KR20150129736A - Tau 면역치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 tau에 대한 항체를 제공한다. 항체는 tau 연관 병리학 및 연관된 증상성 악화를 저해하거나 지연시킨다.

Description

TAU 면역치료제{TAU IMMUNOTHERAPY}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 3월 13일자로 출원된 제61/780,624호 및 2013년 3월 15일자로 출원된 61/800,382호(각각 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)의 정규출원이다.
tau는 인산화 형태로 존재할 수 있는 널리 공지된 인간 단백질이다(예를 들어, 문헌[Goedert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4051-4055(1988); Goedert, EMBO J. 8:393-399(1989); Lee, Neuron 2:1615-1624(1989); Goedert, Neuron 3:519-526(1989); Andreadis, Biochemistry 31:10626-10633(1992)] 참조). tau는 특히 중추 신경계에서 미세소관을 안정화시키는 데 있어서 역할을 갖는 것으로 보고되어 있다. 전체 tau(t-tau, 즉 인산화 형태 및 비인산화 형태) 및 포스포-tau(p-tau, 즉, 인산화 tau)는 뉴런 손상 및 신경퇴행에 반응하여 뇌에 의해 방출되고, 일반 집단에 비해 알츠하이머 환자의 CSF의 수치 증가로 발생하는 것으로 보고되었다(Jack et al., Lancet Neurol 9: 119-28 (2010)).
tau는 플라크와 함께 알츠하이머병에 특징적인 특성인 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle)의 주요 구성성분이다. 이 매듭은 80㎚의 규칙적 주기성으로 나선 방식으로 권취된 쌍으로 나타나는 직경이 10㎚로 측정된 비정상 원섬유를 구성한다. 신경섬유 매듭 내의 tau는 분자 상의 특정 부위에 부착된 포스페이트 기에 의해 비정상적으로 인산화(초인산화)된다. 신경섬유 매듭의 여러 연관이 알츠하이머병에서 내후각 피질의 II 층 뉴런, 해마의 CA1 및 자실 구역, 편도체, 및 신피질의 더 깊은 층(III 층, V 층 및 표재성 VI 층)에서 관찰된다. 과인산화 tau는 또한 뉴런 네트워트 분해를 촉진할 수 있는 미세소관 조립을 방해하는 것으로 보고되었다.
tau는 알츠하이머병, 전측두엽 변성, 진행성 핵상안근 마비 및 픽병을 포함하는 몇몇 신경퇴행 질환의 한정 신경병리학의 일부이다.
본 발명은 단일클론 항체 16B5와 tau에 대한 결합에 대해 경쟁하는 단일클론 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 인간화, 키메라, 베니어 또는 인간 항체이다. 몇몇 항체는 인간 IgG 아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, 또는 IgG4) 유래이다. 몇몇 이러한 항체는 서열 번호 29의 서열을 갖는 인간 IgG1 불변 구역을 갖는다. 몇몇 항체는 서열 번호 32의 서열을 갖는 인간 카파 불변 구역을 갖는다. 몇몇 항체는 불변 구역에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.
몇몇 항체는 단일클론 항체 16B5의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태이다. 몇몇 항체는 단일클론 항체 16B5의 카밧에 의해 한정된 3개의 경쇄 CDR 및 카밧에 의해 한정된 3개의 중쇄 CDR을 갖는다. 몇몇 항체는 인산화 형태 및 비인산화 형태의 tau에 결합한다.
본 발명은 서열 번호 1(스위스-프로트(Swiss-Prot) P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 추가로 제공한다. 몇몇 이러한 항체는 인간, 인간화, 키메라 또는 베니어 항체이다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 25-44번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 30-39번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 인산화 형태 및 비인산화 형태의 tau에 결합한다.
본 발명은 서열 번호 15와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 구역 및 서열 번호 22와 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%) 동일한 성숙 경쇄 가변 구역을 포함하는 단일클론 항체를 추가로 제공한다. 소정의 실시양태에서, 단일클론 항체는 서열 번호 15의 3개의 카밧 CDR 및 서열 번호 22의 3개의 카밧 CDR을 포함한다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 구역은 서열 번호 15로 지정된 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 구역은 서열 번호 21, 서열 번호 22 또는 서열 번호 23으로 지정된 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, H13, H48 및 H91 위치 중 적어도 하나는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치 중 적어도 하나는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, H13, H48 및 H91 위치는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치 중 적어도 2개는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, H13, H48 및 H91 위치는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치 중 적어도 3개는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, H13, H48 및 H91 위치는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 구역은 중쇄 불변 구역에 융합되고, 성숙 경쇄 가변 구역은 경쇄 불변 구역에 융합된다. 몇몇 항체에서, 중쇄 불변 구역은 천연 인간 불변 구역에 비해 Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소한 천연 인간 불변 구역의 돌연변이체 형태이다. 몇몇 항체에서, 중쇄 불변 구역은 IgG1 아이소타입 유래이다.
몇몇 항체에서, 각각 서열 번호 15 및 서열 번호 22로부터의 성숙 중쇄 가변 구역 및 성숙 경쇄 가변 구역의 CDR의 차이는 H60-H65 위치에 있다.
항체는 온전한 항체 또는 단편, 예컨대 Fab 단편일 수 있다.
임의의 단일클론 항체 또는 단편은 세포독성제 또는 세포정지제(cytostatic agent)에 접합될 수 있다.
본 발명은 항체를 인간화하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 구역의 서열을 결정하는 단계; 마우스 항체 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화 중쇄를 코딩하는 핵산 및 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화 경쇄를 코딩하는 핵산을 합성하는 단계; 및 숙주 세포에서 핵산을 발현시켜 인간화 항체를 생성하는 단계를 포함하고, 마우스 항체는 16B5이다.
본 발명은 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 세포가 항체를 분비하도록 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산에 의해 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 세포 배양 배지로부터 항체를 정제하는 단계를 포함하고, 항체는 16B5의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태이다.
본 발명은 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생성하는 세포주를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포로 도입하는 단계; 벡터의 카피수가 증가한 세포를 선택하는 조건 하에 세포를 전파시키는 단계; 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹(banking)하는 단계를 포함하고; 항체는 16B5의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태이다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 번호 10의 서열을 갖는 중쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 번호 15의 서열을 갖는 중쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다. 몇몇 핵산에서, 분절은 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 몇몇 핵산은 예를 들어 서열 번호 29의 서열을 갖는 IgG1 불변 구역, 임의로 인간 IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절을 추가로 포함하되, 단 C 말단 라이신이 생략될 수 있다. 몇몇 핵산에서, IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절은 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 핵산은 중쇄 가변 구역 및 IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절을 연결하는 인트론(intron)을 추가로 포함한다. 예를 들어, 인트론은 서열 번호 31에서 발견된 인트론의 서열을 가질 수 있다. 따라서, IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절 및 인트론은 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 서열 번호 16의 서열을 갖는 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다.
본 발명은 서열 번호 21, 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 서열을 갖는 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산을 추가로 제공한다. 몇몇 핵산에서, 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절은 서열 번호 26, 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 핵산은 카파 불변 구역을 코딩하는 분절을 추가로 포함한다. 카파 불변 구역은 인간 카파 불변 구역일 수 있고, 서열 번호 32의 서열을 가질 수 있다. 임의로, 카파 불변 구역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 33의 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 핵산은 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 카파 불변 구역을 코딩하는 분절에 연결하는 인트론을 추가로 포함한다. 예를 들어, 인트론은 서열 번호 34에서 발견되는 인트론의 서열을 가질 수 있다. 따라서, 카파 불변 구역을 코딩하는 분절 및 인트론은 서열 번호 34의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
임의의 상기 언급된 항체는 서열 번호 29의 서열을 갖는 인간 IgG1 불변 구역을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 번호 32의 서열을 갖는 인간 카파 불변 구역을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단리된 단편을 추가로 제공한다. 몇몇 단편은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 30-39번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함한다. 몇몇 단편은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 33-37번 잔기를 포함한다. 몇몇 단편은 임의로 단편에 대한 항체를 유발하는 것을 돕는 스페이서(spacer)를 통해 캐리어 분자에 연결된다. 몇몇 단편은 인간에 대한 투여에 허용되는 아쥬번트(adjuvant)를 포함하는 약제학적 조성물의 부분이다.
본 발명은 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을 알츠하이머병을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하여, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 본 명세서에 기재된 항체이다. 몇몇 방법에서, 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편이다. 몇몇 방법에서, 환자는 ApoE4 캐리어이다.
본 발명은 tau와 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을 상기 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하여, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 본 명세서에 기재된 항체(예를 들어, 인간화 16B5 항체)이다. 몇몇 방법에서, 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편이다. 몇몇 방법에서, 질환은 신경학적 질환이다.
본 발명은 tau의 비정상 전달을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을 tau의 비정상 전달과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하여, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 본 명세서에 기재된 항체(예를 들어, 인간화 16B5 항체)이다. 몇몇 방법에서, 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편이다.
본 발명은 tau의 식세포작용을 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을 tau의 축적과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 본 명세서에 기재된 항체(예를 들어, 인간화 16B5 항체)이다. 몇몇 방법에서, 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편이다. 몇몇 방법에서, 질환은 신경학적 질환이다.
본 발명은 tau 응집 또는 침착을 저해하는 방법을 추가로 제공한다. 소정의 실시양태에서, 상기 방법은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을 tau의 응집 또는 침착과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 본 명세서에 기재된 항체(예를 들어, 인간화 16B5 항체)이다. 몇몇 방법에서, 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편이다. 몇몇 방법에서, 질환은 신경학적 질환이다.
본 발명은 tau 매듭의 형성을 저해하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을 tau 매듭의 형성과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 본 명세서에 기재된 항체(예를 들어, 인간화 16B5 항체)이다. 몇몇 방법에서, 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편이다. 몇몇 방법에서, 질환은 신경학적 질환이다.
본 발명은 알츠하이머병에 대한 활성에 대해 물질을 스크리닝하는 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 방법은 tau 전이유전자를 발현하는 형질전환 동물에 물질을 투여하는 단계 및 상기 물질이 알츠하이머병의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 저해하거나 지연시키는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 물질은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질이다.
도 1은 16B5 단일클론 항체에 의해 결합된 에피토프(들)를 맵핑하도록 설계된 실험의 결과를 도시한다. 전장 Tau 또는 Tau의 결실 돌연변이체(Δ5-24 또는 Δ25-44)를 함유하는 웨스턴 블롯을 16B5 항체(왼쪽 패널) 또는 Tau46 항체(오른쪽 패널)에 의해 염색하였다. Tau46 항체는 Tau의 C 말단 에피토프에 결합한다.
도 2는 16B5 단일클론 항체에 의해 결합된 에피토프(들)를 맵핑하도록 설계된 실험의 결과를 도시한다. 전장 Tau 또는 Tau의 결실 돌연변이체를 함유하는 웨스턴 블롯을 16B5 항체(상부 왼쪽 패널) 또는 Tau46 항체(오른쪽 패널)에 의해 염색하였다. 16B5 항체에 의해 염색된 블롯의 더 긴 노출은 하부 왼쪽 패널에 도시되어 있다. 이 실험에서 분석된 Tau의 결실 돌연변이체는 Δ25-44, Δ5-24, Δ23-32, Δ30-39 및 Δ37-46을 포함한다.
도 3은 16B5 단일클론 항체에 의해 결합된 에피토프(들)를 맵핑하도록 설계된 알라닌 스캐닝 실험의 결과를 도시한다. 야생형 Tau(WT) 또는 Tau의 알라닌 점 돌연변이체를 함유하는 웨스턴 블롯을 16B5 항체(왼쪽 패널) 또는 Tau46 항체(오른쪽 패널)에 의해 염색하였다. 이 실험에서 분석된 Tau의 알라닌 돌연변이체는 T30A, M31A, H32A, Q33A, D34A, Q35A, E36A, G37A, D38A, T39A, D40A, A41L 및 G42A를 포함한다.
도 4는 인간 tau.P301L 단백질을 발현하는 형질전환 마우스의 뇌간의 사르코실 불용성 분획에서 검출된 tau 단백질의 상대 양을 보여준다. 마우스를 16B5 항체 또는 6F10 항체(비면역 IgG1 아이소타입 대조군)에 의해 수동으로 면역화하였다. 샘플을 웨스턴 블로팅, 항체 염색 및 생성된 신호의 정량화에 의해 분석하였다. tau를 검출하기 위해 사용된 항체는 항-포스포-tau 특이적 항체(AT8, 상부 왼쪽 패널; AT100, 하부 왼쪽 패널; 또는 1F5, 상부 오른쪽 패널) 및 pan tau 항체(HT7, 하부 오른쪽 패널)를 포함하였다.
도 5는 포스포-tau 대 전체 tau 단백질(왼쪽 패널)의 비율 및 인간 tau.P301L 단백질을 발현하는 형질전환 마우스의 전체 뇌간 파쇄액에서 검출된 전체 tau(오른쪽 패널)의 정규화 양을 보여준다. 마우스를 16B5 항체 또는 6F10 항체(비면역 IgG1 아이소타입 대조군)에 의해 수동으로 면역화하였다. 샘플을 웨스턴 블로팅, 항체 염색 및 생성된 신호의 정량화에 의해 분석하였다. AT8 항체는 포스포-tau를 검출하도록 사용되었고, HT7 항체는 전체 tau를 검출하도록 사용되었다. 대조군 6F10 항체에 대한 16B5 항체에 의해 치료된 마우스에서 검출된 tau의 양을 정규화하도록 항-GAPDH 항체를 사용하였다.
도 6은 AT8 항-포스포-tau 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 염색된 인간 tau.P301L 단백질을 발현하는 형질전환 마우스의 소뇌 핵의 절편을 도시한다. 마우스를 16B5 항체(상부 왼쪽 패널) 또는 6F10 항체(하부 왼쪽 패널)(비면역 IgG1 아이소타입 대조군)에 의해 수동으로 면역화하였다. 16B5 또는 6F10 항체에 의해 수동으로 면역화된 마우스로부터 소뇌, 전방부 및 후방부의 삽입된 핵, 부속 외측 소뇌 핵(interposed nucleus of the cerebellum, anterior and posterior part, annex lateral cerebellar nucleus: IntA/P/LAT) 및 시상하부 핵 외측 부정대(subthalamic nucleus annex zona incerta: STH/ZI)에서 AT8 항체에 의해 검출된 tau 염색의 양의 정량화가 상부 막대 그래프 패널에 나타난다. 16B5 또는 6F10 항체에 의해 수동으로 면역화된 마우스로부터의 IntA/P/LAT 및 STH/ZI 절편 상의 AT100 항-포스포-tau 항체를 사용하여 검출된 포스포-tau 염색의 양의 정량화가 하부 막대 그래프 패널에 나타난다. 스튜던트 t 시험(p<0.05)을 이용하여 통계 유의성을 평가하였다.
도 7은 키메라 16B5 항체 및 인간화 16B5 항체(H1L2 및 H1L3 버전)에 의해 얻은 tau 면역침강 결과를 도시한다. 알츠하이머 질환 환자로부터 얻은 사후 전두 피질 샘플의 가용성 분획 및 불용성 분획 둘 다로부터 Tau를 면역침강시켰다. 다중클론 항-tau 항체(tau pAb)를 사용하여 블로팅된 면역침강물에 존재하는 Tau를 검출하였다.
정의
단일클론 항체 및 다른 치료제는 통상적으로 단리된 형태로 제공된다. 이것은 물질이 통상적으로 간섭 단백질, 및 이의 생성 또는 정제로부터 생긴 다른 오염물질 중 적어도 50% w/w 순수하다는 것을 의미하지만, 이 물질이 과량의 약제학적 허용되는 담체(들) 또는 이의 용도를 촉진하도록 의도되는 다른 비히클과 조합될 가능성을 배제하지 않는다. 때때로 단일클론 항체(또는 다른 치료제)는 간섭 단백질 및 생성 또는 정제로부터 생긴 오염물질 중 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순수하다.
본 발명의 항체는 통상적으로 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010M-1의 결합 상수로 이의 지정된 표적에 결합한다. 이러한 결합은 이것이 검출 가능하게 더 높은 규모이고, 적어도 하나의 비연관 표적에 생기는 비특이적 결합으로부터 구별 가능하다는 점에서 특이적 결합이다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간 피트(fit)(예를 들어, 락 및 키 유형) 사이의 결합의 형성의 결과일 수 있지만, 비특이적 결합은 보통 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 단일클론 항체가 하나 및 오직 하나의 표적에 결합한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다.
기본적 항체 구조적 단위는 아단위의 4합체이다. 각각의 4합체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함하고, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25kDa) 및 1개의 "중쇄"(약 50-70kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 약 100개 내지 110개 또는 이것 초과의 아미노산(항원 인식을 주로 담당)의 가변 구역을 포함한다. 이 가변 구역은 개열 가능한 신호 펩타이드에 연결되어 초기에 발현된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 구역은 때때로 성숙 가변 구역이라 칭해진다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 구역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 구역을 의미한다. 각각의 사슬의 카복시 말단 부분은 이팩터 기능을 주로 담당하는 불변 구역을 한정한다. 불변 구역은 임의의 또는 모든 CH1 구역, 힌지 구역, CH2 구역 및 CH3 구역을 포함할 수 있다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 한정한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 구역 및 불변 구역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 구역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 구역을 포함한다. (일반적으로 문헌[Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7](모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)을 참조한다).
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 구역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 2작용성 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다. 사슬은 모두, 또한 상보성 결정 구역 또는 CDR이라 부르는, 3개의 초가변 구역에 의해 연결된 비교적 보전된 프레임워크 구역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 구역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 대한 결합이 가능하게 한다. N 말단으로부터 C 말단으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 카밧의 정의[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)], 또는 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]에 따른다. 카밧은 또한 상이한 중쇄 또는 상이한 경쇄 사이의 상응하는 잔기가 동일한 수로 배정된 널리 사용된 넘버링 관례(카밧 넘버링)를 제공한다.
용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 통상적으로, 단편은 표적에 대한 특이적 결합에 대해 이것이 유래한 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Fv 및 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 (가변) 도메인 항체는 종래의 항체에서 이의 VL 파트너(또는 그 반대)로부터 분리된 VH 구역(Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546), 및 낙타과(Camelidae) 또는 연골 어류(예를 들어, 수염 상어)(여기서, VH 구역이 VL 구역과 연관되지 않음)와 같은 종으로부터의 VH 구역(때때로 VHH로 공지됨)을 포함한다(예를 들어, WO 9404678 참조). 하나의 사슬이 이의 천연 파트너로부터 분리된 단일 도메인 항체는 때때로 Dabs로 공지되어 있고, 낙타과 또는 연골 어류로부터의 단일 도메인 항체는 때때로 나노바디(nanobody)로 공지되어 있다. 불변 구역 또는 불변 구역의 부분은 단일 도메인 항체에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어, 낙타과로부터의 천연 단일 가변 구역 항체는 VHH 가변 구역, 및 CH2 및 CH3 불변 구역을 포함한다. 단일 도메인 항체는 종래의 항체에 대한 유사한 접근법에 의한 인간화의 대상일 수 있다. 항체의 Dabs 유형은 보통 인간 기원의 항체로부터 얻어진다. 항체의 나노바디 유형은 낙타과 또는 상어 기원이고, 인간화로 처리될 수 있다. 단편은 재조합 DNA 기법, 또는 온전한 면역글로불린의 효소 또는 화학 분리에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 2작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌[Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조).
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 노출 시 보유되지만, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 의한 처리 시 소실된다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 입체구성에서 적어도 3개 및 더욱 보통, 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프가 단백질에서 아미노산 잔기의 범위 내에(예를 들어, tau의 25 내지 44번 잔기 내에) 있다고 말해질 때, 이 범위는 이의 경계를 한정하는 잔기를 포함한다. 이 범위 내의 소정의 잔기는 에피토프에 기여하지만, 다른 것은 그렇지 않을 것이다. 에피토프를 형성하는 잔기는 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 유사하게, 항체가 아미노산의 특정한 범위 내에서 발견되는 에피토프에 결합할 때, 항체는 이 범위 내의 모든 아미노산 잔기와 접촉할 필요는 없고, 항체에 의해 접촉된 에피토프의 잔기는 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 에피토프의 공간 입체구성을 결정하는 방법은 예를 들어, x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
동일한 또는 중첩하는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순한 면역검정에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위해 이의 항원에 결합한 항체의 X선 결정학에 의해 규정될 수 있다. 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 몇몇 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 중첩 에피토프를 갖는다. 본 발명은 16B5와 경쟁하고/하거나, tau 상에서 16B5와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
항체 사이의 경쟁은 시험 중인 항체가 공통 항원에 대한 기준 항체(예를 들어, 16B5)의 특이적 결합을 저해하는 검정에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 초과의 시험 항체(예를 들어, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁적 결합 검정에서 측정될 때 기준 항체의 결합을 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 99% 저해하는 경우, 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 발생하도록 기준 항체가 결합한 에피토프에 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류할 목적을 위해, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: I 그룹(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; II 그룹(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; III 그룹(산성 측쇄): asp, glu; IV 그룹(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V 그룹(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 VI 그룹(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 분류 내의 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 것의 구성원에 대해 교환하는 것을 구성한다.
백분율 서열 동일성은 카밧 넘버링 관례에 의해 최대로 정렬된 항체 서열에 의해 결정된다. 정렬 후, 대상 항체 구역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 구역)이 기준 항체의 동일한 구역과 비교되는 경우, 대상 항체 구역과 기준 항체 구역 사이의 백분율 서열 동일성은 대상 항체 구역 및 기준 항체 구역 둘 다에서의 동일한 아미노산이 점유한 위치의 수를 2개의 구역의 정렬된 위치의 전체 수(갭은 계수되지 않음)에 의해 나누고, 100을 곱해서 백분율로 전환한 것이다.
용어 "아쥬번트"는 항원과 같이 투여될 때 항원에 대한 면역 반응을 증대시키고/시키거나 재지시하지만, 단독으로 투여될 때 항원에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 의미한다. 아쥬번트는 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극 및 대식세포의 자극을 포함하는 몇몇 기전에 의해 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
질환을 갖는 환자의 집단이 신경학적 질환을 갖는 것으로 공지되지 않은 대상체의 집단과 비교하여 뇌에서의 tau의 수치의 증가, 또는 tau의 침착 또는 봉입의 증가, 또는 뇌에서의 tau 매듭의 존재, 또는 뇌에서의 tau의 인산화(분자 tau당 포스페이트 기의 평균 수)의 증가, 또는 tau의 비정상 세포간 또는 세포내 전달을 갖는 경우, 질환은 tau와 연관된다. tau 유전자의 변이체 형태를 갖는 환자가 야생형(인간 집단에서 가장 흔히 발생하는 변이체) tau 유전자를 갖는 환자에 비해 질환을 발생시킬 위험의 증가를 갖는 경우, 질환은 또한 tau와 연관된다.
대상체가 적어도 하나의 공지된 위험 인자(예를 들어, 유전적, 생화학적, 가족 병력, 상황적인 노출)를 가져, 위험 인자를 갖는 개인을 위험 인자가 없는 개인보다 질환을 발생시킬 통계적으로 유의적인 더 큰 위험에 있게 하는 경우, 개인은 질환의 위험의 증가에 있다.
용어 "증상"은, 환자가 인지하는 것과 같은, 걸음걸이의 변경과 같은 질환의 주관적인 증거를 의미한다. "징후"는, 의사가 관찰하는 것과 같은, 질환의 객관적인 증거를 의미한다.
통계 유의성은 p≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 일반사항
본 발명은 tau에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 23-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 인산화 상태와 관계없이 tau에 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 tau 연관 병리학 및 연관 증상성 악화를 저해하거나 지연시키도록 작용한다. 기전의 이해가 본 발명의 실행에 필요하지 않지만, 다른 기전 중에서 비독성 입체구성을 안정화시킴으로써, 또는 병원성 tau 형태의 세포간 또는 세포내 전달을 저해함으로써, tau의 식세포작용을 유도하거나, 분자간 또는 분자내 응집으로부터, 또는 다른 분자에 대한 결합으로부터 tau를 저해하는 항체의 결과로서 독성의 감소가 발생할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이러한 항체를 유도하는 물질은 알츠하이머 및 tau와 연관된 다른 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용될 수 있다.
II. Tau
문맥으로부터 달리 명확하지 않은 한, tau에 대한 언급은 번역 후 변형(예를 들어, 인산화, 당화반응, 또는 아세틸화)이 존재하는지와 무관하게 모든 아이소폼을 포함하는 tau의 천연 인간 형태를 의미한다. 인간 뇌에서 발생하는 tau의 6개의 주요 아이소폼(스플라이스 변이체)가 존재한다. 이 변이체 중 가장 긴 것은 441개의 아미노산을 갖고, 이 아미노산의 처음의 met 잔기는 개열된다. 잔기는 441개의 아이소폼에 따라 넘버링된다. 따라서, 예를 들어, 404번 위치에서의 인산화에 대한 언급은 441개의 아이소폼의 404번 위치, 또는 441개의 아이소폼과 최대로 정렬될 때 임의의 다른 아이소폼의 상응하는 위치를 의미한다. 아이소폼의 아미노산 서열 및 스위스 프로트 수는 하기 표시되어 있다.
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tau에 대한 언급은 공지된 천연 변이를 포함하고, 이 변이의 약 30개는 스위스 프로트 데이터베이스 및 이의 순열, 및 tau 병리학, 예컨대 치매, 픽병, 핵상안근 마비 등과 연관된 돌연변이에 기재되어 있다(예를 들어, 스위스 프로트 데이터베이스 및 문헌[Poorkaj, et al. Ann Neurol. 43:815-825 (1998)] 참조). 441개의 아이소폼에 의해 넘버링된 tau 돌연변이의 몇몇 예는 257번 아미노산 잔기에서의 트레오닌으로의 라이신의 돌연변이(K257T), 260번 아미노산 위치에서의 발린으로의 아이소류신의 돌연변이(I260V); 272번 아미노산 위치에서의 발린으로의 글라이신의 돌연변이(G272V); 279번 아미노산 위치에서의 라이신으로의 아스파라긴의 돌연변이(N279K); 296번 아미노산 위치에서의 히스티딘으로의 아스파라긴의 돌연변이 (N296H); 301번 아미노산 위치에서의 세린으로의 프롤린의 돌연변이 (P301S); 303번 아미노산 위치에서의 발린으로의 글라이신의 돌연변이(G303V); 305번 아미노산 위치에서의 아스파라긴으로의 세린의 돌연변이(S305N); 335번 아미노산 위치에서의 세린으로의 글라이신의 돌연변이(G335S); 337번 위치에서의 메티오닌으로의 발린의 돌연변이(V337M); 342번 위치에서의 발린으로의 글루탐산의 돌연변이(E342V); 369번 아미노산 위치에서의 아이소류신으로의 라이신의 돌연변이(K3691); 389번 아미노산 위치에서의 아르기닌으로의 글라이신의 돌연변이(G389R); 및 406번 아미노산 위치에서의 트립토판으로의 아르기닌의 돌연변이(R406W)이다.
Tau는 18번, 29번, 97번, 310번 및 394번 아미노산 위치에서의 타이로신, 184번, 185번, 198번, 199번, 202번, 208번, 214번, 235번, 237번, 238번, 262번, 293번, 324번, 356번, 396번, 400번, 404번, 409번, 412번, 413번 및 422번 아미노산 위치에서의 세린; 및 175, 181번, 205번, 212번, 217번, 231번 및 403번 아미노산 위치에서의 트레오닌을 포함하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 인산화될 수 있다.
III. 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
본 발명은 tau에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 23-46번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 25-44번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 28-41번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 30-39번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 30-36번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 33-39번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 33-36번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 서열 번호 1의 28-30번, 28-31번, 28-32번, 28-33번, 28-34번, 28-35번, 28-36번, 28-37번, 28-38번, 28-39번, 28-40번, 28-41번, 29-31번, 29-32번, 29-33번, 29-34번, 29-35번, 29-36번, 29-37번, 29-38번, 29-39번, 29-40번, 29-41번, 30-32번, 30-33번, 30-34번, 30-35번, 30-36번, 30-37번, 30-38번, 30-39번, 30-40번, 30-41번, 31-33번, 31-34번, 31-35번, 31-36번, 31-37번, 31-38번, 31-39번, 31-40번, 31-41번, 32-34번, 32-35번, 32-36번, 32-37번, 32-38번, 32-39번, 32-40번, 32-41번, 33-35번, 33-36번, 33-37번, 33-38번, 33-39번, 33-40번, 33-41번, 34-36번, 34-37번, 34-38번, 34-39번, 34-40번, 34-41번, 35-37번, 35-38번, 35-39번, 35-40번, 35-41번, 36-38번, 36-39번, 36-40번, 36-41번 잔기를 갖는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 인산화 상태와 무관하게 tau에 결합한다. 몇몇 항체는 인산화로 처리된 잔기를 포함하지 않는 에피토프에 결합한다. 천연 공급원으로부터 정제되거나 재조합으로 발현된 tau 폴리펩타이드에 의해 면역화함으로써 이 항체를 얻을 수 있다. 비인산화 형태, 및 인산화가 되기 쉬운 하나 이상의 잔기가 인산화된 형태의 tau에 대한 결합에 대해 항체를 스크리닝할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 구별 불가능한 친화도로 또는 비인산화 tau(즉, "pan 특이적임)와 비교하여 인산화 tau에 적어도 1.5배, 2배 또는 3배의 인자 내로 결합한다. 16B5는 pan 특이적 단일클론 항체의 예이다. 본 발명은 또한 예를 들어 16B5의 에피토프 등과 같은 임의의 상기 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 16B5와 경쟁하는 것과 같은 임의의 상기 항체와 tau에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체가 또한 포함된다.
서열 번호 1의 23-46번, 25-44번, 28-30번, 28-31번, 28-32번, 28-33번, 28-34번, 28-35번, 28-36번, 28-37번, 28-38번, 28-39번, 28-40번, 28-41번, 29-31번, 29-32번, 29-33번, 29-34번, 29-35번, 29-36번, 29-37번, 29-38번, 29-39번, 29-40번, 29-41번, 30-32번, 30-33번, 30-34번, 30-35번, 30-36번, 30-37번, 30-38번, 30-39번, 30-40번, 30-41번, 31-33번, 31-34번, 31-35번, 31-36번, 31-37번, 31-38번, 31-39번, 31-40번, 31-41번, 32-34번, 32-35번, 32-36번, 32-37번, 32-38번, 32-39번, 32-40번, 32-41번, 33-35번, 33-36번, 33-37번, 33-38번, 33-39번, 33-40번, 33-41번, 34-36번, 34-37번, 34-38번, 34-39번, 34-40번, 34-41번, 35-37번, 35-38번, 35-39번, 35-40번, 35-41번, 36-38번, 36-39번, 36-40번, 36-41번 잔기를 포함하는 펩타이드에 의해 면역화함으로써 또는 이러한 잔기를 포함하는 전장 tau 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 의해 면역화하고 이러한 잔기를 포함하는 펩타이드에 대한 특이적 결합을 스크리닝함으로써 상기 언급된 항체를 신생 생성할 수 있다. 이러한 펩타이드는 바람직하게는 펩타이드에 대한 항체 반응을 유발하도록 돕는 이종성 접합체 분자에 부착된다. 부착은 직접적 부착 또는 스페이서 펩타이드 또는 아미노산을 통한 부착일 수 있다. 이의 유리 SH 기가 캐리어 분자의 부착을 촉진하므로, 시스테인을 스페이서 아미노산으로서 사용한다. 글라이신과 펩타이드 사이에 시스테인 잔기를 갖거나 갖지 않는 폴리글라이신 링커(예를 들어, 2개 내지 6개의 글라이신)를 또한 사용할 수 있다. 캐리어 분자는 펩타이드에 대한 항체 반응을 유발하도록 돕는 T 세포 에피토프를 제공하도록 작용한다. 몇몇 캐리어, 특히 키홀 림펫 혈색소(keyhole limpet hemocyanin: KLH), 난알부민 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)을 보통 사용한다. 고상 펩타이드 합성의 일부로서 펩타이드 면역원에 펩타이드 스페이서를 첨가할 수 있다. 화학 가교결합에 의해 캐리어를 통상적으로 첨가한다. 사용될 수 있는 화학 가교결합제의 몇몇 예는 크로스-N-말레이미도-6-아미노카프로일 에스터 또는 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터(MBS)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Harlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988; Sinigaglia et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz et al., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; 및 Southwood et al. J. Immunology, 160:3363-3373 (1998)] 참조). 캐리어 및 스페이서는 존재하는 경우 면역원의 어느 한 말단에 부착될 수 있다.
하기 더 자세히 기재된 B 세포 또는 실험실 동물을 면역화하기 위해 임의의 스페이서 및 캐리어를 갖는 펩타이드를 사용할 수 있다. 서열 번호 1의 24-46번, 25-44번, 28-30번, 28-31번, 28-32번, 28-33번, 28-34번, 28-35번, 28-36번, 28-37번, 28-38번, 28-39번, 28-40번, 28-41번, 29-31번, 29-32번, 29-33번, 29-34번, 29-35번, 29-36번, 29-37번, 29-38번, 29-39번, 29-40번, 29-41번, 30-32번, 30-33번, 30-34번, 30-35번, 30-36번, 30-37번, 30-38번, 30-39번, 30-40번, 30-41번, 31-33번, 31-34번, 31-35번, 31-36번, 31-37번, 31-38번, 31-39번, 31-40번, 31-41번, 32-34번, 32-35번, 32-36번, 32-37번, 32-38번, 32-39번, 32-40번, 32-41번, 33-35번, 33-36번, 33-37번, 33-38번, 33-39번, 33-40번, 33-41번, 34-36번, 34-37번, 34-38번, 34-39번, 34-40번, 34-41번, 35-37번, 35-38번, 35-39번, 35-40번, 35-41번, 36-38번, 36-39번, 36-40번, 36-41번 잔기 및/또는 예를 들어, 인산화 형태의 404번 위치를 갖는 tau의 전장 아이소폼과 같은 tau의 인산화 형태 및 비인산화 형태를 포함하는 하나 이상의 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 하이브리도마 상청액을 시험할 수 있다. 펩타이드를 캐리어 또는 다른 태그에 부착하여 스크리닝 검정을 촉진할 수 있다. 이런 경우에, 캐리어 또는 태그는, tau 펩타이드보다는, 스페이서 또는 캐리어에 특이적인 항체를 제거하기 위해 면역화에 사용된 스페이서 및 캐리어 분자의 조합과 우선적으로 상이하다. 임의의 tau 아이소폼을 사용할 수 있다.
파지 디스플레이 방법의 변형을 이용하여 선택된 쥣과 항체(예를 들어, 16B5)의 결합 특이성을 갖는 항체를 또한 생성할 수 있다. 윈터(Winter)의 WO 제92/20791호를 참조한다. 이 방법은 인간 항체를 생성하는 데 특히 적합하다. 이 방법에서, 선택된 쥣과 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 구역을 시작 물질로서 사용한다. 예를 들어, 경쇄 가변 구역을 출발 물질로서 선택하는 경우, 구성원이 동일한 경쇄 가변 구역(즉, 쥣과 출발 물질) 및 상이한 중쇄 가변 구역을 디스플레이하는 파지 라이브러리를 작제한다. 재배열된 인간 중쇄 가변 구역의 라이브러리로부터 예를 들어 중쇄 가변 구역을 얻을 수 있다. 원하는 표적(예를 들어, tau 펩타이드)에 강한 특이적 결합(예를 들어, 적어도 108 및 바람직하게는 적어도 109M- 1)을 나타내는 파지를 선택한다. 이후, 이 파지로부터의 중쇄 가변 구역은 추가의 파지 라이브러리를 작제하기 위한 출발 물질로서 작용한다. 이 라이브러리에서, 각각의 파지는 동일한 중쇄 가변 구역(즉, 제1 디스플레이 라이브러리로부터 확인된 구역) 및 상이한 경쇄 가변 구역을 디스플레이한다. 예를 들어, 재배열된 인간 가변 경쇄 구역의 라이브러리로부터 경쇄 가변 구역을 얻을 수 있다. 다시, 원하는 표적에 강한 특이적 결합을 나타내는 파지를 선택한다. 생성된 항체는 보통 쥣과 출발 물질과 동일한 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는다.
16B5와 같은 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 다른 항체를 얻을 수 있다. 성숙 경쇄 및/또는 경쇄 가변 구역의 아미노산 서열에서 16B5와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하고, 이의 기능적 특성을 보유하고/하거나, 작은 수의 기능상 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실, 또는 삽입에 의해 각각의 항체와 다른 단일클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 16B5의 상응하는 CDR과 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 카밧에 의해 한정된 적어도 1개 및 바람직하게는 모든 6개의 CDR(들)을 갖는 단일클론 항체가 또한 포함된다.
B. 비인간 항체
예를 들어, 동물을 상기 기재된 바와 같은 면역원에 의해 면역화함으로써 면역원에 대한 다른 비인간 단일클론 항체, 예를 들어, 쥣과, 기니아 피그, 영장류, 래빗 또는 랫트의 생성을 수행할 수 있다. 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)](모든 목적을 위해 참조문헌으로 포함됨)을 참조한다. 천연 공급원으로부터, 펩타이드 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 이러한 면역원을 얻을 수 있다.
임의로, 면역원을 아쥬번트와 함께 투여할 수 있다. 몇몇 유형의 아쥬번트를 하기 기재된 바대로 사용할 수 있다. 실험실 동물의 면역화에 완전 프로인트 아쥬번트, 이어서 불완전 아쥬번트가 바람직하다. 다중클론 항체를 제조하기 위해 래빗 또는 기니아 피그를 통상적으로 사용한다. 단일클론 항체를 제조하기 위해 마우스를 통상적으로 사용한다. 특이적 결합에 대해 항체를 스크리닝한다. 임의로, tau의 특정한 구역에 대한 결합에 대해 항체를 추가로 스크리닝한다. tau의 결실 돌연변이체의 수집에 대한 항체의 결합의 결정 및 결실 돌연변이체가 항체에 결합하는지의 결정에 의해 이러한 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, FACS(상표명) 또는 ELISA에 의해 결합을 평가할 수 있다.
C. 인간화 항체
인간화 항체는 비인간 "도너" 항체(예를 들어, 16B5)로부터의 CDR이 인간 "억셉터" 항체 서열로 그래프팅된 유전적으로 조작된 항체이다(예를 들어, 퀸(Queen)의 US 5,530,101 및 5,585,089; 윈터의 US 5,225,539, 카르터(Carter)의 US 6,407,213, 아데어(Adair)의 US 5,859,205, 6,881,557, 푸트(Foote)의 US 6,881,557 참조). 억셉터 항체 서열은 예를 들어 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 컴포지트, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식선 구역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 및 가변 구역 프레임워크 서열 및 불변 구역으로부터의, 존재하는 경우, 전부 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의, CDR의 일부 또는 전부를 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 중쇄 및 중쇄 가변 구역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 구역으로부터의, 존재하는 경우, 실질적으로 인간 중쇄 가변 구역 프레임워크 및 불변 구역 서열로부터의, 적어도 1개, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는다. 유사하게, 인간화 경쇄는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 경쇄 및 경쇄 가변 구역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 구역으로부터의, 존재하는 경우, 실질적으로 인간 경쇄 가변 구역 프레임워크 및 불변 구역 서열로부터의, 적어도 1개, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는다. 나노바디 및 dAbs 이외에, 인간화 항체는 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 인간화 항체에서의 CDR은, (카밧에 의해 한정된) 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각자의 CDR 사이에 동일할 때, 실질적으로 비인간 항체에서의 상응하는 CDR에서 유래한다. 항체 사슬의 가변 구역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 구역은, 카밧에 의해 한정된 상응하는 잔기의 적어도 85, 90, 95 또는 100%가 동일할 때, 실질적으로 각각 인간 가변 구역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 구역에서 유래한다.
인간화 항체가 대개 마우스 항체로부터의 (바람직하게는 카밧에 의해 한정된) 모든 6개의 CDR을 편입하지만, 마우스 항체로부터 모든 CDR보다 적은(예를 들어, 적어도 3개, 4개 또는 5개) CDR로 이것을 또한 만들 수 있다(예를 들어, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000] 참조).
몇몇 항체에서, CDR의 오직 일부, 즉 SDR이라 칭하는 결합에 필요한 CDR 잔기의 하위세트가 인간화 항체에서의 결합을 보유하는 데 필요하다. 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004]에 기재된 바대로, 쵸티아(Chothia) 초가변 루프 밖에 있는 카밧 CDR로부터(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), 이전의 연구(예를 들어, CDR H2에서의 H60-H65 잔기가 대개 필요하지 않음)에 기초하여 항원과 접촉하지 않고 SDR에 있지 않은 CDR 잔기를 확인할 수 있다. 하나 이상의 도너 CDR 잔기가 부재하거나, 전체 도너 CDR이 생략된 위치에서의 이러한 인간화 항체에서, 이 위치를 점유하는 아미노산은 억셉터 항체 서열에서 (카밧 넘버링에 의해) 상응하는 위치를 점유하는 아미노산일 수 있다. CDR에서의 도너 아미노산이 포함되게 하는 억셉터의 이러한 치환의 수는 경쟁적 고려사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체에서의 마우스 아미노산의 수를 감소시키고 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시키는 데 있어서 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도를 변화시킬 수 있고, 상당한 친화도의 감소가 바람직하게는 회피된다. 치환하기 위한 아미노산 및 CDR 내의 치환에 대한 위치는 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
인간 억셉터 서열 가변 구역 프레임워크와 도너 항체 사슬의 상응하는 가변 구역 프레임워크 사이의 높은 정도의 서열 동일성(예를 들어, 65% 내지 85%의 동일성)을 제공하기 위해 많은 공지된 인간 항체 서열 중에서 인간 억셉터 항체 서열이 임의로 선택될 수 있다.
인간 가변 구역 프레임워크 잔기로부터의 소정의 아미노산은 CDR 입체구성 및/또는 항원에 대한 결합에 대한 이의 가능한 영향에 기초하여 치환에 대해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 조사는 모델링, 특정한 위치에서의 아미노산의 특징의 검사, 또는 특정한 아미노산의 돌연변이유발 또는 치환의 효과의 경험적 관찰에 의한다.
예를 들어, 쥣과 가변 구역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 구역 프레임워크 잔기 사이에 아미노산이 다른 경우, 인간 프레임워크 아미노산은, 아미노산이
(1) 비공유로 항원에 직접적으로 결합하고,
(2) CDR 구역에 인접하고,
(3) 그렇지 않으면 (예를 들어, 상동성의 공지의 면역글로불린 사슬의 규명된 구조 상에 경쇄 또는 중쇄를 모델링함으로써 확인된) (예를 들어, CDR 구역의 약 6Å 내에 있는) CDR 구역;
(4) VL-VH 계면에 참여하는 잔기와 상호작용하는 것
으로 합당하게 예상될 때, 마우스 항체로부터의 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
퀸의 US 5,530,101에 의해 규정된 바와 같은 종류 (1)-(3)으로부터의 프레임워크 잔기는 때때로 교대하여 카노니컬(canonical) 및 버니어(vernier) 잔기라 칭해진다. CDR 루프의 입체구성을 결정하는 도너 CDR 루프의 카노니컬 종류를 규정하는 프레임워크 잔기는 때때로 카노니컬 잔기라 칭해진다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987), Thornton & Martin J. Mol. Biol., 263, 800-815, 1996). 항원에 대한 항체의 피트를 미세 조정하는 역할을 하는 항원-결합 루프 입체구성을 지지하는 프레임워크 잔기의 층은 때때로 버니어 잔기라 칭해진다(Foote & Winter, 1992, J Mol Bio. 224, 487-499). 치환에 대한 다른 후보는 잠재적 당화 부위를 생성시키는 잔기이다. 치환에 대한 다른 후보는 이 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 드문 억셉터 인간 프레임워크 아미노산이다. 이 아미노산은 마우스 도너 항체의 동등한 위치 또는 더 통상적인 인간 면역글로불린의 동등한 위치로부터의 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 치환에 대한 다른 후보는 이 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 드문 억셉터 인간 프레임워크 아미노산이다.
본 발명은 마우스 16B5 항체의 인간화 형태를 제공한다. 마우스 항체는 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 16을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 포함한다. 본 발명은 하나의 예시적인 인간화 성숙 중쇄 가변 구역(H1) 및 3개의 예시적인 인간화 성숙 경쇄 가변 구역(L1, L2 및 L3)을 제공한다. H1L2 변이체는 키메라 16B5 및 7개의 복귀 돌연변이와 동일한 또는 더 우수한 친화도를 갖는다. H1L1 및 H1L3은 키메라 16B5 및 6개의 복귀 돌연변이와 유사한 친화도를 갖는다.
본 발명은 인간화 성숙 중쇄 가변 구역이 서열 번호 15와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 나타내고, 인간화 성숙 경쇄 성숙 가변 구역이 서열 번호 22와 적어도 90%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 H1L2 인간화 16B5 항체의 변이체를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 항체에서, H1L2에서의 복귀 돌연변이의 일부 또는 전부가 보유된다. 즉, 적어도 1개, 2개 또는 3개의 위치에서 H13 위치의 K에 의해 점유되고, H48 위치는 M에 의해 점유되고, H91 위치는 F에 의해 점유된다. 바람직하게는, 적어도 1개, 2개, 3개 또는 모든 4개의 위치에서 L1 위치는 N에 의해 점유되고, L4 위치는 L에 의해 점유되고, L36 위치는 F에 의해 점유되고, L43 위치는 S에 의해 점유된다. 이러한 인간화 항체의 CDR 구역은 H1L2의 CDR 구역(마우스 도너 항체의 것과 동일)과 바람직하게는 동일하거나 실질적으로 동일하다. CDR 구역은 임의의 종래의 정의(예를 들어, 쵸티아)에 의해 한정될 수 있지만, 바람직하게는 카밧에 의해 한정된다.
16B5 변이체에서의 추가의 변이에 대한 하나의 가능성은 가변 구역 프레임워크에서의 추가의 복귀 돌연변이이다. 인간화 mAb에서의 CDR과 접촉하지 않는 많은 프레임워크 잔기는 도너 마우스 mAb 또는 다른 마우스 또는 인간 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산의 치환을 수용할 수 있고, 심지어 많은 잠재적 CDR-접촉 잔기는 또한 치환에 변경 가능하거나, 심지어 CDR 내의 아미노산은, 예를 들어 가변 구역 프레임워크를 공급하기 위해 사용된 인간 억셉터 서열의 상응하는 위치에서 발견된 잔기에 의해 변경될 수 있다. 또한, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 교대하는 인간 억셉터 서열을 사용할 수 있다. 상이한 억셉터 서열을 사용하는 경우, 상응하는 도너 및 억셉터 잔기가 이미 복귀 돌연변이가 없는 것이므로, 상기 추천된 하나 이상의 복귀 돌연변이를 수행할 수 없다. 예를 들어, H13 위치가 이미 K에 의해 점유된 중쇄 억셉터 서열을 사용할 때, 복귀 돌연변이가 필요하지 않다.
본 발명은 또한 성숙 경쇄 및 중쇄 가변 구역이 인간화 16B5 H1L1 항체(각각 서열 번호 21 및 서열 번호 15) 또는 인간화 16B5 H1L3 항체(각각 서열 번호 23 및 서열 번호 15)의 성숙 경쇄 및 중쇄 가변 구역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 인간화 항체를 포함한다.
D. 키메라 및 베니어 항체
본 발명은 비인간 항체, 특히 16B5 항체의 키메라 및 베니어 형태를 추가로 제공한다.
키메라 항체는 비인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 구역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 구역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전부 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하고, 약 인간 서열의 ⅔이다.
베니어 항체는 비인간 항체의 비인간 가변 구역 프레임워크 잔기의 일부 및 CDR의 일부 및 보통 전부를 보유하지만, B 또는 T 세포 에피토프, 예를 들어 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)에 기여할 수 있는 다른 가변 구역 프레임워크 잔기를 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기에 의해 대체하는, 인간화 항체의 유형이다. 결과는 CDR이 전부 또는 실질적으로 비인간 항체 유래인 항체이고, 비인간 항체의 가변 구역 프레임워크는 치환에 의해 더 인간과 유사하게 만들어진다. 16B5 항체 중 어느 하나의 베니어 형태가 본 발명에 포함된다.
E. 인간 항체
tau에 대한 인간 항체는 하기 기재된 다양한 기법에 의해 제공된다. 인간 항체를 제조하는 방법은 문헌[Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983)]; 외스트베르크(Oestberg)의 미국 특허 제4,634,664호; 및 잉글만(Engleman) 등의 미국 특허 제4,634,666호]의 트리오마 방법, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 형질전환 마우스의 사용(예를 들어, 문헌[론베르크(Lonberg) 등의 WO93/12227(1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), 쿠케르라파티(Kucherlapati)의 WO 91/10741(1991)] 참조) 및 파지 디스플레이 방법(예를 들어, 도워(Dower) 등의 WO 91/17271 및 맥카페르티(McCafferty) 등의 WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 및 US 5,565,332 참조)을 포함한다.
F. 불변 구역의 선택
키메라, 인간화(베니어 포함), 또는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 구역은 인간 불변 구역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 구역의 선택은, 부분적으로, 항체 의존적 보체 및/또는 세포 매개 세포독성이 바람직한지에 따라 달라진다. 예를 들어, 인간 아이소토프 IgG1 및 IgG3은 보체 매개 세포독성을 갖지만, 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 불량한 보체 매개 세포독성을 갖거나 갖지 않는다. 경쇄 불변 구역은 람다 또는 카파일 수 있다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 4합체로서, 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 구역이 스페이서를 통해 연결된 단일 사슬 항체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 구역은 상이한 개인 사이에 알로타입 변이 및 아이소알로타입 변이를 나타내고, 즉 불변 구역은 하나 이상의 다형 위치에서 상이한 개인에서 다를 수 있다. 아이소알로타입은 아이소알로타입을 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 아이소타입의 다형이 아닌 구역에 결합한다는 점에서 알로타입과 다르다. 인간 불변 구역에 대한 언급은 임의의 천연 알로타입 또는 천연 알로타입에서 다형 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 갖는 불변 구역, 또는 하기 기재된 바와 같은 이팩터 기능을 감소시키거나 증가시키기 위한 3개, 5개 또는 10개 이하의 치환을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서의 일 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C 말단 라이신은 분자의 일부 또는 전부에서 손실되거나 유도체화될 수 있다. 치환은 이팩터 기능, 예컨대 보체 매개 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해(예를 들어, 윈터 등의 미국 특허 제5,624,821호; 추(Tso) 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 문헌[Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장하기 위해(예를 들어, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조), 불변 구역에서 만들어질 수 있다. 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위한 250번 위치에서의 Gln 및/또는 428번 위치에서의 Leu(EU 넘버링은 불변 구역에 대해 이 문단에서 사용됨)를 포함한다. 임의의 또는 모든 234번, 235번, 236번 및/또는 237번 위치에서의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다(예를 들어, US 6,624,821 참조). 인간 IgG1의 234번, 235번 및 237번 위치에서의 알라닌 치환은 이팩터 기능을 감소시키기 위해 바람직하다. 임의로, 인간 IgG2에서의 234번, 236번 및/또는 237번 위치는 알라닌에 의해 치환되고, 235번 위치는 글루타민에 의해 치환된다.(예를 들어, US 5,624,821 참조)
G. 재조합 항체의 발현
키메라, 인간화(베니어 포함) 및 인간 항체는 통상적으로 재조합 발현에 의해 제조된다. 항체를 코딩하는 핵산은 원하는 세포형(예를 들어, CHO 또는 Sp2/0)에서 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 인간화 16B5 중쇄 및 경쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산은 예를 들어 서열 번호 25(Hu16B5 H1을 코딩), 서열 번호 26(Hu16B5 L1을 코딩), 서열 번호 27(Hu16B5 L2를 코딩), 또는 서열 번호 28(Hu16B5 L3을 코딩)을 포함하거나, 이들로 이루어진 서열을 갖는다. 서열 번호 10 및 서열 번호 16과 같은 신호 펩타이드를 포함하는 가변 구역의 경우, 핵산은 신호 펩타이드과 함께 또는 이것 없이 가변 구역을 코딩할 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분절은 동일한 인접 핵산 분자 상에 또는 별개의 분자 상에 존재할 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 동일한 벡터로부터 또는 상이한 벡터로부터 발현될 수 있다. 핵산은 통상적으로 단리 형태로 제공된다.
인간화 16B5 중쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산은 예를 들어 서열 번호 30의 서열을 갖는 인간 IgG1 불변 구역을 코딩하는 핵산 분절에 연결될 수 있다. 이러한 핵산은 중쇄 가변 구역 및 IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절 사이(즉, 불변 구역을 코딩하는 분절의 5')에 위치한 인트론을 또한 포함할 수 있다. 인간 IgG1 불변 구역을 코딩하고 이의 5' 말단에서 마우스 인트론을 갖는 예시적인 핵산 서열은 서열 번호 31에 기재되어 있다.
인간화 16B5 경쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산은 예를 들어 서열 번호 33의 서열을 갖는 인간 카파 불변 구역을 코딩하는 핵산 분절에 연결될 수 있다. 이러한 핵산은 경쇄 가변 구역 및 카파 불변 구역을 코딩하는 분절 사이(즉, 카파 불변 구역의 5')의 인트론을 또한 포함할 수 있다. 인간 카파 불변 구역을 코딩하고 이의 5' 말단에서 인간 인트론을 갖는 예시적인 핵산 서열은 서열 번호 34에 기재되어 있다.
재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은, 천연 연관 또는 이종성 프로모터 구역을 포함하는, 항체 사슬의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 통상적으로 포함한다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵생물 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터에서 진핵생물 프로모터 시스템이다. 벡터가 적절한 숙주로 편입되면, 뉴클레오타이드 서열의 고수준 발현, 및 상호작용 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 숙주를 유지시킨다. 항체 사슬을 코딩하는 벡터 또는 벡터들은 또한 선택 가능한 유전자, 예컨대 디하이드로엽산 환원효소 또는 글루타민 생성효소를 함유하여, 항체 사슬을 코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시킬 수 있다.
이. 콜라이는 항체, 특히 항체 단편을 발현시키기에 특히 유용한 원핵생물 숙주이다. 미생물, 예컨대 효모는 발현에 또한 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는 바람직한 효모 숙주이고, 적합한 벡터는 원하는 바대로 발현 조절 서열, 복제 기원, 종결 서열 등을 갖는다. 통상적인 프로모터는 3-포스포글라이세레이트 키나제 및 다른 해당 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 무엇보다도 알콜 탈수소효소, 아이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
포유동물 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 분절을 발현시키기에 바람직한 숙주이다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다. 온전한 이종성 단백질을 분비할 수 있는 적합한 다수의 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되었고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0을 포함하는 비항체 생성 골수종을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간이다. 이 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol . Rev. 89:49 (1986)) 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등으로부터 유래한 프로모터이다. 문헌[Co et al., J. Immunol . 148:1149 (1992)]을 참조한다.
항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터(들)를 세포 배양물로 도입하면, 혈청 비함유 배지에서 성장 생산성 및 생성물 품질에 대해 세포 풀을 스크리닝할 수 있다. 이후, 상부의 생성 세포 풀을 FACS 기반 단일 세포 클로닝으로 처리하여 단일클론 세포주를 생성할 수 있다. 1ℓ의 배양물당 7.5g 초과의 생성물 역가에 상응하는, 1일 세포당 50pg 또는 100pg 초과의 비생산성(specific productivity)이 바람직하다. 혼탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고사카라이드 맵핑, 질량 분광법 및 결합 검정, 예컨대 ELISA 또는 비아코어(Biacore)에 대해 단일 세포 클론에 의해 생성된 항체를 또한 시험할 수 있다. 이후, 후속하는 사용을 위해 선택된 클론을 다수의 바이알에 뱅킹하고 저장하고 냉동시킨다.
발현되면, 단백질 A 포획, 칼럼 크로마토그래피(예를 들어, 소수성 상호작용 또는 이온 교환), 바이러스 불활화에 대한 낮은 pH 등을 포함하는 당해 분야의 표준 절차에 따라 항체를 정제할 수 있다(문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
코돈 최적화, 프로모터, 전사 요소 및 종결자의 선택, 혈청 비함유 단일 세포 클로닝, 세포 뱅킹, 카피수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결자, 혈청 비함유 단일 세포 클로닝, 단백질 역가의 개선을 포함하는 항체의 상업적 생성을 위한 방법론을 이용할 수 있다(예를 들어, US 5,786,464, US 6,114,148, US 6,063,598, US 7,569,339, WO2004/050884, WO2008/012142, WO2008/012142, WO2005/019442, WO2008/107388 및 WO2009/027471 및 US 5,888,809 참조).
IV. 능동 면역원
능동 면역화에 사용되는 물질은 상기 수동 면역화와 연결되어 기재된 항체의 동일한 유형을 환자에서 유도하도록 작용한다. 능동 면역화에 사용되는 물질은 실험실 동물에서 단일클론 항체를 생성하기 위해 사용되는 동일한 유형의 면역원, 예를 들어, 서열 번호 1의 23-46번, 25-44번, 28-41번 또는 30-39번 잔기에 상응하는 tau의 구역으로부터의 3개 내지 15개 또는 3개 내지 12개 또는 5개 내지 12개, 또는 5개 내지 8개의 인접 아미노산의 펩타이드, 예를 들어 서열 번호 1의 28-30번, 28-31번, 28-32번, 28-33번, 28-34번, 28-35번, 28-36번, 28-37번, 28-38번, 28-39번, 28-40번, 28-41번, 29-31번, 29-32번, 29-33번, 29-34번, 29-35번, 29-36번, 29-37번, 29-38번, 29-39번, 29-40번, 29-41번, 30-32번, 30-33번, 30-34번, 30-35번, 30-36번, 30-37번, 30-38번, 30-39번, 30-40번, 30-41번, 31-33번, 31-34번, 31-35번, 31-36번, 31-37번, 31-38번, 31-39번, 31-40번, 31-41번, 32-34번, 32-35번, 32-36번, 32-37번, 32-38번, 32-39번, 32-40번, 32-41번, 33-35번, 33-36번, 33-37번, 33-38번, 33-39번, 33-40번, 33-41번, 34-36번, 34-37번, 34-38번, 34-39번, 34-40번, 34-41번, 35-37번, 35-38번, 35-39번, 35-40번, 35-41번, 36-38번, 36-39번, 36-40번, 36-41번 잔기를 포함하는 펩타이드 등일 수 있다. 16B5와 동일한 또는 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체를 유도하기 위해, (예를 들어, tau에 걸친 일련의 중첩 펩타이드에 대한 결합을 시험함으로써) 이 항체의 에피토프 특이성을 맵핑할 수 있다. 이후, 에피토프로 이루어지거나 이를 포함하거나 이와 중첩하는 tau의 단편을 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 단편은 비인산화 형태로 통상적으로 사용된다.
이종성 캐리어 및 아쥬번트는, 사용되는 경우, 단일클론 항체를 생성하기 위해 사용되는 것과 동일물일 수 있지만, 인간에서 사용하기 위한 더 우수한 약제학적 적합성에 대해 또한 선택될 수 있다. 적합한 캐리어는 혈청 알부민, 키홀 림펫 혈색소, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 난알부민, 파상풍 변독소, 또는 다른 병원균 박테리아, 예컨대 디프테리아(예를 들어, CRM197), 이. 콜라이, 콜레라, 또는 에이치. 파일로리로부터의 변독소, 또는 약독화 독소 유도체를 포함한다. T 세포 에피토프는 또한 적합한 캐리어 분자이다. 본 발명의 물질을 면역자극 중합체 분자(예를 들어, 트라이팔미토일-S-글라이세린 시스테인(Pam3Cys), 만난(만노스 중합체), 또는 글루칸(β 1→2 중합체)), 사이토킨(예를 들어, IL-1, IL-1 알파 및 β 펩타이드, IL-2, γ-INF, IL-10, GM-CSF) 및 케모카인(예를 들어, MIP1-α 및 β 및 RANTES)에 연결함으로써 몇몇 접합체를 형성할 수 있다. 면역원을 스페이서 아미노산(예를 들어, gly-gly)과 함께 또는 이것 없이 캐리어에 연결할 수 있다. 추가의 캐리어는 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바이러스 유사 입자(virus-like particle: VLP)(또한 가성비리온 또는 바이러스 유래 입자라 칭함)는, 생체내 한정된 구형 대칭의 VLP로 자가 조립할 수 있는, 엔벨로프 단백질 및/또는 바이러스 캡시드의 다수의 카피로 이루어진 아단위 구조를 나타낸다. (Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415.) 대안적으로, 펩타이드 면역원은 많은 비율의 MHC II형 분자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 인공 T 세포 에피토프, 예컨대 pan DR 에피토프("PADRE")에 연결될 수 있다. PADRE는 US 5,736,142, WO 95/07707 및 문헌[Alexander J et al, Immunity, 1:751-761 (1994)]에 기재되어 있다. 능동 면역원은 다합체 형태로 제시될 수고, 여기서 면역원 및/또는 이의 캐리어의 다수의 카피는 단일 공유 분자로서 제시된다.
단편은 대개 약제학적으로 허용되는 아쥬번트와 함께 투여된다. 아쥬번트는, 펩타이드가 단독으로 사용되는 경우에 비해, 유도된 항체의 역가 및/또는 유도된 항체의 결합 친화도를 증가시킨다. 면역 반응을 유발하기 위해 tau의 면역원 단편과 함께 다양한 아쥬번트를 사용할 수 있다. 바람직한 아쥬번트는, 반응의 정성적 형태에 영향을 미치는 면역원에서의 입체구성 변화를 발생시키지 않으면서, 면역원에 대한 고유 반응을 증대시킨다. 바람직한 아쥬번트는 알루미늄염, 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL(상표명))(GB 2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc., 몬타나주 해밀턴, 현재 코릭사(Corixa)의 일부) 참조)를 포함한다. 스티뮬론(Stimulon)(상표명) QS-21은 남아메리카에서 발견되는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 나무의 껍질로부터 단리된 트라이테르펜 글라이코사이드 또는 사포닌이다(문헌[Kensil et al ., in Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)]; US 5,057,540 참조)(Aquila BioPharmaceuticals, 매사추세츠주 프레이밍햄; 현재 Antigenics, Inc., 뉴욕주 뉴욕). 다른 아쥬번트는 임의로 면역 자극제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A와 조합된 수중유 에멀션(예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩 오일)(문헌[Stoute et al ., N. Engl . J. Med . 336, 86-91 (1997)] 참조), 플루로닉 중합체 및 사멸된 마이코박테리아이다. Ribi 아쥬번트는 수중유 에멀션이다. Ribi는 Tween 80을 함유하는 식염수에 의해 유화된 대사 가능한 오일(스쿠알렌)을 함유한다. Ribi는 또한 박테리아 모노포스포릴 지질 A 및 면역자극제로서 작용하는 정제된 마이코박테리아 생성물을 함유한다. 또 다른 아쥬번트는 CpG(WO 98/40100)이다. 아쥬번트를 활성제를 갖는 치료학적 조성물의 성분으로서 투여할 수 있거나, 별개로, 치료제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여할 수 있다.
tau에 대한 항체를 유도하는 tau의 천연 단편의 유사체를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 또는 모든 L-아미노산은 이러한 펩타이드에서 D 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 또한 아미노산의 순서는 역전될 수 있다(레트로 펩타이드). 임의로 펩타이드는 반대 순서로 모든 D-아미노산을 포함한다(레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드). 펩타이드 및 반드시 갖지는 않는 다른 화합물은, tau 펩타이드와 상당한 아미노산 서열 유사성을 갖지만, 그럼에도 불구하고 tau 펩타이드의 모방체로서 작용하고, 유사한 면역 반응을 유도한다. 상기 기재된 바와 같은 tau에 대한 단일클론 항체에 대한 항이디오타입 항체를 또한 사용할 수 있다. 이러한 항-Id 항체는 항원을 모방하고, 이것에 면역 반응을 생성한다(문헌[Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6th ed., p. 181] 참조).
펩타이드(및 임의로 펩타이드에 융합된 캐리어)를 또한 펩타이드를 코딩하는 핵산의 형태로 투여하고, 환자에서 인시츄 발현시킬 수 있다. 면역원을 코딩하는 핵산 분절은 통상적으로 조절 요소, 예컨대 환자의 의도하는 표적 세포에서 DNA 분절의 발현을 허용하는 프로모터 및 인핸서에 연결된다. 혈액 세포에서의 발현을 위해, 면역 반응의 유도에 바람직한 것처럼, 중쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서 요소, 또는 CMV 주요 중간 초기 프로모터(CMV major intermediate early promoter) 및 인핸서가 직접 발현에 적합하다. 연결된 조절 요소 및 코딩 서열은 대개 벡터로 클로닝된다. 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산의 형태로 항체를 또한 투여할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다가 존재하는 경우, 사슬은 바람직하게는 단일 사슬 항체로서 연결된다. 예를 들어, 펩타이드 면역원에 의해 치료된 환자의 혈청으로부터의 친화도 크로마토그래피에 의해 수동 투여를 위한 항체를 또한 제조할 수 있다.
DNA는 네이키드 형태(즉, 콜로이드 또는 캡슐화 물질이 없음)로 전달될 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 시스템(예를 들어, 문헌[Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)] 참조); 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[Bett et al, J. Virol. 67, 591 1 (1993)] 참조); 아데노 연관 바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)] 참조), 백시니아 바이러스 및 조류 수두 바이러스를 포함하는 폭스(pox) 패밀리로부터의 바이러스 벡터, 알파 바이러스 속으로부터의 바이러스 벡터, 예컨대 신드비스(Sindbis) 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스로부터 유래한 것(예를 들어, 문헌[Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)] 참조), 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스(US 5,643,576 참조) 및 랍도바이러스, 예컨대 수포성 구내염 바이러스(WO 96/34625 참조) 및 파필로마바이러스(Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); 우(Woo) 등의 WO 94/12629 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996))를 포함하는 다수의 바이러스 벡터 시스템을 사용할 수 있다.
면역원을 코딩하는 DNA, 또는 이를 포함하는 벡터를 리포솜으로 패킹할 수 있다. 적합한 지질 및 관련 유사체는 US 5,208,036, US 5,264,618, US 5,279,833 및 US 5,283,185에 기재되어 있다. 면역원을 코딩하는 DNA 및 벡터는 또한 입자성 캐리어에 흡착되거나 회합될 수 있고, 이의 예는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드)(예를 들어, 문헌[McGee et al., J. Micro Encap. 1996] 참조)를 포함한다.
V. 스크리닝 방법
상기 기재된 바와 같은 의도하는 결합 특이성에 대해 항체를 초기에 스크리닝할 수 있다. 이러한 결합 특이성을 갖는 항체를 유도하는 능력에 대해 능동 면역원을 마찬가지로 스크리닝할 수 있다. 이런 경우에, 실험실 동물을 면역화하기 위해 능동 면역원을 사용하고, 적절한 결합 특이성에 대해 생성된 혈청을 시험한다.
이후, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체를 세포 및 동물 모델에서 시험할 수 있다. 이러한 스크리닝에 사용된 세포는 우선적으로 뉴런 세포이다. 신경아세포종 세포가, 임의로 tau 병리학과 연관된 돌연변이와 함께, tau의 4개의 반복 도메인에 의해 형질감염되는, tau 병리학의 세포 모델이 보고되었다(예를 들어, 델타 K280, 문헌[Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544-546 (2007)] 참조). 또 다른 모델에서, tau는 독시사이클린의 첨가에 의해 신경아세포종 N2a 세포주에서 유도된다. 세포 모델은 가용성 또는 응집된 상태의 세포에 대한 tau의 독성, tau 유전자 발현에 대한 전환 후 tau 응집물의 출현, 다시 유전자 발현을 전환 후 tau 응집물의 분해 및 tau 응집물의 형성을 저해하거나 이것을 탈응집시키는 항체의 효율을 연구하도록 한다.
tau와 연관된 질환의 형질전환 동물 모델에서 항체 또는 능동 면역원을 또한 스크리닝할 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 (예를 들어, 임의의 인간 아이소폼의) tau 전이유전자 및 무엇보다도 임의로 인간 APP 전이유전자, 예컨대 tau를 인산화하는 키나제, ApoE, 프레세닐린 또는 알파 시누클레인을 포함할 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 tau와 연관된 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 발생시키도록 배치된다.
예시적인 형질전환 동물은 마우스의 K3 세포주이다(Itner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(41):15997-6002 (2008)). 이 마우스는 K 369 I 돌연변이를 갖는 인간 tau 전이유전자(돌연변이는 픽병과 관련됨) 및 Thy 1.2 프로모터를 갖는다. 이 모델은 소뇌 과립 세포 및 구심성 섬유의 퇴화, 운동 결핍 및 신경퇴행의 신속한 과정을 나타낸다. 또 다른 예시적인 동물은 마우스의 pR5 세포주이다. 이 마우스는 P301L 돌연변이를 갖는 인간 tau 전이유전자(돌연변이는 전두측두 치매와 관련됨) 및 Thy 1.2 프로모터를 갖는다(Taconic, Germantown, N.Y., Lewis, et al., Nat Genet. 25:402-405 (2000)). 이 마우스는 신경퇴행의 더 점전적인 과정을 갖는다. 마우스는 뇌 구역 및 척수에서 신경섬유 매듭을 발생시킨다(이는 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨). 이는 매듭 발생의 결과를 연구하고, 이 응집물의 생성을 저해할 수 있는 치료를 스크리닝하기 위한 훌륭한 모델이다. 이 동물의 또 다른 이점은 병리학의 비교적 초기 발병이다. 동형접합성 세포주에서, tau 병리학과 연관된 행동 비정상은 적어도 빨리 3개월에 관찰될 수 있지만, 동물은 적어도 8개월까지 비교적 건강하게 있는다. 즉, 8개월에, 동물은 돌아다니고, 혼자 먹고, 모니터링하고자 하는 치료를 허용하도록 충분히 잘 행동 업무를 수행할 수 있다. -AI wI KLH-PHF-1에 의한 6-13개월 동안 이 마우스의 능동 면역화는 약 1,000의 역가를 생성하고, 비치료 대조군 얼음에 비해 더 적은 신경섬유 매듭, 더 적은 pSer422 및 체중 감소의 감소를 나타낸다.
전체 tau 또는 인산화 tau의 양의 감소, 다른 병리학적 특징, 예컨대 Aβ의 아밀로이드 침착, 및 저해 또는 지연 또는 행동 결핍의 감소를 포함하는 다양한 기준에 의해 항체 또는 활성제의 활성을 평가할 수 있다. 혈청에서의 항체의 유도에 대해 능동 면역원을 또한 시험할 수 있다. 형질전환 동물의 뇌로의 혈액 뇌 장벽에 걸친 항체의 통과에 대해 수동 면역원 및 능동 면역원 둘 다를 시험할 수 있다. tau를 특징으로 하는 질환의 증상을 천연으로 또는 유도를 통해 발생시키는 비인간 영장류에서 항체 또는 항체를 유도하는 단편을 또한 시험할 수 있다. 항체 또는 활성제가 부재한다(예를 들어, 비히클에 의해 대체됨)는 것을 제외하고 평행 실험이 수행되는 대조군과 함께 항체 또는 활성제에 대한 시험을 보통 수행한다. 이후, 시험 중인 항체 또는 활성제에 기여하는 질환의 징후 또는 증상의 감소, 지연 또는 저해를 대조군에 대해 평가할 수 있다.
VI. 치료에 적용 가능한 환자
신경섬유 매듭의 존재가 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 뇌염 후 파킨슨증, 외상 후 치매 또는 복싱 치매, C형 니만 피크 질환, 핵상안근 마비, 전두측두 치매, 전측두엽 변성, 근위축성 측삭경화증/Guam 및 PSP 진행성 핵상안근 마비의 복합 파킨슨증 치매를 포함하는 몇몇 질환에서 발견되었다. 임의의 이 질환의 치료 또는 예방에서 본 섭생을 또한 사용할 수 있다. 신경학적 질환 및 병증과 tau 사이의 널리 퍼진 관련성으로 인해, 신경학적 질환을 갖지 않는 개인에서의 평균 값과 비교하여 (예를 들어, CSF에서의) tau 또는 인산화 tau의 수치의 상승을 나타내는 임의의 대상체의 치료 또는 예방에서 본 섭생을 사용할 수 있다. 신경학적 질환과 연관된 tau에서 돌연변이를 갖는 개인에서 신경학적 질환의 치료 또는 예방에서 본 섭생을 또한 사용할 수 있다. 본 방법은 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 대해 및 특히 환자에서 특히 적합하다.
치료에 적용 가능한 환자는 질환의 위험에 있지만 증상을 나타내지 않는 개인, 및 증상을 현재 나타내는 환자를 포함한다. 질환의 위험에 있는 환자는 질환의 공지된 유전 위험을 갖는 환자를 포함한다. 이러한 개인은 이 질환을 경험한 친척을 갖는 개인, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 위험이 결정된 개인을 포함한다. 위험의 유전적 마커는 상기 기재된 것과 같은 tau에서의 돌연변이, 및 신경학적 질환과 연관된 다른 유전자에서의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이형접합성 형태 및, 더욱 더, 동형접합성 형태의 ApoE4 대립유전자는 알츠하이머병의 위험과 연관된다. 알츠하이머병의 위험의 다른 마커는 APP 유전자에서의 돌연변이, 특히 717번 위치 및 670번 및 671번 위치에서의 돌연변이(각각 하디(Hardy) 및 스웨디시(Swedish) 돌연변이라 칭함), 프레세닐린 유전자, PS1 및 PS2에서의 돌연변이, AD의 가족 병력, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증을 포함한다. 현재 알츠하이머병을 앓는 개인은 특징적인 치매로부터의 PET 영상화, 및 상기 기재된 위험 인자의 존재에 의해 인지될 수 있다. 또한, AD를 갖는 개인을 확인하기 위해 다수의 진단학적 시험이 이용 가능하다. 이는 CSF tau 또는 포스포-tau, 및 Aβ42 수치의 측정을 포함한다. tau 또는 포스포-tau의 증가 및 Aβ42 수치의 감소는 AD의 존재를 의미한다. 몇몇 돌연변이는 파킨슨병과 연관된다. Ala30Pro 또는 Ala53, 또는 다른 유전자에서의 돌연변이는 파킨슨병, 예컨대 류신 농후 반복 키나제, PARK8과 연관된다. 개인은 또한 DSM IV TR의 기준에 의해 상기 언급된 임의의 신경학적 질환으로 진단될 수 있다.
무증상 환자에서, 치료는 임의의 연령(예를 들어, 10세, 20세, 30세)에 시작할 수 있다. 그러나, 보통, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세에 도달할 때까지 치료를 시작할 필요는 없다. 치료는 통상적으로 일정 기간 동안의 다수의 투약량을 수반한다. 시간에 걸쳐 항체 수치를 평가함으로써 치료를 모니터링할 수 있다. 반응이 실패하면, 부스터(booster) 투약량이 표시된다. 잠재적 다운 증후군 환자의 경우, 모친에 치료제를 투여함으로써 출산 전에 또는 출산 직후 치료를 시작할 수 있다.
VII. 약제학적 조성물 및 치료 방법
예방학적 적용에서, 위험을 감소시키거나, 중증도를 낮추거나, 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 발병을 지연시키기에 효과적인 섭생(투여의 용량, 빈도 및 경로)에서 질환(예를 들어, 알츠하이머병)에 걸리기 쉽거나, 그렇지 않으면 이의 위험이 있는 환자에게 항체 또는 항체를 유도하는 물질 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 투여한다. 특히, 섭생은 바람직하게는 뇌에서 tau 또는 포스포-tau, 및 이로부터 형성된 쌍 지은 필라멘트를 저해하거나 지연시키고/시키거나, 이의 독성 효과를 저해하거나 지연시키고/시키거나, 행동 결핍의 발생을 저해하거나 지연시키기에 효과적이다. 치료학적 적용에서, 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 경감시키거나, 적어도 이의 추가의 악화를 저해하기에 효과적인 섭생(투여의 용량, 빈도 및 경로)에서 질환(예를 들어, 알츠하이머병)이 의심되거나, 이미 이를 앓는 환자에게 항체 또는 항체를 유도하는 물질을 투여한다. 특히, 섭생은 바람직하게는 tau, 포스포르-tau, 또는 이로부터 형성된 쌍 지은 필라멘트의 수치의 증가, 연관 독성 및/또는 행동 결핍을 제거하거나, 적어도 이들을 추가로 저해하기에 효과적이다.
개별적인 치료된 환자가 본 발명의 방법에 의해 치료되지 않은 필적하는 환자의 대조군 집단에서 평균 결과보다 더 양호한 결과를 성취하는 경우, 또는 p<0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 조절된 임상 실험(예를 들어, II상, II상/III상 또는 III상 실험)에서 치료된 환자 대 대조군 환자에서 더 양호한 결과가 입증되는 경우, 섭생은 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 것으로 생각된다.
효과적인 용량은 많은 상이한 인자, 예컨대 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 ApoE 캐리어인지, 환자가 인간 또는 동물인지, 투여된 다른 약제 및 치료가 예방학적 또는 치료학적인지에 따라 달라진다.
항체에 대한 예시적인 투약량 범위는 약 0.01 내지 5㎎/㎏, 및 더 일반적으로 0.1 내지 3㎎/㎏, 또는 0.15 내지 2㎎/㎏, 또는 0.15 내지 1.5㎎/㎏(환자 체중)이다. 항체를 매일, 교대 일에, 주마다, 격주마다, 개월마다, 분기마다, 또는 실증적 분석에 의해 결정되는 임의의 다른 스케줄에 따라 이러한 용량으로 투여할 수 있다. 예시적인 치료는 예를 들어 적어도 6개월의 장기간에 걸쳐 다수의 투약량의 투여를 포함한다. 추가의 예시적인 치료 섭생은 매 2주마다 1회, 또는 1개월마다 1회, 또는 매 3개월 내지 6개월마다 1회의 투여를 포함한다.
활성제 투여를 위한 물질의 양은 환자마다 0.1 내지 500㎍, 및 더 일반적으로 인간 투여를 위한 주사마다 1 내지 100, 또는 1 내지 10㎍ 변할 수 있다. 주사의 시기는 매일 1회로부터, 1년 1회, 10년 1회로 상당히 변할 수 있다. 통상적인 섭생은 면역화, 이어서 시간 간격, 예컨대 6주 간격 또는 2개월에서의 부스터 주사로 이루어진다. 또 다른 섭생은 면역화, 이어서 1개월, 2개월 및 12개월 후의 부스터 주사로 이루어진다. 또 다른 섭생은 일생동안 매 2개월마다의 주사를 포함한다. 대안적으로, 부스터 주사는 면역 반응의 모니터링에 의해 표시된 바대로 불규칙 기준일 수 있다.
항체 또는 항체를 유도하는 물질을 바람직하게는 말초 경로(즉, 투여된 또는 유도된 항체가 혈액 뇌 장벽을 횡단하여 뇌에서의 의도하는 부위에 도달하는 것)를 통해 투여한다. 투여 경로는 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 지주막하, 복강내, 비강내 또는 근육내를 포함한다. 항체의 투여를 위한 바람직한 경로는 정맥내 및 피하이다. 능동 면역화를 위한 바람직한 경로는 피하 및 근육내이다. 팔 또는 다리 근육에서 이러한 유형의 주사가 가장 통상적으로 수행된다. 몇몇 방법에서, 물질을 침착물이 축적되는 특정한 조직으로 직접적으로 주사한다(예를 들어, 두개내 주사).
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 바람직하게는 무균이고, 실질적으로 등장성이고, GMP 조건 하에 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 용량 형태(즉, 단일 투여를 위한 투약량)로 제공될 수 있다. 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 약제학적 조성물을 제형화할 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 주사를 위해, 수성 용액, 바람직하게는 생리학적 상용성 완충제, 예컨대 행크액, 링거액, 또는 생리학적 식염수 또는 아세테이트 완충제(주사 부위에서의 불편함을 감소하기 위함) 중에 항체를 제형화할 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 무균 발열원 비함유 물과의 구성을 위해 항체는 동결건조 형태일 수 있다.
본 섭생을 치료하고자 하는 질환의 치료 또는 예방에서 효과적인 또 다른 물질과 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 섭생은 알츠하이머병의 경우에 Aβ에 대한 면역치료제(WO/2000/072880), 콜린스테라제 저해제 또는 메만틴, 또는 파킨슨병의 경우에 알파 시누클레인에 대한 면역치료제(WO/2008/103472), 레보도파, 도파민 효현제, COMT 저해제, MAO-B 저해제, 아만타딘, 또는 항콜린제와 병용될 수 있다.
VIII. 생체내 영상화, 진단학적 방법 및 면역치료의 최적화
본 발명은 환자에서 tau 단백질 침착물(예를 들어, 신경섬유 매듭 및 tau 봉입체)을 생체내 영상화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시약, 예컨대 tau에 결합하는 항체(예를 들어, 마우스, 인간화, 키메라 또는 베니어 16B5 항체)를 환자에게 투여하고, 이후 이것이 결합한 후 물질을 검출함으로써 작용한다. 24번 내지 46번 아미노산 내의 tau의 에피토프에 결합하는 항체가 바람직하다. 몇몇 방법에서, 항체는 25번 내지 44번 아미노산, 또는 30번 내지 39번 아미노산 내의 에피토프에 결합한다. 투여된 항체에 대한 명확한 반응이 전장 불변 구역이 결여된 항체 단편, 예컨대 Fab를 사용함으로써 회피되거나 감소될 수 있다. 몇몇 방법에서, 동일한 항체는 치료 및 진단학적 시약 둘 다로서 작용할 수 있다.
환자의 체내로 정맥내 주사에 의해, 또는 두개내 주사에 의해 뇌로 직접적으로 또는 두개골을 통해 홀을 뚫음으로써 진단학적 시약을 투여할 수 있다. 시약의 투약량은 치료 방법에서와 같은 동일한 범위 내에 있어야 한다. 통상적으로, 시약을 라벨링하지만, 몇몇 방법에서, tau에 대한 친화도를 갖는 주요 시약을 라벨링하지 않고, 2차 라벨링제를 사용하여 1차 시약에 결합시킨다. 라벨의 선택은 검출 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 형광성 라벨이 광학 검출에 적합하다. 상자성 라벨의 사용은 수술 중재 없이 단층촬영 검출에 적합하다. PET 또는 SPECT를 사용하여 방사성 라벨을 또한 검출할 수 있다.
tau 단백질 침착물의 생체내 영상화 방법은 타우병증, 예컨대 알츠하이머병, 전측두엽 변성, 진행성 핵상안근 마비 및 픽병, 또는 이러한 질환에 대한 감수성을 진단하거나 이의 진단을 확인하는 데 유용하다. 예를 들어, 치매의 증상을 제시하는 환자에서 상기 방법을 사용할 수 있다. 환자가 비정상 신경섬유 매듭을 갖는 경우, 환자는 마찬가지로 알츠하이머병을 앓는다. 대안적으로, 환자가 비정상 tau 봉입체를 갖는 경우, 봉입체의 위치에 따라, 환자는 전측두엽 변성을 앓을 수 있다. 무증상 환자에서 상기 방법을 또한 사용할 수 있다. 비정상 tau 단백질 침착물의 존재는 미래의 증상성 질환에 대한 감수성을 나타낸다. 상기 방법은 tau 관련 질환을 갖는 것으로 이전에 진단된 환자에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하는 데 또한 유용하다.
라벨링된 좌위의 수, 크기 및/또는 강도를 상응하는 기준 값과 비교함으로써 진단을 수행할 수 있다. 기준 값은 이환되지 않은 개인의 집단에서 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준 값은 동일한 환자에서 결정된 이전의 수준을 또한 나타낼 수 있다. 예를 들어, 기준 값은 tau 면역치료 치료제를 시작하기 전에 환자에서 결정될 수 있고, 측정된 값은 이후 기준 값과 비교될 수 있다. 기준에 대한 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 시사한다.
몇몇 환자에서, PET 스캔을 수행함으로써 타우병증의 진단을 보조할 수 있다. 예를 들어, 종래의 PET 영상기 및 보조 장비를 사용하여 PET 스캔을 수행할 수 있다. 스캔은 통상적으로 tau 단백질 침착물과 연관된 것으로 일반적으로 공지된 뇌의 하나 이상의 구역 및 아주 적은(있더라도) 침착물이 대조군으로서 작용하도록 일반적으로 제시되는 하나 이상의 구역을 포함한다.
PET 스캔에서 검출된 신호는 다차원 이미지로 표시될 수 있다. 다차원 이미지는 뇌를 통한 단면을 나타내는 2차원, 3차원 뇌를 나타내는 3차원, 또는 시간에 따라 3차원 뇌의 변화를 나타내는 4차원일 수 있다. 칼러 스케일은 상이한 양의 라벨 및, 추론에 의해, 검출된 tau 단백질 침착물을 나타내는 상이한 칼러에 의해 사용될 수 있다. 스캔의 결과는 또한 숫자로 표시될 수 있고, 수는 검출된 라벨의 양 및 결과적으로 tau 단백질 침착물의 양에 관한 것이다. 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)에 대한 침착물과 연관된 것으로 공지된 뇌의 구역에 존재하는 라벨을 침착물과 연관된 것으로 공지되지 않은 구역에 존재하는 라벨과 비교하여, 전자 구역 내의 침착물의 정도를 나타내는 비율을 제공할 수 있다. 동일한 방사능 표지된 리간드의 경우, 이러한 비율은 tau 단백질 침착물의 필적하는 측정치 및 상이한 환자 사이의 이의 변화를 제공한다.
몇몇 방법에서, MRI 또는 CAT 스캔과 동일한 환자 방문에서 또는 이와 동시에 PET 스캔을 수행한다. MRI 또는 CAT 스캔은 PET 스캔보다는 뇌의 더 해부학적인 상세사항을 제공한다. 그러나, PET 스캔으로부터의 이미지는 더 정확하게 MRI 또는 CAT 스캔 이미지에 중첩하여, PET 리간드의 위치 및 추론에 의해 뇌에서의 해부학적 구조에 관해 tau 침착물을 나타낼 수 있다. 몇몇 기계는 환자가 스캔 사이에 위치를 바꾸지 않으면서(위치 변화는 이미지의 중첩을 촉진함) PET 스캐닝 및 MRI 또는 CAT 스캐닝 둘 다를 수행할 수 있다.
적합한 PET 리간드는 본 발명의 방사능 표지된 항체(예를 들어, 마우스, 인간화, 키메라 또는 베니어 16B5 항체)를 포함한다. 사용된 방사성 동위원소는 예를 들어 C11, N13, O15, F18 또는 I123일 수 있다. PET 리간드를 투여하고 스캔을 수행하는 것 사이의 간격은 PET 리간드 및 특히 이의 흡수 속도 및 뇌로의 청소(clearing) 및 이의 방사능 표지의 반감기에 따라 달라질 수 있다.
무증상 환자 또는 경증 인지 장애의 증상을 갖지만, 아직 타우병증으로 진단되지 않고, 타우병증을 발생시킬 높은 위험에 있는 환자에서 PET 스캔을 또한 예방학적 조치로서 수행할 수 있다. 무증상 환자의 경우, 스캔은 가족 병력, 유전적 또는 생화학적 위험 인자, 또는 성숙 연령으로 인해 타우병증의 위험의 증가에 있는 것으로 생각되는 개인에서 특히 유용하다. 예방학적 스캔은 예를 들어 45세와 75세 사이의 환자에서 시작할 수 있다. 몇몇 환자에서, 50세에 제1 스캔을 수행한다.
예를 들어, 6개월과 10년 사이, 바람직하게는 1년 내지 5년 사이의 간격으로 예방학적 스캔을 수행할 수 있다. 몇몇 환자에서, 년마다 예방학적 스캔을 수행한다. 예방학적 조치로서 수행된 PET 스캔이 tau 단백질 침착물의 비정상적으로 높은 수치를 나타내는 경우, 면역치료를 개시하고, 타우병증으로 진단된 환자에서처럼 후속하는 PET 스캔을 수행할 수 있다. 예방학적 조치로서 수행된 PET 스캔이 정상 수치 내의 tau 단백질 침착물의 수치를 나타내는 경우, 상기처럼 6개월 내지 10년 사이 및 바람직하게는 1년 내지 5년 사이의 간격으로, 또는 타우병증 또는 경증 인지 장애의 징후 및 증상의 출현에 반응하여 추가의 PET 스캔을 수행할 수 있다. tau 단백질 침착물의 수치가 정상보다 높게 검출되는 경우 및 검출될 때, 예방학적 스캔을 tau 지시된 면역치료제의 투여와 조합함으로써, tau 단백질 침착물의 수치는 정상 수치로 감소하거나, 이에 가까울 수 있거나, 적어도 추가로 증가하는 것이 저해될 수 있고, 환자는 예방학적 스캔 및 tau 지시된 면역치료제를 받지 않는 경우보다 긴 기간 동안(예를 들어, 적어도 5년, 10년, 15년 또는 20년, 또는 환자의 일생의 마지막 동안) 타우병증이 없을 수 있다.
tau 단백질 침착물의 정상 수치는 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)으로 진단되지 않고, 이러한 질환을 발생시킬 위험의 증가에 있는 것으로 생각되지 않는(예를 들어, 50세 이하의 무질환 개인의 대표적인 샘플) 일반적인 집단에서 개인의 대표적인 샘플의 뇌에서의 신경섬유 매듭 또는 tau 봉입체의 양에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, tau 단백질 침착물이 발생하는 것으로 공지된 뇌의 구역에서의 본 방법에 따른 PET 신호가 이러한 침착물이 보통 발생하지 않는 것으로 공지된 뇌의 구역으로부터의 신호와 다르지 않은 경우(측정의 정확성 내), 정상 수치는 개별적인 환자에서 인지될 수 있다. 개인의 수치의 증가는 정상 수치와의 비교에 의해(예를 들어, 평균 및 표준 편차의 분산 밖) 또는 단순히 침착물과 연관된 것으로 공지되지 않은 구역과 비교하여 tau 단백질 침착물과 연관된 뇌의 구역에서의 실험 오차를 초과하는 신호의 증가로부터 인지될 수 있다. 개인 및 집단에서의 tau 단백질 침착물의 수치를 비교할 목적을 위해, tau 단백질 침착물은 바람직하게는 뇌의 동일한 구역(들)에서 결정되어야 하고, 이 구역은 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)과 연관된 tau 단백질 침착물이 형성하는 것으로 공지된 적어도 하나의 구역을 포함한다. tau 단백질 침착물의 수치의 증가를 갖는 환자는 면역치료를 시작하기 위한 후보자이다.
면역치료를 시작하기 전에, tau 단백질 침착물의 수치의 감소는 처음에 치료가 원하는 효과를 갖는지의 표시로서 보일 수 있다. 관찰된 감소는 예를 들어 기준 값의 1% 내지 100%, 1% 내지 50%, 또는 1% 내지 25%의 범위일 수 있다. 이러한 효과는 침착물이 형성되는 것으로 공지된 뇌의 하나 이상의 구역에서 측정될 수 있거나, 이러한 구역의 평균으로부터 측정될 수 있다. 전체 치료 효과는 tau 단백질 침착물의 증가(달리 평균 비치료 환자에서 발생함)에 대한 기준에 비해 백분율 감소를 첨가함으로써 근사치가 계산될 수 있다.
대략 일정한 수치의 tau 단백질 침착물의 유지 또는 심지어 tau 단백질 침착물의 적은 증가는 또한 준최적 반응일지라도 치료에 대한 반응의 표시일 수 있다. 이러한 반응은, 면역치료가 tau 단백질 침착물의 추가의 증가를 저해하는 데 있어서 효과를 갖는지를 결정하기 위해, 치료를 받지 않는 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)을 갖는 환자에서의 tau 단백질 침착물의 수치의 시간 경과에 의해 비교될 수 있다.
tau 단백질 침착물의 변화의 모니터링은, 치료에 반응하는, 면역치료 또는 다른 치료 섭생의 조정을 허용한다. PET 모니터링은 치료에 대한 반응의 성질 및 정도의 표시를 제공한다. 이후, 치료를 조정할지 및 PET 모니터링에 반응하여 원하는 치료가 조정될 수 있는지에 대한 결정을 할 수 있다. 따라서, PET 모니터링은, 다른 바이오마커, MRI 또는 인지 측정치가 검출 가능하게 반응을 보이기 전에, tau 지시된 면역치료 또는 다른 치료 섭생이 조정되게 한다. 상당한 변화는, 기준에 비해 치료 후의 매개변수의 값의 비교가, 치료가 유리한 효과를 발생시키거나 발생시키지 않는다는 일부 증거를 제공한다는 것을 의미한다. 몇몇 경우에, 환자 그 자체에서의 매개변수의 값의 변화는 치료가 유리한 효과를 발생시키거나 발생시키지 않는다는 증거를 제공한다. 다른 경우에, 환자에서의, 값의 변화(있다면)는 면역치료를 받지 않은 환자의 대표적인 대조군 집단에서의, 값의 변화(있다면)와 비교된다. 대조군 환자에서의 정상 반응으로부터의 특정한 환자에서의 반응의 차이(예를 들어, 평균 + 표준 편차의 분산)는 또한 면역치료 섭생이 환자에서 유리한 효과를 성취하거나 성취하지 않는다는 증거를 제공할 수 있다.
몇몇 환자에서, 모니터링은 tau 단백질 침착물의 수치가 정상 초과로 있지만 tau 단백질 침착물이 검출 가능하게 감소한다는 것을 나타낸다. 이러한 환자에서, 허용되는 않는 부작용이 없는 경우, 최대 추천 용량에 이미 있지 않은 경우, 투여의 빈도 및/또는 용량에 있으면서 심지어는 이것이 증가하면서, 치료 섭생이 계속될 수 있다.
모니터링이 환자에서의 tau 단백질 침착물의 수치가 이미 정상이거나, 거의 정상인 tau 단백질 침착물의 수치로 감소한다는 것을 나타내는 경우, 면역치료 섭생은 유도의 섭생(즉, tau 단백질 침착물의 수치를 감소시킴)으로부터 유지의 섭생(즉, 대략 일정한 수치로 tau 단백질 침착물을 유지시킴)으로 조정될 수 있다. 이러한 섭생은 면역치료제를 투여하는 것의 용량 및 또는 빈도를 감소시킴으로써 영향을 받을 수 있다.
다른 환자에서, 모니터링은 면역치료제가 유리한 효과, 그러나 준최적 효과를 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 최적 효과는, 치료를 시작한 후 소정의 시점에서 면역치료제를 받는 타우병증 환자의 대표적인 샘플이 경험한, (전체 뇌 또는 tau 단백질 침착물이 형성하는 것으로 공지된 이의 대표적인 구역(들)에 걸쳐 측정되거나 계산된) tau 단백질 침착물의 변화의 앞의 절반 또는 사분위수 내의 tau 단백질 침착물의 수치의 백분율 감소로 정의될 수 있다. 더 적은 감소를 경험한 환자, 또는 tau 단백질 침착물이 일정하게 있거나, (예를 들어, 면역치료제를 투여받지 않은 환자의 대조군 그룹으로부터 추론된) 면역치료제의 부재에서 예상된 것보다 더 적은 정도로, 심지어 증가한 환자는 양성의, 그러나 준최적 반응을 경험한 것으로 분류될 수 있다. 이러한 환자는 임의로 물질의 투여의 빈도 및/또는 용량이 증가한 섭생의 조정으로 처리될 수 있다.
몇몇 환자에서, tau 단백질 침착물은 면역치료제를 받지 않는 환자에서의 tau 침착물과 유사하거나 더 높은 방식으로 증가할 수 있다. 이러한 증가가 심지어 물질의 빈도 또는 용량의 임의의 증가 후 일정 기간, 예컨대 18개월 또는 2년에 걸쳐 지속하면서, 면역치료제는 다른 치료를 위해 원하는 경우 중단될 수 있다.
타우병증에 대한 치료를 진단하고 모니터링하고 조정하는 것의 상기 설명은 PET 스캔을 사용하는 것에 주로 집중하였다. 그러나, 본 발명의 tau 항체(예를 들어, 마우스, 인간화, 키메라 또는 베니어 16B5 항체)의 사용에 적용 가능한 tau 단백질 침착물을 가시화하고/하거나 측정하기 위한 임의의 다른 기법은 이러한 방법을 수행하기 위한 PET 스캔 대신에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1. 항체 16B5의 생성
인산화되든 또는 인산화되지 않든 tau를 인식하는, Pan 항체 16B5를 길러, tau를 정제하고, ELISA 검정에서 이의 고친화도 포획 특성에 기초하여 선택하였다.
실시예 2. 항체 16B5의 클로닝 및 서열분석
트리졸(Trizol) LS(인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 16B5 항체를 발현하는 펠렛화 세포로부터 RNA를 추출하였다. 퀀트-IT 키트(Quant-IT kit)(인비트로겐)를 사용하여 RNA 농도를 측정하였다.
5'-RACE를 사용하여, 스마트(Smart) RACE 키트(클론테크(Clontech))를 사용하여 IgG mRNA의 5' 말단을 증폭시켰다. 약 1㎍의 RNA를 RT 반응에 사용하고, 스마트 RACE 키트가 제공된 유니버셜 프라이머(Universal primer) 및 엑손바이오(ExonBIO)에서 설계된 유전자 특이적 프라이머(GSP)를 사용하여 cDNA 풀을 추가로 증폭시켰다.
프라이머 서열:
유니버셜 프라이머: CTAATACGACTCACTATAGGGC(서열 번호 7)
GSP:
IgG1 및 IgG2a: CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC(서열 번호 8)
IgG2b: CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC(서열 번호 9)
PCR 생성물을 겔 정제하고, pSUPER-블런트(blunt) 벡터(아덱손(Adexon), www.adexonbiotech.com)로 클로닝하였다. 중쇄를 위해, 15개의 콜로니를 미니 제조하고, 서열분석하였다. 경쇄를 위해, 콜로니 PCR을 수행하여 내인성 비정상 경쇄를 구별하고, 콜로니 PCR로부터 증폭되지 않은 클론만을 서열분석하였다. 서열분석 결과를 NTI 벡터에서 분석하였다. 어댑터 및 GSP 프라이머 서열을 맵에 마킹하였다. 어댑터와 GSP 서열 사이의 구역은 리더, 신호 펩타이드 및 V-구역, 및 불변 구역의 일부를 포함하는 IgG 중쇄 서열이다. ORF를 맵에 마킹하였다.
실시예 3. 항체 16B5의 에피토프 맵핑
펩타이드 단편 분석에 의한 에피토프의 확인. 4개의 미세소관 결합 반복부를 갖고 N 말단 삽입부를 갖지 않으며, P301L 돌연변이(rTau)를 함유하는 인간 tau 서열을 이. 콜라이에서 발현시키고 정제하였다. tau의 이 형태는 (tau의 가장 긴 아이소폼에 기초하여 넘버링 관례를 이용하여 P301L에 상응하는) 243번 위치에서의 프롤린에 대한 류신의 치환을 갖는 서열 번호 3의 서열을 갖는다. 200㎍의 tau의 효소 분해를 4개의 상이한 프로테아제: 트립신(아르기닌 및 라이신의 카복실 말단에서 개열함), 키모트립신(주로 타이로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 류신의 카복실 말단에서 개열함), LysC(라이신의 카복실 말단에서 개열함), 또는 GluC(글루타메이트 잔기 후 및 드물게는 아스파르테이트 잔기 후에 개열함) 중 하나에 의해 수행하였다. 모든 프로테아제를 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)사로부터 얻었고, 37℃에서 16시간 동안 분해를 수행하였다. 생성된 펩타이드 단편을 10㎍의 16B5와 항온처리하고, 단백질 G 자기 비드(NEB)를 사용하여 침전시켰다. 침전물을 300mM NaCl 및 0.5%의 NP-40을 함유하는 PBS 중에 완전히 세척한 후, 100mM 글라이신(pH 2.8) 중의 1M NaCl로 용리시켰다. 용리물을 진공 하에 건조시키고, 0.1% 트라이플루오로아세트산(TFA) 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 용리물을 4.6x50mm C18 칼럼에 로딩한 후, 0.075% TFA를 갖는 아세토나이트릴의 선형 구배를 이용하여 HPLC(애질런트 1260 인피니티 시스템(Agilent 1260 Infinity system))에 의해 분별화하였다. 피크 분획을 수집하고, 건조시키고, 증류수 중에 재현탁시켰다. 펩타이드 질량 및 정체를 MALDI-TOF/TOF에 의해 결정하였다. LysC MS 스펙트럼에서 서열 번호 1의 25-44번 잔기에 상응하는 피크를 확인하였다. 트립신 MS 스펙트럼에서 서열 번호 1 및 24-44의 25-44번 잔기에 상응하는 피크를 확인하였다. 키모트립신 및 GluC 분해물로부터 신호가 얻어지지 않아서, 일부 에피토프가 서열 번호 1의 29번 잔기 및/또는 서열 번호 1의 37번 잔기를 함유할 수 있다는 것을 제시한다.
돌연변이 분석에 의한 에피토프의 확인. (상기 기재된) 펩타이드 단편 분석에 의해 결정된 결과를 이용하여, 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 전체 플라스미드 증폭에 의해 rTau의 결실 돌연변이유발을 수행하였다. 단백질을 적은 용적의 박테리아 배양물 중에 발현시키고, 동일 용적의 정제된 박테리아 용해물을 전기영동시키고, 블로팅하고, 16B5 항체에 의해 염색하였다. 샘플 로딩에 대해 조절하기 위해, tau의 C 말단 구역에 대한 특이성을 갖는 항체(C 말단 에피토프)인 Tau46을 사용하여 이중 블롯을 염색하였다. 항체 둘 다를 0.2㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 리코 오디세이 형광성 스캐너(Licor Odyssey fluorescent scanner)를 사용하여 이미지를 포획하였다. tau의 하기 결실 돌연변이체를 이러한 방식으로 만들고 분석하였다: Δ5-24, Δ23-32, Δ25-44, Δ30-39 및 Δ37-46. 도 1 및 도 2에 도시된 바대로, tau의 Δ25-44 및 Δ30-39 결실 돌연변이체는 16B5 항체에 의해 검출되지 않아서, 에피토프가 이 잔기 내의 16B5 세포주에 의해 인식되지 않는다는 증거를 제공한다. tau의 Δ37-46 결실 돌연변이체가 16B5에 의해 오직 약간 검출 가능하여서, 37-46번 내의 잔기(예를 들어, 37번 잔기) 중 일부가 tau에 대한 16B5의 결합에서 역할을 할 수 있다는 증거를 제공한다. 16B5 항체는 Δ5-24보다 더 적은 정도로 및 Δ25-44 및 Δ30-39 결실 돌연변이체보다 더 높은 정도로 tau의 Δ23-32 결실 돌연변이체를 염색시켜서, 16B5가 33-36번, 30-36번, 33-37번, 30-37번 또는 33-39번 잔기를 포함하는 펩타이드에 또한 결합할 수 있다는 증거를 제공한다. 종합하면, tau 결실 돌연변이체로부터 얻은 데이터는 16B5에 의해 인식된 에피토프가 서열 번호 1의 23-32번 잔기의 일부 또는 전부, 및 서열 번호 1의 37-46번 잔기의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다는 것을 제시한다. 예를 들어, 16B5는 서열 번호 1의 32-38번 또는 28-41번 잔기 내의 에피토프를 인식할 수 있다.
알라닌 스캐닝에 의한 에피토프의 확인. PCR 돌연변이유발을 이용하여 30-42번 잔기에 걸친 tau의 구역 내의 단일 잔기를 다음에 알라닌에 돌연변이시켰다. 돌연변이된 단백질을 발현시키고, 용해물을 전기영동에 의해 분할하고, 상기 기재된 바대로 16B5 항체 또는 Tau46 항체 중 어느 하나에 의해 블로팅하였다. 이 분석의 결과는 도 3에 도시되어 있다. T30A, M31A, H32A, Q33A, D34A, Q35A, E36A, G37A, D38A, T39A, D40A, A41L 및 G42A를 포함하는, 분석된 특이적 점 돌연변이체가 블롯 위에 기재되어 있다. 특히 중요한 잔기는 각각의 블롯에서 박스 내에 둘러싸여 있다. 16B5의 검출 가능한 결합을 Q33A tau 돌연변이체에 의해 완전히 제거하고, G37A tau 돌연변이체에 의해 실질적으로 감소시켜서, 33번 잔기 및 적은 정도로 37번 잔기가 16B5에 의해 인식된 에피토프의 중요한 성분일 수 있다는 증거를 제공한다. 다른 잔기는 비아코어 분석에서 16B5에 의해 인식된 에피토프의 중요한 성분일 수 있다.
실시예 4. 타우병증의 hTau.P301L 형질전환 마우스 모델에서의 수동 면역화
면역화. FVB/N 유전자 배경에서의 3월령 hTau.P301L-Tg 암컷 마우스를 이 연구에 사용하였다. 10㎎/㎏의 시험 및 대조군 항체의 투여를 1주 1회 복강내 수행하였다. 치료 기간은 약 5개월이었다. 23 주사 후, 마우스를 희생시켜서 연구를 종료하였다. 표 1은 이 연구에서 투여된 시험 및 대조군 항체를 기술한다.
Figure pct00007
조기 사망은 형질전환 쥣과 타우병증 모델에서 관찰된 표현형이다. 이 연구에서 사용된 특정한 모델은, 발병이 높은 가변성을 갖지만, 6월령에서 초인산화 tau를 발생시켰다. 마우스는 또한 뒷다리 절임(clasping) 및 일반 이동성의 감소와 같은 운동 결함을 겪고, 8-11월령에 조기 사망하였다(reMYND 미공개 데이터, Terwel et al ., 2005). 절임 표현형 및 체중 감소의 존재를 특징으로 하는, 말기 질환 증상을 발생시킨 마우스를 희생시켰다. 예상치 못하게 많은 수의 마우스가 이 증상의 존재 없이 조기에 사망하였다. 이러한 경우의 사명의 원인은 후기 타우병증 또는 시험 항체와 연관되지 않는 것으로 생각되고, 대신에 근친교배 FVB/N 배경과 연관된 것으로 생각되었다.
표 2는 연구 과정 동안 모든 마우스의 전체 생존율의 개관을 보여준다.
Figure pct00008
희생 후, 마우스를 절제하고, 20mM 트리스-HCl(pH 8.1); 150 Mm NaCl; 1mM 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(EDTA, 머크(Merck)); 1mM 에틸렌 글라이콜 테트라아세트산(EGTA, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)); 5mM 나트륨 피로포스페이트(시그마); 30mM 나트륨 플루오라이드(시그마-알드리치); 1mM PMSF(시그마); 2mM 나트륨 바나데이트(시그마); 10mM 1,10-오르토-페난트롤린모노하이드레이트(시그마-알드리치); 5㎍/㎖의 대두 트립신 저해제; 5㎍/㎖의 펩스타틴; 및 단백분해효소 저해제의 칵테일(CPI, 로슈 다이그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일)을 함유하는 10중량 용적의 아이스 콜드 트리스-단백분해효소-포스파타제-저해제 완충제(TPPI-완충제) 중의 포터형(potter-type) 기계적 파쇄기(VOS 14 S40, 속도 750rpm; VWR)를 사용하여 뇌간 및 중뇌를 파쇄하였다. 각각 고정된 용적의 140㎕ 및 100㎕의 뇌간 및 중뇌 파쇄액(TotH)(전체 용적의 대략 절반)을 136000xg에서 4℃에서 60분 동안 원심분리(TLA-55 회전자, 옵티마TMTLX 울트라센트리퓨지(OptimaTMTLX Ultracentrifuge), 벡만 콜터(Beckman Coulter))하여 트리스-가용성 분획(SF)을 생성시키고, 전체 파쇄액의 나머지를 -80℃에서 저장하였다. 제한된 수의 원심분리기 홀더(N=12)로 인해, 샘플을 무작위화하여 원심분리기를 평형시키고, 상이한 원심분리 세션에 걸쳐 상이한 치료 그룹을 나눴다.
상청액(S1, 또한 "가용성 분획" 또는 "SF"라 칭함)을 펠렛(P1)으로부터 분리시키고, 분취하고, -80℃에서 저장하였다. P1 펠렛을 10중량 용적의 고염 용액(TPPI-완충제를 함유하는 0.85 M NaCl) 중에 가용화시키고, 20000xg에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 생성된 고염 펠렛(P2)을 -80에서 저장하였다. 상청액(S2)을 1/10 10% 사르코실에 의해 1% 사르코실이 되게 하고, 탑-오버-탑(top-over-top) 회전 텀블러 내에서 실온에서 60분 동안 항온처리한 후, 136000xg에서 4℃에서 60분 동안 원심분리하였다. 사르코실 가용성 상청액(S3)을 -80℃에서 저장하고, 사르코실 불용성 펠렛(P3, 또한 "불용성 분획" 또는 "IF"라 칭함)을 30㎕의 TPPI 완충제 중에 재현탁시키고 분취하였다. 상기 기재된 분별 프로토콜에 의해 생성된, 전체 파쇄액(TotH), 트리스-가용성(SF) 및 사르코실-불용성(IF) 뇌간 분획을 후속하는 폴리-아크릴아마이드 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅 분석에서 사용하였다.
폴리 - 아크릴아마이드 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅. 종래의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅의 적용을 위해, 샘플을 변성시키고, 95℃에서 10분 동안 항온처리에 의해 환원시킨 후, 7.5% 트리스-HCl 겔(크리테리언 XT 프리캐스트 겔(Criterion XT Precast Gel), 26웰 콤(comb), 15㎕, 1.0㎜; 바이오라드(Biorad))에서 분리하였다. PVDF-막(iBlot(상표명) 겔 트랜스퍼 스택스(Gel Transfer Stacks), PVDF, 레귤러(Regular), 인비트로겐)으로 건식 전기이동(iBlot(상표명) 인비트로겐) 후, 막을 30분 동안 0.4% PFA 중에 세척한 후, 트리스-완충 식염수 중에 세척하였다. 다음에, 막을 5%(w/v)의 탈지 분유 및 0.1%(v/v)의 Tween-20을 함유하는 트리스-완충 식염수(TBS, pH 7.6) 중에 1시간 동안 항온처리하였다. 블롯을 표 3에 기재된 작업 농도에서 다양한 항-tau 1차 항체와 밤새 항온처리하였다. 세척 및 항마우스 또는 항-래빗 HRP-접합된 2차 항체(염소-항마우스 또는 염소-항-래빗 IgG, DAKO)와의 항온처리 후, ECL 검출 시스템(슈퍼시그널 웨스트 펨토 맥시멈 센시티브 섭스트레이트(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate), 제품 34096, 써모 사이언티픽)에 의해 블롯을 전개시켰다. 이미지를 상이한 노출 시간으로 디지털로 기록하고(VisionWorks Acquisition, UVP), 블롯의 분석에 전용 소프트웨어(VisionWorks Analysis, UVP)를 사용하였다. 비교를 위해, 겔 간 기준 겔을 비교하고자 하는 각각의 겔에서 실행되는 4개의 분획의 분취량으로 실행하였다. 검출에 사용된 항-tau 1차 단일클론 항체는 AT100(포스포-Tau, 써모 사이언티픽; 희석 1:250), AT8(포스포-Tau, 써모 사이언티픽; 희석 1:500), HT7(pan Tau, 피어스(Pierce); 희석 1:1000) 및 1F5(시험 설비(Testing Facility)에 공지되지 않은 에피토프, 네오토프(Neotope), 희석 3:500)를 포함하였다. 로딩 대조군으로서 항-GAPDH(압캠(Abcam) 9485; 희석 1:2500)에 의해 블롯을 재프로빙하였다. Pan Tau 항체는 포스포-Tau에 특이적이지 않았다.
Figure pct00009
도 4에 도시된 바대로, 통계적으로 유의적인 tau의 양의 감소가, 6F10 대조군 항체에 의해 시험된 동물과 비교하여, 16B5 항체에 의해 치료된 동물로부터의 사르코실 불용성 뇌간 분획에서 관찰되었다. 스튜던트 t 시험(p<0.05)을 이용하여 통계 유의성을 평가하였다. 이 감소는 포스포-tau 특이적 항체(AT8, 상부 왼편 패널; AT100, 하부 왼편 패널; 1F5, 상부 오른편 패널) 및 pan-tau 항체(HT7, 하부 오른편 패널) 둘 다에 의해 관찰되었다. 전체 파쇄액의 웨스턴 블롯은 또한, 포스포-특이적 항체에 의해 검출할 때, 6F10 항체에 의해 치료된 대조군 동물에 비해, 16B5 치료된 동물에서 포스포르-tau 대 전체 tau의 비율의 유의적인 감소를 나타낸다. 도 5, 왼쪽 패널(HT7 pan tau 항체에 의해 검출된 신호로 나눈 AT8 항-포스포-tau 항체에 의해 검출된 신호를 나타냄)을 참조한다. 반대로, 6F10 항체에 의해 치료된 대조군 동물과 비교하여, 16B5 치료된 동물의 전체 파쇄액에서 전체 tau 대 GAPDH 수준의 비율의 유의적인 변화가 없었다. 도 5, 오른쪽 패널(GAPDH 항체에 의해 검출된 신호로 나눈 HT7 pan tau 항체에 의해 검출된 신호를 나타냄)을 참조한다. 이 데이터는, 전체 tau가 아니라, 포스포-Tau의 수치가 파쇄액에서 감소한다는 증거를 제공한다.
조직학적 분석. 시상하부 핵 외측 부정대(STH/ZI) 및 소뇌, 전방부 및 후방부의 삽입된 핵, 부속 외측 소뇌 핵(IntA/P/LAT)에서 항-포스포-tau 항체를 사용한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 시상봉합 바이브라톰(vibratome) 절편(40㎛)을 사용까지 4℃에서 0.1% 아지드화나트륨을 갖는 PBS 중에 저장하였다. 마우스마다 8개의 절편을, 표시된 브레그마(bregma)에서, mAb AT8, AT100 또는 1F5에 의해 자유 유동 염색하였다. 하기 표 4에 기재된 바와 같은 표시된 항체에 의해 염색하기 위한 절편을 선택하였다. 특정한 염색에 대해 선택된 모든 동물의 절편을 염색 및 블라인딩 정량화에 대해 무작위화하였다.
자유 유동 절편을 넷츠웰스(Netwells)(상표명)에서 항온처리하였다. 이후, 절편을 PBS 중에 2회 세척하고, PBS 및 메탄올(1:1) 중의 과산화수소 1.5% 중에 20분 동안 항온처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 제거하였다. 절편을 0.1% 트리톤 X100(PBST)을 함유하는 PBS 중에 3회 세척한 후, 절편을 PBST 중의 10% 소 태아 혈청(FCS) 중에 30분 동안 차단한 후, 10% FCS를 갖는 PBST 중에, 각각 0.4㎍/㎖ 및 0.05㎍/㎖의 농도를 이용하여, 1차 항체 AT8, AT100(써모 사이언티픽)과 밤새 항온처리하였다. 세정 후, 절편을 염소 항마우스 퍼옥시다제 라벨링된(GAMPO) 2차 항체(DAKO, PBST 중의 1/500, 10% FCS)와 항온처리하고, 3,3'-다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB, 10㎖마다 3㎕의 H2O2를 갖는 10㎖의 트리스-HCl마다 1 정제)에 의해 신호를 전개시켰다. 절편을 메이어(Mayer)의 헤마톡실린에 의해 교차염색시키고, 에탄올 및 자일렌(Merck Eurolab) 중의 5개의 단계(50, 70, 95 및 2x100%)로 탈수시키고, 데펙스(Depex)(데펙스 탑재 배지, BDH 실험실)에 탑재하였다.
Figure pct00010
칼러 뷰 II 올림푸스 카메라가 장착된 올림푸스(Olympus) BX41 현미경에 의해 이미지를 획득하고, 어날리시스 파이브 - 셀^D 소프트웨어(AnalySIS Five - Cell^D software)를 사용하여 컴퓨터에 의해 분석하였다. 현미경에 대한 강 강도 및 콘덴서 설정을 이미지 획득 프로세스에 걸쳐 일정하게 유지시켰다. 모든 획득된 이미지를 동일한 컴퓨터 서브루틴으로 처리하여 조사자 편견을 최소화하였다. 밀도 슬라이스 쓰레스홀딩(thresholding)을 분석에 걸쳐 균일하게 적용하였다.
하기 정의된 바와 같은 관심 있는 구역을 염색 신호(들)의 자동 정량화에 대해 선택하였다. 각각 배쪽으로 대뇌각(cerebral peduncle)에 의해 그리고 등쪽으로 백질에 의해, 그리고 세포 밀도의 차이에 기초하여(시상봉합 소뇌 절편 브레그마 1,32-1,92), 시상하부 핵 및 부정대를 그렸다. 소뇌, 전방부 및 후방부의 삽입된 핵, 및 외측 소뇌 핵을 백질 및 세포 밀도의 변화 및 제3 뇌실(시상봉합 소뇌 절편, LAT에 대해 브레그마 1,92-2,64 및 IntA/P에 대해 0,84-1,8)에 의해 그렸다. 각각의 염색을 위해, 마우스마다 STH/ZI를 함유하는 6개의 뇌 절편 및 IntA/P/LAT를 함유하는 16개의 절편이 분석에 포함되었다.
도 6에 도시된 바대로, 16B5 항체에 의해 치료된 동물의 소뇌 핵 및 시상하부 구역에서 검출된 포스포-tau의 양은 6F10 항체에 의해 치료된 대조군 동물에서 동일한 구조에서 검출된 포스포-tau의 양과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 스튜던트 시험(p<0.05)을 이용하여 통계 유의성을 평가하였다.
실시예 5. 16B5의 인간화
서열 분석은 16B5 항체가, 마우스 카밧 하위그룹 1에 속하고 인간 카밧 하위그룹 4에 상응하는, 서열 번호 16의 서열을 갖는 가변 카파(Vk) 도메인을 갖는다는 것을 나타낸다. 카밧 CDR은 밑줄그어져 있다. 16B5 항체의 가변 중쇄(Vh) 도메인은 마우스 카밧 하위그룹 2b에 속하고 인간 카밧 하위그룹 1에 상응하는 서열 번호 10의 서열을 갖는다(Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition; NIH Publication No. 91-3242). 카밧 CDR은 밑줄그어져 있다.
16B5 Vk 도메인은 17개의 잔기 CDR-L1 서열(KSSQSLLNSRTRKNYLA, 서열 번호 17), 7개의 잔기 CDR-L2 서열(WASTRES, 서열 번호 18) 및 8개의 잔기 CDR-L3(KQSYTLRT, 서열 번호 19)을 포함한다. CDR-L1 서열은 카노니컬 분류 3에 속하고, CDR-L2 및 CDR-L3 서열은 분류 1에 속한다(Martin & Thornton (1996), J. Mol. Biol. 263:800-15).
16B5 Vh 도메인은 카밧 넘버링에 기초하여 5개의 잔기 CDR-H1 서열(YHGMD, 서열 번호 11) 또는 조합 카밧 및 쵸티아 넘버링에 기초하여 10개의 잔기 CDR-H1 서열(GYPFTYHGMD, 서열 번호 24), 17개의 잔기 CDR-H2 서열(WINTYSGVPTYADDFKG, 서열 번호 12) 및 8개의 잔기 CDR-H3 서열(RRDFTMDF, 서열 번호 13)을 포함한다. CDR-H1 서열은 카노니컬 분류 1에 속하고, CDR-H2 서열은 분류 2에 속한다(Martin & Thornton (1996), J. Mol. Biol. 263:800-15). CDR-H3 서열은 카노니컬 분류를 갖지 않지만, 아마도 문헌[Shirai et al. (1999), FEBS Lett. 455:188-97]의 규칙에 따라 뒤틀린(kinked) 염기를 갖는다.
Vk 도메인과 Vh 도메인 사이의 계면에서의 잔기는 마우스에서 이 위치에 대한 일반 잔기이다.
16B5 항체의 대략적 구조적 모델을 제공하는 구조를 찾기 위해 PDB 데이터베이스(Deshpande et al. (2011), J. Virol. 85:1820-33)에서 단백질 서열에 걸쳐 조사를 수행하였다. 항콜레라 독소 항체 Fab 단편 Te33(pdb 코드 1ZEA_H)의 구조를 1.78 A의 해상도로 VL에 대해 사용하였다. 이것은 루프에 대해 16B5와 동일한 카코니컬 구조를 보유하였다. Dsbb-Fab 복합체(pdb 코드 2ZUQ_B)에서의 Fab 결정 구조를 사용하여 16B5의 VH 도메인을 모델링하였다. 이것은 3.3 A의 해상도로 해상되고, CDR-H1 및 CDR-H2에 대해 동일한 카코니컬 구조 및 또한 뒤틀린 염기를 갖는 동일한 길이 CDR-H3을 함유하였다. 바이오루미네이트 프로그램(BioLuminate program)을 이용하여 16B5 Fv의 대략적 구조를 모델링하였다.
CDR"X"화 16B5 Fv 서열을 갖는 NCBI로부터의 비중복 단백질 서열 데이터베이스의 조사는 쥣과 CDR을 그래프팅할 적합한 인간 프레임워크의 선택을 허용한다. Vk의 경우, NCBI 수탁 코드 ACJ71718.pro를 갖는 인간 카파 경쇄를 선택하였다(서열 번호 20). 이 인간 카파 경쇄 서열은 CDR-L2 및 L3에 대해 동일한 카코니컬 분류를 갖는다. Vh의 경우, 인간 Ig 중쇄 BAC02002.1을 선택하였다(서열 번호 14). 이것은 16B5 CDR-H1 및 H2의 카코니컬 형태를 공유하고, H3은 예상된 뒤틀린 염기를 갖는 8개 잔기 길이이다.
이 인간 프레임워크에 기초한 인간화 중쇄 및 경쇄 설계 및 복귀 돌연변이는 각각 표 5 및 표 6에 기재되어 있다.
서열 번호 15의 서열을 갖는 인간화 16B5 가변 중쇄(H1)를 설계하였다. 설계는 3개의 복귀 돌연변이: R13K; V48M; 및 Y98F를 포함한다. 13번 위치에서의 K는 인간에서의 R보다 더 빈번하므로 선택되었다. 48번 위치에서의 M은 인간에서의 V보다 더 빈번하므로 선택되었다. 98번 위치에서의 F는 계면에 위치하므로(마우스 잔기를 유지시키는 것이 바람직하게 함) 선택되었다.
3개의 인간화 16B5 가변 경쇄 서열을 설계하였다:
버전 1(L1)은 서열 번호 21의 서열을 갖고, 3개의 복귀 돌연변이: D1N; M4L; 및 Y36F를 포함한다. 1번 위치에서의 N은 HCDR2에서의 N61과의 잠재적 수소 결합을 형성하므로 선택되었다. 4번 위치에서의 L은 LCDR3에서 K96, Q97 및 S98과 접촉하고; 또한 계면 잔기인 F104와 접촉하므로 선택되었다. 36번 위치에서의 F는 Y가 HCDR3에서 D106과 수소 결합할 수 있지만, F는 그렇지 못하므로 선택되었다. 수소 결합은, HCDR3 기능에 영향을 미치고 따라서 바람직하게는 회피되는, 추가의 상호작용을 구성할 것이다.
버전 2(L2)는 서열 번호 22의 서열을 갖고, 4개의 복귀 돌연변이: D1N; M4L; Y36F; 및 P43S를 포함한다. D1N, M4L 및 Y36F에 대한 이유는 버전 1에서와 동일하였다. 43번 위치에서의 S는 S가 HCDR3에 가까운 VH에서 Q110과 수소 결합을 형성하므로 선택되었다.
버전 3(L3)은 서열 번호 23의 서열을 갖고, 3개의 복귀 돌연변이: M4L; Y36F; 및 P43S를 포함한다. 각각의 이 돌연변이의 이유는 버전 1 및 2에서와 동일하였다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 6. 인간화 16B5 항체의 Tau 친화도
H1L1 또는 H1L2 설계를 갖는 인간화 16B5 항체에 대한 결합 데이터는 하기 표 7에 기재되어 있다. 비교를 위해, 키메라 16B5에 대한 결합 데이터가 또한 기재되어 있다. 비아코어 기기를 사용하여 데이터를 생성하였다. 버전 H1L2가 가장 강한 친화도(키메라 16B5의 것과 실질적으로 동일)를 갖는 것으로 결정되었다. 인간화 16B5 버전 H1L1 및 H1L3은 또한 적절한 친화도를 가졌다.
비아코어 T200(GE Lifesciences)을 사용하여 표면 플라스몬 공명 측정을 수행하였다. 항마우스 또는 항인간 포획 항체를 아민 커플링하여 제조된 CM5 센서 칩 상에서 30㎕/분으로 10mM HEPES(pH 7.4), 150mM NaCl 및 0.05% Tween-20의 이동상을 사용하여 모든 실험을 수행하였다. 16B5(키메라 또는 인간화 형태)는 부동화 포획 항체에 결합하고, 다양한 농도의 재조합 정제된 hTau-P301L을 연속적인 반복으로 항체 복합체에 적용하였다. 반복 단계를 고염 또는 저 pH 재생 단계에 의해 분리하였다. 항체 및 항원의 상이한 제제에 의해 실험을 반복하였다. 온보드(onboard) 비아코어 소프트웨어에 의해 분석을 수행하였다.
Figure pct00019
실시예 7. 인간화 16B5 항체에 의한 Tau의 면역침강 검출
브라크 점수(Braak score)가 6인 알츠하이머 질환 환자로부터의 전두엽의 사후 샘플을 하기 순서로 증가하는 가용화 강도의 완충제 중에 순차적으로 추출하였다: (ⅰ) 고염 완충제(20mM 트리스, 5mM EDTA, 1mM DTT, 10% 수크로스, 7500mM NaCl(pH 7.4)), (ⅱ) 트리톤 완충제(20mM 트리스, 5mM EDTA, 1mM DTT, 10% 수크로스, 1% 트리톤 X100, 500mM NaCl(pH 7.4)) 및 (ⅲ) 사르코실 완충제(10mM 트리스, 5mM EDTA, 1mM DTT, 10% 수크로스, 500mM NaCl, 1% 사르코실(pH 7.4)).
각각의 샘플의 경우, 200 마이크로그램의 고염 가용성 분획, 또는 20 마이크로그램의 사르코실 불용성 분획을 400 마이크로리터의 면역침강 완충제(10mM 트리스, 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X100, 1mM EGTA, 1mM EDTA, pH 7.4)에 의해 희석시켰다. 샘플을 단백질 G 자기 비드(뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 예비세척하고, 5 마이크로그램의 항체를 각각의 관에 첨가하였다. 사용된 항체는 하기를 포함하였다: 1) 대조군으로서의 마우스 비면역 IgG 항체(mIgG); 2) 대조군으로서의 인간 비면역 IgG 항체(hIgG); 3) 키메라 16B5 항체(Chi16B5); 4) 인간화 16B5, 버전 H1L2(h16B6-H1L2); 및 인간화 16B5, 버전 H1L3(h16B6-H1L3). 예비세척된 용해물 및 항체를 4℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 항체/항원 복합체를 단백질 G 자기 비드를 사용하여 침전시키고, 침전물을 PBS/350mM NaCl에 의해 완전히 세척하였다. 라엠리(Laemmli) 완충제를 사용하여 용리한 후, 용리물을 SDS-PAGE에 의해 분할시키고, 다중클론 tau 항체(DAKO)를 사용하여 블롯팅하였다.
도 7에 도시된 바대로, 키메라 16B5 및 인간화 16B5 H1L2 및 H1L3은 알츠하이머 뇌로부터의 가용성 분획 및 불용성 분획 둘 다에서 tau를 인식하였다.
실시예 8. 알츠하이머병 뇌에서의 쥣과 및 인간화 16B5 tau 항체의 면역조직화학적 규명
쥣과 단일클론 항-tau 항체 16B5 및 이의 2개의 인간화 변이체, h16B5-H1L2 및 h16B5-N1D를 알츠하이머병 도너 및 비이환된 나이 든 대조군으로부터의 인간 뇌 피질의 새로 냉동된 절편에서 면역조직화학적으로 또한 시험하였다.
방법:
인간 뇌 조직
전두엽을 선 건강 조사 위원회(Sun Health Research Institute)로부터 얻었다. 사례는 알츠하이머병으로 진단되고 사후 신경병리학적 평가에 의해 확인된 6명의 환자(평균 연령 86.8±0.40세 SEM) 및 3명의 비이환된 나이 든 대조군(평균 연령 77±9.7세 SEM)을 포함한다. 사례의 인구통계가 하기 표 8에 기재되어 있다. 약하게 아세톤 고정된, 10㎛ 슬라이드-탑재 극저온절편(cryosection)에서 면역조직화학을 수행하였다.
Figure pct00020
면역조직화학
면역퍼옥시다제 방법은 염소 항마우스 면역글로불린(엔비전+시스템 HRP 라벨링된 중합체(EnVision+System HRP labeled Polymer); Dako K4001)에 접합된 퍼옥시다제 라벨링된 중합체 또는 직접적으로 바이오티닐화된 인간화 항체(ABC 엘리트 스탠다드(ABC Elite Standard); PK-6100; 벡터 레버러토리즈(Vector Laboratories))에 대한 벡터 ABC 증폭 시스템으로 이루어진 주요 검출 시스템이다. 갈색 침착물을 생성시키는 DAB 발색체(리퀴드 DAB(Liquid DAB) + 섭스트레이트 크로모겐 시스템(Substrate Chromogen System); Dako K3468)에 의해 염색을 가시화하였다.
음성 대조군은 IgG 아이소타입 대조군 항체 또는 1차 항체의 생략을 갖는 인접한 절편에서 전체 면역조직화학 절차를 수행하는 것으로 이루어진다.
면역형광성 라벨링
항체의 쥣과 및 인간화 변이체, 다양한 인산화 에피토프를 인식하는 다른 tau 항체 및 아밀로이드 베타 사이의 관계를 결정하기 위해 이중 면역형광성 염색을 수행하였다. 조직 절편을 바이오티닐화 또는 FITC 태그화된 인간화 16B5 변이체(1㎍/㎖) 및 쥣과 항체(단일클론 16B5(1㎍/㎖), AT8(1:1000), AT100(1:1000), 또는 3D6(1㎍/㎖) 중 어느 하나)를 함유하는 항체 칵테일에 의해 동시에 염색하였다. 488 또는 635 형광단(인비트로겐)에 접합된 염소 항마우스 2차에 의해 쥣과 항체를 검출하였다. 바이오티닐화 인간화 항체를 스트렙타비딘 635에 의해 검출하였다.
예비흡수
항체의 이의 표적 항원에 대한 특이성을 평가하기 위해, 1㎍/㎖의 16B5 항체를 4℃에서 밤새 50㎍/㎖의 정제된 인간 P301L tau 또는 야생형 시누클레인(비연관 단백질)에 의해 예비흡수시켰다. 이후, 항체를 조직에 적용하고, 면역조직화학 절차를 상기 기재된 바대로 수행하였다.
이미지 분석
슬라이드를 올림푸스 BX61 현미경, 올림푸스 나노주머(Olympus Nanozoomer) 2.0HT, 또는 레이카(Leica) SPE 스펙트럼 공초점 시스템에 의해 영상화하였다. 이미지를 TIFF 파일로서 수집하였다.
결과
하기 표 9에 기재된 바대로, 마우스 단일클론 항체 16B5 및 인간화 변이체 둘 다는, 주로 신경망 트레드(neuropil thread), 몇몇 신경섬유 매듭(대부분 구형) 및 몇몇 tau 양성 신경반을 염색시키는, 알츠하이머병 조직에 대한 반응성을 나타냈다. 대부분의 16B5 AD 섬유성 병리학은 회백질로 제한되지만, 일부 반응성이 백질에서도 검출되었다. 비이환된 대조군 조직은 반대로 분산성 배경 반응성을 나타내지만, AD 조직에서 발견되는 임의의 병리학에 대해 음성이었다.
항체 변이체에 의해 인식된 병리학을 추가로 규명하기 위해, 16B5의 쥣과 단일클론 버전 및 (1) 인간화 변이체 둘 다, (2) 다양한 인산화 에피토프에서 tau를 인식하는 항체 및 (3) 베타 아밀로이드에 의해 이중 라벨링 실험을 수행하였다.
h16B5-H1L2 및 h16B5-N1D 둘 다는 AD 섬유성 병리학적 구조에서 높은 일치도(congruence)로 단일클론 16B5 항체와 동시 국재화되었다. H16B5-H1L2는 또한 세린202 및 트레오닌205(AT8), 세린212 및 트레오닌214(AT100), 및 세린396(인하우스 독점적 항체, 20H1)을 포함하는, 다양한 인산화 tau 에피토프에 대해 면역반응성인 것으로 나타난 병리학을 검출하였다. 마지막으로, N 말단 아미노산 서열(3D6; aa 1-5)을 인식하는 아밀로이드 베타 항체 및 16B5에 의한 이중 라벨링은 아밀로이드 플라크에서 Aβ와 16B5-면역반응성 구조 사이의 매우 적은 동시 국재화를 나타냈다.
16B5 면역반응성을 잘 규명된 상업적으로 구입 가능한 단일클론 항-tau 항체(Dako)와 비교할 때, 둘 다는 tau 양성 신경반, 신경망 트레드 및 신경섬유 매듭을 포함하는 섬유성 AD 병리학을 염색시켰다.
항체의 특이성을 정제된 재조합 P301L tau에 의한 예비흡수에 의해 평가하였다. 16B5가 P301L tau에 의해 예비흡수될 때 염색의 감소가 관찰되었지만, 항체가 동일한 몰 농도에서 비연관 단백질(야생형 시누클레인)에 의해 예비흡수될 때 염색은 영향을 받지 않았다.
IgG 아이소타입 대조군 항체 및 1차 항체 생략 절편 둘 다는 시험된 모든 조직에 걸쳐 염색에 음성이었다.
Figure pct00021
인용된 모든 공보(젠뱅크(GenBank) 수탁 번호, 유니프로트KB/스위스 프로트 수탁 번호 등 포함), 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 공보, 특허 및 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 젠뱅크 및 유니프로트KB/스위스 프로트 수탁 번호 등과 연관된 서열의 임의의 변동의 경우에, 본 출원은 관련 수탁 번호를 개시하는 우선권의 실제 출원일 또는 우선일을 의미하는 본원의 유효 출원일에 인용된 수탁 번호와 연관된 서열에 관한 것이다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시양태 또는 양상은, 달리 구체적으로 표시되지 않은 한, 서로 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예의 방식으로 약간 자세히 기재되더라도, 첨부된 청구범위 내에 소정의 변경 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 명확할 것이다.
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Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 21 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 21 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 22 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 23 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 24 Gly Tyr Pro Phe Thr Tyr His Gly Met Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 25 caggtccagt tggtgcagtc tggatctgag ctgaagaagc ctggagcctc cgtcaaggtg 60 tcctgcaagg cttctgggta tcccttcaca taccatggaa tggactgggt gcgtcaggct 120 cctggtcagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 180 gctgatgact tcaagggacg atttgtgttc tctttggaca cctctgtctc tactgcctat 240 ttgcagatct cttctctcaa agccgaggac acggccgtgt atttttgtgc aagacggcgt 300 gattttacaa tggacttctg gggtcaagga accaccgtga ccgtctcctc a 351 <210> 26 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 26 aacatcgtgc tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagga ccaggaagaa ctacctggcc 120 tggttccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180 gagagcggcg tgcccgatag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240 atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacaccctg 300 agaaccttcg gcggcggcac caaggtggaa attaaacgt 339 <210> 27 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 27 aacatcgtgc tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagga ccaggaagaa ctacctggcc 120 tggttccagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180 gagagcggcg tgcccgatag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240 atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacaccctg 300 agaaccttcg gcggcggcac caaggtggaa attaaacgt 339 <210> 28 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 28 gacatcgtgc tgacccagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga gagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcagga ccaggaagaa ctacctggcc 120 tggttccagc agaagcccgg ccagagcccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180 gagagcggcg tgcccgatag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgattt caccctgacc 240 atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacaccctg 300 agaaccttcg gcggcggcac caaggtggaa attaaacgt 339 <210> 29 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 29 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 30 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 30 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 31 <211> 1343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 31 ggtgagtgga tccgcggccg ctaaactctg agggggtcgg atgacgtggc cattctttgc 60 ctaaagcatt gagtttactg caaggtcaga aaagcatgca aagccctcag aatggctgca 120 aagagctcca acaaaacaat ttagaacttt attaaggaat agggggaagc taggaagaaa 180 ctcaaaacat caagatttta aatacgcttc ttggtctcct tgctataatt atctgggata 240 agcatgctgt tttctgtctg tccctaacat gccctgtgat tatccgcaaa caacacaccc 300 aagggcagaa ctttgttact taaacaccat cctgtttgct tctttcctca gcctccacca 360 agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg 420 ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag 480 gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact 540 ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca 600 acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aaatcttgtg 660 acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct 720 tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat 780 gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg 840 gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc 900 gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt 960 gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 1020 ggcagccccg agaaccacag gtgtacacgc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga 1080 accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 1140 gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 1200 acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 1260 acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc 1320 tctccctgtc cccgggtaaa tga 1343 <210> 32 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 32 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 33 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 33 acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318 <210> 34 <211> 671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 34 cgtgagtgga tccgcggccg ctaaactctg agggggtcgg atgacgtggc cattctttgc 60 ctaaagcatt gagtttactg caaggtcaga aaagcatgca aagccctcag aatggctgca 120 aagagctcca acaaaacaat ttagaacttt attaaggaat agggggaagc taggaagaaa 180 ctcaaaacat caagatttta aatacgcttc ttggtctcct tgctataatt atctgggata 240 agcatgctgt tttctgtctg tccctaacat gccctgtgat tatccgcaaa caacacaccc 300 aagggcagaa ctttgttact taaacaccat cctgtttgct tctttcctca ggaactgtgg 360 ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct 420 ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg 480 ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca 540 gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag 600 tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca 660 ggggagagtg t 671

Claims (83)

  1. 항체 16B5와 tau에 대한 결합에 경쟁하는 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간화, 키메라, 베니어(veneered) 또는 인간 항체인, 단일클론 항체.
  3. 제1항에 있어서, 인간 IgG 아이소타입을 갖는, 단일클론 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아이소타입은 IgG1인, 단일클론 항체.
  5. 제4항에 있어서, 불변 구역에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는, 단일클론 항체.
  6. 제1항에 있어서, 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입을 갖는, 단일클론 항체.
  7. 제1항에 있어서, 단일클론 항체 16B5의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태인, 단일클론 항체.
  8. 제1항에 있어서, 단일클론 항체 16B5의 카밧(Kabat)에 의해 규정된 3개의 경쇄 CDR 및 카밧에 의해 규정된 3개의 중쇄 CDR을 갖는, 단일클론 항체.
  9. 서열 번호 1(스위스-프로트(Swiss-Prot) P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  10. 제9항에 있어서, 인간, 인간화, 키메라 또는 베니어인, 단일클론 항체.
  11. 제10항에 있어서, 서열 번호 1의 25-44번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단일클론 항체.
  12. 제11항에 있어서, 서열 번호 1의 30-39번 잔기 내의 에피토프에 결합하는 인간화, 키메라 또는 베니어 항체인, 단일클론 항체.
  13. 제1항에 있어서, 인산화 형태 및 비인산화 형태로 tau에 결합하는, 단일클론 항체.
  14. 서열 번호 15와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 구역 및 서열 번호 22와 적어도 90% 동일한 성숙 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, 서열 번호 15의 3개의 카밧 CDR 및 서열 번호 22의 3개의 카밧 CDR을 포함하는 항체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 단 H13, H48 및 H91 위치 중 적어도 하나는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치 중 적어도 하나는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유되는 항체.
  17. 제16항에 있어서, 단 H13, H48 및 H91 위치는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치 중 적어도 2개는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유되는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 단 H13, H48 및 H91 위치는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치 중 적어도 3개는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유되는 항체.
  19. 제17항에 있어서, 단 H13, H48 및 H91 위치는 각각 K, M 및 F에 의해 점유되고, L1, L4, L36 및 L43 위치는 각각 N, L, F 및 S에 의해 점유되는 항체.
  20. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 15와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 구역 및 서열 번호 22와 적어도 95% 동일한 성숙 경쇄 가변 구역을 포함하는 항체.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 구역은 중쇄 불변 구역에 융합되고, 상기 성숙 경쇄 가변 구역은 경쇄 불변 구역에 융합된 항체.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 불변 구역은, 천연 인간 불변 구역에 비해, Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소한 천연 인간 불변 구역의 돌연변이체 형태인 항체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 중쇄 불변 구역은 IgG1 아이소타입을 갖는 항체.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단 서열 번호 15 및 서열 번호 22로부터의 성숙 중쇄 가변 구역 및 성숙 경쇄 가변 구역의 CDR의 임의의 차이는 각각 H60-H65 위치에 있는 항체.
  25. 제14항, 제22항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 구역은 서열 번호 15로 지정된 아미노산 서열을 갖고, 상기 성숙 경쇄 가변 구역은 서열 번호 21, 서열 번호 22 또는 서열 번호 23으로 지정된 아미노산 서열을 갖는 항체.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 구역은 서열 번호 15로 지정된 아미노산 서열을 갖고, 상기 성숙 경쇄 가변 구역은 서열 번호 22로 지정된 아미노산 서열을 갖는 항체.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 세포독성제 또는 세포정지제(cytostatic agent)에 접합된 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fab 단편인 항체.
  29. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  30. 항체를 인간화하는 방법으로서,
    마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 구역의 서열을 결정하는 단계;
    상기 마우스 항체 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화 중쇄를 코딩하는 핵산 및 상기 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화 경쇄를 코딩하는 핵산을 합성하는 단계; 및
    숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시켜 인간화 항체를 생성하는 단계를 포함하되,
    상기 마우스 항체는 16B5인, 항체를 인간화하는 방법.
  31. 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 제조하는 방법으로서,
    상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산에 의해 형질전환된 세포를 배양하여, 상기 세포가 상기 항체를 분비하도록 하는 단계; 및
    세포 배양 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하되,
    상기 항체는 16B5의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태인, 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 제조하는 방법.
  32. 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생성하는 세포주를 제조하는 방법으로서,
    항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포로 도입하는 단계;
    상기 벡터의 카피수가 증가한 세포를 선택하게 하는 조건 하에 상기 세포를 전파시키는 단계;
    상기 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및
    항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹(banking)하는 단계를 포함하되,
    상기 항체는 16B5의 인간화, 키메라 또는 베니어 형태인, 인간화, 키메라 또는 베니어 항체를 생성하는 세포주를 제조하는 방법.
  33. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  34. 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는, tau의 단리된 단편.
  35. 제34항에 있어서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 30-39번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는, tau의 단리된 단편.
  36. 제34항에 있어서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 33-37번 잔기를 포함하는, tau의 단리된 단편.
  37. 제34항에 있어서, 임의로 상기 단편에 대해 항체를 유발하는 것을 돕는 스페이서(spacer)를 통해 캐리어 분자에 연결된, tau의 단리된 단편.
  38. 제34항의 단편 및 인간에 대한 투여에 허용되는 아쥬번트(adjuvant)를 포함하는 약제학적 조성물.
  39. 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을, 알츠하이머병을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여함으로써, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항체는 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 환자는 ApoE4 캐리어인 방법.
  43. tau와 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을, 상기 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여함으로써, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항체는 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 질환은 신경학적 질환인 방법.
  47. tau의 비정상 전달을 감소시키는 방법으로서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을, tau의 비정상 전달과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여함으로써, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 항체는 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편인 방법.
  50. tau의 식세포작용을 유도하는 방법으로서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을, tau의 축적과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항체는 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 질환은 신경학적 질환인 방법.
  54. tau 응집 또는 침착을 저해하는 방법으로서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을, tau의 응집 또는 침착과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 항체는 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 질환은 신경학적 질환인 방법.
  58. tau 엉킴(tangle)의 형성을 저해하는 방법으로서, 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질의 효과적인 섭생을, tau 엉킴의 형성과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항체는 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 항체를 유도하는 물질은 서열 번호 1의 24-46번 잔기 내의 tau의 3개 내지 10개의 인접 잔기를 포함하는 tau의 단편인 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 질환은 신경학적 질환인 방법.
  62. 알츠하이머병에 대한 활성에 대해 물질을 스크리닝하는 방법으로서, tau 전이유전자를 발현하는 형질전환 동물에 상기 물질을 투여하는 단계 및 상기 물질이 알츠하이머병의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 저해하거나 지연시키는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 물질은 서열 번호 1(스위스-프로트 P10636-8호)의 24-46번 잔기 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이러한 항체를 유도하는 물질인 방법.
  63. 서열 번호 10의 서열을 갖는 중쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산.
  64. 서열 번호 15의 서열을 갖는 중쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산.
  65. 제64항에 있어서, 상기 분절은 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절을 추가로 포함하는 핵산.
  67. 제66항에 있어서, 상기 IgG1 불변 구역은 인간 IgG1 불변 구역인 핵산.
  68. 제67항에 있어서, 상기 IgG1 불변 구역은 서열 번호 29의 서열을 갖되, 단 C 말단 라이신은 생략될 수 있는 핵산.
  69. 제68항에 있어서, 상기 IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절은 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 구역 및 IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절을 연결하는 인트론(intron)을 추가로 포함하는 핵산.
  71. 제70항에 있어서, 상기 IgG1 불변 구역을 코딩하는 분절은 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
  72. 서열 번호 16의 서열을 갖는 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산.
  73. 서열 번호 21, 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 서열을 갖는 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 포함하는 핵산.
  74. 제73항에 있어서, 상기 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절은 서열 번호 26, 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 서열을 갖는 핵산.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 카파 불변 구역을 코딩하는 분절을 추가로 포함하는 핵산.
  76. 제75항에 있어서, 상기 카파 불변 구역은 인간 카파 불변 구역인 핵산.
  77. 제76항에 있어서, 상기 카파 불변 구역은 서열 번호 32의 서열을 갖는 핵산.
  78. 제77항에 있어서, 상기 카파 불변 구역을 코딩하는 핵산은 서열 번호 33의 서열을 갖는 핵산.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 구역을 코딩하는 분절을 상기 카파 불변 구역을 코딩하는 분절에 연결하는 인트론을 추가로 포함하는 핵산.
  80. 제79항에 있어서, 상기 카파 불변 구역을 코딩하는 분절은 서열 번호 34의 서열을 갖는 핵산.
  81. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 서열 번호 29의 서열을 갖는 인간 IgG1 불변 도메인을 포함하는 항체.
  82. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 서열 번호 32의 서열을 갖는 인간 카파 불변 구역을 포함하는 항체.
  83. 서열 번호 15의 중쇄 가변 구역 및/또는 서열 번호 21, 서열 번호 22 또는 서열 번호 23의 경쇄 가변 구역을 코딩하는 핵산(들).
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