MX2010011342A

MX2010011342A - Anticuerpos anti-factor d humanizados y sus usos.

Info

Publication number: MX2010011342A
Application number: MX2010011342A
Authority: MX
Inventors: Robert F Kelley; Henry Lowman; Arthur J Huang; Campagne Menno Van Lookeren; Charles M Winter
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2010-12-06
Also published as: HK1147503A1; EP3002295A1; HK1245812A1; NZ588457A; US9676868B2; CO6331346A2; NZ621103A; TWI616456B; CA2720853A1; US20160145349A1; TW201437230A; IL253014A0; HK1193111A1; PE20140806A1; CN103724433A; WO2009134711A1; KR101322027B1; CA2720853C; AU2009241348C1; MA32300B1

Abstract

La invención hace referencia a anticuerpos anti-factor D, sus secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos, las células y vectores que contienen estos anticuerpos y su producción y uso en la preparación de composiciones y medicamentos para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados a una activación excesiva o descontrolada del complemento. Estos anticuerpos son útiles para diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades.

Description

ANTICUERPOS ANTI-FACTOR D HUMANIZADOS Y SUS USOS Referencia cruzada a aplicaciones afines En esta solicitud no provisional, presentada al amparo del artículo 1.53 (b) del Código de Regulaciones Federales (CFR) 37, se reivindica el beneficio contemplado en el artículo 1 19(e) del Código de Estados Unidos (USC) 35 de la solicitud provisional de patente de EE.UU. con n.° de serie 61/048,431 , presentada el 28 de abril de 2008 y la solicitud provisional con n.° de serie 61/048,689 presentada el 29 de abril de 2008, cuyas descripciones se incluyen aquí en su totalidad a modo de referencia.

Antecedentes de la invención El sistema del complemento desempeña un papel esencial en el aclaramiento de los ¡nmunocomplejos y en la respuesta inmunitaria a agentes infecciosos, antígenos extraños, células infectadas con virus y células tumorales. Sin embargo, el complemento también interviene en la inflamación patológica y en enfermedades autoinmunes. Por ello, la inhibición de una activación excesiva o descontrolada de la cascada del complemento podría proporcionar un beneficio clínico a pacientes afectados por estas enfermedades y procesos.

El sistema del complemento engloba dos vías de activación claras, denominadas vía clásica y vía alternativa (V.M. Holers, en Clinical Immunology: Principies and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). La vía clásica es una cascada dependiente de calcio/magnesio, que se suele activar mediante la formación de complejos antígeno-anticuerpo. La vía alternativa es una cascada dependiente de magnesio que se activa mediante el depósito y activación del factor C3 en determinadas superficies susceptibles (por ejemplo, polisacáridos de la pared celular de levaduras y bacterias y algunos materiales biopoliméricos). La activación de la vía del complemento genera fragmentos biológicamente activos de proteínas del complemento, por ejemplo, anafilatoxinas C3a, C4a y C5a y complejos de ataque a la membrana (MAC) C5b-9, que median en actividades inflamatorias en las que interviene quimiotaxis leucocitaría, activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastocitos y células endoteliales, permeabilidad vascular, citolisis y lesión tisular.

El factor D es una serina proteasa altamente específica esencial para la activación de la vía alternativa del complemento. Escinde el facto B unido a C3b, lo que genera la enzima C3b/Bb que es el componente activo de las convertasas C3/C5 de la vía alternativa. El factor D puede ser una diana apropiada para la inhibición, dado que su concentración plasmática en humanos es muy baja (1 ,8 pg/ml) y se ha demostrado que es la enzima que limita la activación de la vía alternativa del complemento (P.H. Lesavre y H.J. Müller-Eberhard. J. Exp. Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis y col., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401).

La regulación por disminución de la activación del complemento ha demostrado su eficacia en el tratamiento de diversas indicaciones de enfermedades en modelos animales y en estudios ex vivo, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis (Y. Wang y col., Proc. Nati. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568), arthritis reumatoide (Y. Wang y col., Proc. Nati. Acad. Sci., 1995; 92: 8955-8959), bypass cardiopulmonar y hemodialisis (C.S. Rinder, J. Clin. Invest, 1995; 96: 1564-1572), rechazo agudo de trasplante de órgano (T.J. Kroshus y col., Transplantation, 1995; 60: 1194-1202), infarto de miocardio (J. W. Homeister y col., J. Immunol., 1993; 150: 1055-1064; H.F. Weisman y col., Science, 1990; 249: 146-151), daño por reperfusión (E.A. Amsterdam y col., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457) y síndrome de distrés respiratorio del adulto (R. Rabinovici y col., J. Immunol., 1992; 149: 1744-1750). Además, otros procesos inflamatorios y enfermedades autoinm unes/por inmunocomplejos están también estrechamente relacionadas con la activación del complemento (V.M. Holers, ibid., B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest, 1994: 24: 219-228), incluida agresión térmica, asma grave, choque anafiláctico, inflamación intestinal, urticaria, angioedema, vasculitis, esclerosis múltiple, miastenia gravis, glomerulonefritis membranoproliferativa y síndrome de Sjogren. Existe la necesidad de tratamiento con anticuerpos en el ámbito de los trastornos mediados por el complemento y los anticuerpos anti-factor D humanizados y sus variantes y fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígenos) de la presente invención proporcionan anticuerpos de .alta afinidad que pueden satisfacer esta necesidad.

Compendio de la invención En un aspecto, la presente invención se relaciona en general con los anticuerpos capaces de inhibir las actividades biológicas asociadas con el factor D.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con los anticuerpos anti-factor D humanizados, que tienen una gama de características terapéuticas deseables. La invención incluye las secuencias de aminoácidos de las HVR de estos anticuerpos antifactor D humanizados y sus correspondientes secuencias de ácidos nucleicos. La invención incluye las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables ligera y pesada de los anticuerpos anti-factor D humanizados y sus correspondientes secuencias de ácidos nucleicos. La invención incluye las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables ligera y pesada de los anticuerpos anti-factor D humanizados y sus correspondientes secuencias de ácidos nucleicos.

En un aspecto los anticuerpos del ámbito de esta invención incluyen, sin limitación los anticuerpos anti-factor D humanizados, que comprenden las HVR de los clones Fab (fragmentos de anticuerpo) anti-factor D humanizados n.° 238, 238-1, 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ó 238-11. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D humanizados comprenden los dominios variables de las cadenas pesada o ligera de los Fab (fragmentos de anticuerpo) anti-factor D humanizados clones n.° 238, 238-1 , 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ó 238-11. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D humanizados comprenden las cadeneas pesada y/o ligera de los Fab anti-factor D humanizados clones n.° 238, 238-1 , 238,2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ó 238-11. En una forma de realización, la invención incluye los clones de Fab anti-factor D humanizados n.° 238, 238-1 , 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ó 238-11. En una forma de realización, la invención incluye fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos de longitud completa de los clones de Fab anti-factor D humanizados n.° 238, 238-1 , 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ó 238-11. En una forma de realización, la invención incluye los anticuerpos de longitud completa o los fragmentos que se unen a los anticuerpos de los mismos, que comprenden las secuencias de unión a los antígenos de la cadena pesada y/o ligera de los Fab anti- factor D humanizados clones n.° 238, 238-1 , 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 ó 238-11. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden por lo menos una, dos o tres de las secuencias de la HVR de la cadena pesada. En una forma de realización, estos anticuerpos comprenden al menos una, dos o tres las secuencias de la HVR de la cadena ligera. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden al menos una porción (o la totalidad) del dominio variable de la cadena pesada. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden al menos una porción (o todas) del dominio variable de la cadena ligera.

En un aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión a los antígenos) o anticuerpos de longitud completa del clon de Fab anti-factor D humanizado n.° 11 1 , que comprende por lo menos una modificación de la secuencia del clon de Fab anti-factor D humanizado n.° 1 11 , donde dichos anticuerpos de longitud completa o dichos fragmentos de unión al antígeno comprenden las secuencias de unión al antígeno de las cadenas pesada y/o ligera del clon de Fab antifactor D humanizado n.° 1 1 1. En una forma de realización, los fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión a los antígenos) o anticuerpos de longitud completa del clon de Fab anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , que comprende al menos una modificación de la secuencia del clon de Fab anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , que comprende las secuencias de unión al antígeno de las cadenas pesada y/o ligera del clon Fab anti-factor D humanizado n.° 1 11 , además se unen esencialmente al mismo epítopo que el clon de Fab de anticuerpo humanizado n.° 1 1 1. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden por lo menos una, dos ó tres de las secuencias de la HVR de la cadena pesada. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden al menos una, dos o tres de las secuencias de la HVR de la cadena ligera. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden al menos una porción (o la totalidad) del dominio variable de la cadena pesada. En una forma de realización, dichas secuencias de unión al antígeno comprenden al menos una porción (o todas) del dominio variable de la cadena ligera. En una forma de realización, la modificación de los fragmentos de anticuerpo o de los anticuerpos de longitud completa, es una cadena pesada. En una forma de realización, la modificación de los fragmentos de anticuerpo o de los anticuerpos de longitud completa, ocurre en la cadena ligera. En una forma de realización, la modificación de los fragmentos de anticuerpo o de los anticuerpos de longitud completa, ocurre en el dominio variable de la cadena pesada. En una forma de realización, la modificación de los fragmentos de anticuerpo o de los anticuerpos de longitud completa, ocurre en el dominio variable de la cadena ligera. En una forma de realización, la modificación de los fragmentos de anticuerpo o de los anticuerpos de longitud completa, ocurre en al menos una, dos o tres secuencias de la HVR de la cadena pesada. En una forma de realización, la modificación de los fragmentos de anticuerpo o de los anticuerpos de longitud completa, ocurre en al menos una, dos o tres secuencias de la HVR de la cadena ligera. En un aspecto la invención se refiere a los anticuerpos de la presente invención o a sus fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) que se unen al factor D con una afinidad de unión de al menos 10"9 a 10" 2M.

En un aspecto la invención se refiere a los anticuerpos de la presente invención o a sus fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno); donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe una función biológica del factor D en una proporción molar fragmento Fab-factor D de aproximadamente 0,05:1 (0,05) a 10:1 (10), de 0,09:1 (0,09) a 8:1 (8), de 0,1 :1 (0,1) a 6:1 (6), de 0,15:1 (0,15) a 5:1 (5), de 0,19:1 (0,19) a 4:1 (4), de 0,2:1 (0,2) a 3:1 (3), de 0,3:1 (0,3) a 2:1 (2), de 0,4:1 (0,4) a 1 :1 (1), de 0,5:1 (0,5) a 1 :2 (0,5), de 0,6:1 (0,6) a 1 :3 (0,33), de 0,7:1 (0,7) a 1 :4 (0,25), de 0,8:1 (0,8) a 1 :5 (0,2) o de 0,9:1 (0,9) a 1 :6 (0,17).

En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención incluyen a los anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos.

En otro aspecto, la presente invención incluye fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión a los antígenos) de anticuerpos anti-factor D, humanizados. Los fragmentos de anticuerpos de la presente invención pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, fragmentos que determinan la región de complementariedad, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única, minicuerpos, diacuerpos o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

En otros aspectos de la presente invención, ésta incluye compuestos que comprenden un anticuerpo de la invención o un fragmentos del mismo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno). En otra forma de realización, la invención proporciona líneas celulares y vectores que codifican al menos una porción de un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno). En un aspecto, la invención incluye un método para elaborar, un método para producir y un método para utilizar anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) y compuestos de la invención. Un método para la elaboración de un anticuerpo de la invención o un fragmento el mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) donde el método comprende (a) el cultivo de una célula huésped, por ejemplo, una célula eucariótica o una célula CHO, que comprenda un vector, además de comprender un anticuerpo de la invención que codifique polinucleótidos o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) bajo condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) y (b) el aislamiento del anticuerpo o de un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno).

En otro aspecto, la invención hace referencia a la composición de sustancias que comprenden un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) según se describe en la presente memoria, en combinación con un vehículo. Opcionalmente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otra forma de realización de la presente invención es él uso de estos anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) para la preparación de un medicamento o composición para la prevención o el tratamiento de trastornos asociados a una activación excesiva o descontrolada del complemento. Incluyen la activación del complemento durante intervenciones de bypass cardiopulmonar; activación del complemento debida a isquemia-reperfusión tras infarto agudo de miocardio, aneurisma, ictus, choque hemorrágico, lesión por aplastamiento, fallo multiorgánico, choque hipovolémico, isquemia intestinal u otros acontecimientos que causen isquemia. Asimismo, se ha demostrado que la activación del complemento está asociada a procesos inflamatorios como quemaduras graves, endotoxemia, choque septicémico, síndrome de distrés respiratorio del adulto, hemodiálisis, choque anafiláctico, asma grave, angioedema, enfermedad de Crohn, anemia drepanocítica, glomerulonefritis postestreptocócica y pancreatitis. El trastorno puede estar ocasionado por una reacción adversa a un fármaco, una alergia medicamentosa, síndrome de fuga vascular inducida por IL-2 o alergia a medios de contraste radiográfico. También incluye enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. En otra forma de realización, la activación del complemento también está asociada con el rechazo de trasplantes. En otra forma de realización, la activación del complemento también está asociada con enfermedades oculares (todas las afecciones y enfermedades cuya patología involucra al complemento, incluso la vía clásica y la vía alternativa del complemento), tal como, por ejemplo, sin limitación, la enfermedad macular degenerativa, tal como todas las etapas de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), que incluye la forma seca y la forma húmeda (no exudativa y exudativa), la retinopatía diabética y otras retinopatias relacionadas con la isquemia, neovascularización de la coroides (CNV), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea, neovascularización retiniana. En un ejemplo, las afecciones oculares asociadas al complemento incluyen la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD no exudativa (por ejemplo la AMD intermedia seca o la atrofia geográfica (GA)) y la AMD exudativa (por ejemplo, la AMD húmeda (neovascularización de la coroides (CNV)), la retinopatía diabética (DR), endoftalmitis y uveítis. En otro ejemplo, la AMD no exudativa puede incluir la presencia de drusen rígido o drusen blando, atrofia geográfica y/o pigmento agrumado. En otro ejemplo, las afecciones oculares asociadas al complemento incluyen la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD (por ejemplo incluye desde múltiples drusen pequeños hasta uno o más drusen medianos no extendidos, AMD intermedia (por ejemplo, incluye drusen medianos extendidos a uno o más drusen grandes) y la AMD avanzada (por ejemplo, incluye la atrofia geográfica o la AMD húmeda avanzada (CNV). En otro ejemplo, la AMD intermedia seca puede incluir drusen grandes confluentes. En otro ejemplo, la atrofia geográfica puede incluir la pérdida de los fotorreceptores y/o del epitelio retiniano pigmentado (RPE). En otro ejemplo, el área de atrofia geográfica puede ser pequeña o grande y puede estar en el área macular o en la retina periférica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD intermedia seca. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)).

En otro aspecto, la invención proporciona un kit que comprende un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antigeno). En una forma de realización, la invención proporciona un kit que comprende un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno y las instrucciones de uso. En una forma de realización la invención hace referencia a un kit que comprende un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) y las instrucciones para la administración de dicho anticuerpo para el tratamiento de un trastorno asociado al complemento. En una forma de realización, la invención proporciona un kit que comprende un primer envase que contiene una composición que incluye uno o más anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) y un. segundo envase que contiene una solución tampón. En una forma de realización, la solución tampón es farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, una composición que incluye un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) comprende, además, un vehículo, que en algunas formas de realización, es farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, un kit comprende también instrucciones para la administración de la composición (por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento del mismo) a un sujeto. En otra forma de realización, el kit comprende, además, las instrucciones de uso del kit.

En un aspecto, la invención hace referencia a un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención o diagnóstico de los trastornos asociados al complemento. En una forma de realización, la invención hace referencia a un artículo de fabricación que contiene: (a) un envase, (b) una etiqueta en el envase y (c) una composición de sustancias que contiene un anticuerpo o una variante del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de la presente invención, contenida en el envase, donde la etiqueta de dicho envase indica que la composición se puede utilizar para el tratamiento, prevención y diagnóstico de los trastornos asociados al complemento. En un aspecto, la invención permite usar un anticuerpo anti-factor D de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno), un ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención o una célula huésped de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, tal como un trastorno ocular asociado al complemento. En una forma de realización, el trastorno ocular asociado al complemento se selecciona entre la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD no exudativa (por ejemplo, la AMD intermedia seca o la atrofia geográfica (GA)) y la AMD exudativa (por ejemplo, la AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)), la retinopatía diabética (DR), la endoftalmitis y la uveítis. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD intermedia seca. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)).

En un aspecto, la invención permite usar un artículo de fabricación de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, como un trastorno ocular asociado al complemento. En una forma de realización, el trastorno ocular asociado al complemento se selecciona entre la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD no exudativa (por ejemplo, la AMD intermedia seca o la atrofia geográfica (GA)) y la AMD exudativa (por ejemplo, la AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)), la retinopatía diabética (DR), la endoftalmitis y la uveítis. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD intermedia seca. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)).

En un aspecto, la invención permite usar un kit de la invención en la preparación de un fármaco para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, como un trastorno ocular asociado al complemento. En una forma de realización, el trastorno ocular asociado al complemento se selecciona entre la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD no exudativa (por ejemplo, la AMD intermedia seca o la atrofia geográfica (GA)) y la AMD exudativa (por ejemplo, la AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)), la retinopatía diabética (DR), la endoftalmitis y la uveítis. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD intermedia seca. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)).

Breve descripción de las figuras Las Figuras 1-1 C muestran la alineación de secuencias de los dominios variables de las cadenas ligeras para los siguientes: clon Fab anti-factor D humanizado n.° 111 (¡dentificador de secuencia n.°: 1), Fab anti-factor D humanizados, 238, 238-1 , 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 y 238-11 (identificadores de secuencia n.° 6-17, respectivamente) y secuencia de consenso de VL kappa I (¡dentificador de secuencia n.°: 65). Las posiciones están numeradas según la numeración de Kabat y las regiones hipervanables (según las definiciones de HVR de Kabat y Chotia) aparecen en un recuadro (HVR: (1) HVR-L1 identificada como A1-A1 1 (ITSTDIDDDMN (¡dentificador de secuencia n.°: 30), ITSTDIDDDLN (¡dentificador de secuencia n.°: 31), ITSTDIDDDIN (¡dentificador de secuencia n.°: 32), ITSTDIDDDMA (¡dentificador de secuencia n.°: 33) o ITSTDIDDDMCi (¡dentificador de secuencia n.°: 34)), (2) HVR-L2 identificadas como B1-B7 (GGNTLRP (¡dentificador de secuencia n.°: 35), GGSTLRP (¡dentificador de secuencia n.°: 36) o GGATLRP (¡dentificador de secuencia n.°: 37)), (3) HVR-L3 identificadas como C1-C9 (LQSDSLPYT (¡dentificador de secuencia n.°: 38)). Los cambios en los aminoácidos de cada Fab anti-factor D humanizado se encuentran en letras negritas e itálicas.

Las Figuras 2- 2C muestra la alineación de secuencias de los dominios variables de las cadenas pesadas para los siguientes: clon Fab anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 (identificador de secuencia n.°: 2) y Fab anti-factor D humanizados, 238, 238-1 , 238-2, 238-3, 238-4, 238-5, 238-6, 238-7, 238-8, 238-9, 238-10 y 238-11 (identificadores de secuencia n.° 18-29, respectivamente) y la secuencia de consenso del subgrupo 7 de VH (identificador de secuencia n.°: 66). Las posiciones están numeradas según la numeración de Kabat y las regiones hipervariables (según las definiciones de HVR de Kabat y Chotia) aparecen en un recuadro (HVR: (1 ) HVR-H1 identificada como D1-D10 (GYTFTNYGMN (identificador de secuencia n.°: 39), (2) HVR-H2 identificada como E1-E19 (WINTYTGETTYADDFKG (identificador de secuencia n.°: 40), (3) HVR-H3 identificada como F1-F6 (EGGVNN (identificador de secuencia n.°: 41 ), EGGVAN (identificador de secuencia n.°: 42), EGGVQN (identificador de secuencia n.°: 43), EGGVNA (identificador de secuencia n.°: 44) o EGGVNQ (identificador de secuencia n.°: 45)). Los cambios en los aminoácidos de cada Fab anti-factor D humanizado se encuentran en letras negritas o en itálicas.

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos (identificador de secuencia n.°: 46) de la cadena ligera de un Fab anti-factor D humanizado 238. La secuencia de nucleótidos codifica la cadena ligera de Fab anti-factor D humanizado 238 con los codones de inicio y terminación se muestran en negrita y subrayados. El codón correspondiente al primer aminoácido de la Figura 4 (identificador de secuencia n.°: 47) se muestra en letras negritas e itálicas.

La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos (identificador de secuencia n.°: 47) de la cadena ligera del Fab anti-factor D humanizado 238. La secuencia de aminoácidos carece de la secuencia de señal de N terminal de los polipéptidos codificados por el identificador de secuencia n.°: 46 mostrado en la Figura 3. Las secuencias HVR están en letras negritas e itálicas. Las regiones variables son las regiones no subrayadas, mientras que el primer dominio constante CL1 sí está subrayado. Las regiones de andamio (FR) y las regiones HVR se muestran: FR1-LC (identificador de secuencia n.°: 48), FR2-LC (identificador de secuencia n.°: 49), FR3-LC (identificador de secuencia n.°: 50), FR4-LC (identificador de secuencia n.°: 51), HVR1-LC (identificador de secuencia n.°: 30 (ITSTDIDDDMN)), HVR2-LC (identificador de secuencia n.°: 35 (GGNTLRP)), HVR3-LC (identificador de secuencia n.°: 38 (LQSDSLPYT)) y CL1 (identificador de secuencia n.°: 52).

La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos (identificador de secuencia n.°: 53) de la cadena pesada de un Fab anti-factor D humanizado 238. La secuencia de nucleótidos codifica la cadena pesada del Fab anti-factor D humanizado 238 con los codones de inicio y terminación en negrita y subrayados. El codón correspondiente al primer aminoácido de la Figura 6 (identificador de secuencia n.°: 54) está en letras negritas e itálicas.

La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos (identificador de secuencia n.°: 54) de la cadena pesada del Fab anti-factor D humanizado 238. La secuencia de aminoácidos carece de la secuencia de señal de N terminal de los polipéptidos codificados por el identificador de secuencia n.°: 53 mostrada en la Figura 5. Las secuencias HVR están en letras negritas e itálicas. Las regiones variables son las regiones no subrayadas, mientras que el primer dominio constante CH1 sí está subrayado. Las regiones de andamio (FR) y las regiones HVR se muestran: FR1-HC (identificador de secuencia n.°: 55), FR2-HC (identificador de secuencia n.°: 56), FR3-HC (identificador de secuencia n.°: 57), FR4-HC (identificador de secuencia n.°: 58), HVR1-HC (identificador de secuencia n.°: 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2-HC (identificador de secuencia n.°: 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC (identificador de secuencia n.°: 41 (EGGVNN)) y CH1 (identificador de secuencia n.°: 59).

La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (identificador de secuencia n.°: 60) de la cadena ligera de un Fab anti-factor D humanizado 238-1. La secuencia de nucleótidos codifica la cadena ligera de Fab anti-factor D humanizado 238-1 con los codones de inicio y terminación se muestran en negrita y subrayados. El codón correspondiente al primer aminoácido de la Figura 8 (identificador de secuencia n°: 61) está en letras negritas e itálicas.

La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos (identificador de secuencia n.°: 61) de la cadena ligera del Fab anti-factor D humanizado 238-1. La secuencia de aminoácidos carece de la secuencia de señal de N terminal de los polipéptidos codificados por el identificador de secuencia n.°: 60 mostrada en la Figura 7. Las secuencias HVR están en letras negritas e itálicas. Las regiones variables son las regiones no subrayadas, mientras que el primer dominio constante CL1 sí está subrayado. Las regiones de andamio (FR) y las regiones HVR se muestran: FR1-LC (identificador de secuencia n.°: 48), FR2-LC. (identificador de secuencia n.°: 49), FR3-LC (identificador de secuencia n.°: 50), FR4-LC (identificador de secuencia n.°: 51), HVR1-LC (identificador de secuencia n.°: 30 (ITSTDIDDD N)), HVR2-LC (identificador de secuencia n.°: 35 (GGNTLRP)), HVR3-LC (identificador de secuencia n.°: 38 (LQSDSLPYT)) y CL1 (identificador de secuencia n.°: 52).

La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos (identificador de secuencia n.°: 62) de la cadena pesada de un Fab anti-factor D humanizado 238-1. La secuencia de nucleótidos codifica la cadena pesada de Fab anti-factor D humanizado 238-1 con los codones de inicio y terminación se muestran en negrita y subrayados. El codón correspondiente al primer aminoácido de la Figura 10 (identificador de secuencia n°: 63) está en letras negritas e itálicas.

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (identificador de secuencia n.°: 63) de la cadena pesada del Fab anti-factor D humanizado 238-1. La secuencia de aminoácidos caréce de la secuencia de señal de N terminal de los polipéptidos codificados por el identificador de secuencia n.°: 62 mostrada en la Figura 9. Las secuencias HVR están en letras negritas e itálicas. Las regiones variables son las regiones no subrayadas, mientras que el primer dominio constante CH1 sí está subrayado. Las regiones de andamio (FR) y las regiones HVR se muestran: FR1-HC (identificador de secuencia n.°: 64), FR2-HC (identificador de secuencia n.°: 56), FR3-HC (identificador de secuencia n.°: 57), FR4-HC (identificador de secuencia n.°: 58), HVR1-HC (identificador de secuencia n.°: 39 (GYTFTNYGMN)), HVR2-HC (identificador de secuencia n.°: 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC (identificador de secuencia n.°: 41 (EGGVNN)) y CH1 (identificador de secuencia n.°: 59).

La Figura 1 1 muestra los resultados del ensayo hemoiítico, y demuestran la inhibición de la actividad alternativa del complemento, para clon Fab anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 y los Fab anti-factor D humanizado 238 y 238-1. Se muestran los valores de IC50.

La Figura 12 muestra los resultados del ensayo hemoiítico, que demuestra la inhibición de la actividad de la vía alterna (AP) del complemento de Fab anti-factor D humanizado en tres concentraciones séricas (9,7 nm, 16,2 nM y 26,5 nM) del factor D. La Tabla 3 muestra los valores de IC50 (nM) e IC90 (nM) (los valores representan el promedio de tres experimentos repetidos), que corresponden a las tres concentraciones séricas del factor D. Las proporciones molares de los anticuerpos anticuerpo que tienen como objetivo el factor D también se muestran en la Tabla 3.

La Figura 13 muestra la duración simulada de la inhibición de la activación de la vía alterna (AP) del complemento eri un ojo humano, utilizando una única inyección intravítrea (IVT) de Fab anti-factor D 238 a una dosis de 2,5 mg (asumiendo una semivida (t,/2) del Fab anti-factor D 238 = 11 ,5 días con base en la escala ¡nterespecífica de conejo). Se estimó que una inyección IVT única de Fab anti-factor D 238 inhibió la activación AP del complemento en el tejido retiniano durante al menos 74 días y en humor vitreo durante al menos 97 días. En la Figura 13, la línea interrumpida demuestra la concentración simulada del Fab anti-factor D 238 en el humor vitreo después de la administración intravítrea. En la Figura 13, la línea sólida muestra la concentración simulada del Fab anti-factor D 238 en el tejido retiniano después de la administración intravítrea. La diferencia en la concentración en el humor vitreo y en el tejido retiniano se basa en un estimado del coeficiente de partición del tejido retiniano de 20 %, en otras palabras, 20 % del total del fármaco que se administra al humor vitreo tendrá acceso al tejido retiniano.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones Los términos utilizados en esta solicitud se interpretarán con el significado habitual y común para los expertos en la materia. No obstante, los solicitantes desean que los términos que se indican a continuación se entiendan según la definición que se proporciona.

La frase "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia' de polipéptidos de una cadena de anticuerpos se puede interpretar como una cadena de anticuerpos con una secuencia que presenta una homología de al menos el 70 %, o el 80 %, o el 90 % o el 95 % con respecto a la secuencia del polipéptido de referencia. El término "con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos" se puede interpretar como una secuencia de nucleótidos que presenta una homología de al menos el 85 % aproximadamente, o el 90 %, o el 95 % o el 97 %, con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de referencia. El término "identidad" u "homología" se entenderá como el porcentaje de los residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos al residuo de una secuencia correspondiente con la que se compara, tras alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, a fin de lograr el porcentaje máximo de identidad para la secuencia entera, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Se considerará que ni las extensiones ni las inserciones en los extremos N-terminal o C-terminal reducen la homología. Los procedimientos y programas informáticos para establecer dicha alineación son bien conocidos en el sector. La identidad de la secuencia puede medirse utilizando software de análisis de secuencias. El término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio y cubre, específicamente, anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los anticuerpos (Ab) y las inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un objetivo específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a lós anticuerpos que carecen de especificidad de un objetivo. Las inmunoglobulinas y los anticuerpos nativos son por lo general glicoproteínas heterotetraméricas con una masa atómica de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de diversos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en el otro.

Un anticuerpo "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En un ejemplo, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95 % de su peso tal como se determina por el método de Lowry, y más preferentemente, en más del 99 % de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o internos mediante un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando una tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. No obstante, en general el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva, por "anticuerpo anti-factor D humano" se entiende un anticuerpo que se une específicamente al factor D humano de manera que inhibe o reduce sustancialmente la activación del complemento.

El término "factor D" se utiliza en la presente memoria descriptiva para referirse a la secuéncia nativa y a los polipéptidos variables del factor D.

Un factor D de "secuencia nativa" es un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido de factor D obtenido de la naturaleza, sin importar el método de preparación. Por lo tanto, dicha secuencia nativa del factor D puede aislarse de la naturaleza o producirse por medios sintéticos y/o recombinantes. Además de una proteína madura del factor D, como una proteína madura del factor D humano (NM_001928), el término "factor D de secuencia nativa", abarca específicamente las formas precursoras del factor D que ocurren naturalmente (por ejemplo, un preproteína inactiva, que se separa proteolíticamente para producir la forma activa), las formas variantes que ocurren naturalmente (por ejemplo, las formas alternativas de ayuste) y las variantes alélicas del factor D que ocurren naturalmente, sí como las variantes estructurales de conformación de las moléculas del factor D que tienen la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido del factor D que ocurre naturalmente. Los polipéptidos del factor D de animales no humanos, que incluyen los primates mayores y a los mamíferos que no son humanos, se incluyen específicamente en esta definición.

La expresión "Variante del factor D" se refiere a un polipéptido activo del factor D, según se define más adelante, que tiene al peños un 80 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con una secuencia nativa de polipéptidos del factor D, tal como la secuencia nativa del polipéptido del factor D humano (NM_001928). Normalmente, una variante del factor D tiene al menos una identidad del 80 %, de al menos 85 %, de al menos 90 %, de al menos 95 % o de al menos 98% o de al menos 99 % de identidad de la secuencia dé aminoácidos con la secuencia de aminoácidos maduros de humano (NM_001928).

El "porcentaje (%) de identificación de la secuencia de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en un factor D de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identificación de la secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identificación de la secuencia. A efectos de determinar el porcentaje de homología de la secuencia de aminoácidos, la alineación se puede conseguir de varias formas que son conocidas en la materia; por ejemplo, usar software para computadoras disponible comercialmente como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en este campo pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se comparan. Entonces, se calcula la identidad de la secuencia en relación con la secuencia más larga, es decir, que aunque una secuencia más corta muestre una identidad de secuencia del 100 % con una porción de una secuencia más larga, la identidad total de la secuencia será menor que el 100 %. El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos" se define como el porcentaje de nucleótidos de una secuencia candidata que es idéntica a los nucleótidos respecto a la secuencia que codifica factor D, de interés, después de alinear las secuencias e introducir interrupciones, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología de la secuencia. A efectos de determinar el porcentaje de homología de la secuencia de ácidos nucleicos, la alineación se puede conseguir de varias formas que son conocidas en la materia; por ejemplo, usar software comercializado como BLAST, BLAST-2, ALIGN o egalign (DNASTAR). Los expertos en este campo pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se comparan. Entonces, se calcula la identidad de la secuencia en relación con la secuencia más larga, es decir, que aunque una secuencia más corta muestre una identidad de secuencia del 100 % con una porción de una secuencia más larga, la identidad total de la secuencia será menor que el 100 %.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de, al menos, una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislado es distinta de la forma o entorno en los que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el polipéptido codificado en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor D que se identifica y separa de, al menos, una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica factor D. Una molécula de ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido de factor D aislado es distinta de la que se encuentra en la naturaleza, tanto por su forma como entorno. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido del factor D aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica factor D incluye una molécula de ácido nucleico que codifica factor D contenida en células que habitualmente expresan el factor D, en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales.

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que sea capaz de neutralizar, bloquear, inhibir total o parcialmente, invalidar, reducir o interferir con la actividad biológica del factor D. Los antagonistas del factor D incluyen, sin limitación a los anticuerpos anti-factor D y a las variantes de los mismos, fragmentos de unión al antígeno, otras moléculas pequeñas de polipéptidos, péptidos y no péptidos de unión, que se unen al factor D y son capaces de neutralizar, bloquear, inhibir parcial o totalmente, invalidar, reducir o interferir las actividades del factor D, tales como la habilidad del factor D de participar en la patología de un trastorno ocular asociado al complemento.

Según su definición en la presente memoria descriptiva, una "molécula pequeña" tiene un peso molecular inferior a unos 600 daltons, de preferencia menor de 1000.

En el contexto de los antagonistas del factor D de la presente invención, "activa", "actividad" o "actividad biológica" es la habilidad de antagonizar (inhibir parcial o completamente) una actividad biológica del factor D. Un ejemplo de una actividad biológica de un antagonista del factor D es la capacidad de lograr una mejoría medible del estado, por ejemplo, la patología de alguna enfermedad o trastorno asociado con el factor D, por ejemplo, un trastorno ocular asociado al complemento. La actividad se puede determinar por pruebas in vitro o in vivo, que incluyen los ensayos de unión, los ensayos hemolíticos de la vía alterna (por ejemplo, los ensayos que determinan la inhibición de la actividad o de la activación de la vía alterna del complemento, usando un modelo animal pertinente o ensayos clínicos con humanos.

El término "trastorno asociado al complemento" se usa en el más amplio sentido e incluye los trastornos que asocian con una activación excesiva o descontrolada del complemento. Incluyen la activación del complemento durante intervenciones de bypass cardiopulmonar; activación del complemento debida a isquemia-reperfusión tras infarto agudo de miocardio, aneurisma, ictus, choque hemorrágico, lesión por aplastamiento, fallo multiorgánico, choque hipovolémico, isquemia intestinal u otros acontecimientos que causen isquemia. Asimismo, se ha demostrado que la activación del complemento está asociada a procesos inflamatorios como quemaduras graves, endotoxemia, choque septicémico, síndrome de distrés respiratorio del adulto, hemodiálisis, choque anafiláctico, asma grave, angioedema, enfermedad de Crohn, anemia drepanocítica, glomerulonefritis postestreptocócica y pancreatitis. El trastorno puede estar ocasionado por una reacción adversa a un fármaco, una alergia medicamentosa, síndrome de fuga vascular inducida por IL-2 o alergia a medios de contraste radiográfico. También incluye enfermedades autoinmunes como lupus éritematoso sistémico, miastenia gravis, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. La activación del complemento también está asociada a rechazo de trasplante. La activación del complemento también se asocia con las enfermedades oculares tales como la degeneración macular asociada a la edad, la retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas con la isquemia, neovascularización coroidea (CNV), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, oclusiones venosas retinianas, incluida oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea y neovascularización retiniana.

El término "trastorno ocular asociado al complemento" se usa en el más amplio sentido e incluye todas las afecciones oculares, cuya patología involucra al complemento, incluso la vía clásica y la alterna y en particular, la vía alterna del complemento. Entre los ejemplos de enfermedades oculares asociadas al complemento se incluyen sin limitación, las enfermedades maculares degenerativas, tales como todas las etapas de la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye las formas húmeda y seca (no exudativa y exudativa), neovascularización de la coroides (NVC), uveítis, retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas a la isquemia y otras enfermedades neovasculares intraoculares, tales como edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, oclusiones venosas retinianas, incluida oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea y neovascularización retiniana. En un ejemplo, las afecciones oculares asociadas al complemento incluyen la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD no exudativa (por ejemplo la AMD intermedia seca o la atrofia geográfica (GA)) y la AMD exudativa (por ejemplo, la AMD húmeda (neovascularización de la coroides (CNV)), la retinopatía diabética (DR), endoftalmitis y uveítis. En otro ejemplo, la AMD no exudativa puede incluir la presencia de drusen rígido o drusen blando, atrofia geográfica y/o pigmento agrumado. En un ejemplo, , las afecciones oculares asociadas al complemento incluyen la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD (por ejemplo incluye desde múltiples drusen pequeños hasta uno o más drusen medianos no extendidos AMD intermedia (por ejemplo, incluye drusen medianos extendidos a uno o más drusen grandes) y la AMD avanzada (por ejemplo, incluye la atrofia geográfica o la AMD húmeda avanzada (CNV). (Ferris y col., AREDS Report No. 18, ; Sallo y col., Eye Res., 34(3): 238-40 (2009); Jager y col., New Engl. J. Med., 359(1): 1735 (2008)). En otro ejemplo, la AMD intermedia seca puede incluir drusen grandes confluentes. En otro ejemplo, la atrofia geográfica puede incluir la pérdida de los fotorreceptores y/o del epitelio retiniano pigmentado (RPE). En otro ejemplo, el área de atrofia geográfica puede ser pequeña o grande y puede estar en el área macular o en la retina, periférica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD intermedia seca. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)).

El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de evitar el desarrollo o alteración de la patología de un trastorno. Por lo tanto, por "tratamiento" se entiende tanto el tratamiento terapéutico como las medidas profilácticas o preventivas. Entre los sujetos que necesitan tratamiento se incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. En el tratamiento de una enfermedad inmune relacionada, un agente terapéutico puede alterar directamente la magnitud de la respuesta de un componente de la respuesta inmune o volver la enfermedad más susceptible al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, quimioterapéuticos, etc.

La "patología" de una enfermedad, tal como un trastorno ocular asociado al complemento, incluye todos los acontecimientos que ponen en peligro la salud del paciente. En el caso del cáncer, incluyen crecimiento celular anómalo o incontrolable (neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos), producción de anticuerpos, producción de autoanticuerpos, producción de complemento, interferencia con el funcionamiento normal de células circundantes, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anómalos, supresión o empeoramiento de cualquier respuesta inflamatoria o inmunológica, infiltración de células inflamatorias (neutrófilos, eosinófilos, .monocitos y linfocitos) a los espacios celulares, etc.

Por "mamífero", según se usa en la presente memoria descriptiva, se entiende cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos sin limitación humanos, primates mayores, animales utilizados en actividades deportivas o en zoos, como caballos, cerdos, ganado, perros, gatos y hurones, etc. En una forma de realización de la invención, el mamífero es un humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

La "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad de un "antagonista del factor D" que se necesita para lograr una mejoría medible en el estado, por ejemplo, patología de la enfermedad o trastorno objetivo, como por ejemplo, -un trastorno ocular asociado al complemento.

Por "secuencias de control" se entienden las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora enlazada de forma funcional a un organismo anfitrión en particular. Las secuencias de control que son aptas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operadores y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "enlazado de forma funcional" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o un líder secretor está operativamente enlazado al ADN de un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia y un sitio de unión al ribosoma está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si está situado para facilitar la traducción. Por lo general, por "funcionalmente enlazado" se entiende que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se consigue mediante ligaduras en sitios de restricción apropiados. Si esos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de conformidad con la práctica habitual.

Cualquier experto en la materia puede determinar rápidamente las "condiciones restrictivas" de las reacciones de hibridación, tratándose por lo general de un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, para realizar correctamente una hibridación, las sondas más largas requieren temperaturas más altas, mientras que las más cortas las requieren inferiores. La hibridación depende habitualmente de la capacidad de rehibridación del ADN desnaturalizado ante la presencia de hebras complementarias en un entorno con temperatura inferior a su punto de fusión. Cuanto más elevado sea el grado deseado de homología entre la sonda y la secuencia susceptible de hibridación, más alta será la temperatura relativa que podrá emplearse. Como consecuencia, las temperaturas relativas más altas tenderían a perfilar unas condiciones de reacción más restrictivas, mientras que las más bajas desarrollarán unas condiciones menos restrictivas. Para conocer más detalles y una explicación sobre las condiciones restrictivas de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones restrictivas" o "condiciones altamente restrictivas", tal como se definen en la presente memoria descriptiva, pueden identificarse como aquéllas que: (1 ) emplean para el lavado una concentración iónica baja y temperaturas altas, por ejemplo, 0,015 M cloruro sódico/0,0015 M citrato sódico/dodecil sulfato sódico al 0,1 % a 50 °C; (2) durante la hibridación emplean un agente desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1 % /Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/50 mM de tampón de fosfato sódico con un pH 6,5 y 750 m de cloruro sódico, 75 mM de citrato sódico a 42 °C o (3) emplean formamida al 50 %, SSC 5 x (0,75 M NaCI, 0,075 M citrato sódico), 50 mM de fosfato sódico (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1 %, solución de Denhardt 5x , ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50 % a 55° C, seguido de un lavado en condiciones muy restrictivas consistente en SSC 0,1 x con EDTA a 55 °C. Las "condiciones moderadamente restrictivas" pueden identificarse tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y unas condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, concentración iónica y porcentaje de SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas sería la incubación durante toda la noche a 37 °C en una solución que contenga: 20 % de formamida, SSC 5 x (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato sódico (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros en SSC 1 x a una temperatura comprendida entre 37 y 50 °C aproximadamente. El experto en la materia sabrá cómo ajusfar la temperatura, la concentración iónica, etc, como sea necesario para integrar factores como la longitud de la sonda y otros similares. El término "variable", en el contexto del dominio variable de anticuerpos, se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo.a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su objetivo concreto. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones de determinación de complementariedad (CDR), también llamadas regiones hipervariables (HVR) de los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman la estructura (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cuatro regiones FR que, en su mayor parte, adoptan una configuración de hoja-ß, y están conectadas por tres CDR, que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-ß, y, en algunos casos, forman parte de ella. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de los anticuerpos a su diana (véase Kabat et al). Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la numeración de los residuos aminoacídicos de las inmunoglobulinas se realiza según el sistema de numeración de residuos aminoacídicos de inmunoglobulinas de Kabat y col., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987), a menos que se indique lo contrario.

En la presente memoria descriptiva, el término "región hipervariable", "HVR" o "HV" se refiere a las regiones del dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos contienen seis regiones hipervariables: tres en la VH (H1 , H2, H3) y tres en la VL (L1 , L2, L3). En la presente memoria descriptiva se usan y engloban diversas delineaciones de regiones hipervariables. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de las secuencias y son las más frecuentemente usadas (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El final del asa CDR-H1 de Chotia, cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat, varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del asa (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat ubica las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el asa termina en 32; si sólo está presente 35A, el asa termina en 33; si tanto 35A como 35B están presentes, el asa termina en 34). Las regiones hipervariables de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y las asas estructurales de Chothia y son las utilizadas en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. A continuación, se indican los residuos procedentes de cada una de estas regiones hipervariables.

Asa Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 H30-H35B (Numeración de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables ampliadas" como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (L1), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH.

Los residuos de dominio variable están numerados según Kabat y col., citado anteriormente, para cada una de estas definiciones .

Los residuos de una "región de andamio" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable o residuos CDR, tal como se define en la presente memoria descriptiva.

Los términos "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat", y las variaciones de los mismos, se refieren al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o ' los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que correspondan a un acortamiento de una FR o CDR del domino variable o una inserción en ellas. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después de un residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede ser determinada para un anticuerpo dado por una alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

El sistema de numeración de Kabat se utiliza, generalmente, cuando se trata de un residuo en el dominio variable (aproximadamente, residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), que se incorpora expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se utiliza generalmente para hacer referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU indicado en Kabat y col., citado anteriormente, la región bisagra del dominio constante de la cadena pesada es aproximadamente residuos 216-230 (numeración EU de la cadena pesada). Por "índice EU tal como se describe en Kabat" se entiende la numeración de residuos del anticuerpo humano anti-lgG1 EU. Salvo que se especifique lo contrario en la presente memoria descriptiva, las referencias a la numeración de los residuos en el dominio variable de los anticuerpos constituyen la numeración de los residuos según el sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria descriptiva, las referencias a los números de residuos en el dominio constante de los anticuerpos significan la numeración de residuos según el sistema de numeración EU (por ejemplo, véase la solicitud provisional de EE.UU. n.° 60/640.323, Figuras para numeración EU).

Según se utiliza en la presente memoria descriptiva, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de diez aminoácidos. En un ejemplo, el polipéptido es una proteína de mamífero, cuyos ejemplos incluyen el factor D y las variantes del factor D. En otro ejemplo, el polipéptido es un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de dicho anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) que se une al factor D, cuyos ejemplos incluyen los fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única y anticuerpos multiespecíficos que se forman a partir de los fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Una "variante" o "variante de la secuencia de aminoácidos" de un polipéptido inicial es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de aquella del polipéptido inicial. Generalmente, una variante poseerá por lo menos 80 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 90 % de identidad de secuencia, con mayor preferencia por lo menos 95 % de identidad de secuencia y más preferentemente por lo menos 98 % de identidad de secuencia con el polipéptido original. Se determina el porcentaje de identidad de secuencia, por ejemplo, por la versión de Fitch y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 1382-1386 (1983) del algoritmo descrito por Needleman y col., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970), después de alinear las secuencias para proporcionar el máximo de homología. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido se pueden preparar mediante la introducción de cambios adecuados de nucleótidos en la codificación del ADN del polipéptido o mediante la síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del polipéptido de interés y/o inserciones de dichos residuos y/o sustituciones de los mismos. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, siempre que éste tenga las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos postraducionales del polipéptido, como por ejemplo cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación. Los métodos para la generación de variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos se describen en la Patente de EE.UU. n.° n.° 5.534.615, expresamente incorporada én la presente memoria descriptiva a modo de referencia, por ejemplo.

Una "variante del anticuerpo" o "anticuerpo modificado" de un anticuerpo inicial es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de aquella del anticuerpo inicial, donde uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo inicial se han modificado.. Generalmente, una variante del anticuerpo poseerá por lo menos 80 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 90 % de identidad de secuencia, con mayor preferencia de al menos 95 % de identidad de secuencia y más preferentemente, por lo menos 98 % de identidad de secuencia con el anticuerpo original. Se determina el porcentaje de identidad de secuencia, por ejemplo, por la versión de Fitch y col., Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA, 80: 1382-1386 (1983) del algoritmo descrito por Needleman y col., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970), después de alinear las secuencias del anticuerpo inicial y de la variante candidata del anticuerpo para proporcionar el máximo de homología. La identidad o similitud respecto a la secuencia original se define en la presente memoria descriptiva como el porcentaje de residuos de aminoácidos de la secuencia de la variante candidata que son idénticos (por ejemplo, los mismos residuos) o similares (por ejemplo, los residuos de aminoácidos del mismo grupo basándose en las propiedades en común de la cadena lateral, ver más a bajo) con los residuos del anticuerpo original, después de alinear las secuencias e introducir interrupciones, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología de la secuencia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar mediante la introducción de cambios adecuados de nucleótidos en la codificación del ADN del anticuerpo o mediante la síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo de interés y/o inserciones de dichos residuos y/o sustituciones de los mismos. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, siempre que éste tenga las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo, como por ejemplo cambiar el número o la posición de los lugares de glicosilación. Los métodos para la generación de variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos se describen en la Patente de EE.UU. n.° n.° 5.534.615, expresamente incorporada en la presente memoria descriptiva a modo de referencia, por ejemplo.

Una variante "desamidada" de una molécula de polipéptido es un polipéptido en el que uno o más residuos de asparagina (N o Asn) del polipéptido original se han convertido en aspartato (D o Asp), es decir, la amida neutra de la cadena lateral se convierte en un residuo con características generales acídicas. Se puede evitar la desaminación ál convertir la asparagina (N o Asn) a glutamina (Q o Gln) o alanina (A o Ala) o serina (S o Ser) (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)).

Una variante "oxidada" de una molécula de polipéptido es un polipéptido en el que uno o más residuos de metionina (M o Met) o triptófano (W o Trp) del polipéptido original se han convertido en sulfonas o sulfóxidos mediante el sulfuro de metionina. Se puede evitar la oxidación al convertir la metionina (M o Met) en leucina (L o Leu) o isoleucina (I o He) (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)).

Una variante de "piroglutamato" de una molécula de polipéptido es un polipéptido en el que uno o más residuos de glutamina (Q o Gln) del polipéptido original se han convertido en piroglutamato, que ocurre cuando los residuos de glutamina, por ejemplo, los residuos de glutamina N terminal, espontáneamente se ciclizan formando el piroglutamato. La conversión de piroglutamato se puede evitar al convertir los residuos de glutamina (Q o Gln) en glutamato (E o Glu) (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol., 9: 1-140 (1996)). Por "fragmento de anticuerpo" se entiende una porción de un anticuerpo de longitud completa, por lo general la región variable o de unión a un objetivo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen los fragmentos Fab, Fab", F(ab')2 y Fv. Por "análogo o fragmento funcional" de un anticuerpo se entiende un compuesto con una actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un análogo o fragmento funcional de un anticuerpo anti:factor D humano es aquel que se puede unir al factor D de forma que impida o reduzca sustancialmente la activación del complemento. Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, por "fragmento funcional" con respecto a anticuerpos se entienden los fragmentos Fv, F(ab) y F(ab')2. Un fragmento "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de una diana y de unión a la misma. Esta región está compuesta por un di mero de un domino variable de la cadena pesada y otro de la cadena ligera en una estrecha asociación no covalente (dímero VH-Vl). En esta configuración, las tres regiones CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a una diana en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión al objetivo. Sin embargo, incluso un dominio de una única variable (o la mitad de un Fv que comprenda sólo tres CDR específicas para una diana) tiene la capacidad para reconocer su diana y unirse a ella. Los fragmentos "Fv de cadena única" o "sFv" de un anticuerpo comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, los cuales están presentes en una cadena única de polipéptidos. Por lo general, el polipéptido de Fv comprende también un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a la diana.

El fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab') se producen mediante escisión del puente disulfuro en las cisteínas bisagra del producto de la digestión con pepsina F(ab')2. Los expertos en la materia conocen emparejamientos químicos adicionales de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al anticuerpo).

En la presente memoria descriptiva, por "biblioteca" se entiende una pluralidad de secuencias de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, los polipéptidos de la invención) o los ácidos nucleicos que codifican a esas secuencias, siendo las secuencias diferentes en la combinación de las variantes de aminoácidos que son introducidas, en esas secuencias según los métodos de la invención.

Por "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se entiende un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto en posibles mutaciones de formación natural que pueden estar presentes en cantidades insignificantes. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un único sitio diana. Además, a diferencia de las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en la diana. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que pueden ser sintetizados mediante el cultivo de hibridoma, sin estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de que se ha obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como una indicación de que sea necesario producir el anticuerpo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para uso con la presente invención se pueden aislar a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando técnicas bien conocidas. Los anticuerpos monoclonales parentales que deben usarse de acuerdo con la presente invención pueden conseguirse por el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler y Milstein, Nature 256, 495 (1975), o mediante métodos recombinantes.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias.de anticuerpos que se unen a dianas) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en los que todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR correspondan a las de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las regiones FR sean las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de de una plantilla de inmunoglobulina humana elegida.

Los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" incluyen progenie. También se entiende que no es posible identificar con precisión toda la progenie en un contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Se incluye la progenie variante que tenga la misma función o propiedad biológica, detectadas en la célula transformada originalmente. Las "células huésped" utilizadas en la presente invención son, por lo general, huéspedes procariotas o eucariotas.

Por "vector" se entiende un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN que está funcionalmente unida a una secuencia adecuada de control capaz de producir la expresión del ADN en un huésped conveniente. Estas secuencias de control incluyen un promotor que produce la transcripción, una secuencia de operadores opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión adecuados al ribosoma del ARNm y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o, simplemente, una inserción genómica potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del huésped, o, en algunos casos, puede integrarse en el propio genoma. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" son a veces intercambiables, dado que el plásmido es la forma de vector que se usa con mayor frecuencia. Sin embargo, la invención está pensada para incluir otras formas de vectores que tienen una función equivalente y que ya se conocen o se conocerán, en la materia.

La palabra "marcador" utilizada en la presente memoria descriptiva se refiere a un compuesto o composición detectables que se conjuga directa o indirectamente con una molécula o proteína, por ejemplo, un anticuerpo. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de isótopos radioactivos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustratos que sea detectable.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a que se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Entre los ejemplos de fases sólidas englobadas en la presente memoria descriptiva se incluyen aquellas formadas parcial o completamente por cristal (por ejemplo, cristal poroso controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol de polivinilo y siliconas. En determinadas formas de realización, según el contexto, la fase sólida puede comprender el pocilio de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad).

La "presentación en fagos" es una técnica mediante la cual las variantes de polipéptidos se muestran como proteínas de fusión como mínimo a una parte de la proteína de revestimiento sobre la superficie del fago, por ejemplo, fago filamentoso, partículas. La utilidad de la presentación en fagos reside en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorias se pueden clasificar con rapidez y eficacia para hallar aquellas secuencias que se unen a un antígeno objetivo con afinidad elevada. La presentación de bibliotecas de péptidos y proteínas en fagos se ha utilizado en el estudio de millones de polipéptidos para detectar aquellos con propiedades de unión específicas. Los métodos de reproducción de imágenes en fagos polivalentes se han utilizado para mostrar péptidos pequeños aleatorios y proteínas pequeñas mediante fusión bien con el gen III o con el gen VIII del fago filamentoso. Wells y Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362, y la bibliografía incluida en este documento. En una presentación en fagos monovalentes, una biblioteca de proteínas o péptidos se fusiona con un gen III o una parte del mismo y se expresa a bajos niveles en presencia de la proteína de tipo natural del gen III, de modo que las partículas del fago muestran una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de afinidad son reducidos en relación con el fago polivalente, de modo que la selección se realiza en función de la afinidad intrínseca del ligando, y se utilizan vectores fagémidos, que simplifican las manipulaciones del ADN. Lowman y Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216.

Un "fagémido" es un vector plásmido que tiene un origen de replicación bacteriano, por ejemplo, Co1E1 , y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. Se puede usar el fagémido en cualquier bacteriófago conocido, incluido el bacteriófago filamentoso y el bacteriófago lambda. El plásmido también contiene generalmente un marcador elegible para resistencia a antibióticos. Los segmentos de ADN clonados en esos vectores pueden reproducirse como plásmidos. Cuando las células que alojan a estos vectores se suministran con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fagos, el modo de replicación del plásmido cambia a replicación por círculo rodante para generar copias de una hebra de ADN del plásmido y de las partículas que envuelven al fago. El fagémido puede formar partículas de fagos infecciosas o no infecciosas. Este término incluye a los fagémidos que contienen un gen de proteína de revestimiento del fago o un fragmento del mismo unido a un gen de polipéptido heterólogo como una fusión de genes en la que el polipéptido heterólogo se muestra sobre la superficie de la partícula del fago. Una "variante de la región Fe" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de otra región Fe en al menos una "modificación de aminoácidos", según se define en la presente memoria descriptiva. Preferentemente, la variante de la región Fe tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de secuencia nativa o la región Fe de un polipéptido progenitor, por ejemplo, aproximadamente entre una y diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente entré una y cinco sustituciones en una región Fe de secuencia nativa o la región Fe del polipéptido progenitor. La variante de la región Fe de la presente memoria descriptiva tendrá preferentemente al menos un 80 % de homología con relación a una región Fe de secuencia nativa y/o una región Fe de un polipéptido parental, y más preferentemente, al menos un 90 % de homología con las mismas, y más preferentemente aún, al menos un 95 % de homología con las mismas. Los ejemplos de las "regiones Fe humanas de secuencia nativa" se muestran en la Figura 23 del documento WO 00/42072 una región Fe de la lgG1 humana con secuencia nativa (alotipos A y no A); región Fe de la lgG2 humana con secuencia nativa; región Fe de la lgG3 humana con secuencia nativa; y región Fe de la lgG4 humana con secuencia nativa, así como las variantes de las mismas que se producen naturalmente. Las regiones Fe murinas de secuencia nativa se muestran en la Figura 22A del documento WO 00/42072.

De acuerdo con esta invención, la afinidad de unión al FcRn "alterada" es aquella que tiene una actividad de unión al FcRn mayor o menor que un polipéptido parental o un polipéptido que comprenda una región Fe de secuencia nativa. En un ejemplo, el anticuerpo con la afinidad de unión a FcRn alterada ha aumentado la unión a FcRn a pH 6,0 y/o disminuido la unión a FcRn a pH 7,0. La variante que "presenta mayor unión" a un FcR se une al menos a un FcR con mayor afinidad que el polipéptido parental. La variante que "presenta menor unión" a un FcR se une al menos a un FcR con peor afinidad que un polipéptido parental. La variante que se une a un FcR con "mejor afinidad" que un polipéptido parental, es aquella que se une a una FcR con una afinidad de unión sustancialmente mejor que el anticuerpo parental, cuando las cantidades de la variante del polipéptido y el polipéptido parental en el ensayo de unión son básicamente ¡guales. Por ejemplo, la variante del polipéptido con la afinidad mejorada de unión de FcR puede presentar una mejoría de 1 ,15 a 100 veces aproximadamente, por ejemplo, mejora de aproximadamente 1 ,2 a 50 veces la afinidad de unión de FcR al compararla con la del polipéptido parental, donde la afinidad de unión de FcR se determina.

Por "modificación aminoacídica" se entiende un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Entre las modificaciones ejemplares se incluye una sustitución, inserción y/o deleción aminoacídica. Un ejemplo de la modificación aminoacídica en la presente memoria descriptiva es una sustitución.

Una "modificación aminoacídica en" una posición especificada, por ejemplo, de la región Fe, hace referencia a la sustitución o deleción del residuo especificado, o la inserción de al menos un residuo aminoacídico adyacente al residuo especificado. Por inserción "adyacente" a un residuo especificado se entiende la inserción dentro de uno a dos residuos del mismo. La inserción puede estar en el extremo N-terminal o C-terminal del residuo especificado.

Por "sustitución aminoacídica" se entiende la sustitución de al menos un residuo aminoacídico existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada con otro residuo aminoacídico "de sustitución" diferente. El residuo o residuos de sustitución pueden ser "residuos aminoacídicos que se obtienen naturalmente" (es decir, codificados por el código genético) y se pueden seleccionar a partir del grupo integrado por: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutámico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lie); leucina (Leu); Usina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptófano (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). La sustitución con uno o más residuos aminoacídicos que no se producen naturalmente también está englobada en la definición de una sustitución de aminoácidos en la presente memoria descriptiva. Un "residuo de aminoácido que no se obtiene naturalmente" es un residuo que no es ninguno de los residuos de aminoácidos obtenidos naturalmente que se enumeraron anteriormente y que tiene capacidad de unir covalentemente residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptidos. Entre los ejemplos de residuos aminoacídicos que no se producen naturalmente se incluyen norleucina, ornitina, nórvalina, homoserina y otros análogos de residuos aminoacídicos, como los descritos en Ellman y col., Meth. Enzym, 202: 301-336 (1991). Para generar estos residuos aminoacídicos que no se producen naturalmente, se pueden utilizar los métodos de Noren y col., Science, 244: 182 (1989); y Ellman y col., mencionado anteríonvente. Cabe señalar brevemente que estos métodos suponen la activación química de un ARNt supresor con un residuo aminoacídico que no se produce naturalmente, seguida de transcripción y traducción in vitro del ARN.

Por "inserción de aminoácidos" se entiende la incorporación de al menos un aminoácido en una secuencia de aminoácidos predeterminada. Aunque la inserción consistirá habitualmente en la inserción de uno o dos residuos aminoacídicos, la presente solicitud prevé "inserciones peptídicas" más amplias, por ejemplo, inserción de unos tres a unos cinco o incluso hasta unos diez residuos aminoacídicos. El residuo o residuos insertados se pueden obtener de forma natural o de forma no natural como se expone en la presente memoria descriptiva.

Por "deleción de aminoácidos" se entiende la eliminación de al menos un residuo aminoacídico en una secuencia de aminoácidos predeterminada.

II. Descripción detallada La invención de la presente memoria descriptiva proporciona antagonistas del factor D, que incluyen anticuerpos anti-factor D y las variantes y fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) útiles en la prevención y tratamiento de trastornos asociados al complemento, que incluyen afecciones oculares (todas las afecciones y enfermedades oculares, cuya patología involucra al complemento, incluso las vía vía clásica y la vía alterna del complemento, en particular la vía alterna del complemento) como, por ejemplo, las enfermedades degenerativas de la mácula, como todas las etapas de la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye las formas seca y húmeda (no exudativa y exudativa), neovascularización coroidea (CNV), uveítis, retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas a la isquemia, endoftalmitis y otras enfermedades neovasculares infraoculares, como el edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea y neovascularización retiniana. Un grupo de trastornos oculares asociados al complemento incluye la degeneración macular asociada a la edad (AMD), que incluye la AMD no exudativa (por ejemplo la AMD intermedia seca o la atrofia geográfica (GA)) y la AMD exudativa (por ejemplo, la AMD húmeda (neovascularización de la coroides (CNV)), la retinopatía diabética (DR), endoftalmitis y uveítis. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD intermedia seca. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado al complemento es una AMD húmeda (neovascularización coroidea (CNV)).

La AMD es una degeneración de la mácula que se relaciona con la edad, que es la principal causa de disfunción visual en las personas mayores de 60 años de edad. Existen dos tipos de AMD, la AMD no exudativa (seca) y la AMD exudativa (húmeda o neovascular). La forma seca o no exudativa involucra cambios atrofíeos e hipertróficos en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) subyacente a la retina central (macula) así como depósitos (drusen) en el RPE. Los pacientes que tienen AMD no exudativa pueden progresar a la forma de AMD húmeda o exudativa, en la cual los vasos sanguíneos anormales, llamados membranas neovasculares coroideas (CNVM) se desarrollan debajo de la retina, gotea líquido y sangre y por último causa una cicatriz disciforme en la retina y por .debajo de la misma. La AMD no exudativa, que generalmente es un precursor de la AMD exudativa, es más común. La presentación de la AMD no exudativa varía: puede haber drusen rígido, drusen blando, atrofia geográfica RPE y pigmento, agrumado. Los componentes del complemento se depositan en el RPE en la etapa temprana de la AMD y son constituyentes principales de los drusen. 1. Anticuerpos anti-factor D humanizados La invención de la presente memoria descriptiva incluye la producción y el uso de anticuerpos anti-factor D humanizados y fragmentos de los mismos. Los métodos ejemplares para producir anticuerpos se describen con más detalle en las siguientes secciones.

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el campo. Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen generalmente como residuos "importados", que, por lo general, proceden de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores [Jones y col., Nature. 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature. 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science. 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo las CDR o las secuencias de las CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por lo tanto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos patente de EE.UU. n.° 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR, y posiblemente algunos de FR, se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán para realizar los anticuerpos humanizados, en algunos casos puede ser muy importante para disminuir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo humano anti-ratón), cuando se prevé dar un uso terapéutico humano al anticuerpo. La reducción o eliminación de una respuesta HAMA generalmente es un aspecto significativo del desarrollo clínico de agentes terapéuticos adecuados. Véase, por ejemplo, Khaxzaeli y col., J. Nati. Cáncer Inst. (1988), 80:937; Jaffers y col., Transplantation (1986), 41 :572; Shawler y col., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears y col., J. Biol. Response Mod. (1984), 3: 138; Miller y col., Blood (1983), 62:988; Hakimi y col., J. Immunol. (1991 ), 147:1352; Reichmann y col., Nature (1988), 332:323; Junghans y col., Cáncer Res. (1990), 50:1495. Como se describe en la presente memoria descriptiva, la invención proporciona anticuerpos que son humanizados, de forma que la respuesta HAMA se reduce o elimina. También se pueden obtener variantes de estos anticuerpos utilizando métodos habituales conocidos en la materia, algunos de los cuales se describen más adelante. Según el llamado método del "más apto", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se compara con toda la biblioteca de secuencias conocidas de dominios variables de humanos. La secuencia del dominio V humano que se encuentra más cercano al del roedor se identifica y la región de estructura humana (FR) dentro de éste se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol. 151 :2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol.. 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región estructural concreta derivada de la secuencia consensual de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. Esta misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol. 151 :2623 (1993)).

Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo que se describe en la presente memoria descriptiva puede servir como secuencia de inicio (parental) para la diversificación de la secuencia o secuencias de estructura y/o hipervariables. Una secuencia de la estructura seleccionada a la que la secuencia hipervariable de inicio está enlazada se denomina estructura humana del aceptor en la presente memoria descriptiva. Aunque las estructuras humanas de aceptor pueden proceder o derivarse de una inmunoglobulina humana (las regiones VL y/o VH de la misma), proceden o se derivan de una secuencia de la estructura de consenso humana, dado que estas estructuras han demostrado tener una inmunogenicidad mínima o carecer de ella en pacientes humanos. A efectos de la presente memoria descriptiva, una "estructura humana del aceptor" es una estructura que comprende la secuencia aminoacídica de una estructura de VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulinas humanas, o de una estructura de consenso humana. Una estructura humana del aceptor "derivada de" una estructura de inmunoglobulinas humanas o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de éstas o puede contener cambios preexistentes en la secuencia de aminoácidos. En el caso de que estén presentes cambios en la secuencia de aminoácidos, habrá preferente un máximo de 5 y, preferentemente, 4 ó menos, ó 3 ó menos cambios preexistentes de aminoácidos. En una forma de realización, la estructura humana de VH del aceptor tiene una secuencia idéntica a la de la estructura de VH de la inmunoglobulina humana o a de la estructura de consenso humana. En una forma de realización, la estructura humana de VL del aceptor tiene una secuencia idéntica a la de la estructura de VL de la inmunoglobulina humana o a de la estructura de consenso humana. Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa el residuo de aminoácidos más frecuente en una selección de secuencias de estructura de VL o VH de inmunoglobulina humana. Por lo general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza en un subgrupo de secuencias de dominio variable. El subgrupo de secuencias suele ser un subgrupo como en Kabat y col. En una forma de realización, para VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I como en Kabat y col. En una forma de realización, para VH, el subgrupo es un subgrupo III como en Kabat y col.

Cuando el aceptor se deriva de una inmunoglobulina humana, se puede seleccionar opcionalmente una secuencia de estructura humana que se selecciona en función de su homología con la secuencia de estructura del donante, alineando la secuencia de estructura del donante con varias secuencias de estructura humanas en una colección de secuencias de, estructura humanas, y seleccionando como aceptor la secuencia de estructura que presente más homología. La estructura de andamio del receptor humano puede provenir de o ser un derivado de las secuencias de la línea germinal del anticuerpo humano, disponibles en las bases de datos públicas.

En una forma de realización, las estructuras de consenso humanas de la presente memoria descriptiva proceden o se derivan de secuencias de estructuras de consenso kappa de VL del subgrupo I y/o de VH del subgrupo VII.

En una forma de realización, la plantilla de la estructura que se utilizó para producir un anticuerpo anti-factor D puede comprender secuencias de la estructura de una plantilla que contiene una combinación de Vl-4.1 b+ (familia de VH7) y JH4d para la cadena VH y/o una combinación de DPK4 (familia de VKI) y JK2 para la cadena VL.

En una forma de realización, la estructura humana de VH del aceptor puede comprender una, dos, tres o todas las secuencias de estructura siguientes: FR1 que comprende QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS (aminoácidos 1-25 del identificador de secuencia n.°: 2), FR2 que comprende WVRQAPGQGLE (aminoácidos 36-49 del identificador de secuencia n.°: 2), FR3 que comprende RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCER (aminoácidos 67-98 del identificador de secuencia n.°: 2), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE (aminoácidos 67-97 del identificador de secuencia n.°: 2), RFVFS LDTSVSTAYLQ I S S LKAE DTAVYYC (aminoácidos 67-96 del identificador de secuencia n.°: 2), RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS (identificador de secuencia n.°: 3) o RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR (identificador de secuencia n.°: 4) FR4 que comprende WGQGTLVTVSS (aminoácidos 105-1 15 del identificador de secuencia n.°: 2).

En una forma de realización, la estructura humana de VL del aceptor puede comprender una, dos, tres o todas las secuencias de estructura siguientes: FR1 que comprende DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC (aminoácidos 1-23 del identificador de secuencia n.°: 1), FR2 que comprende WYQQKPGKVPKLLIS (aminoácidos 35-49 del identificador de secuencia n.°: 1), FR3 que comprende GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (aminoácidos 57-88 del identificador de secuencia n.°: 1), FR4 que comprende FGQGTKLEIK (aminoácidos 98-107 del identificador de secuencia n.°: 1) o FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 5).

Aunque el aceptor puede tener una secuencia idéntica a la secuencia de la estructura humana seleccionada, proceda de una inmunoglobulina humana o de una estructura de consenso humana, la presente invención contempla que la secuencia del aceptor pueda comprender sustituciones de aminoácidos preexistentes con respecto a la secuencia de inmunoglobulina humana o la secuencia de la estructura de consenso humana. Estas sustituciones preexistentes son preferentemente mínimas; por lo general, sólo cuatro, tres, dos o una diferencias aminoacidicas con respecto a la secuencia de la inmunoglobulina humana o a la secuencia de la estructura de consenso.

Los residuos de la región hipervariable del anticuerpo no humano se incorporan en las estructuras humanas de VL y/o VH del aceptor. Por ejemplo, se pueden incorporar residuos que corresponden a los residuos de la CDR según Kabat, los residuos de un bucle hipervariable de Chothia, los residuos de un Abm y/o los residuos de contacto. Opcionalmente, se incorporan los residuos extendidos de la región hipervariable que siguen a continuación: 24-36 ó 24-34 (L1), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un identificador de secuencia n.°: 2. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende un identificador de secuencia n.°: 1. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende un identificador de secuencia n.°: 2 y el dominio variable de la cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 1. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identificación de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 2. En ciertas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones, inserciones o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia; sin embargo, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unirse al factor D. En algunas formas de realización un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado de una secuencia del identificador de secuencia n.°: 2. En ciertas formas de realización, las sustituciones, ¾ inserciones o eliminaciones se producen en regiones externas a las HVR (es decir, en las FR). En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-factor D comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 2. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En ciertas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 1. En ciertas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones, inserciones o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia; sin embargo, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unirse al factor D. En algunas formas de realización un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado de una secuencia del identificador de secuencia n.°: 1. En ciertas formas de realización, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones externas a las HVR (es decir, en las FR). En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-factor D comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 1. n un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Un anticuerpo anti-factor D puede comprender cualquier secuencia de dominio variable de la estructura d andamio adecuada, siempre que el anticuerpo conserve la capacidad de unirse al factor D. Por ejemplo, en algunas formas de realización, los anticuerpos antifactor D de la invención comprenden una secuencia de dominio variable de la estructura de andamio de la cadena pesada que es una combinación de VI.4. Í b+ y JH4d (vea la Figura 3). En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden una secuencia de consenso de la estructura de la cadena pesada del subgrupo VII humano. En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-factor D de la invención comprende un dominio variable de la estructura de andamio de la cadena pesada, que comprende FR1 que incluyen los aminoácidos 1-25 del identificador de secuencia n.°: 2, FR2 que comprende los aminoácidos 36-49 del identificador de secuencia n.°: 2, FR3 que comprende los aminoácidos 67-98 del identificador de secuencia n.°: 2 y FR4 que comprende los aminoácidos 105-115 de identificador de secuencia n.°: 2. En una forma de realización de estos anticuerpos, la secuencia de consenso de la estructura de la cadena pesada involucra sustituciones en la posición 40 y/o 88 (numeración de Kabat). En una forma de realización de estos anticuerpos, la posición 40 corresponde a cisteína (C) o alanina (A) y/o la posición 88 corresponde a cisteína (C) o alanina (A) . En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio variable de la estructura de andamio de la cadena ligera que es una combinación de DPK4 y JK2 (véase la Figura 4). En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden una secuencia de consenso de la estructura de andamio de la cadena ligera kappa I (??) humana. En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio variable de la estructura de andamio de la cadena ligera, que comprende FR1 que comprende los aminoácidos 1-23 del identificador de secuencia n.°: 1 , FR2 que comprende los aminoácidos 35-49 de identificador de secuencia n.°: 1 , FR3 comprende los aminoácidos 57-88 de identificador de secuencia n.°: 1 y FR4 que comprende los aminoácidos 98-107 de identificador de secuencia n.°: 1. En una forma de realización de estos anticuerpos, la secuencia de I estructura de andamio variable de la cadena ligera comprende una o más sustituciones en las posiciones 15, 43 y/o 104 (numeración de Kabat). En una forma de realización de estos anticuerpos, la posición 15 corresponde a cisteína (C) o valina (V), la posición 43 corresponde a cisteína (C) o alanina (A) y la posición 104 corresponde a valina (V) o leucina (L) . En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Un anticuerpo anti-factor D puede comprender cualquier secuencia de dominio constante de la estructura adecuada, siempre que el anticuerpo conserve la capacidad de unirse al factor D. Por ejemplo, en algunas formas de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden al menos una porción del dominio constante de la cadena pesada. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de la cadena pesada de cualquiera o una combinación de una cadena pesada a, d, e, ? o µ. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas se pueden asignar a distintas clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas llamadas a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las clases ? y a se dividen además en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y función del CH; por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de la cadena pesada que comprende sustituciones en las posiciones aminoacídicas que resultan del efecto deseado en una función efectora (por ejemplo, afinidad de unión). En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de la cadena pesada que comprende sustituciones en las posiciones aminoacídicas que no dan como resultado una función efectora (por ejemplo, afinidad de unión). En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de cadena pesada de tipo IgG (por ejemplo, IgGI , lgG2, lgG3 o lgG4) y comprende además una sustitución en la posición 114 (según la numeración de Kabat; equivalente a la 1 18 de la numeración EU), 168 (según la numeración de Kabat; equivalente a la 172 de la numeración EU), 172 (según la numeración de Kabat; equivalente a la 176 de la numeración EU) y/o 228 (según la numeración EU). En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de cadena pesada de tipo IgG (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4) y comprende además una sustitución en la posición 1 14 donde la posición 1 14 es cisteína (C) o alanina (A), la posición 168 es cisteína (C) o alanina (A), la posición 172 es cisteína (C) o alanina (A) y la posición 228 es prolina (P), arginina (R) o serina (S). En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Además, por ejemplo, en algunas formas de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden al menos una porción del dominio constante de la cadena ligera. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de cadena ligera de cualquiera o de una combinación de la cadena ligera kappa o lambda, como la cadena ligera de cualquier vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de la cadena ligera que comprende sustituciones en las posiciones aminoacídicas que resultan del efecto deseado en una función efectora (por ejemplo, afinidad de unión). En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de la cadena ligera que comprende sustituciones en las posiciones aminoacídicas que no dan como resultado una función efectora (por ejemplo, afinidad de unión). En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de cadena ligera de tipo kappa y comprende además una sustitución en las posiciones 110, 144, 146 y/o 168 (según la numeración de Kabat). En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D de la invención comprenden un dominio constante de cadena ligera de tipo kappa y comprende además una sustitución en la posición 1 10, donde 110 es cisteína (C) o valina (V), en la posición 144 donde 144 es cisteína (C) o alanina (A), en la posición 146 donde 146 es isoleucina (I) o valina (V) y/o en la posición 168 donde 168 es cisteína (C) o serina (S). En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno). 2. Anticuerpos anti-factor D modificados La invención de la presente memoria descriptiva incluye la producción y el uso de anticuerpos anti-factor D modificados, por ejemplo, anticuerpos anti-factor D humanizados modificados y las variantes y fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a los antígenos). Los métodos ejemplares para producir anticuerpos modificados se describen con más detalle en las siguientes secciones.

Un anticuerpo anti-factor D parental, que incluye un anticuerpo anti-factor D humanizado, se puede modificar para producir anticuerpos anti-factor D modificados y las variantes de los mismos. En una forma de realización, los anticuerpos anti-factor D modificados y sus variantes pueden tener propiedades físicas, químicas, biológicas o de homogeneidad mejoradas respecto al anticuerpo original. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, un anticuerpo de esta invención comprende una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en una o más regiones hipervariables del anticuerpo original. De manera alternativa o adicional una o más de las alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de los residuos de la región de andamio se pueden introducir al anticuerpo parental. Los ejemplos de los residuos de la región de andamio para modificación incluyen aquellos que se unen al antígeno de una forma no covalente y directa (Amit y col., (1986) Science, 233: 747-753); interactúan con/efectúan la conformación de una CDR (Chothia y col. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917) y/o participan en l interfaz de VL-VH (EP 239 400B1). En cierta forma de realización, la modificación de uno o más residuos de la región de andamio da como resultado una mejoría en la afinidad de unión de un anticuerpo con un antígeno. Por ejemplo, de uno a aproximadamente 5 residuos de la estructura se pueden alterar en esta forma de realización de la invención. Los ejemplos de los residuos de la región de andamio o de HVR a modificar incluyen los sitios, donde las modificaciones en dichos sitios dan como resultado la degeneración de las variantes desamidadas (por ejemplo, residuos de asparagina (N o Asn) modificados a aspartato (D o Asp), variantes por oxidación (por ejemplo, residuos de metionina (M o Met) y/o de triptófano (W o Trp) modificados a sulfonas o sulfóxidos) o variantes de piroglutamato (por ejemplo, residuos de glutamina (Q o Gln) modificados a piroglutamato). Los ejemplos de los residuos de la región de andamio y de la región HVR a modificar incluyen los posibles sitios de desamidación (por ejemplo, asparagina (N o Asn)), los sitios de oxidación (es decir, metionina (M o Met) o triptófano (W o Trp)) o los sitios de conversión de piroglutamato (es decir, glutamina (Q o GIn)), donde la modificación en dichos sitios previene la desamidación y/o la oxidación y/o la conversión de piroglutamato, respectivamente. Para evitar la formación de variantes desamidadas, se pueden mutar variantes de asparagina (N o Asn) a alanina (A o Ala), glutamina (Q o GIn) o serina (S o Ser). Para evitar la formación de variantes oxidadas, se debe mutar metionina (Met) o triptófano (W o Trp) a leucina (L) o isoleucina (I). Para evitar la formación de variantes de piroglutamato, se puede mutar glutamina (Q o GIn) a glutamato (E o Glu). (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)). De manera alternativa o adicional una o más de las alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de los residuos de la región de andamio se pueden introducir a la región Fe del anticuerpo parental. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, un anticuerpo de esta invención comprende una región Fe -variante de tal manera que la semivida del anticuerpo in vivo se aumenta o se reduce respecto a la del anticuerpo original o del anticuerpo que comprende una región Fe de secuencia nativa. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una región Fe variante que aumenta o reduce la afinidad de unión del receptor Fe neonatal (FcRn) al anticuerpo (consulte el documento WO2000042072, incorporado en su totalidad a manera de referencia). Por ejemplo, dicho anticuerpo puede comprender una modificación de aminoácidos en una o más de las posiciones aminoacídicas 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 31 1 , 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 ó 447 de la región Fe, donde la numeración de los residuos en la región Fe corresponde a la del índice EU tal como se describe en Kabat. Las variantes de los polipéptidos con menor capacidad de unión a un FcRn puede comprender una modificación de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 ó 447 de la región Fe, donde la numeración de los residuos en la región Fe sigue el índice EU como en la numeración de Kabat. Las variantes de polipéptidos mencionadas anteriormente pueden presentar, alternativamente, un aumento de la afinidad dé unión a FcRn y pueden comprender una modificación de aminoácidos en una o más de las posiciones aminoacídicas 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311 , 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ó 434 de la región Fe, donde la numeración de los residuos en la región Fe sigue el índice EU como en la numeración de Kabat. Por ejemplo, el anticuerpo comprende una región Fe variante que se une con una semivida aumentada in vivo respecto a la del anticuerpo parental o del anticuerpo que comprende una región Fe de secuencia nativa. Por ejemplo, el anticuerpo comprende una región Fe variante que se une con una afinidad por FcRn aumentada in vivo respecto a la del anticuerpo parental o del anticuerpo que comprende una región Fe de secuencia nativa. La afinidad de unión de FcRn se puede medir como sigue: La unión de los anticuerpos de esta invención contra FcRn humana se puede estudiar por resonancia del plasmón superficial usando, por ejemplo un instrumento BiaCore 3000. La FcRn humana se acopla a un chip sensor usando un kit de acoplamiento de aminas. Por ejemplo, un chip sensor CM5 se puede activar con EDC/NHS durante 7 minutos a 5µ?/????. Se puede inyectar 100µg/ml de FcRn humana durante 30 segundos a 2 minutos a una tasa de flujo de ? ?µ?/min sobre el chip activado para obtener una unidad final de respuesta de unión (RU) de 100 a 200. Después de la conjugación, el chip con la FcRn acoplada se puede bloquear con una inyección de 35µ? de hidrocloruro de etanolamina 1 M a 5µ?/p???. Se puede determinar la unión de los anticuerpos de la invención a la FcRn humana a pH 6,0 o pH 7,4. La solución tampón para el experimento de unión es PBS pH 6,0 o pH 7,4 que contiene 0,01 % P20 y 0,02 % de azida de sodio. Los anticuerpos de esta invención se pueden intercambiar con tampón a pH 6,0 o pH 7,4. En una forma de realización, los experimentos se realizaron a 25°C. Para el análisis a pH 6,0 se hacen fluir los anticuerpos que tienen concentraciones que oscilan entre 4µ? y 0,7 nM, sobre un chip recubierto con FcRn a 30µ?/?tp? durante 4 minutos y luego se permite que se disocien del chip durante 5 minutos. Para el análisis a pH pH 7,4 se inyectan los anticuerpos que tienen concentraciones que oscilan entre 12µ? y 100n sobre un chip recubierto con FcRn a 20µ?/???? durante 1.5 min. y luego se liberan durante 2 minutos. Los anticuerpos también se hacen fluir sobre un punto no conjugado del chip sensor para permitir la sustracción de la unión ¡nespecífica de fondo al chip acoplado con FcRn. El chip se puede regenerar con un pulso de 30 segundos de TRIS al 0,1 M con pH 8,3 entre inyecciones. La RU estable de cada inyección se puede registrar al final de cada fase de inyección y luego se calculan las constantes de disociación (KD) por gráficas de la RU estable contra la concentración de la inyección.

Un procedimiento útil para producir dichos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) modificados o sus variantes, se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" (Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085). En este caso, uno o más residuos de. la región hipervariable se reemplazan por residuos de alanina o polialanina para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estos residuos de regiones hipervariables que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se retinan introduciendo otras mutaciones en los sitios de sustitución. Por tanto, a pesar de que el sitio donde se introducirá una variación de una secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se tenga un carácter predeterminado. Los mutantes ala que se producen de esta manera se clasifican por su. actividad biológica (es decir, por su afinidad de unión o por en ensayo de hemolisis) según se describe en la presente memoria descriptiva.

Normalmente se empezaría con las sustituciones conservadoras, como las que se muestran bajo el título "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión), entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la siguiente Tabla, o, como se describe a continuación en relación con las clases de aminoácidos, y se pueden monitorizar los productos. Las sustituciones preferidas se muestran en la siguiente Tabla.

Tabla 1 : Sustituciones preferentes Residuo Substituciones Substituciones original ejemplares preferentes Ala (A) val, leu, ile val Arg (R) lys, gln, asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) Glu glu · Cys (C) ser ser Gln (Q) Asn asn Glu (E) Asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn, gln, lys, arg arg lie (1) leu; val; met; ala; phe; leu norleucina Leu (L) norleucina; ¡le; val; met; ala; ile phe Lys (K) arg, gln, asn arg Met (M) leu, phe, ¡le leu Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) Thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr, phe tyr Tyr (Y) trp, phe, thr, ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; leu norleucina Las modificaciones aún más sustanciales en las propiedades biológicas de los anticuerpos o los fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la columna vertebral del poiipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c) el residuo de la cadena lateral. Los residuos que aparecen naturalmente se dividen en grupos basándose en sus propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutrales: cys, ser, thr, asn, gln; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

En otra forma de realización, los sitios seleccionados para la modificación se modifican y las modificaciones con afinidad de unión mejorada se seleccionan por representación de fagos.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican mutantes de secuencias de aminoácidos o secuencias de aminoácidos modificadas se preparan mediante varios métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, entre otros, preparación mediante mutagénesis con mediación" oligonucleótida (o dirigida al sitio), mutagénesis mediante PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo parental. Un método para producir mutantes, variantes o para modifica las secuencias de aminoácidos es la mutagénesis orientada al sitio (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488).

En ciertas formas de realización, el anticuerpo modificado únicamente tendrá un residuo de la región hipervariable sustituido. En otras formas de realización, se habrán sustituido dos o más residuos de la región hipervariable del anticuerpo parental, por ejemplo, aproximadamente de dos a 10 sustituciones de regiones hipervariables. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Generalmente, el anticuerpo modificado tendrá una secuencia de aminoácidos con al menos 75 % de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos definida anteriormente en la sección de Definiciones) con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo parental, más preferentemente, al menos 80, más preferentemente, al menos 85 %, más preferentemente, al menos 90, y aún más preferente, al menos 95 %. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Después de la producción del anticuerpo modificado o de un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno), se determina la actividad biológica de esa molécula respecto al anticuerpo parental o al fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno). Según se indicó anteriormente, esto puede involucrar la determinación de la afinidad de unión y/o de otras actividades biológicas de la variante del anticuerpo o del fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno). En una forma de realización de la invención se prepara un panel de anticuerpos modificados o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) y clasifican por su afinidad de unión al antígeno, tal como el factor D o un fragmento del mismo. Uno o más mutantes del anticuerpo, anticuerpos modificados o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) seleccionados de la clasificación inicial se someten opcionalmente a uno o más ensayos adicionales de actividad biológica para confirmar que las variantes o fragmentos del anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) son en efecto útiles, por ejemplo, para estudios preclínicos.

Los anticuerpos anti-factor D modificados o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente memoria descriptiva pueden someterse a modificaciones adicionales, con frecuencia dependiendo del uso previsto del anticuerpo modificado o del fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno). Dichas modificaciones pueden involucrar alteraciones adicionales de la secuencia de aminoácidos, fusión a polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes, tales como las que se explican a continuación. Con respecto a las alteraciones de las secuencias de aminoácidos, se elaboran las modificaciones ejemplares anteriores. Por ejemplo, cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación adecuada del anticuerpo modificado también se puede sustituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar interuniones atípicas. A la inversa, la(s) unión(es) de cisteína se pueden agregar al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como por ejemplo un fragmento Fv). Otro tipo de mutante aminoacídica altera el patrón de glicosilación. Se puede lograr al eliminar uno o más residuos de carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo, y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión a los antígenos) es generalmente por enlace tipo N o tipo O. Por enlace tipo N se entiende el anclaje del residuo de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de asparagina Las secuencias de los tripéptidos asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para las uniones enzimáticas del residuo de carbohidratos a la cadena lateral de asparagina Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación por enlace O se refiere a la anexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, a pesar de que también se puede utilizar 5-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra cómodamente al alterar la secuencia del aminoácido para que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos por enlace tipo N). La alteración también se puede realizar además mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos por enlace tipo O).

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado, de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo anti-factor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental donde por lo menos una posición (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud es sustituido con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V.

En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho anticuerpo anti-factor D (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde la variante del anticuerpo anti-factor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde al menos una posición (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E, (b) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (c) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde la variante del anticuerpo anti-factor D modificado comprende ia secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde al menos una posición (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo antifactor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo antifactor D parental de la solicitud, donde al menos dos posiciones (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V.

En uña forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo antifactor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo antifactor D parental de la solicitud, donde al menos dos posiciones (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes. (a) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E, (b) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (c) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo antifactor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo antifactor D parental de la solicitud, donde al menos dos posiciones (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo antifactor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo antifactor D parental de la solicitud, donde al menos tres posiciones (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo antifactor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde al menos tres posiciones (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E, (b) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (c) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud, donde el anticuerpo anti-factor D modificado comprende la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo antifactor D parental de la solicitud, donde al menos tres posiciones (según la numeración de Kabat) de la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo anti-factor D parental de la solicitud se sustituye con uno o más de los siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, . (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende HVR de cadena ligera de un anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo anti-factor D comprende, además una sustitución en una o más posiciones de dicho anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo de referencia comprende HVR-1 de cadena ligera, que contiene ITSTDIDDDMN (identificador de secuencia n.°: 30), cadena ligera HVR-2 que comprende GGNTLRP (identificador de secuencia n.°: 35) y cadena ligera HVR-3 que comprende LQSDSLPYT (identificador de secuencia n.°: 38) donde dicha sustitución es una o más de las siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende HVR de cadena pesada de un anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo anti-factor D comprende además una sustitución en una o más posiciones de dicho anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo de referencia comprende una HVR-1 de cadena pesada que contiene GYTFTNYGMN (identificador de secuencia n.°: 39), cadena pesada HVR-2 que comprende WINTYTGETTYADDFKG (identificador de secuencia n.°: 40) y de la cadena pesada HVR-3 que comprende EGGVNN (identificador de secuencia n.°: 41) donde dicha sustitución es una o más de las siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende HVR de cadena ligera y de cadena pesada de un anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo anti-factor D comprende además una sustitución en una o más posiciones de dicho anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo de referencia comprende una HVR-1 de cadena ligera que contiene ITSTDIDDDMN (identificador de secuencia n.°: 30), cadena ligera HVR-2 que comprende GGNTLRP (identificador de secuencia n.°: 35) y cadena ligera HVR-3 que comprende LQSDSLPYT (identificador de secuencia n.°: 38) y de la cadena pesada HVR-1 que comprende GYTFTNYGMN (identificador de secuencia n.°: 39), cadena pesada HVR-2 que comprende WINTYTGETTYADDFKG (identificador de secuencia n.°: 40) y de la cadena pesada HVR-3 que comprende EGGVNN (identificador de secuencia n.°: 41) donde dicha sustitución es una o más de las siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, o (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende: (a) al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas entre: (i) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 39; (ii) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 40; (¡ii) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 41 , identificador de secuencia n.°: 42, identificador de secuencia n.°: 43, identificador de secuencia n.°: 44 y el identificador de secuencia n.°: 45; (iv) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°; 30, identificador de secuencia n.°: 31 , identificador de secuencia n.°: 32, identificador de secuencia n.°: 33 y el identificador de secuencia n.°: 34; (v) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 35, identificador de secuencia n.°: 36 y el identificador de secuencia n.°: 37; y (vi) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 38, o (b) al menos una variante de la HVR, donde la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia n.°: 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37 0 38.

En ciertas formas de realización, una HVR que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones, inserciones o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia; sin embargo, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unirse al factor D. En algunas formas de realización un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado de una secuencia seleccionada del grupo del identificador de secuencia n.°: 39, identificador de secuencia n.°: 40, identificador de secuencia n.°: 41 , identificador de secuencia n.°: 42, identificador de secuencia n.°: 43, identificador de secuencia n.°: 44, identificador de secuencia n.°: 45, identificador de secuencia n.°: 30, identificador de secuencia n.°: 31, identificador de secuencia n.°: 32, identificador de secuencia n.°: 33, identificador de secuencia n.°: 34, identificador de secuencia n.°: 35, identificador de secuencia n.°: 36, identificador de secuencia n.°: 37 y el identificador de secuencia n.°: 38.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende: (a) al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas entre: (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 39; (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 40; (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 41 , identificador de secuencia n.°: 42, identificador de secuencia n.°: 43, identificador de secuencia n.°: 44 y el identificador de secuencia n.°: 45; (iv) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 30, identificador de secuencia n.°: 31 , identificador de secuencia n.°: 32, identificador de secuencia n.°: 33 y el identificador de secuencia n.°: 34; (v) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 35, identificador de secuencia n.°: 36 y el identificador de secuencia n.°: 37); y (vi) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 38; o (b) al menos una variante de la HVR, donde la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en los identificadores de secuencia n.°: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37 ó 38.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 39. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 40. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 41. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 30. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 35. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 38. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 39, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 40 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 41. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho anticuerpo anti-factor D (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 30, una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 35, una HVR-L3 que comprenda la secuencia -de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 38. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho anticuerpo anti-factor D (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 39, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 40, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.° 41 , una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 30, una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 35, una HVR-L3 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 38. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho anticuerpo anti-factor D (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno).

En un aspecto, la' invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29. En ciertas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones, inserciones o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia; sin embargo, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unirse al factor D. En algunas formas de realización un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado de una secuencia del identificador de secuencia n.°: 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29. En ciertas formas de realización, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones externas a las HVR (es decir, en las FR). En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-factor D modificado comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 y 17. En ciertas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ó 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones, inserciones o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia; sin embargo, un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unirse al factor D. En algunas formas de realización un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado o eliminado de una secuencia del identificador de secuencia n.°: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 y 17. En ciertas formas de realización, . las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones externas a las HVR (es decir, en las FR). En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-factor D comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 y 17. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado qúe comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 18. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 6. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 18 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 6. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de- cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 19. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 7. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 19 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 7. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 20. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 8. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 20 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 8. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 21. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 9. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 21 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 9. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 22. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 10. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 22 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 10. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 23. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 1 1. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 23 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 1 1. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 24. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 12.

Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 24 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 12. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 25. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 13. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 25 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 13. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 26. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 14. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 26 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 14. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 27. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 15. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 27 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 15. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 28. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 16. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 28 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 16. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 29. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende el identificador de secuencia n.°: 17. Por ejemplo; la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende el identificador de secuencia n.°: 29 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 17. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos siguiente: X^QLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGE TTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGVX2X3WGQGTLVTVSS (identificador de secuencia n.°: 74), donde X, es Q o E, X2 es N, A o Q y X3 es N, A o Q. En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: XiVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEW GWINTYTGE TTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGVX2X3WGQGTLVTVSS (identificador de secuencia n.°: 74), donde X, es Q o E; X2 es N, A o Q y X3 es N, A o Q. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho polipéptido.

En una forma de realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6TLRPGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7EIK (identificador de secuencia n.°: 73), donde X es M, L o I; X5 es N, A o Q; X6 es N, S o A y X7 es L o V. En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado, que comprende el polipéptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6TLRPGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7EIK (identificador de secuencia n.°: 73), donde X4 es M, L o I; X5 es N, A o Q; Xe es N, S o A y X7 es L o V. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho polipéptido.

En una forma de realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo del identificador de secuencia n.°: 18, identificador de secuencia n.°: 19, identificador de secuencia n.°: 20, identificador de secuencia n.°: 21 , identificador de secuencia n.°: 22, identificador de secuencia n.°: 23, identificador de secuencia n.°: 24, identificador de secuencia n.°: 25, identificador de secuencia n.°: 26, identificador de secuencia n.°: 27, identificador de secuencia n.°: 28 y el identificador de secuencia n.°: 29. En otra forma de realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados entre el grupo del identificador de secuencia n.°: 6, identificador de secuencia n.°: 7, identificador de secuencia n.°: 8, identificador de secuencia n.°: 9, identificador de secuencia n.°: 10, identificador de secuencia n.°: 11 , identificador de secuencia n.°: 12, identificador de secuencia n.°: 13, identificador de secuencia n.°: 14, identificador de secuencia n.°: 15, identificador de secuencia n.°: 16 y el identificador de secuencia n.°: 17. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho polipéptido.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado, donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 47.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado, donde el dominio de la cadena pesada contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 54.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado, donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 61. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado, donde el dominio de la cadena pesada contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 63.

En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia del identificador de secuencia n.°: 47. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia del (identificador de secuencia n.°: 54. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia del identificador de secuencia n.°: 61. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia del (identificador de secuencia n.°: 63. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho polipéptido.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del antifactor D humanizado n.° 111, donde el dominio variable de la cadena ligera contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 6, identificador de secuencia n.°: 7, identificador de secuencia n.°: 8, identificador de secuencia n.°: 9, identificador de secuencia n.°: 10, identificador de secuencia n.°: 11, identificador de secuencia n.°: 12, ¡dentificador de secuencia n.°: 13, identificador de secuencia n.°: 14, identificador de secuencia n.°: 15, identificador de secuencia n.°: 16 y el identificador de secuencia n.°: 17. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho anticuerpo anti-factor D (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del antifactor D humanizado n.° 1 11 , donde el dominio variable de la cadena pesada contiene la secuencia de seleccionada del identificador de secuencia n.°: 18, identificador de secuencia n.°: 19, identificador de secuencia n.°: 20, identificador de secuencia n.°: 21 , identificador de secuencia n.°: 22, identificador de secuencia n.°: 23, identificador de secuencia n.°: 24, identificador de secuencia n.°: 25, identificador de secuencia n.°: 26, identificador de secuencia n.°: 27, identificador de secuencia n.°: 28 y el identificador de secuencia n.°: 29. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 11 1 , donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 47. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111 , donde el dominio de la cadena pesada contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 54. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 61. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111 , donde el dominio de la cadena pesada contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 63. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dicho anticuerpo anti-factor D (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del del anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 6 y la secuencia del dominio variable de la cadena pesada comprende el identificador de secuencia n.°: 18. En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado de un anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de identificador de secuencia n.°: 7 y la secuencia del dominio variable de la cadena pesada comprende el identificador de secuencia n.°: 19. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 8 y la secuencia del dominio variable de la cadena pesada comprende el identificador de secuencia n.°: 20. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 9 y la secuencia del dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 21. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 10 y el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia del identificador de secuencia n.°: 22. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 11 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 23. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 12 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 24. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111, donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 13 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 25. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111, donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 14 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 26. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 15 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 27. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 16 y las secuencias del dominio variable de la^cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 28. En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111, donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del identificador de secuencia n.°: 17 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de identificador de secuencia n.°: 29. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 111 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del ¡dentificador de secuencia n.°: 47 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de ¡dentificador de secuencia n.°: 54. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-factor D modificado del anti-factor D humanizado n.° 11 1 , donde el dominio de la cadena ligera contiene la secuencia del ¡dentificador de secuencia n.°: 61 y las secuencias del dominio variable de la cadena pesada de ¡dentificador de secuencia n.°: 63. 3. Afinidad y actividad biológica de los anticuerpos anti-factor D La invención de la presente memoria descriptiva incluye anticuerpos y variantes o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) que tienen características que se identifican en la presente memoria descriptiva como deseables en un anticuerpo anti-factor D. Los anticuerpos y sus variantes o fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) que tienen características que se identifican en la presente memoria descriptiva como deseables en un anticuerpo anti-factor D, se pueden clasificar por su actividad biológica inhibitoria, por ejemplo, in vitro o in vivo, o midiendo su afinidad de unión. a. Afinidad A fin de determinar si un anticuerpo anti-factor D y sus variantes o fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) se une al mismo epítopo del factor D unido por un anticuerpo de interés (por ejemplo, los anticuerpos que antagonizan con la actividad del factor D), se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988)). Alternativamente, se puede realizar un mapeo de epítopos para determinar si el anticuerpo anti-factor D se une al epítopo de interés (Champe y col., J. Biol. Chem., 270: 1388-1394 (1995). La afinidad de los anticuerpos, por ejemplo, por el factor D se puede determinar mediante métodos estándares, mediante métodos que incluyen los descritos en el Ejemplo 3.

En un aspecto la invención proporciona anticuerpos anti-factor D o variantes o fragmentos e los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) que compiten con un anticuerpo anti-factor D murino y/o un clon n.° 111 de anticuerpo anti-factor D humanizado y/o un anticuerpo que comprende un dominio variable o secuencias HVR del clon n.° 1 1 1 del anticuerpo anti-factor D humanizado. Los anticuerpos anti-factor Do variantes o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo anti-factor D murino y/o al clon n.° 1 11 del anticuerpo anti-factor D humanizado y/o un anticuerpo que comprende un dominio variable o secuencias HVR del clon n.° 111 del anticuerpo anti-factor D humanizado, también se proporcionan.

En una forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad monovalente del anticuerpo hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es menor por lo menos 1 ó 2 veces, que la afinidad monovalente de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo quimérico como fragmento Fab con el factor D), que comprende, consiste o consiste esencialmente en secuencia de cadena ligera o pesada de dominio variable de un anticuerpo anti-factor D murino. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad bivalente del anticuerpo hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como una IgG con el factor D) es menor por lo menos 1 ó 2 veces, que la afinidad bivalente de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo quimérico como una IgG con el factor D), que comprende, consiste o consiste esencialmente en secuencia de cadena ligera o pesada de dominio variable de un anticuerpo anti-factor D murino. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad monovalente del anticuerpo hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es mayor por lo menos 1 ó 2 veces, que la afinidad monovalente de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo quimérico como fragmento Fab con el factor D), que comprende, consiste o consiste esencialmente en secuencia de cadena ligera o pesada de dominio variable de un anticuerpo anti-factor D murino. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o variantes del mismo, donde la afinidad bivalente del anticuerpo hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como una IgG con el factor D) es mayor por lo menos 1 ó 2 veces, que la afinidad bivalente de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo quimérico como una IgG con el factor D), que comprende, consiste o consiste esencialmente en secuencia de cadena ligera o pesada de dominio variable de un anticuerpo anti-factor D murino. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 20 nM (20x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factór D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 10 n (10x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 1 ,0 nM (1 ,0x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-facfor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 0,5 nM (0,5x10 9 M) o mejor. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 1 ,0 pM (1 ,0x10"12 M) o mejor. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 0,5 pM (0,5x10"12 M) o mejor. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos antifactor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 10,0 nM (10,0x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 5,0 nM (5,0x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti- factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 1 ,0 nM (1 ,0x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 0,5 nM (0,5x10"9 M) o mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 5,0 pM (5,0x10"12 M) o mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 2,0 pM (2,0x10"12 M) o mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 1 ,0 pM (1 ,0x10"12 M) o - mejor. En otra forma de realización la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 0,5 pM (0,5x10:12 M) o mejor. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 0,5 mM (0,5x10"6 M) a 0,5 pM (0,5x10"12 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 15 nM (15x10"9 M) a 0,1 nM (0,1x10"9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 5,5 nM (5,5x10~9 M) a 1 nM (1x10"9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab con el factor D) es de 0,5 pM (0,5x10'12 M) a 2 pM (2x10" 12 M). En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos antifactor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 0,5 mM (0,5x 0" 6 M) a 0,5 pM (0,5x10~12 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 10 nM (10x10~9 M) a 0,05 nM (0,05x10 9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 5,5 nM (5,5x10"9 M) a 1 nM (1x10"9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente con el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de 0,5 pM (0,5x10"12 M) a 2 pM (2x10"12 M). En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 1 ,4 pM (1 ,4x10"12 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de aproximadamente 1 ,1 pM (1 , 1x1 O*12 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 0,19 nM (0, 19x10"9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de aproximadamente 0,08 nM (0,08x10"9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 12,3 nM (12,3x10 9 M). En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de aproximadamente 9,0 nM (9,0x10"9 M). En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 1 ,4 pM (1 ,4x10 2 M) +/- 0,5. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de aproximadamente 1 , 1 pM (1 ,1x10"12 M) +/-0,6. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D ó una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 0,19 nM (0,19x10"9 M) +/- ,01. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de aproximadamente 0,08 nM (0,08x10"9 M) +/-0,01. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 12,3 nM (12,3x10"9 M) +/- 2. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como IgG hacia el factor D) es de aproximadamente 9,0 nM (9,0x10"9 M) +/- 1. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo, donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 1 ,4 pM (1 ,4x10"12 M) +1- 2. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo.donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 1 , 1 pM (1 ,1x10"12 M) +/- 2. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo.donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente (0, 19x10"9 M) +/- 2. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo ahti-factor D o una variante del mismo.donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 0,08 nM (0,08x10"9 M) +/-2. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo.donde la afinidad del anticuerpo en su forma monovalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 12,3 nM (12,3x10"9 M) +/- 2. En otra forma de realización, la invención provee un anticuerpo anti-factor D o una variante del mismo.donde la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente hacia el factor D (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo como fragmento Fab hacia el factor D) es de aproximadamente 9,0 nM (9,0x10" 9 M) +/- 2. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

Como es bien sabido en esté campo, la afinidad de unión de un ligando a su receptor se puede determinar utilizando uno de los diversos ensayos existentes y se puede expresar en función de diversos valores cuantitativos. Por ello, en una forma de realización, la afinidad de unión se expresa como valores KD y refleja una afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). Por lo general, y preferentemente, la afinidad de unión se mide in vitro, tanto en un entorno sin células como en uno asociado a células. Como se describe detalladamente en la presente memoria descriptiva, el número de veces en que se diferencia la afinidad de unión se puede cuantificar en función de la proporción entre el valor de la afinidad de unión monovalente de un anticuerpo humanizado (por ejemplo, en forma Fab) y el valor de la afinidad de unión monovalente de un anticuerpo de referencia/de control (por ejemplo, en forma Fab) (por ejemplo, un anticuerpo murino que tiene secuencias de la región hipervariable del donante), donde los valores de la afinidad de unión se determinan en condiciones de ensayo similares. De este modo, en una forma de realización, esta diferencia de la afinidad de unión en número de veces sé determina como la proporción entre los valores KD del anticuerpo humanizado en forma Fab y el dicho anticuerpo Fab de referencia/comparador. Por ejemplo, en una forma de realización, si un anticuerpo de la invención (A) tiene una afinidad que es "3 veces menor" que la afinidad de un anticuerpo de referencia (M), entonces, si el valor KD para A es 3x, el valor KD de sería 1x y la proporción entre el KD de A y el KD de M sería 3:1. En cambio, en una forma de realización, si un anticuerpo de la invención (C) tiene una afinidad que es "3 veces mayor" que la afinidad de un anticuerpo de referencia (R), entonces, si el valor KD para C es 1x, el valor KD de R sería 3x y la proporción entre el valor KD de C y el valor KD de R sería 1 :3. Se puede utilizar cualquiera de los diversos ensayos conocidos en la materia, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva, para obtener mediciones de la afinidad de unión, incluyendo, por ejemplo, Biacore, radioinmunoensayo (RIA) y ELISA.

Además, los valores KD de un anticuerpo de la invención pueden variar dependiendo de las condiciones del ensayo en particular que se utilice. Por ejemplo, en una forma de realización, las mediciones de la afinidad de unión se pueden obtener mediante un 9 ensayo, en el cual el Fab o el anticuerpo se inmoviliza y se mide la unión del ligando, es decir del factor D o alternativamente, se inmoviliza el Fab o el anticuerpo y se mide la unión del Fab o del anticuerpo. En una forma de realización, las mediciones de la afinidad de unión se pueden obtener en un ensayo, en el cual las condiciones de regeneración pueden comprender (1 ) 10mM glicina o 4M MgCI2 a pH 1 ,5 y (2) pH entre pH 1 ,0 y pH 7,5, incluso a pH 1 ,5, pH 5,0, pH 6,0 y pH 7,2. En una forma de realización, las mediciones de la afinidad de unión se pueden obtener mediante un ensayo, en el cual las condiciones de unión pueden comprender (1) PBS o solución salina con tampón HEPES y (2) Tween-20, es decir, Tween-20 al 0,1 %. En una forma de realización, las mediciones de la afinidad de unión se pueden obtener mediante un ensayo, en el cual la fuente del ligando, por ejemplo, el factor D, puede ser de fuentes disponibles comercialmente. En una forma de realización, las mediciones de la afinidad de unión se pueden obtener mediante un ensayo, en el cual (1) el Fab o el anticuerpo se inmoviliza y se determina la unión del ligando, por ejemplo, el factor D, (2) las condiciones de regeneración comprenden 4 M MgCI2 a pH 7,2 y (3) las condiciones de unión comprenden solución salina con tampón HEPES, pH 7,2 que contiene Tween-20 al 0,1 %. En una forma de realización, las mediciones de la afinidad de unión se pueden obtener mediante un ensayo, en el cual (1) el ligando, por ejemplo, el factor D, se inmoviliza y se mide la unión del Fab o del anticuerpo, (2) las condiciones de regeneración comprenden 10 m de glicina a pH 1 ,5 y (3) las condiciones de unión comprenden tampón de PBS. b. Actividad biológica Para determinar si un anticuerpo anti-factor D, una variante del anticuerpo o un fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) es capaz de unirse al factor D y ejercer un efecto biológico, por ejemplo, la inhibición de la hemólisis de la vía alterna, los ensayos de inhibición de hemólisis con eritrocitos de conejos son útiles, incluso los que se describen en el Ejemplo 2. Dicha inhibición de la hemolisis se puede determinar mediante ensayos estándar (Kostavasili y col., J of Immunology, 158(4): 1763-72 (1997); Wiesmann y col., Nature, 444(71 16): 159-60 (2006)). En dichos ensayo se puede iniciar la activación del complemento con suero o plasma. Las concentraciones adecuadas de factor D en suero o en plasma (Pascual y col., Kidney International, 34: 529-536 (1998); Complement Facts Book, Bernard J. Morley y Mark J. Walport, editores, Academic Press (2000); Barnum y col., J. Immunol. Methods, 67: 303-309 (1984)) se pueden determinar de rutina de acuerdo con los métodos conocidos en el campo, incluso aquellos descritos en las referencias, tales como Pascual y col., Kidney International, 34: 529-536 (1998) and Barnum y col., J. Immunol. Methods, 67: 303-309 (1984) y el Ejemplo 4. La presente invención se relaciona en general con los anticuerpos capaces de inhibir las actividades biológicas asociadas al factor D. Por ejemplo, a una concentración de 18 µ9/?t?? (equivalente a aproximadamente 1 ,5 veces la concentración del factor D humano en la sangre; la relación molar del anticuerpo anti-factor D contra el factor D es de aproximadamente 1.5: 1), se observa una inhibición de la actividad de la vía alterna del complemento por parte del anticuerpo (véase, por ejemplo; la patente de EE.UU. n.° 6.956.107) En una forma de realización, la invención incluye anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 menores de 30 nM. En una forma de realización, la invención incluye anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 menores de 15 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 menores de 10 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 menores de 5 nM. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos antifactor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 30 nM y 2 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 25 nM y 7 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 20 nM y 12 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 30 nM y 15 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 12 nM y 8 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 7 nM y 2 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 6 nM y 3 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 8 nM y 5 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemóiisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 5 nM y 2 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemóiisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 10 n y 5 n . En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC550 entre 8 nM y 2 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 entre 7 nM y 3 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC5o entre 6 nM y 4 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con un valor de ICS0 de aproximadamente 4,7 nM ± 0,6 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con un valor de IC50 de aproximadamente 6,4 nM ± 0,6 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con un valor de IC50 de aproximadamente 3,5 nM ± 0,5 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con un valor de IC50 de aproximadamente 4,4 nM ± 1 ,5 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con un valor de IC50 de aproximadamente 10,2 nM ± 0,8 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con un valor de IC50 de aproximadamente 23,9 nM ± 5,0 nM. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 menores de 80 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 menores de 50 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 menores de 40 nM. En una forma de realización, l invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 menores de 20 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC50 menores de 15 nM. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 80 nM y 10 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 75 nM y 15 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 70 nM y 20 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 65 nM y 25 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemolisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 60 nM y 30 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 55 nM y 35 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab dé dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 50 nM y 40 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 80 nM y 70 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 55 nM y 25 nM. En una forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con valores de IC90 entre 16 nM y 12 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con un valor de IC90 de aproximadamente 14,0 nM ± 1 ,0 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía, alterna con un valor de IC90 de aproximadamente 38,0 nM ± 1 1 ,0 nM. En otra forma de realización, la invención provee anticuerpos anti-factor D, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna con un valor de IC90 de aproximadamente 72,6 nM ± 4,8 nM. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la invención se refiere a los anticuerpos de la presente invención o a sus fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno); donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la hemólisis de la vía alterna en una proporción molar de anticuerpo-factor D de aproximadamente 0,05:1 (0,05) a 10: 1 (10), de 0,09:1 (0,09) a 8:1 (8), de 0,1 :1 (0,1) a 6:1 (6), de 0,15:1 (0,15) a 5:1 (5), de 0,19:1 (0,19) a 4:1 (4), de 0,2:1 (0,2) a 3:1 (3), de 0,3:1 (0,3) a 2:1 (2), de 0,4:1 (0,4) a 1 :1 (1), de 0,5:1 (0,5) a 1:2 (0,5), de 0,6:1 (0,6) a 1 :3 (0,33), de 0,7:1 (0,7) a 1 :4 (0,25), de 0,8:1 (0,8) a 1 :5 (0,2) o de 0,9:1 (0,9) a 1:6 (0,17). En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la presente invención incluye fragmentos de anticuerpos anti-factor D humanizados (por ejemplo, fragmentos de unión a los antígenos). Los fragmentos de anticuerpos de la presente invención pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', Ffab^, scFv, (scFv)2, dAb, fragmentos que determinan la región de complementariedad, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única, minicuerpos, diacuerpos o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En otra forma de realización, la invención provee un fragmento de anticuerpo anti-factor D humanizado (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) que es capaz de penetrar sustancialmente toda la retina. En otra forma de realización, la invención provee un fragmento de anticuerpo anti-factor D humanizado (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) que es capaz de penetrar todo el grosor de la retina. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

En una forma de realización, la presente invención incluye anticuerpos anti-factor D humanizados, donde un fragmento Fab de dichos anticuerpos tiene una semivida de al menos 3, 5, 7, 10 ó 12 días después de la administración al ojo de mamífero (por ejemplo, humano) por medio de una única inyección intravítrea. En otra forma de realización, la presente invención incluye anticuerpos anti-factor D humanizados, donde el fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la activación de la vía alterna (AP) del complemento durante al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ó 115 días después de la administración al ojo de mamífero (por ejemplo, humano) por medio de una única inyección ¡ntravítrea. En otra forma de realización, la presente invención incluye anticuerpos anti-factor D humanizados, donde la concentración del fragmento Fab de dichos anticuerpos que inhibe la activación de la vía alterna (AP) del complemento se mantiene en el tejido retiniano durante al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 días después de la administración al ojo de mamífero (por ejemplo, humano) por medio de una única inyección ¡ntravítrea. En otra forma de realización, la presente invención incluye anticuerpos anti-factor D humanizados, donde la concentración del fragmento Fab de dichos anticuerpos que inhibe la activación de la vía alterna (AP) del complemento se mantiene en el humor vitreo durante al menos 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10 ó 115 días después de la administración al ojo de mamífero (por ejemplo, humano) por medio de una única inyección ¡ntravítrea. En un ejemplo, la invención proporciona un fragmento de dichos anticuerpos anti-factor D (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno).

GENERACIÓN DE ANTICUERPOS SELECCIÓN Y TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS HUÉSPED Las células huésped se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente memoria descriptiva para la producción de anticuerpo anti-factor D y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados adecuadamente para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Un experto en la materia puede seleccionar sin experimentación indebida las condiciones de cultivo, como el medio de cultivo, la temperatura, el pH y similares. En general, los principios, los protocolos y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, . Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., citado anteriormente.

Cualquier experto en la materia conoce los métodos de transfeccion y transformación de células eucariotas y procariotas, respectivamente, por ejemplo, CaCI2, CaP04, procesos mediados por liposomas, polietilenglicol/DMSO y electroporación, los cuales implican la introducción del ADN en el anfitrión de modo que dicho ADN sea replicable, bien como componente extracromosómico o por la acción de un integrante cromosómico. Según la célula huésped que se utilice, la transformación se realiza empleando técnicas estándar apropiadas para dicho tipo de células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, descrito en Sambrook y col., citado anteriormente, o electroporación, se utiliza generalmente para las procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, como se describe en Shaw y col., Gene. 23:315 (1983) y en el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin estas paredes celulares, se puede emplear el método de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Viroloqv, 52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos generales de las transfecciones del sistema de células huésped de mamíferos en la patente de EE.UU. n.° 4.399.216. Las transformaciones en levadura se suelen llevar a cabo según el método de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Nati. Acad. Sci. (USAV 76:3829 (1979). No obstante, también se pueden utilizar otros métodos para introducir ADN en células, como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policaciones, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para información sobre diversas técnicas para la transformación de células de mamíferos, véase Keown y col., Methods in Enzymoloqy, 185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature. 336:348-352 (1988).

Las células huésped adecuadas para clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria descriptiva son células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas para este fin incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacteriaceas como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P dado a conocer en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus, y Streptomyces. Un huésped de clonación preferido de E. coli es E.o coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635) son adecuadas. Estos ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitador. La cepa W3110 es una huésped particularmente preferente o parental, porque comúnmente actúa como huésped en las fermentaciones de productos de AD recombinante. Preferentemente, la célula anfitriona secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Bioloqy. vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1 190-1219; Depósito de ATCC n.° 27.325 se puede modificar para obtener una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas en el anfitrión y entre los ejemplos de estos anfitriones están la cepa de E. co// W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA, la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3, la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompTkarí, la cepa de E. co//'W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 HvG karí, la cepa de E. coli W3110 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de la eliminación degP no resistente a la kanamicina, la cepa de E. coli W3110 33D3 con el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de EE.UU. n.° 5.639.635) y una cepa de £. coli que contiene la proteasa períplasmática mutante que se describe en la patente de EE.UU. n.° 4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990., Otras cepas y derivados de las mismas, como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608) también están indicados. Estos ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitador. Los métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas con genotipos definidos conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Bass y col., Proteins. 8:309-314 (1990). Por lo general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la capacidad de replicación del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia o Salmonella se pueden usar adecuadamente como anfitrión cuando se utilicen plásmidos bien conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para proporcionar el replicón. Normalmente, en caso de que la célula huésped deba secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas puede resultar conveniente incorporar al cultivo celular inhibidores adicionales de la proteasa. Alternativamente, son adecuados los métodos in vitro de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos* nucleicos.

Los anticuerpos de longitud completa, los fragmentos de anticuerpo (por ejempjo, fragmentos de unión al antígeno y las proteínas de fusión del anticuerpo se pueden producir en bacterias, en especial cuando la glicosilación y la función efectora de Fe no se necesitan, lo que ocurre por ejemplo cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5,648,237 (Cárter et. al,), 5,789,199 (Joly y col.) y 5.840.523 (Simmons y col.) que describe las secuencias de señal y la región de iniciación de la traducción (TIR) para optimizar la expresión y secreción. Estas patentes se incorporan en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Después de la expresión, se aisla el anticuerpo de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar a través, por ejemplo, de una columna de proteínas A o G, dependiendo del isotipo. La purificación final puede realizarse de forma similar al proceso de purificación de anticuerpos expresados en, por ejemplo, células CHO.

Además de procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o la levadura también son aptos como huéspedes para expresión o clonación de los vectores de codificación del anticuerpo. El microorganismo de eucariotas inferiores más utilizado como huésped es Saccharomyces cerevisiae. No obstante, otros géneros, especies y cepas están disponibles y son útiles en la presente memoria descriptiva, como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, Candida, Trichoderma, Neurospora crassa y hongos filamentosos como, por ejemplo, huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus como A. nidulans y A. niger. Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente memoria descriptiva e incluyen, aunque sin limitarse a, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas del género formado por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos típicos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilados se derivan de organismos pluricelulares. En principio, es válido cualquier cultivo de células eucariotas superiores, procedan de vertebrados o de invertebrados. Entre los ejemplos 1 de células de invertebrados se encuentran células de plantas e insectos, Luckow y col., Bio Technology 6, 47-55 (1988); Miller y col., Genetic Enginéering, Setlow y col., eds. Vol. 8, págs. 277-279 (Plenam publishing 1986); Mseda y col., Nature 315, 592-594 (1985). Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células huésped de insectos permisivas procedentes de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Están públicamente disponibles diversas cepas de virus para transfección, por ejemplo, la variante L-1 del NPV Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV Bombyx mori y estos virus se pueden usar como el virus de la presente memoria descriptiva, de acuerdo con la presente invención, en concreto para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda. Además, se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células de plantas como algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Las células de vertebrados, y su propagación, en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Véase Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, eds. (1973). Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos están líneas de células de riñon de mono; líneas de células de riñon de embriones humanos; células de riñon de crías de hámster; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Uriaub y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células sertoli de ratón; células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA); células de riñon de perro; células de pulmón humano; células de hígado humano; células de tumor de mama murino; y células NSO.

Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno), por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que lo codifica se aisla e introduce en un vector replicable para seguir clonándolo (amplificación del ADN) o para que se exprese. El ADN que codifica el anticuerpo o a un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotidas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Existen muchos vectores disponibles. La elección del vector depende en parte de la célula huésped que se utilice. Por lo general, las células huésped preferentes son de origen procariótico o eucariótico (habitualmente, de mamíferos).

Por ejemplo, el vector puede estar en forma de plásmído, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia apropiada de ácidos nucleicos se puede insertar en el vector mediante diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en uno o más sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector suelen incluir una o más secuencias de señal, un origen de replicacíón, un o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. En la construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes se emplean técnicas estándar de ligado que los expertos en la materia conocen.

La factor D puede producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una •secuencia de señal u otro polipéptido con un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o el polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN que codifica el anticuerpo antifactor D que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o líderes de enterotoxina II termoestables. Para la secreción de levadura, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de la levadura, el líder del factor alfa (incluidos los líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces , este último descrito en la patente de EE.UU. n.° 5.010.182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa C. albicans (patente EP n.° 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias de señal de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secrecion de la proteína, como secuencias de señal procedentes de polipéptidos secretados de la misma especia o de una especie afín, así como líderes secretores virales.

Las células huésped se transforman con los vectores descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados adecuados para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo, la variante o el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de esta invención se pueden cultivar en diversos medios. a. Células huésped procarióticas Las células procarióticas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la materia y aptos para el cultivo de células huésped seleccionadas. Un ejemplo de medio apropiado es el caldo de Luria (LB) más nutrientes suplementarios necesarios. En algunas formas de realización, los medios también contienen un agente de selección, elegido en función de la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de células procarióticas que contengan el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios de cultivo para el crecimiento de células que expresen un gen resistente a ampicilina. 1 Cualquier suplemento necesario aparte de carbono, nitrógeno y fuentes inorgánicas de fosfato también se puede incluir a concentraciones apropiadas, introduciéndolo solo o como mezcla con otro suplemento o medio de cultivo, como una fuente compleja de nitrógeno. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados en el grupo formado por glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las células anfitrión procarióticas se cultivan a temperaturas apropiadas. En el cultivo de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferente oscila entre unos 20°C y 39 °C, más preferentemente entre unos 25°C y 37 °C, y aún más preferentemente alrededor de 30 °C. El pH del medio de cultivo puede ser cualquier valor comprendido entre 5 y 9 aproximadamente, dependiendo sobre todo del organismo anfitrión. En el caso de E. coli, el pH oscila preferentemente entre 6,8 y 7,4, y más preferentemente alrededor de 7,0. Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína se induce en condiciones aptas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, los promotores PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos. Según esto, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitador dé fosfato para conseguir la inducción. Preferiblemente, el medio de cultivo limitador de fosfato es el C.R.A.P (véase, por ejemplo, Simmons y col., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Se pueden utilizar otros inductores, según el constructo de vector empleado, como se sabe en el sector.

En una forma de realización, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en el periplasma de las células huésped y de allí se recuperan. La recuperación de las proteínas supone habitualmente la alteración del microorganismo, por lo general mediante choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez producida la alteración de las células, los desechos celulares o células enteras se pueden eliminar mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse aún más, por ejemplo, mediante cromatografía dé afinidad con resina. De manera alternativa, se pueden transportar proteínas dentro del medio de cultivo y aislarlas en él. Las células pueden retirarse del cultivo, y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para proceder a una posterior purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden volver a aislarse e identificarse mediante métodos comúnmente conocidos, como la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y el ensayo "Western blot".

En uno de los aspectos de la invención, la producción de anticuerpos se realiza en gran cantidad mediante proceso de fermentación. Existen varios procesos disponibles de fermentación de lotes alimentados a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala se realizan en dispositivos de al menos 1000 litrps de capacidad, preferiblemente entre aproximadamente 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan agitadores de hélice para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferente de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala hace referencia generalmente a la fermentación en fermentadores de aproximadamente no más de 100 litros de capacidad volumétrica, y pueden variar de 1 a 100 litros aproximadamente.

En un proceso de fermentación, la inducción de expresión proteica se inicia típicamente después de que las células hayan crecido en condiciones adecuadas hasta alcanzar la densidad deseada, por ejemplo, una OD550 de entre 180-220, momento en el cual las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden Osarse distintos inductores, de acuerdo con el constructo del vector utilizado, tal como se conoce en la materia y se ha descrito anteriormente. Las células pueden hacerse crecer durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante unas 12-50 horas, aunque es posible utilizar tiempos de inducción más cortos o más prolongados.

Pueden modificarse distintas condiciones de fermentación para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, para mejorar él ensamblaje y plegamiento adecuados de los polipéptidos de los anticuerpos secretados, pueden utilizarse vectores adicionales que sobreexpresen las proteínas chaperonas, como las proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilpropil cis.trans-isomerasa con actividad de chaperona) para transformar conjuntamente las células huésped procarióticas. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan la solubilidad y el plegamiento adecuados de las proteínas heterólogas producidas en células bacterianas anfitrión. Chen y col., (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou y col., patente de EE.UU. n.° 6.083.715; Georgiou y col., patente de EE.UU. n.° 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie y col. (2001) Mol. Microbio!. 39:199-210.

Pueden utilizarse ciertas cepas huésped con deficiencia de enzimas proteolíticas para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas (especialmente las que son sensibles desde el punto de vista proteolítico) para la presente invención. Por ejemplo, las cepas de células anfitrión pueden modificarse para efectuar mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas, como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas de E. coli con deficiencia de proteasas están disponibles y se describen, por ejemplo, en Joly y col. (1998), citado anteriormente Georgiou y col., patente de EE.UU. n.° 5.264.365; Georgiou y col., patente de EE.UU. n.6 5,508,192; Hará y col., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

En una forma de realización, en el sistema de expresión de la invención se utilizan como células huésped cepas de E. coli con deficiencia de enzimas proteolíticas transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas. b. Células huésped eucarióticas Medios comercialmente disponibles como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Médium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM, Sigma) son aptos para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem. 102: 255; 1980), Patentes de EE.UU. 4.767.704, 4.657.866, 4.560.655, 5.122.469, 5.712.163 ó 6.048.728 se pueden utilizar como medios dé cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o el factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruros X, donde X es sodio, calcio, magnesio y fosfatos), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN.TM.), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en las concentraciones finales del intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Otros suplementos necesarios se pueden incluir también a concentraciones adecuadas que serán conocidas por aquellos con conocimientos en la materia. Las condiciones del cultivo, como temperatura o pH entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán conocidas por los expertos en la materia.

PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS Las formas de los anticuerpos anti-factor D o sus fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) se pueden recuperar de un medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si£_¿5 encuentra unido a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión del anticuerpo anti-factor D pueden sufrir una alteración por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelación/descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de lisado celular. Es posible que se desee purificar el anticuerpo anti-factor D para separarlo de proteínas o polipéptidos de células recom binantes. Los siguientes procedimientos tienen un carácter ejemplar en lo que se refiere a los procedimientos de purificación adecuados: mediante el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación de etanoi, HPLC de fase reversa, cromatografía en sílice o en resina de intercambio catiónico como DEAE, cromatoisoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; usar filtración en gel, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sefarosa para eliminar contaminantes como IgG y columnas de quelantes metálicos para unir las formas marcadas con epítopo del anticuerpo anti-factor D. Pueden utilizarse diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzvmoloav . 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del anticuerpo anti-factor D particular producido.

Al utilizar técnicas recombinantes, se puede producir el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) intraceluiarmente, en el espacio periplasmático, o se puede secretar directamente en el medio de cultivo. Si el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno) se produce intraceluiarmente, como primer paso, los residuos de partículas, bien células huésped o fragmentos lisados, se pueden eliminar, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltrado. Cárter y col., Bion'echnology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Puede resumirse diciendo que la pasta celular se funde en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluorido (P SF) en unos 30 minutos. Los residuos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno) se secreta en el medio de cultivo, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran primero, por lo general, utilizando un filtro para concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltrado Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes casuales.

La composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo esta última una técnica de purificación. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier domino Fe de la inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno). La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas de lgG1 , lgG2 o lgG4 humanas (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para la lgG3 humana (Guss y col., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz a que el ligando de afinidad se une con mayor frecuencia es la agarosa, pero también hay disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio poroso controlado o poli(estirenodivinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno) comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno) que quiera recuperarse, otras técnicas para la purificación de las proteínas, como fraccionamiento en una columna dé intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en anhídrido silícico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoisoenfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio.

Siguiendo cualquiera de los pasos preliminares de purificación, la mezcla que contiene el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígéno) de interés y los contaminantes, puede estar sujeta a cromatografía de interacción hidrófoba con pH bajo utilizando una solución tampón de elución a un pH comprendido entre 2,5 y 4,5 aproximadamente, preferiblemente a concentraciones bajas en sal (por ejemplo, sal entre 0-0,25 M aproximadamente).

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Se pueden preparar formulaciones farmacéuticas del polipéptido, el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno). para su conservación como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas, mezclando el polipéptido con el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales "farmacéuticamente aceptables" empleados habitualmente en el sector (todos los cuales se denominan "excipientes"). Por ejemplo, tampones, estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. (Véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, A. Osol, Ed. (1980)). Estos aditivos no pueden ser tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones usadas.

Los tampones ayudan a mantener el pH en un rango próximo a condiciones fisiológicas. Preferentemente, están presentes en una concentración que oscila entre 2 y 50 mM. Entre los tampones adecuados para su uso con la presente invención se incluyen ácidos tanto orgánicos como inorgánicos y las sales de los mismos, como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato disódico y citrato monosódico, mezcla de citrato trisódico y ácido cítrico, mezcla de citrato monosódico y ácido cítrico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de succinato monosódico y ácido succínico, mezcla de hidróxido sódico y ácido succínico, mezcla de succinato disódico y ácido succínico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de tartrato sódico y ácido tartárico, mezcla de tartrato potásico y ácido tartárico, mezcla de hidróxido sódico y ácido tartárico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de fumarato monosódico y ácido fumárico, mezcla de fumarato disódico y ácido fumárico, mezcla de fumarato disódico y fumarato monosódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de gluconato sódico y ácido glucónico, mezcla de hidróxido sódico y ácido glucónico, mezcla de gluconato potásico y ácido glucónico, etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de oxalato sódico y ácido oxálico, mezcla de hidróxido sódico y ácido oxálico, mezcla de oxalato potásico y ácido oxálico, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de lactato sódico y ácido láctico, mezcla de hidróxido sódico y ácido láctico, mezcla de lactato potásico y ácido láctico, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de acetato sódico y ácido acético, mezcla de hidróxido sódico y ácido acético, etc.). Asimismo, se pueden haber mencionado tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como Tris.

Se pueden añadir conservantes para retrasar el crecimiento microbiano, en cantidades que oscilen entre 0,2 %-1 % (p/v). Entre los conservantes aptos para su uso con la presente invención están fenol, alcohol bencílico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de amonio de octadecildimetibencilo, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de hexametonio, alquil parabenos como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Se pueden añadir isotonificantes, conocidos a veces como "estabilizantes", para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente invención e incluyen alcoholes polihídricos de azúcares, preferentemente alcoholes trihídricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. .

Los estabilizantes constituyen una amplia categoría de excipientes que pueden variar en su función desde un agente a granel a un aditivo que solubiiiza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a la pared del envase. Entre los estabilizantes típicos están los alcoholes polihídricos de azúcares (enumerados anteriormente), aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., alcoholes orgánicos o alcoholes de azúcares como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluidos ciclitoles, como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen sulfuro, como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, alfa-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir < 10 residuos); proteínas como albúmina sérica humana, albúmina de suero bovino, gelatina o ¡nmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como monosacáridos de polivinilpirrolidona, como xilosa, mañosa, fructosa, glucosa; disacáridos como lactosa, maltosa, sucrosa y trisacáridos como rafinosa; polisacáridos como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en un rango de 0,1 a 10.000 pesos por parte de la proteína activa de peso. Se pueden añadir detergentes o surfactantes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como proteger la proteína terapéutica de la agregación inducida por la agitación, lo que también permite a la formulación estar expuesta a un esfuerzo cortante en la superficie sin causar la desnaturalización de la proteína. Entre los surfactantes no iónicos aptos están polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), Pluronic.RTM. polioles, monoéteres de polioxietileno sorbitan (Tween.RTM.-20, Tween.RTM.-80, etc.). Pueden estar presentes surfactantes no iónicos en un rango de entre 0,05 y 1 ,0 mg/ml, preferentemente entre 0,07 y 0,2 mg/ml.

Otros excipientes diversos incluyen agentes a granel (por ejemplo, almidón), quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes. La formulación de la presente memoria descriptiva también contiene más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar también un agente inmunodepresor. Dichas moléculas están presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin que se pretende. Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones.

Dichas técnicas se detallan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, A. Osal, Ed., (1980).

Las formulaciones para administrar en vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden elaborar preparaciones de liberación controlada. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno), cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido glicólico-ácido láctico como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas por un período de más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo menores. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un largo período de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que conduce a una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Es posible concebir estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo que intervenga. Por ejemplo, si se observa que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante un intercambio tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos sulfhidrilos, liofilizando soluciones ácidas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros especificas. Los compuestos de la invención para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular se administran generalmente por inyección ocular, intraocular y/o intravítrea y/o inyección juxtaescleral y/o inyección subtenon y/o inyección supracoroidal y/o administración tópica en forma de colirio o de ungüento. Dichos compuestos de la invención se pueden administrar por varios métodos, por ejemplo, por vía intravítrea con un dispositivo o depósito que permite la liberación lenta del compuesto al vitreo, incluso los que se describen en las referencias, tales como Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, y Pearson, editores, Taylor & Francis (March 2006). En un ejemplo, un dispositivo en forma de minibomba y/o una matriz y/o un sistema de difusión pasiva y/o células encapsuladas que liberan el compuesto durante un período prolongado de tiempo (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editores, Taylor & Francis (March 2006). También se pueden utilizar otros métodos de administración, que incluyen, sin limitación, la administración, tópica, parenteral, subcutánea, intraperítoneal, intrapulmonar, intranasal e intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraárterial, intraperítoneal y subcutánea.

Las formulaciones para la administración ocular, intraocular o intravítrea se pueden preparar utilizando métodos e ingredientes conocidos en la materia. Un requisito importante para el tratamiento eficiente es la penetración adecuada en el ojo. A diferencia de las enfermedades del frente del ojo, para las cuales se pueden administrar los fármacos tópicamente, las enfermedades de la retina requieren que el método sea más específico en cuanto a la especificidad del sitio. Los colirios y ungüentos rara vez penetran hasta el fondo del ojo y la barrera ocular de sangre dificulta la penetración de los fármacos administrados sistémicamente al tejido ocular. Por lo tanto, generalmente el método de elección para la administración de fármacos para el tratamiento de enfermedades de la retina, AMD y CNV, el la inyección intravítrea directa. Los intervalos de las inyecciones intravítreas dependen de la condición del paciente y de las propiedades y semivida del fármaco administrado. Para la penetración infraocular (por ejemplo, intravítrea), usualmente se prefieren las moléculas de tamaño pequeño.

La eficacia del tratamiento de afecciones oculares asociadas al complemento, como AMD o CNV, puede medirse mediante diversos puntos de valoración comúnmente usados en la evaluación de los trastornos infraoculares. Por ejemplo, se puede evaluar la pérdida de la visión. La pérdida de I visión se puede evaluar, sin limitación por medio de la evaluación del cambio medio en la mejor agudeza visual corregida (BCVA) desde el nivel de referencia hasta un momento dado (por ejemplo, donde la BCVA se basa en el cuadro de agudeza visual para el Tratamiento temprano de la retinopatía diabética (ETDRS) y en la evaluación a una distancia de prueba de 4 metros), la medición de la proporción de sujetos que pierden menos de 15 letras en la agudeza visüal en un momento dado en comparación con el nivel de referencia, evaluación de la proporción de sujetos que recuperan 15 o más letras en la agudeza visual en un momento dado en comparación con el nivel de referencia, evaluación de la proporción de sujetos con una agudeza visual según el tablero de Snellen equivalente a 20/2000 o peor en un momento dado, evaluación del Cuestionario de Funcionamiento Visual NEI, evaluación del tamaño de la neovascularización coroidal (CNV) y cantidad de derrame de CNV en un momento dado, por ejemplo, por angiografía con fluoresceína, etc. Se pueden realizar evaluaciones oculares, que incluyen sin limitación, por ejemplo, la realización de exámenes oculares, medición de la presión infraocular, evaluación de agudeza visual, prueba de lámpara de hendidura (slitlamp) evaluación de inflamación infraocular, etc.

La cantidad de polipéptido, anticuerpo o fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) terapéutico que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o una afección en particular dependerá del carácter de dicho trastorno o afección y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. Siempre que sea posible, es deseable determinar la curva dosis-respuesta y las composiciones farmacéuticas de la invención primero in vitro y luego, en sistemas de modelos animales útiles, antes de realizar ensayos en humanos.

En una forma de realización, se administra, mediante inyección subcutánea, una solución acuosa del polipéptido, anticuerpo o fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) terapéutico. En otra forma de realización, se administra, mediante inyección intravítrea, una solución acuosa del polipéptido, anticuerpo o fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) terapéutico. Cada dosis puede oscilar entre 0,5 pg y 50 pg por kilogramo de peso corporal o más, preferentemente, entre 3 pg y aproximadamente 30 pg por kilogramo de peso corporal. La pauta posológica para la administración subcutánea puede oscilar desde una vez al mes a diariamente, dependiendo de diversos factores clínicos, incluido el tipo de enfermedad, su gravedad y la sensibilidad del sujeto al agente terapéutico.

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y de ningún modo se proponen limitar el alcance de la presente invención.

El contenido de todas las patentes y referencias bibliográficas citadas en la presente especificación se incorporan expresamente en su totalidad a la presente memoria descriptiva a modo de referencia.

ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS Otra forma de realización de la invención es un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención o diagnóstico de los trastornos a los cuales se orientan los anticuerpos, las variantes de los anticuerpos o los fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) de la invención. Por ejemplo, la invención se relaciona con un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención o diagnóstico de trastornos asociados al complemento. El elemento de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, frascos, viales y jeringas. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es efectiva en el tratamiento, prevención o diagnóstico de la afección asociada al complemento y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón que una aguja hipodérmica pueda perforar). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo o un fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición es útil para el tratamiento, prevención o diagnóstico de una afección en particular.

El prospecto se refiere a las instrucciones habitualmente incluidas en los prospectos con los que se comercializan los productos terapéuticos, que contienen información sobre indicaciones, uso, posología, administración, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de estos productos terapéuticos. En una forma de realización, La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para el tratamiento de trastornos asociados al complemento, tales como cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente, que incluyen los trastornos oculares, por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Además, la etiqueta o prospecto comprende instrucciones para la administración de la composición del anticuerpo al paciente.

Adicionalmente, el artículo fabricado puede comprender un segundo envase que contenga un tampón farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución salina tampón con fosfato, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

En otra forma de realización, también se proporcionan kits útiles para diversos propósitos, por ejemplo, tratamiento, prevención o diagnóstico de trastornos asociados con el complemento, ensayos de hemolisis asociados al complemento, para purificación o inmunoprecipitación del polipéptido del factor D de las células. Por ejemplo, para el aislamiento y la purificación del polipéptido del factor D, el kit puede contener un anticuerpo anti-factor D, emparejado con microesferas (por ejemplo, microesferas de sefarosa). Los kits se pueden proporcionar con los anticuerpos para detección y cuantificación del polipéptido factor D in vitro, por ejemplo en un análisis ELISA o Western blot. Como ocurre con el artículo fabricado, el kit comprende un envase y una etiqueta o un prospecto en el mismo envase o asociado a éste. El envase contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-factor o un fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de la invención. Se pueden incluir otros envases adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes y soluciones tampón, anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto pueden proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso previsto, ya sea in vitro o detección. La etiqueta o el inserto puede proporcionar instrucciones para su administración (por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) a un sujeto.

USOS DEL ANTICUERPO HUMANIZADO Los anticuerpos humanizados de la presente invención, los fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) o sus variantes, son útiles en los ensayos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de una diana de interés en células, tejidos o suero específicos. Para las aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) generalmente se marcará con un grupo detectable. Hay varios marcadores disponibles. Las técnicas para cuantificar un cambio de fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y, entonces, puede emitir luz que puede medirse (mediante un quimioluminómetro, por ejemplo) o puede donar energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de los marcadores enzimáticos incluyen las luciferasas (por ejemplo, luciferasa bacteriana y de luciérnaga; Patente de EE.UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, malato deshidrogenase, ureasa, peroxidasa tal como la peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas (como por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para la conjugación de enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (Ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981 ).

En ocasiones, el marcador se conjuga indirectamente con el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno). El experto en la materia conocerá diversas técnicas, para lograrlo. Por ejemplo, el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionadas anteriormente se puede conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, de este modo, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno), se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digloxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con el anticuerpo anti-hapteno, una variante del anticuerpo o (por ejemplo, anticuerpo anti-digloxina) un fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión ai antígeno). Por lo tanto, se puede lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno). En otra forma de realización de la invención, el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) no puede estar marcada y la presencia del mismo se puede detectar utilizando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo, a la variante del anticuerpo o al fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno).

Los anticuerpos, las variantes o los fragmentos del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) de la presente invención puede emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como los ensayos de unión competitiva, ensayos tipo "sándwich" directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva dependen de la capacidad de un estándar marcado para competir por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo, de una variante del anticuerpo o de un fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno). La cantidad de la diana en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos suelen insolubilizarse antes o después de la competición. Como consecuencia, la muestra de prueba y el estándar que se une a los anticuerpos pueden separarse cómodamente del estándar y de la muestra de prueba que permanecen sin unir.

Los ensayos tipo sándwich suponen el uso de dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno), cada uno de los cuales es capaz de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo o a la proteína para ser detectados. En un ensayo tipo sándwich, la muestra de prueba que se va a analizar se une por un primer anticuerpo que es inmovilizado en un soporte sólido y, posteriormente, un segundo anticuerpo se une a la muestra de prueba, formándose así un complejo insoluble formado por tres partes. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 4.376.110. El segundo anticuerpo puede marcarse con una porción detectable (ensayos tipo sándwich directos) o se puede medir utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con una porción detectable (ensayo tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo tipo sándwich es un ensayo ELISA, en el que la porción detectable es una enzima.

Para el ensayo inmunohistoquímico, la muestra tumoral puede ser fresca o congelada o puede estar impregnada en parafina y fijada con un conservante como formol, por ejemplo.

Los anticuerpos, las variantes del anticuerpo o los fragmentos del anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) pueden utilizarse también para ensayos de diagnóstico in vivo. Por lo general, el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) está marcada con un radionucleótido (como. sup.111 In, .sup.99 Tc, .sup.14 C, .sup. 31 I, .sup.3 H, .sup.32 P o .sup.35 S), de forma que el tumor se pueda localizar utilizando la inmunoescintiografia. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo anti-lgE de alta afinidad de la presente invención para detectar la cantidad de IgE presente, por ejemplo, en los pulmones de un paciente asmático.

El anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión al antígeno) de la presente invención se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación empacada de reactivos en cantidades prefijadas con instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. Cuando el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) está marcado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores necesarios para la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En concreto, los reactivos se pueden proporcionar en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivos en la concentración apropiada.

USOS IN VIVO DEL ANTICUERPO Se prevé que los anticuerpos, las variantes de los anticuerpos o los fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) de la presente invención se puedan utilizar para tratar a un mamífero. En una forma de realización, el anticuerpo o la variante del anticuerpo se administra a un mamífero no humano a efectos de obtener datos preclínicos,. por ejemplo. Entre los ejemplos de mamíferos no humanos a tratar se incluyen primates no humanos, perros, gatos, roedores y otros mamíferos con que se lleven a cabo estudios preclínicos. Estos mamíferos se pueden establecer como modelos animales para una enfermedad que se quiera tratar con el anticuerpo o variante del anticuerpo o se pueden utilizar para estudiar la toxicidad del anticuerpo de interés. En cada una de estas formas de realización, se pueden llevar a cabo estudios de aumento de la dosis en el mamífero.

El anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, el fragmento de unión al antígeno) o polipéptido se administra por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento inmunodepresor local, la vía intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal y subcutánea. Además, el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) se administra í adecuadamente mediante infusión de efecto rápido, especialmente con dosis del anticuerpo, de la variante del anticuerpo o del fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) cada vez menores. Preferentemente, la administración se realiza mediante inyecciones, mejor aún por vía intravenosa q subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la. dosis adecuada del anticuerpo, de la variante del anticuerpo o del fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) o polipéptido dependerá del tipo de enfermedad que se trate, su gravedad y evolución, si el anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) se administra para fines preventivos o terapéuticos, el tratamiento anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, a la variante del anticuerpo o al fragmento del anticuerpo (por ejemplo un fragmento de unión al antígeno) y el criterio del médico que atiende el paciente.

Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración en un paciente es de aproximadamente 0,1 mg/kg a 150 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) del anticuerpo, de la variante del anticuerpo o del fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno), ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 mg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que ocurra la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No obstante, también pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Un ejemplo dé pauta posológica se describe en el documento WO 94/04188.

Las composiciones de anticuerpos de la invención se pueden formular, pautar y administrar de una manera que concuerde con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno específico que se trate, el mamífero específico sometido a tratamiento, el estado clínico del paciente, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la pauta posológica y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo, de la variante del anticuerpo o del fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) que se va a administrar se regirá por estas consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad o trastorno. El anticuerpo, la variante del anticuerpo o el fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) puede formularse opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos agentes depende de la cantidad de anticuerpo, variante el anticuerpo o fragmento del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno) presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores ya abordados con anterioridad. Generalmente, se usan en las mismas dosis y por las mismas vías de administración descritas en la presente memoria descriptiva o aproximadamente entre el 1 y el 99 % de las dosis empleadas hasta este momento.

Los anticuerpos, variantes de los anticuerpos o los fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) de la presente invención que reconocen el factor D como su diana se pueden utilizar para tratar trastornos mediados por el complemento. Estos trastornos se asocian a una activación excesiva o descontrolada del complemento. Incluyen: activación del complemento durante intervenciones de bypass cardiopulmonar; activación del complemento debida a isquemia-reperfusión tras infarto agudo de miocardio, aneurisma, ictus, choque hemorrágico, lesión por aplastamiento, fallo multiorgánico, choque hipovolémico e isquemia intestinal. Estos trastornos también pueden incluir una enfermedad o proceso que sea un proceso inflamatorio como quemaduras graves, endotoxemia, choque septicémico, síndrome de distrés respiratorio del adulto, hemodiálisis, choque anafiláctico, asma grave, angioedema, enfermedad de Crohn, anemia drepanocítica, glomerulonefritis postestreptocócica y pancreatitis. El trastorno puede estar ocasionado por una reacción adversa a un fármaco, una alergia medicamentosa, síndrome de fuga vascular inducida por IL-2 o alergia a medios de contraste radiográfico. También incluye enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. La activación del complemento también está asociada a rechazo de trasplante. Recientemente, también ha se ha establecido una estrecha correlación entre la activación del complemento y las enfermedades oculares como la degeneración macular asociada a la edad, la retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas con la isquemia, neovascularización coroidea (CNV), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, oclusiones venosas retinianas, incluida oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea y neovascularización retiniana.

EJEMPLOS A continuación, se ofrecen ejemplos a título ilustrativo únicamente. Los reactivos comercializados a los cuales se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de esas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de toda la especificación, por números de registro de la ATCC, es la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

Ejemplo 1 : Modificación de anticuerpos anti-factor D Para identificar los anticuerpos anti-factor D modificados y sus variantes y fragmentos (por ejemplo, . fragmentos de unión al antígeno) que tienen características deseables comercialmente, tales como la homogeneidad durante la fabricación y producción o con fines de identificación analítica, se usó un método de mutagénesis orientado a los sitios para generar los anticuerpos anti-factor D humanizados modificados y sus variantes y fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno). Primero, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del de Fab anti-factor D humanizado n.° 111 (identificador de secuencia n.°: 2 y el identificador de secuencia n.°: 1 , respectivamente) se subclonaron a un plásmido de expresión. Segundo, los oligonucleótidos que codifican mutaciones sencillas se recombinaron con el plásmido de expresión resultante para introducir las mutaciones dirigidas a los sitios.

Inicialmente, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del clon de Fab antifactor D humanizado n.° 111 se subclonaron con el plásmido pAEP1 (pAEP1 es un plásmido para la expresión de anticuerpos Fab en E.coli.), con la subclonación resultante de la introducción de valina (V) en la posición 104 (según la numeración de Kabat, consulte la Figura 10) del dominio variable de la cadena ligera.

La subclonación del dominio variable de la cadena ligera del clon del Fab anti-factor D n.° 1 en pAEP1 involucró el enlace de dos fragmentos de ADN. El primer fragmento es el vector pAEP1 del cual se removió el pequeño fragmento EcoRV/Kpnl. El segundo fragmento fue de aproximadamente 300 pares de bases EcoRV-Kpnl PCR producido a partir del plásmido de cadena ligera para elclon de Fab anti-factor D humanizado n.° 111 , utilizando los siguientes cebadores: 5' - TTTCCCTTTGATATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCT-3' (identificador de secuencia n.°: 67) 5' - TTTCCCTTTGGTACCCTGGCCAAACGTGTACGGCAAAGAATC-3' (identificador de secuencia n.°: 68).

La subclonación del dominio variable de cadena ligera del clon n.° 111 del anti-factor D humanizado en pAEP1 introducido a valina (V) en la posición 104 porque la posición 104 está a 2 aminoácidos en la cadena de sitios de restricción de endonucleasa, EcoRV y Kpnl, que se utilizan para insertar un dominio variable de cadena ligera deanti-factor D humanizado, clon n.° 111 en el pAEP1 y por lo tanto es el soporte del plásmido pAEP1.

En la presente memoria descriptiva se denomina al plásmido intermedio resultante como "pAEP1-283-VL".

La subclonación del dominio variable de la cadena pesada del clon del Fab anti-factor D n.° 1 1 1 en pAÉP1-238-VL involucró el enlace de dos fragmentos de ADN. El primer fragmento fue el vector pAEP1-238-VL, en el cual se removió el pequeño fragmento BsiWI/PspOMI. El segundo fragmento fue de aproximadamente 364 pares de bases BsiWI-PspOMI PCR producido a partir del plásmido de cadena pesada para el clon de Fab anti-factor D humanizado n.° 1 1 1 , utilizando los siguientes cebadores: 5' - TTTGGGTTTCGTACGCTCAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGG-3' (identificador de secuencia n.°: 69) 5' - TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3' (identificador de secuencia n.°: 70).

La unión de los dos fragmentos de ADN produjo la variante 238 del Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado (también denominado en la presente memoria descriptiva como "238" y al plásmido se le denomina "p238").

Después de la subclonación de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anti-factor D humanizado n.° 11 1 , se utilizó la mutagénesis de PCR orientada al sitio para mutar la glutamina (Q) en la posición 1 (según la numeración de Kabat, véase la Figura 1 ) del dominio variable de la cadena pesada del Fab de la variante del anticuerpo 238 anti-factor D humanizado a glutamato (E), produciendo la variante 238-1 del Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado (también denominado en la presente memoria descriptiva como "238-1 "). La construcción del plásmido de la variante 238-1 del Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado (el plásmido se denomina en la presente memoria descriptiva como "p238-1 ") involucra la unión de dos fragmentos de ADN. El primer fragmento es el vector p238 en el cual se removió el pequeño fragmento BsiWI/PspOMI.

El segundo fragmento fue de aproximadamente 364 pares de bases BsiWI-PspO I PCR producido a partir del plásmido p238, utilizando los siguientes cebadores: 5' - TTTGGGTTTCGTACGCTGAAGTCCAGCTGGTGCAATCTGGG-3' (identificador de secuencia n.°: 71 ) 5' - TTTGGGTTTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3' (identificador de secuencia ri.°: 72).

La unión de los dos fragmentos de ADN produjo la variante 238-1 del Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado (también denominado en la presente memoria descriptiva como "238-1 "; y al plásmido se le denomina "p238-1 "), que se incluye en la mutación orientada a los sitios de la posición 1 a glutamato (E). Se determinó que esta mutación inhibe la conversión parcial de la glutamina (Q) en la variante 238-1 del Fab del anticuerpo antifactor D humanizado a piroglutamato (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol., 9: 1-140 (1996)).

Adicionalmente, se puede utilizar mutagénesis de PCR orientada al sitio para mutar residuos de metionina (M o Met) o triptófano (W o Trp) para evitar la oxidación o para mutar residuos de asparagina (N o Asn) para evitar la desamidación. Para prevenir la formación de las variantes oxidadas de los anticuerpos anti-factor D humanizados, se pueden mutar las metioninas (M o Met), por ejemplo, en la posición 33 de la cadena ligera a leucina (L o Leu) que es muy similar en tamaño e hidrofobicidad a la metionina, pero carece de un sulfuro para la oxidación o alternativamente, se puede mutar a isoleucina (I o lie) (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol., 9:1-140 (1996)). Para evitar la formación de variantes desamidadas de los anticuerpos anti-factor D humanizados, se pueden mutar las asparaginas (N o Asn), por ejemplo, en la posición 34 y 52 de la cadena ligera o en la posición 99 ó 100 de la cadena ligera a glutamina (Q o Gln) que es muy similar químicamente a la asparagina (N o Asn), o se puede mutar a alanina (A o Ala) o serina (S 14 o Ser) que son sustituciones comunes en esas posiciones en otros anticuerpos (Amphlett, G. y col., Pharm. Biotechnol. , 9:1-140 (1996)).

Las Figuras 1 y 2 muestran las secuencias del dominio variable de la cadena ligera y de la cadena pesada de la variante 238 del Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado (identificador de secuencia n.° 6 y 18, respectivamente) y la variante 238-1 del Fab de anticuerpo anti-factor d humanizado (identificadores de secuencia n.°: 7 y 19, respectivamente). La Figura 4 y la Figura 6 muestran las secuencias de la cadena ligera y de la cadena pesada (identificadores de secuencia n.°: 47 y 54, respectivamente) para la variante 238 de Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado. La Figura 8 y la Figura 10 muestran las secuencias de la cadena ligera y de la cadena pesada (identificadores de secuencia n.°: 61 y 63, respectivamente) para la variante 238-1 de Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado.

Los datos obtenidos con BiaCore mostraron afinidad de la variante 238 de Fab del anticuerpo anti-factor D humanizado hacia el factor D humano, así como afinidad de la versión del clon n.° 1 1 1 del mAb anti-factor D humanizado de longitud completa (mAb 234 anti-factor D humanizado de longitud completa) (denominado en la presente memoria descriptiva como "234" o "mAb 234 anti-factor D de longitud completa" o "mAb 234 antifactor D humanizado de longitud completa") (Tabla 2). Las variantes 238 y 238-1 del Fab de anticuerpo anti-factor D humanizado también se analizaron en el ensayo de inhibición de hemolisis (Figura 1 ) para evaluar la inhibición de la vía alterna (véase el Ejemplo 3).

Ejemplo 2: Ensayo de hemolisis de la vía alterna (AP) Se determinó la función biológica de los anticuerpos anti-factor D modificados utilizando el ensayo de inhibición hemolítica con suero humano depletado de C1q y el análisis BIAcore (véase el Ejemplo 3 a continuación). El ensayo hemolítico se realizó como se indica a I continuación.

Para determinar la actividad de la vía alterna, se lavaron los eritrocitos de conejo (Er, Colorado Serum) 3x en GVB y se resuspendieron a 2 x 109/ml. Se mezclaron los inhibidores (50µ?) y 20µ? de suspensión Er en relación de 1 :1 con GVB/0.1 M EGTA/0.1M MgCI2. La activación del complemento se inició al agregar suero humano depletado de C1q (para evitar cualquier activación del complemento por la vía clásica) (CompTech; 30 µ? dilución 1 :3 en GVB). Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió 200 µ? GVB/10 mM EDTA para detener la reacción y se centrifugaron las muestras durante 5 minutos a 500 g. Se determinó la hemolisis en 200 µ? de sobrenadante por una medida de absorbancia a 412 nm. Los datos se expresaron en % de hemolisis inducida en ausencia del inhibidor.

La Figura 11 muestra la inhibición que produce el Fab anti-factor D humanizado, clon n.° 111 (IC50 = 4,7 ± 0,6 nM), Fab anti-Factor D modificado 238 (IC50 = 6,4 ± 0,6 nM) y Fab anti-factor D modificado 238-1 (IC50 = 3,5 ± 0,5 nM) sobre la hemolisis de la vía alterna, usando el ensayo de hemolisis de los glóbulos rojos de conejo, usando suero humano depletado de C1q como fuente de complemento. Los controles fueron los anticuerpos del factor H ('fH humano") (de CompTech) y anti-glucoproteína 120 ("xgp120").

Ejemplo 3: Análisis cinético del Fab del factor D anti-humano mediante BiaCore La constante cinética y de afinidad por la unión del factor D humano D (Advanced Research, Inc.) al Fab 238 anti-factor D modificado inmovilizado (denominado en la presente memoria descriptiva como "238"; véase el Ejemplo 1) se determinaron por mediciones con resonancia plasmón de superficie con los instrumentos BiaCore 3000 y BiaCore A100. Con respecto a los valores de la Tabla 2 enumerados como resultados "BiaCore 3000/BiaCore A100" se realizaron experimentos separados en cada instrumento, los datos de los experimentos separados se analizaron para obtener las constantes cinéticas, de las cuales se obtuvo el promedio para obtener los valores que se muestran en la Tabla 2. Alternativamente, se puede medir la constante cinética y de afinidad por la unión al factor D humano inmovilizando el factor D humano y midiendo la unión del mAb o Fab por medio de diferentes condiciones de regeneración (por ejemplo, con MgCI2 4M) y/o medirlas usando diferentes tampóns de unión (por ejemplo, con PBS). El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-factor D humanizado de longitud completa en la versión del clon n.° 1 1 1 (denominado en esta memoria descriptiva como "234" o "mAb 234 anti-factor D de longitud completa" o "mAb 234 anti-factor D humanizado de longitud completa") también se analizó. 1. Inmovilización Los mAb o Fab se inmovilizaron mediante el acoplamiento de aminas usando un protocolo estándar suministrado por el fabricante. La densidad del acoplamiento se reguló por el ajuste de la concentración o el pH de las soluciones de mAb o Fab inyectadas, de tal forma que la señal total de la unión saturada del factor D humano fue de 50 a 150 unidades de resonancia (RU). Después del acoplamiento de la cantidad deseada de mAb o Fab, se bloquearon los grupos funcionales que no reaccionaron del chip sensor con una inyección de etanolamina. 2. Análisis cinético Los experimentos de unión se realizaron por inyección de alícuotas de 60 µ? de una serie de soluciones de factor D humano en varias concentraciones de 500 nM a 0,98 nM en incrementos del doble. Todas las muestras se diluyeron en un tampón compuesto de 150 mM de NaCI, Tween-20 al 0,01 % y uno de los siguientes componentes de tampón: (a) pH 7,2 (10 mM HEPES (ácido 4-(2-hidroxiet¡l)-1-piperazinetanosulfónico), (b) pH 6,0 (10 mM MES (ácido 2-[N-Morfol¡no]etanosulfónico) o pH 5,0 (10 mM acetato de sodio). La tasa de flujo fue de 30 pL/min y la disociación se monitoreó durante 10 minutos para cada concentración del factor D humano que se analizó. La señal (sensograma) observada por inyección de las mismas soluciones en una célula de referencia (bloqueo de etanolamina) se restó del sensograma. La superficie se regeneró entre sensogramas con inyección de 30 pL de 4 M MgCI2 para provocar la disociación del factor D humano restante unido al anticuerpo inmovilizado. El sensograma de control registrado para la inyección del tampón únicamente sobre la superficie del chip sensor se restó de los sensogramas del factor D humano. Estos datos se analizaron por regresión lineal de acuerdo con un modelo de unión de Langmuir 1 :1 , utilizando BIAevaluation software v4.1. En la Tabla 2 a continuación se presenta la constante cinética y la constante de afinidad. La tecnología BiaCore es limitada y no es posible medir con exactitud las tasas activas que son demasiado rápidas (es decir, los valores de KD menores de aproximadamente 10 pM) (Safsten y col., Anal. Biochem., 353: 181 (2006)).

Tabla 2: Resultados BIAcore Ejemplo 4: Ensayo de hemólisis de la vía alternativa (AP) con varias concentraciones de factor D La función biológica de los anticuerpos (Ab) anti-factor D, que incluyen los Fab anti-factor D 238, se determinó mediante el ensayo de la inhibición de hemólisis, usando suero humano depletado de C1q y el análisis BiaCore (consulte el Ejemplo 2 arriba) en presencia de tres concentraciones del factor D.

El suero humano depletado de C1q (CompTech), así como el fluido vitreo y el tejido de la membrana de Bruch de los ojos de pacientes con AMD (obtenidos por colaboración del Colé Eye Institute, Cleveland, OH) se analizaron por el método de ELISA para determinar cuantitativamente el factor D (vea a continuación). La concentración del factor D en el suero depletado de C1q fue de 97 nM, mientras el nivel en el fluido vitreo y en el tejido de la membrana de Bruch de los pacientes con AMD fue de 16,2 ± 10,3 nM (media ± SD, n=10).

Se midió cuantitativamente el facto D por el método de ELISA diluyendo anticuerpos policlonales anti-factor D del complemento humano de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 1 pg/mL en solución salina de tampón de fosfato (PBS) y recubriendo el anticuerpo policlonal anti-factor D (R&D Systems, Minneapolis, MN) en placas de 384 pocilios paral ELISA (de alta unión; Greiner Bio One a través de VWR International, Bridgeport, NJ) durante una incubación durante la noche a 4 °C. Después de lavar 3 veces con tampón de lavado (PBS / 0,05 % Tween-20), se bloquearon las placas durante 1 - 2 h con PBS/albúmina de suero bovino al 0,5 % (BSA). Ésta y todas las demás incubaciones se realizaron a temperatura ambiente en un agitador orbital. Se preparó una curva estándar del factor D (Complement Technology, Inc., Tyler, Texas) en PBS/0,5 % BSA/0,05 % Tween-20 en un rango de 15,6 - 1.000 pg/ml. Se descongelaron los controles prediluidos para cuantificar en las regiones alta, media y baja de la curva estándar. Las muestras del suero humano depletado de C1q, del fluido vítrico y de la membrana membrana de Bruch lisada se diluyeron con diluyente de ensayo (PBS / 0,5 % BSA / 0,5 % Tween-20). Tras el paso de bloqueo, las placas se lavaron y las muestras se diluyeron (suero, fluid vítrico y lisados de membrana de Bruch), los estándares y los controles se añadieron y se incubaron durante 2 horas. Después de 2 h de incubación se lavaron las placas y se detectó el factor D unido durante una incubación de 1 a 2 horas con un anticuerpo monoclonal anti-factor D biotinilado (clon 9G7.1.16, producido por Genentech, diluido a 62,5 ng/ml) seguido de una incubación durante 30 minutos con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (SA-HRP)_(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), diluido 1/10,000 en diluyente de ensayo. Después de un paso final de lavado, se añadió tetrametilbenzidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y se reveló el color durante 5 a 7 minutos. La reacción se detuvo con la adición de 1 M de ácido fosfórico. La densidad óptica se obtuvo usando un lector de microplacas (450 nm, i 650 nm de referencia), y las concentraciones de muestras se calcularon a partir de ajustes de 4 parámetros de las curvas estándar. Las concentraciones mínimas cuantificables del factor D en las muestras humanas del fluido vitreo y en el lisado de la membrana de Bruch fueron de 780 pg/mL (dilución mínima de 1/50) y 156 pg/mL (dilución mínima de 1/10), respectivamente.

Para determinar los valores de IC50 e IC90 de la inhibición de la vía alterna del complemento utilizando Fab anti-factor D 238 modificado en presencia de concentraciones de factor D similares a las concentraciones de factor D que se observan en el fluido vitreo y en los tejidos de la membrana de Bruch de los pacientes con AMD, el ensayo hemolítico se realizó según se describe en el Ejemplo 2, usando suero depletado de C1q al 10 % (9,7 nM de factor D) o suero depletado de C1q al 10 %suplementado con factor D adicional (CompTech)) para alcanzar las concentraciones de factor D que representaran la concentración media (16,2 nM) o la media + 1 SD (26,5 nM) que se observa en el fluido vitreo y en los tejidos de la membrana de Bruch de los ojos de los pacientes con AMD. Los datos se expresaron como % de hemolisis inducida en ausencia del inhibidor (Figura 12). Las concentraciones de Fab anti-factor D 238 que causan el 50 % y el 90 % de inhibición de la reacción hemolítica (valores de IC5o e IC90, respectivamente) se determinaron mediante tres experimentos repetidos por regresión no lineal de las curvas de inhibición utilizando un modelo de ecuación de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading, PA). También se calcularon las proporciones molares de los valores de IC50 e IC90 contra la concentración relativa del factor D. En la Tabla 3 se muestran los valores promedio de IC50 e IC90 y las proporciones molares.

Tabla 3: IC50 e IC90 de Fab anti-factor D Fab anti-factor D 315 (238-1) Concentración IC50 IC90 de factor D nM Proporción nM Proporción (nM) molar molar (ICso/fD) (IC90/fD) 9,7 (nM) 4,4 ± 1 ,5 0,454 14,0 ± 1 ,443 1 ,0 16,2 (nM) 10,2 ± 0,630 38,0 2,346 0,8 ±11 ,0 26,5 (nM) 23,9 ± 0,902 72,6 ± 2,740 5,0 4,8 Ejemplo 5: Duración de la inhibición de la activación de la vía alterna del complemento Se determinó la duración simulada de la inhibición de la activación de la vía alterna (AP) del complemento en un ojo humano, utilizando una única inyección intravítrea (IVT) de Fab anti-factor D 238 a una dosis de 2,5 mg (asumiendo una semivida (½) del Fab antifactor D 238 de 11 ,5 días con base en la escala interespecífica de conejo).(Ejerhplo 13) Los datos simulados se basan en la escala de un estudio PK de una dosis única intravítrea de Fab 238 en conejos blancos de Nueva Zelanda.

Para calcular la semivida de Fab anti-factor D 238 en humanos, se calculó la semivida del antifactor-D 238 en conejos. A doce (12) conejos blancos de Nueva Zelanda se les administró una dosis única intravítrea de 1 mg Fab 238 en cada ojo. Se obtuvo muestras de humor vitreo y de tejido retiniano de ambos ojos de la cantidad especificada de animales en los siguientes tiempos: 3 animales a las 4, 24 y 96 horas (n=6 muestras en cada punto de tiempo) y un animal a las 216 horas (n=2 muestras en este punto de tiempo) y 2 animales a las 240 horas (n=4 muestras en este punto de tiempo). Las concentraciones de Fab 238 en las matrices oculares se determinaron por un método de ELISA para medir la unión del factor D.

Los datos de concentración-tiempo de todos los animales se analizaron para calcular los estimados del parámetro farmacocinético utilizando un método de recolección virgen con el modelo de administración de bolo IV (Modelos 201 , WinNonlin Pro versión 5.2.1 ; Pharsight Corporation, Mountain View, CA) para calcular un estimado de semivida terminal (T1 2) de 3,83 días. El coeficiente de partición de la retina se calculó como la proporción entre la concentración del tejido retiniano y la del humor vitreo, en promedio de todos los ojos en todos los puntos de tiempo y es igual a 0,24. Los parámetros PK del humor vitreo se calcularon para los humanos utilizando los mismos factores de escala que se observan con ranibizumab. Se asume que el ojo humano tiene un Vi de 4 mL, la proporción de la semivida en el humano respecto a la del conejo se asume que es de 3, que da un estimado de t1 2 en humanos de 1 1 ,5 días. Este dato permite estimar la concentración vitrea y la concentración del tejido retinal en función de tiempo de la siguiente manera: Concentración vitrea = (Dosis/V1)*exp([-ln(2)/t1/2]*tiempo) Concentración en tejido retiniano = (Dosis/V1)*exp([-ln(2)/t1/2]*tiempo)*(coeficiente de partición retiniana) En la Figura 13 la gráfica se realizó con una dosis única ITV de 2,5 mg/ojo y representa el tiempo desde t=0 hasta t=1 12 días. El valor de IC90 representa la concentración de Fab 238 que produce un 90 % del efecto inhibidor en el ensayo de hemolisis que se realizó como se muestra en los Ejemplos 2 y 4, en los cuales el 10 % del pool de sueros humanos se suplemento con factor D a una concentración de 16,2 nM. El resultado del ensayo fue IC90 = 38 nM Fab 238. Para comparar las concentraciones en la retina y en el humor vitreo se realizó una conversión molar utilizando la siguiente ecuación: IC90 = 38 x 10"9 moles/L MW de Fab 238 = 50,000 gramos/mol IC90 (ug/mL) = (38 x 10"9 moles/L) x (50 x103 gramos/mol) = 1 ,9 x 10"9 gramos/L, o 1 ,9 ug/ml_ Según se muestra en la Figura 13, los "días sobre IC90" se estimaron como la cantidad de tiempo que se predice que la concentración vitrea o retinal permanece arriba de 1 ,9 ug/mL después de una dosis única ITV de 2,5 mg/ojo y se observó como el punto en el cual la gráfica de la concentración vitrea o retiniana cruza la línea en 1 ,9 ug/mL. Se estimó que una inyección IVT única de Fab anti-factor D 238 inhibió la activación AP del 15 complemento en el tejido retiniano durante al menos 74 días y en humor vitreo durante al menos 97 días. La línea interrumpida de la Figura 13 demuestra la concentración simulada del Fab anti-factor D 238 en el humor vitreo después de la administración intravítrea. La línea sólida de la Figura 13 muestra la concentración simulada del Fab anti-factor D 238 en el tejido retiniano después de la administración intravítrea. La diferencia en la concentración en el humor vitreo y en el tejido retiniano se basa en un estimado del coeficiente de partición del tejido retiniano de 20 %, en otras palabras, 20 % del total del fármaco que se administra al humor vitreo tendrá acceso al tejido retiniano. Los expertos en la materia reconocerán o podrán obtener, utilizando experimentos habituales, muchos equivalentes de las formas de realización específicas de la invención descrita en la presente memoria descriptiva. Se pretende que estos equivalentes se engloben en las reivindicaciones que se especifican a continuación.

Aunque la anterior invención se ha descrito con cierto detalle a modo ilustrativo y ejemplar para facilitar la claridad de comprensión, las descripciones y los ejemplos no deberían interpretarse de forma que limiten el ámbito de la invención. El contenido de todas las patentes y documentos científicos citados en la presente memoria descriptiva quedan expresamente incorporados en su integridad en la misma a modo de referencia Se considera que lo expuesto hasta el momento en la presente memoria descriptiva es suficiente para permitir que un experto en la materia practique la invención. La presente invención no tiene un ámbito de aplicación limitado por la construcción depositada, dado que el objetivo de la realización depositada es ilustrar determinados aspectos de la invención y cualquier construcción funcionalmente equivalente queda dentro del ámbito de aplicación de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en esta memoria, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y se encuentran dentro del ámbito de aplicación de las reivindicaciones incluidas más adelante.

Claims

Reivindicaciones

1. Un anticuerpo anti-factor D que comprende HVR de cadena ligera de un anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo anti-factor D comprende además una sustitución en una o más posiciones de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo de referencia comprende HVR-1 de cadena ligera que contiene ITSTDIDDDMN (identificador de secuencia n.°: 30), cadena ligera HVR-2 que comprende GGNTLRP (identificador de secuencia n.°: 35) y cadena ligera HVR-3 que comprende LQSDSLPYT (identificador de secuencia n.°: 38) donde dicha sustitución es una o más de las siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

2. Un anticuerpo anti-factor D que comprende HVR de cadena pesada de un anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo anti-factor D comprende además una sustitución en una o más posiciones de dicho anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo de referencia comprende una HVR-1 de cadena pesada que contiene GYTFTNYGMN (identificador de secuencia n.°: 39), cadena pesada HVR-2 que comprende WINTYTGETTYADDFKG (identificador de secuencia n.°: 40) y de la cadena pesada HVR-3 que comprende EGGVNN (identificador de secuencia n.°: 41) donde dicha sustitución es una o más de las siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

3. Un anticuerpo anti-factor D que comprende HVR de cadena ligera y de cadena pesada de un anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo anti-factor D comprende además una sustitución en una o más posiciones de dicho anticuerpo de referencia, donde dicho anticuerpo de referencia comprende una HVR-1 de cadena ligera que contiene ITSTDIDDDMN (identificador de secuencia n.°: 30), cadena ligera HVR-2 que comprende GGNTLRP (identificador de secuencia n.°: 35) y cadena ligera HVR-3 que comprende LQSDSLPYT (identificador de secuencia n.°: 38) y de la cadena pesada HVR-1 que comprende GYTFTNYGMN (identificador de secuencia n.°: 39), cadena pesada HVR-2 que comprende WINTYTGETTYADDFKG (identificador de secuencia n.°: 40) y de la cadena pesada HVR-3 que comprende EGGVNN (identificador de secuencia n.°: 41 ) donde dicha sustitución es una o más de las siguientes: (a) el aminoácido de la posición 33 de la cadena ligera es L o I, (b) el aminoácido de la posición 34 de la cadena ligera es A o Q, (c) el aminoácido de la posición 52 de la cadena ligera es S o A, (d) el aminoácido de la posición 104 de la cadena ligera es V, (e) el aminoácido de la posición 1 de la cadena pesada es E; (f) el aminoácido de la posición 99 de la cadena pesada es A o Q, (g) el aminoácido de la posición 100 de la cadena pesada es A o Q.

4. Un anticuerpo anti-factor D que comprende: (a) al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas en el grupo formado por: (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 39; (¡i) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de. identificador de secuencia n.°: 40; (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 41 , identificador de secuencia n.°: 42, identificador de secuencia n.°: 43, identificador de secuencia n.°: 44 y el identificador de secuencia n.°: 45; (iv) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 30, identificador de secuencia n.°: 31 , identificador de secuencia n.°: 32, identificador de secuencia n.°: 33 y el identificador de secuencia n.°: 34; (v) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 35, identificador de secuencia n.°: 36 y el identificador de secuencia n.°: 37; y (vi) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 38, o (b) al menos una variante de la HVR, donde la variante de la HVR incluye la modificación de al menos un residuo de la secuencia descrita en el identificador de secuencia n.°: 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37 ó 38.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una HVR-H1 que comprende la de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 39

6. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de HVR-H2, que comprende la secuencia amínoacídica del identificador de secuencia n.°: 40.

7. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de HVR-H3, que comprende la secuencia amínoacídica del identificador de secuencia n°: 41.

8. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de HVR-L1 , que comprende la secuencia amínoacídica del identificador de secuencia n°: 30.

9. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de HVR-L2, que comprende la secuencia amínoacídica del identificador de secuencia n°: 35.

10. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de HVR-L3, que comprende la secuencia amínoacídica del identificador de secuencia n°: 38.

11. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una HVR-H1 que comprende la de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 39, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 40 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 41.

12. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una secuencia de HVR-L1 , que comprende la secuencia amínoacídica del identificador de secuencia n°: 30, una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 35, una HVR-L3 que comprenda la secuencia de¦ aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 38.

13. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una HVR-H1 que comprende la de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 39, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 40, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.° 41 , una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 30, una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 35, una HVR-L3 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 38.

14. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con 5 respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 18.

15. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 10. 19.

16. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 6. 15

17. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 7.

18. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio 20 variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 18 y un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identificación de secuencia de aminoácidos de, identificador de secuencia n.°: 6.

19. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio 25 variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 19 y un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identificación de secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 7.

20. Un anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada seleccionada del identificador de secuencia n.°: 18, identificador de secuencia n.°: 19, identificador de secuencia n.°: 20, identificador de secuencia n.°: 21 , identificador de secuencia n.°: 22, identificador de secuencia n.°: 23, identificador de secuencia n.°: 24, identificador de secuencia n.°: 25, identificador de secuencia n.°: 26, identificador de secuencia n.°: 27, identificador de secuencia n.°: 28 y el identificador de secuencia n.°: 29.

21. Un anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera seleccionada del identificador de secuencia n.°: 6, identificador de secuencia n.°: 7, identificador de secuencia n.°: 8, identificador de secuencia n.°: 9, identificador de secuencia n.°: 10, identificador de secuencia n.°: 11 , identificador de secuencia n.°: 12, identificador de secuencia n.°: 13, identificador de secuencia n.°: 14, identificador de secuencia n.°: 15, identificador de secuencia n.°: 16 y el identificador de secuencia n.°: 7.

22. Un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos siguiente: X!VQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGE TTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCEREGGVX2X3WGQGTLVTVSS (identificador de secuencia n.°: 74), donde es Q o E; X2 es N, A o Q y X3 es N, A o Q.

23. Un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos siguiente: DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDX4X5WYQQKPGKVPKLLISGGX6TLRPGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDSLPYTFGQGTKX7EIK (identificador de secuencia n.°: 73), donde X4 es M, L o I; X5 es N, A o Q; X6 es N, S o A y X7 es L o V.

24. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo compuesto por identificador de secuencia n.°: 18, identificador de secuencia n.°: 19, identificador de secuencia n.°: 20, identificador de secuencia n.°: 21, identificador de secuencia n.°: 22, identificador de secuencia n.°: 23, identificador de secuencia n.°: 24, identificador de secuencia n.°: 25, identificador de secuencia n.°: 26, identificador de secuencia n.°: 27, identificador de secuencia n.°: 28 y el identificador de secuencia n.°: 29.

25. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo compuesto por identificador de secuencia n.°: 6, identificador de secuencia n.°: 7, identificador de secuencia n.°: 8, identificador de secuencia n¡°: 9, identificador de secuencia n.°: 10, identificador de secuencia n.°: 11, identificador de secuencia n.°: 12, identificador de secuencia n.°: 13, identificador de secuencia n.°: 14, identificador de secuencia n.°: 15, identificador de secuencia n.°: 16 y el identificador de secuencia n.°: 17.

26. Un anticuerpo anti-factor D que comprende el polipéptido de la reivindicación 22.

27. Un anticuerpo anti-factor D que comprende el polipéptido de la reivindicación 23.

28. El anticuerpo anti-factor D que comprende el polipéptido de la reivindicación 22 y el polipéptido de la reivindicación 23.

29. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 18.

30. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 19.

31. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia de un dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 6.

32. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia de un dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 7.

33. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 18 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 6.

34. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 19 y el dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 7.

35. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 54.

36. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 63.

37. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 47.

38. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 61.

39. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 54 y un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 47.

40. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del identificador de secuencia n.°: 63 y un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 61.

41. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 54.

42. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 63.

43. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia de un dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 47.

44. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 61.

45. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 54 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 47.

46. El anticuerpo de la reivindicación 4, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada del identificador de secuencia n.°: 63 y la secuencia del dominio variable de la cadena ligera del identificador de secuencia n.°: 61.

47. El polipéptido que comprende el aminoácido seleccionado de un grupo que incluye los identificadores de secuencia n.°: 47 y 61.

48. El polipéptido que comprende el aminoácido seleccionado de un grupo que incluye los identificadores de secuencia n.°: 54 y 63.

49. El anticuerpo de la reivindicación 4 ó 14-19 ó 26-28, donde el anticuerpo es humanizado.

50. El anticuerpo de la reivindicación 4 ó 14-19 ó 26-28, donde el factor D es de mamífero.

51. El anticuerpo de la reivindicación 50, donde el factor D es humano.

52. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la reivindicación 4 ó 14-19 ó 26-28.

53. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de las reivindicaciones 22-25 ó 47-48.

54. Un vector que comprenda el polinucleótido de la reivindicación 52 ó 53.

55. Una célula huésped que incluya el vector de la reivindicación 54.

56. La célula huésped de la reivindicación 55, donde la célula huésped es eucariótica.

57. La célula huésped de la reivindicación 55, donde la célula huésped es una célula CHO.

58. Un método de fabricación de un anticuerpo anti-factor D, en el que el método comprende (a) el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 56 ó 57 en condiciones aptas para la expresión del polinucleótido que codifica el anticuerpo, y (b) el aislamiento del anticuerpo.

59. El anticuerpo de la reivindicación 4 ó 14-19 ó 26-28, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

60. El anticuerpo de la reivindicación 59, donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre el fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv o (Fab')2.

61. El anticuerpo de la reivindicación 59, donde el anticuerpo es humanizado.

62. El anticuerpo de la reivindicación 59 que se produce en una bacteria.

63. El anticuerpo de la reivindicación 59 que se produce en células CHO.

64. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-factor D de la reivindicación 59 y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

65. Un artículo de fabricación que contiene: a) una formulación farmacéutica de la reivindicación 64, b) un envase contenedor y c) un prospecto o etiqueta donde se indica que el compuesto puede usarse para tratar el trastorno asociado al complemento.

66. Un kit que comprende un anticuerpo de la reivindicación 4 ó 14-19 ó 26-28 e instrucciones para la administración de dicho anticuerpo para el tratamiento de un trastorno asociado al complemento.

67. El método de la reivindicación 66, donde el trastorno asociado al complemento se selecciona del grupo compuesto por enfermedades oculares.

68. Un kit de la reivindicación 67, donde la enfermedad ocular se selecciona de un grüpo que comprende degeneración macular asociada con la edad, retinopatía diabética, neovascularización coroidea (CNV), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, oclusiones venosas' retinianas, incluida oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea y neovascularización retiniana.

69. Un kit de la reivindicación 68, donde la degeneración macular asociada a la edad se selecciona del grupo compuesto por AMD intermedia seca, atrofia geográfica y atrofia geográfica.

70. Un método de tratamiento de trastornos asociados al complemento seleccionados de un grupo que incluye los trastornos inflamatorios.

71. El método de la reivindicación 70, donde el trastorno inflamatorio es una enfermedad autoinmune.

72. Un método de la reivindicación 71 , donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que incluye enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple.

73. Un método de tratamiento de trastornos asociados al complemento seleccionados de un grupo que incluye los trastornos oculares.

74. Un método de la reivindicación 73, donde la enfermedad ocular se selecciona de un grupo que incluye la degeneración macular asociada a la edad, retinopatía diabética, neovascularización coroidea (CNV), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, oclusión de la vena central de la retina (OVCR), neovascularización de la córnea y neovascularización retiniana.

75. El método según la reivindicación 74, donde la degeneración macular asociada a la edad se selecciona del grupo que incluye la AMD intermedia seca, atrofia geográfica y atrofia geográfica.

76. El anticuerpo hecho por el proceso de: (a) cultivo de una célula que exprese un anticuerpo que comprenda un dominio variable de la cadena pesada de cualquiera de las reivindicaciones 14-15, 29-30, 35-36 o 41-42 y un dominio variable de la cadena ligera de cualquiera de las reivindicaciones 16-17, 31-32, 37-38 o 43-44 y (b) aislar el anticuerpo de dicha célula cultivada.