-camundongo de cabra (EnVision+System HRP labeled Polymer; Dako K4001) ou um sistema de amplificação de Vetor ABC para anticorpos humanizados diretamente biotinilados (ABC Elite Standard; PK-6100; Vetor Laboratories). A coloração foi visualizada com um cromogênio DAB (Liquid DAB + Substrate Chromogen System; Dako K3468), que produziu um depósito marrom.
[0174] O controle negativo consistia de desempenhar todo o procedimento imuno-histoquímico em seções adjacentes com um anticorpo de controle isotipo IgG ou uma omissão do anticorpo primário.
Rotulação imunofluorescente
[0175] A coloração imunofluorescente dupla foi conduzida para determinar a relação entre a murina e as variantes humanizadas do anticorpo, outros anticorpos tau que reconhecem os vários epitopos fosforilados, e beta-amilóide. As seções de tecido foram coloridas em paralelo com um coquetel de anticorpos contendo variantes 16B5 biotiniladas ou humanizadas etiquetadas com FITC (1 μg/mL) e um anticorpo murina (ou 16B5 monoclonal (1 μg/mL), AT8 (1:1000), AT100 (1:1000), ou 3D6 (1 μg/mL). Os anticorpos murina foram detectados com um anti-camundongo de cabra secundário conjugado a um fluoróforo 488 ou 635 (Invitrogen). Os anticorpos humanizados biotinilados foram detectados com um streptavidin 635.
Pré-absorções
[0176] Para avaliar a especificidade dos anticorpos em relação aos seus antígenos alvo, 1 μg/mL de anticorpos 16B5 foram pré-absorvidos com 50 μg/mL de sinucleína do tipo selvagem ou tau P301L humano purificado (uma proteína irrelevante) durante a noite a 4oC. Os anticorpos foram, então, aplicados ao tecido e o procedimento imuno-histoquímico foi conduzido conforme delineado acima.
Análise de Imagem
[0177] As lâminas foram visualizadas ou com um microscópio Olympus BX61, Olympus Nanozoomer 2.0HT, ou um sistema confocal Leica SPE spectral. As imagens foram coletadas como arquivos TIFF.
Resultados
[0178] Conforme mostrados na Tabela 9, abaixo, 16B5 monoclonal anticorpo de camundongo e ambas variantes humanizadas mostraram reatividade no tecido de Doença de Alzheimer, colorindo de maneira proeminente as cadeias de neuropil, alguns emaranhados neurofibrilares (principalmente globosa), e algumas placas neuríticas tau-positiva. A maior parte da patologia AD- fibrilar 16B5 foram confinadas à matéria cinzenta, mas alguma reatividade também foi detectada na branca. O tecido de controle não doente, por sua vez, demonstrou reatividade de antecedente difusa, mas também negativa para quaisquer das patologias encontradas no tecido AD.
[0179] Os experimentos de rotulação dupla foram desempenhados com a versão monoclonal de murina de 16B5 e com (1) ambas variantes humanizadas, (2) anticorpos que reconhecem tau em vários epitopos fosforilados, e (3) beta- amilóide para caracterizar ainda mais as patologias reconhecidas pelas variantes de anticorpo.
[0180] Ambos h16B5-H1L2 e h16B5-N1D colocalizados com anticorpo 16B5 monoclonal com alta congruência em estruturas patológicas AD-fibrilar. H16B5-H1L2 também detectou patologias que foram mostradas como sendo imunorreativas aos vários epitopos tau fosforilados, incluindo serina202 e treonina205 (AT8), serina212 e treonina214 (AT100), e serina396 (anticorpo proprietário interno, 20H1). Finalmente, a rotulagem dupla com um anticorpo beta- amilóide que reconhecem a sequência de aminoácidos de terminal N (3D6; aa 15) e 16B5 mostrou muito pouca colocalização entre estruturas Aβ e 16B5- imunoreativas nas placas amilóide.
[0181] Quando a imunoreatividade 16B5 foi comparada a um anticorpo anti- tau monoclonal bem caracterizado comercialmente disponível (Dako), ambos coloriam a patologia AD fibrilar que incluía placas de tau-positiva, cadeias de neuropil, e emaranhados neurofibrilares.
[0182] A especificidade do anticorpo foi analisada por meio das pré- absorções com tau P301L recombinante purificado. Uma diminuição na coloração foi observada quando 16B5 foi pré-absorvido com tau P301L, mas a coloração não foi afetada quando os anticorpos foram pré-absorvidas com uma proteína irrelevante (sinucleína de tipo selvagem) nas mesmas concentrações molares.
[0183] Tanto o anticorpo de controle IgG-isotipo quanto as seções de omissão de anticorpo primário foram negativos para coloração através de todos os tecidos testados. Tabela 9 Anticorpos 16B5 caracterizados de maneira imuno-histoquímica
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[0184] Todas as publicações (incluindo os números de GenBank Accession, números de acesso UniProtKB/Swiss-Prot e similares), patentes e pedidos de patentes citados são incorporados neste documento a título de referência em sua plenitude para todos os propósitos na mesma extensão como se cada publicação individual, patente e pedido de patente foi específica e individualmente indicados como sendo incorporados por meio de referência em sua plenitude para todos os propósitos. No evento de qualquer variação em sequências associadas com números de acesso Genbank e UniProtKB/Swiss-Prot e similares, a aplicação se refere às sequências associadas aos números de acesso citados partir da data de arquivamento eficaz do pedido significando as datas de arquivamento real ou datas anteriores de um pedido de prioridade que divulgue o número de acesso relevante. Qualquer recurso, etapa, elemento, modalidade, ou aspecto da invenção pode ser usado em combinação com qualquer outros a menos que indicado especificamente de outro modo. Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e entendimento, será parente certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das presentes reivindicações.

Claims (15)

1. Anticorpo monoclonal que se liga ao tau, caracterizado pelo fato de que compreende CDR-H1 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 24, CHR-H2 de SEQ ID NO: 12, CDR-H3 de SEQ ID NO: 13, CDR-L1 de SEQ ID NO: 17, CDR-L2 de SEQ. ID NO: 18 e CDR-L3 de SEQ ID NO: 19.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é humanizado, quimérico ou com superfície modificada.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada madura que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve madura que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as posições H13, H48 e H91 providas são ocupadas por K, M e F, respectivamente, e as posições L1, L4, L36 e L43 são ocupadas por N, L, F e S, respectivamente.
5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura é fundida a uma região de cadeia pesada constante e a região variável de cadeia leve madura é fundida a uma região de cadeia leve constante.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico ou citostático.
9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento Fab.
10. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 25 e uma sequência de nucleotídeo de uma dentre SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
12. Uso de um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma doença associada a tau.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a doença é doença de Alzheimer.
14. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 25 e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 27.
15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma cadeia pesada do anticorpo compreende domínio constante IgG1 humano com a sequência de SEQ ID NO: 29 desde que a lisina C-terminal possa ser omitida e em que uma cadeia leve do anticorpo compreende uma região constante kappa humana com a sequência de SEQ ID NO: 32.
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