MX2015003281A

MX2015003281A - Metodos y composiciones para impedir la mala incorporacion de norleucina en proteinas.

Info

Publication number: MX2015003281A
Application number: MX2015003281A
Authority: MX
Inventors: Michael W Laird; Karthik Veeravalli
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2015-07-06
Also published as: JP6796631B2; CA2882463C; IL272866A; WO2014047311A1; JP6479661B2; US10421984B2; AR092630A1; AU2017203049A1; US20180080056A1; KR102123134B1; RU2681928C2; MX363187B; IL237310A0; JP2015528314A; RU2015111350A; EP3502267A1; ZA201501653B; JP2021048849A; US20160186227A1; HRP20190060T1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para impedir la incorporación de norleucina en proteínas durante la producción de proteína recombinantes en bacterias. La presente invención también proporciona células hospedadoras de microorganismos y moléculas de ácido nucleico para el uso con los métodos y composiciones proporcionados en la presente.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA IMPEDIR LA MALA INCORPORACIÓN DE NORLEUCINA EN PROTEÍNAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas durante la producción de proteínas recombinantes en bacterias. La presente invención también proporciona células hospedadoras de microorganismos y moléculas de ácido nucleico para el uso con los métodos y composiciones proporcionados en la presente.

Antecedentes de la Invención La norleucina, un análogo del aminoácido metionina, se puede incorporar mal en las proteínas en lugar de los residuos de metionina. Cuando se expresan en Escherichia coli ( E . coli) , muchas proteínas heterólogas tienen mal incorporada a la norleucina en lugares donde deben aparecer residuos de metionina. La mala incorporación de norleucina en proteínas, en particular en proteínas heterólogas producidas por medios recombinantes, se considera en general indeseable debido, en parte, a la producción resultante de proteínas alteradas que tienen características indeseables.

La mala incorporación de norleucina en las posiciones de metionina durante la producción de proteínas recombinantess en E. coli se ha observado durante más de 50 años. (Ver, por ejemplo, Munier y Cohen (1959) Biochim Biophys Acta 31:378-391; Cohén and Munier (1956) Biochim Biophys Acta 21:592-593; Cohén y Munier (1959) Biochim Biophys Acta 31:347-356; y Cowie et al., (1959) Biochim Biophys Acta 34:39-46). Por ejemplo, aproximadamente 14% de los residuos de metionina en la somatotropina bovina de metioniol (MBS) exhibieron mala incorporación de norleucina durante la producción recombinante de esta proteína en E. coli, g aproximadamente 6% de los residuos de metionina en las proteínas nativas de E. coli también se sustituyeron con norleucina. (Ver Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:31-9). En otro ejemplo, la producción de la interleucina-2 en una fermentación de E. coli de medio mínimo dio por resultado que aproximadamente 19% de los residuos de metionina en la proteína recombinante estuvieran sustituidos con norleucina. (Ver Tsai et al, (1988) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739). Otros estudios mostraron que la mala incorporación de residuos de norleucina en la proteína puede presentarse tanto en residuos internos de metionina como en residuos amino-terminales de metionina. (Ver Brown (1973) Biochim Biophys Acta 294: 527-529; y Barker y Bruton (1979) J Mol Biol. 133:217-231).

La norleucina compite con la metionina para la incorporación en proteínas debido a la naturaleza promiscua de la enzima metionil-AENt-sintetasa (MetG). (Ver Trupin et al, (1966) Biochem Biophys Res Commun 24:50-55; y Fersht y Dingwall (1979) Biochemistry 18:1250-1256). Los estudios cinéticos con la enzima MetG de E. coli mostraron que la acilación de MetG es aproximadamente 4 veces mayor con metionina en comparación a aquella con norleucina. (Veer van Hest et al, (2000) Am Chem Soc 122:1282-1288). Debido a la especificidad relajada de substrato de MetG, la norleucina puede sustituir a la metionina en la reacción de acilación, dando por resultado una mala incorporación de norleucina en proteínas en lugar de metionina.

La mala incorporación de residuos norleucina por residuos de metionina en la producción de proteínas recombinantes en general se considera indeseable. Las proteínas o polipéptidos recombinantes que contienen residuos mal incorporados de norleucina pueden exhibir características funcionales y estructurales y alteradas, tal como, por ejemplo, sensibilidad alterada a proteolisis, actividad biológica disminuida, o inmunogenicidad incrementada.

Se han desarrollado varias estrategias para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes. Por ejemplo, complementando el medio de cultivo celular con metionina durante el proceso de fermentación (por alimentación/adición continua o en bolo metionina) se ha usado para asegurar que esté disponible un exceso de metionina a las células, reduciendo de este modo la probabilidad de una carga incorrecta de metionil-ARNt con norleucina. (Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 5,599,690). En tanto que la alimentación/adición continua o en bolo de metionina redujo el grado de mala incorporación de norleucina en proteínas recombinantes, puede incrementarse la complejidad operativa y el costo del proceso de fermentación. Además, la alimentación/adición continua o en bolo de metionina durante la fermentación puede conducir a dilución indeseable de los contenidos del fermentador, dando por resultado menores densidades celulares y menores rendimientos de producto.

La supresión de genes comprendidos en la ruta de biosíntesis de norleucina, tal como, por ejemplo, la supresión de genes del operón de leucina ( leuA , leuB, leuCc, y leuD) o la supresión de genes codificadores de transaminasa tal como ilvE o tyrB, también se ha usado para reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas. (Ver Bogosian et al, (1989) J Biol Chem 264:531-539; Tsai et al, (1989) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739; y Randhawa et al, (1994) Biochemistry 33:4352 -4362.) La supresión de los genes de ruta biosintética para impedir la mala incorporación de norleucina, sin embargo, puede requerir la adición de otros aminoácidos (tal como leucina o isoleucina) al medio de cultivo durante la fermentación puesto que también muchos genes comprendidos en la biosíntesis de norleucina también están comprendidos en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. (Ver Bogosian et al, (1989) J Biol Chem.264:531-539; ver Figura 8 de la presente especificación).

Otra estrategia usada para impedir la mala incorporación de norleucina comprendió la co-expresión de enzimas que degradan a la norleucina, incluyendo, por ejemplo, aminoácido-deshidrogenasas y aminoácidooxidasas. Sin embargo, este planteamiento requirió al sobreexpresión de estas enzimas, que no puede ser deseable durante la producción de proteínas recombinantes, y puede conducir a menores rendimientos de proteínas recombinantes. (Ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US2007/0009995). Además, la sobreexpresión de estas enzimas puede dar por resultado la degradación de otros aminoácidos análogos durante el proceso de fermentación. La alteración de la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido que se va expresar al sustituir codones de metionina con otros codones también se realizó para impedir la mala incorporación de norleucina. (Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No.5,698,418). Sin embargo, estas sustitución, pueden conducir a actividad disminuida o cambios estructurales en la proteína resultante, un resultado altamente indeseable para la producción de proteínas recombinantes en la industria bioteenológica.

Como se señala anteriormente, los métodos actuales usados para impedir la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes en microorganismos están asociados con varios desventajas; por lo tanto, existe una necesidad de nuevos métodos útiles para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas, en particular durante la producción de proteínas recombinantes y microorganismos, tal como E. coli .

La presente invención cumple esta necesidad al proporcionar células hospedadoras de microorganismos, manejadas, efectivas al impedir la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes en microorganismos, tal como, por ejemplo, bacterias. La presente invención proporciona, ínter alia, células hospedadoras de E. coli que comprenden alelos metA y metK mutados (es decir, secuencias de ácido nucleico de metA y metK alteradas) que dan por resultado la producción de metionina por el microorganismo a un grado o proporción suficiente para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas y polipéptidos. El análisis de proteínas recombinantes producidas utilizando estas células hospedadoras mostró que se eliminó la mala incorporación de residuos norleucina en lugar de residuos de metionina. La presente invención demuestra adicionalmente que el desempeño del proceso de fermentación usando estas células hospedadoras de E. coli , incluyendo el crecimiento de celulas hospedadoras y los títulos de productos de proteínas recombinantes que utilizan estas células hospedadoras de E. coli , fue comparable a aquel observado en células hospedadoras de control.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona, en parte, métodos y composiciones para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas y polipéptidos. Los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinantes), y polipéptidos expresados por un microorganismo, tal como, por ejemplo, bacterias (por ejemplo, E. coli) .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido expresado por un microorganismo, en donde la mala incorporación produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en la proteína o polipéptido. En algunas modalidades, el microorganismo es un microorganismo de homoserina-succiniltransferasa resistente a retro-alimentación o insensible a retroalimentación. En otras modalidades, el microorganismo es un microorganismo que comprende un alelo metA mutante, un alelo metK mutante, o un alelo metA mutante y un alelo metK mutante.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA seleccionada del grupo que consiste de una sustitución de arginina a cisteína en la posición de aminoácido 27, una sustitución de glutamina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 64, una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294, una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296, y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para sustituciones de aminoácido en MetA que comprende una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296 y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298. Las posiciones de posiciones de aminoácido de MetA descritas en la presente especificación son con referencia a la secuencia de aminoácidos de MetA tipo silvestre como se muestra en la figura 7A y en SEQ ID NO: 29.

En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo met A mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.

Como se señala anteriormente, la presente invención proporciona métodos para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido expresado por un microorganismo, en donde el microorganismo produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en la proteína o polipéptido. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido expresado por un microorganismo, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en el microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo des-reprimido para la producción de metionina. En algunas modalidades, el microorganismo se des-reprime para la producción de metionina debido a la pérdida parcial de función de S-adenosilmetionina-sintasa. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación norleucina en una proteína o polipéptido expresado por un microorganismo, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en el microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metK mutante. En algunas modalidades, el alelo metK mutante da por resultado una pérdida parcial de función de MetK.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetK que comprende una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una supresión de la base citosina en la posición del residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK. Las posiciones de aminoácido de MetK, descritas en la presente especificación son con referencia a la secuencia de aminoácidos de MetK tipo silvestre como se muestra en la figura 8A y SEQ ID NO: 30. Las posiciones de aminoácido de MetK descritas en la presente especificación son con referencia a la secuencia de ácido nucleico MetK tipo silvestre como se muestra en la figura 8B y SEQ ID NO: 32.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo met K mutante, en donde el alelo met K mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante o un alelo metK. En otras modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294 de MetA y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185 de MetK. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294 de MetA, y en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una supresión de la base de citosina en la posición de residuo de aminoácido 1132 del alelo metK.

En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo mutante metA mutante y un alelo metK mutante, y en donde el alelo metA mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y el alelo metK mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27. En aun otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo met A mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo me tA mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y el alelo metK mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28.

La presente invención proporciona además células hospedadoras de microorganismos útiles para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas y polipéptidos expresados por una célula hospedadora de microorganismo. La presente invención también proporciona células hospedadoras de microorganismos para el uso en la expresión de proteínas o polipéptidos por la célula hospedadora de microorganismo, en donde las proteínas o polipéptidos expresados están libres de mala incorporación de norleucina. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo (por ejemplo, una célula hospedadora de microorganismo), en donde el microorganismo produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos expresados por el microorganismo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo es uunn microorganismo de homoserina- succiniltransferasa y insensible a retroalimentación. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo etA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA seleccionada del grupo que consiste de una sustitución de arginina a cisteína en la posición de aminoácido 27, una sustitución de glutamina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 64, una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294, una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296, y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. coli .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para más de una sustitución de aminoácido en MetA. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296 en MetA y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298 en MetA. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. coli .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo me tA mutante, en donde el alelo me tA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo (por ejemplo, una célula hospedadora de microorganismo), donde el microorganismo produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos expresados por el microorganismo. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo des-reprimido para la producción de metionina. En algunos aspectos, el microorganismo des-reprimido para la producción de metionina resulta de la pérdida parcial de función de S-adenosilmetionina-sintasa. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo met K mutante. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetK que comprende una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una supresión de la base de citosina en la posición de residuo de ácido nucleico 1132 en el alelo metK. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. col i .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. coli .

La presente invención también proporciona células hospedadoras de microorganismos que comprenden varias combinaciones de alelos metA mutantes y alelos metK mutantes. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante y un alelo etK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA que comprende una sustitución de tirosina de cisteína en la posición aminoácido 294, y en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetK que comprende una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA que comprende una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294, y en donde el alelo metK mutante comprende una supresión de la citosina de ácido nucleico en el residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y en donde el alelo metK mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y en donde el alelo metK mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28. En algunas modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es una bacteria. En otras modalidades, la célula hospedadora de microorganismo es E. coli .

La presente invención también proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico para el uso en los presentes métodos. En algunos aspectos, la presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico de metA (es decir, moléculas aislada de ácido nucleico que codifican para MetA). En algunas modalidades, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico de metA, en donde la molécula de ácido nucleico de metA comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA seleccionada del grupo que consiste de una sustitución de arginina a cisteína en la posición de aminoácido 27, una sustitución de glutamina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 64, una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294, una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296, y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298. En otras modalidades, una molécula aislada de ácido nucleico de met A proporcionada por la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. El uso de estas moléculas aisladas de ácido nucleico de met A y secuencias de estas para la producción de microorganismos para el uso en el impedimento o reducción de la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos se proporciona específicamente en la presente invención.

La presente invención también proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico metK (es decir, moléculas aisladas de de ácido nucleico que codifica para MetK). En algunas modalidades, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de metK, en donde la molécula de ácido nucleico de metK comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetK que comprende una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185. En otras modalidades, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de metK, en donde la molécula de ácido nucleico de metK comprende una supresión de la citosina de ácido nucleico en el residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK. En otras modalidades, una molécula de ácido nucleico de met K proporcionada por la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. El uso de estas moléculas aisladas de ácido nucleico de metK y secuencias de las mismas para la producción de microorganismos para el uso en la prevención o reducción de la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos se proporciona específicamente en la presente invención.

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que codifica para un alelo metA mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que corresponde a SEQ ID NO: 33 y un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que corresponde a SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo met K mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que corresponde a SEQ ID NO: 33 y un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que corresponde a SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E . col i .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo met A mutante y un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que corresponde a SEQ ID NO: 33 y un ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico que corresponde a SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26, y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti Factor-D. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo met A mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo met K mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo met A mutante y un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26, y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. En algunas modalidades, el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. col i .

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el microorganismo comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un ácido nucleico que comprende un alelo etA mutante y un alelo etK mutante, en donde el microorganismo comprende además un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26, y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunos aspectos, el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, E. coli .

La presente invención proporciona además un método para producir en una célula hospedadora bacteriana, una proteína o un polipéptido libre de la mala incorporación de norleucina, el método que comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para la proteína o el polipéptido, en donde la célula hospedadora bacteriana comprende un alelo metA mutante, un alelo metK mutante, o un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, produciendo de este modo una proteína o polipéptido libre de mala incorporación de norleucina. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26 , y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en una célula hospedadora bacteriana, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está libre de mala incorporación de norleucina, el método que comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, en donde la célula hospedadora bacteriana comprende un alelo metA mutante, un alelo metK mutante, o un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, produciendo de este modo un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo libre de la mala incorporación de norleucina. En algunos aspectos, el método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en una célula hospedadora bacteriana libre de mala incorporación de norleucina de acuerdo a la presente invención comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo. En algunos aspectos, el polipéptido de cadena pesada de anticuerpo es un polipéptido de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo, y el polipéptido de cadena ligera de anticuerpo es un polipéptido de cadena ligera de fragmento Fab de anticuerpo. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26, y el alelo met K mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF en una célula hospedadora bacteriana, donde el anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de anticuerpo anti-VEGF está libre de mala incorporación de norleucina, el método que comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de anticuerpo anti-VEGF, en donde la célula hospedadora bacteriana comprende un alelo me tA mutante, un alelo metK mutante, o un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, produciendo de este modo un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF libre de mala incorporación de norleucina. En algunas modalidades, el método comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo anti-VEGF o un polipéptido de cadena pesada de fragmento de anticuerpo anti-VEGF o fragmento del mismo y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo anti-VEGF o un polipéptido de cadena ligera de fragmento de anticuerpo anti-VEGF o fragmento del mismo. En algunos aspectos, la cadena pesada de anticuerpo anti-VEGF y la cadena ligera de anticuerpo anti-VEGF son de polipéptidos de anticuerpo anti-VEGF de cadena ligera y cadena pesada de longitud completa. En otros aspectos, la cadena pesada de anticuerpo anti-VEGF es un polipéptido de cadena pesada de fragmento Fab de anticuerpo, y la cadena ligera de anticuerpo anti-VEGF es un polipéptido de cadena ligera de fragmento de Fab de anticuerpo. En algunas modalidades, la cadena pesada de anticuerpo anti-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y la cadena ligera de anticuerpo anti-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 es la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunas modalidades, el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

La invención proporciona además un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF producido por cualquiera de los métodos descritos en la presente, en donde el anticuerpo anti-VEGF o fragmento de anticuerpo anti-VEGF está libre de mala incorporación de norleucina.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D en una célula hospedadora bacteriana, en donde el anticuerpo anti-Factor D o el fragmento de anticuerpo anti-Factor D está libre de mala incorporación de norleucina, el método que comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-Factor D o el fragmento de anticuerpo anti-Factor D, en donde la célula hospedadora bacteriana comprende un alelo met A mutante, un alelo metK mutante, o un mutante alelo MetA y un alelo metK mutante, produciendo de este modo un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D libre de mala incorporación de norleucina. En algunas modalidades, el método comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo anti-Factor D o un polipéptido de cadena pesada de fragmento de anticuerpo anti-Factor o fragmento del mismo y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo anti-Factor D o un polipéptido de cadena ligera de fragmento de anticuerpo anti-Factor D o fragmento del mismo. En algunos aspectos, la cadena pesada de anticuerpo anti-Factor D y la cadena ligera de anticuerpo anti-Factor son polipéptidos de anticuerpo anti-Factor D de cadena pesada y de cadena ligera de longitud completa. En otros aspectos, la cadena pesada de anticuerpo anti-Factor D es un polipéptido de cadena pesada de fragmento Fab de anticuerpo, y la cadena ligera de anticuerpo anti-Factor D es un polipéptido de cadena ligera de fragmento de Fab de anticuerpo. En algunas modalidades, la cadena pesada de anticuerpo anti-Factor D comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y la cadena ligera de anticuerpo anti-Factor D comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunas modalidades, el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

La invención proporciona además un anticuerpo anti-Factor D o fragmento de anticuerpo anti-Factor D producido por cualquiera de los métodos descritos en la presente, en donde el anticuerpo anti-Factor D o fragmento de anticuerpo anti-Factor D está libre de mala incorporación de norleucina.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET en una célula hospedadora bacteriana, en donde el anticuerpo anti-MET o el fragmento de anticuerpo anti-MET está libre de mala incorporación de norleucina, el método que comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-MET o el fragmento de anticuerpo anti-MET, en donde la célula hospedadora bacteriana comprende un alelo metA mutante, un alelo metK mutante, o un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, produciendo de este modo un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET libre de mala incorporación de norleucina. En algunas modalidades, el método comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo anti-MET o un polipéptido de cadena pesada de fragmento de anticuerpo anti-MET o fragmento del mismo y un ácido nucleico que codifica para polipéptido de cadena ligera de anticuerpo anti-MET o un polipéptido de cadena ligera de fragmento de anticuerpo anti-MET o fragmento del mismo. En algunos aspectos, la cadena pesada de anticuerpo anti-MET y la cadena ligera de anticuerpo anti-MET son polipéptidos de anticuerpo anti-MET de cadena pesada y de cadena ligera, de longitud completa. En otros aspectos, la cadena pesada de anticuerpo anti-MET es un polipéptido de cadena pesada de fragmento Fab de anticuerpo, y la cadena ligera de anticuerpo anti-MET es un polipéptido de cadena ligera de fragmento Fab de anticuerpo. En algunas modalidades, la cadena pesada de anticuerpo de anti-MET comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, el fragmento de cadena pesada de anticuerpo anti-MET comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, y la cadena ligera de anticuerpo anti-MET comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En algunas modalidades, el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 26. En algunas modalidades, el alelo met K mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

La invención proporciona además un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET producido por cualquiera de los metodos descritos en la presente, en donde el anticuerpo anti-MET o fragmento de anticuerpo anti-MET está libre de mala incorporación de norleucina.

En varios aspectos, un microorganismo mutante que comprende cualquiera o cualesquiera de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente invención es una bacteria; en otros aspectos, el microorganismo es E. coli . La presente invención proporciona específicamente el uso de un microorganismo mutante descrito en la presente para la producción de polipéptidos heterólogos (por ejemplo, recombinante) y proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinante), en donde se reduce, se reduce sustancialmente, se elimina sustancialmente o se impide la mala incorporación de norleucina en los polipéptidos heterólogos y proteínas heterólogas.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico de metA (R27C) que corresponde a SED ID NO: 23.

La figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico de metA (Y294C) que corresponde a SED ID NO: 24.

La figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico de metA (I296S/P298L) que corresponde a SED ID NO: 25.

La figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico de metA (Q64E) que corresponde a SED ID NO: 26.

La figura 5 muestra la secuencia de ácido nucleico de metK (V185E) que corresponde a SED ID NO: 27.

La figura 6 muestra la secuencia de ácido nucleico de metK (cll32del) que corresponde a SED ID NO: 28.

Las figuras 7A y 7B muestran la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de MetA tipo silvestre que corresponde a SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 31, respectivamente.

Las figuras 8A y 8B muestran la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico MetK tipo silvestre que corresponde a SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente.

La figura 9 muestra la estructura de norleucina y análogos de norleucina. Norleucina es un análogo estructural de metionina, donde el átomo de azufre (S) se reemplaza por un grupo metileno (es decir, -C¾).

La figura 10 muestra una vista esquemática de la ruta de biosíntesis de norleucina en E. coli . Las flechas de puntos indican que están comprendidos múltiples pasos. Se convierte piruvato a a-cetocaproato por tres pasos a través del proceso de alargamiento de cadena ceto-ácida catalizada por enzimas codificadas por el operón leuABCD de leucina. El a-cetocaproato intermedio se transaminado a norleucina por las transaminasas IlvE o TyrB.

La figura 11 muestra la biosíntesis de metionina y la regulación en E. coli . Las flechas de puntos indican la inhibición de retroalimentación y las flechas abiertas indican represión. La metionina y la S-adenosilmetionina (SAM) son inhibidores de retroalimentación de la enzima MetA. El represor MetJ y su co-represor SAM inhiben la transcripción de enzimas en el reguión de metionina.

Las figuras 12A, 12B, y 12C exponen tendencias de crecimiento, como se mide por OD550 (figura 12A) e iOD550 (figura 12B) de fermentaciones de E. coli de 10 L. La fermentación de hospedador de control (60E4) se ejecutó con una alimentación continua de metionina (¦) o continuo de agua (?) (figura 12A). La fermentación del hospedador 60E4mefcA(Y294C) se realizó alimentación continua de agua (D) o sin alimentación (A) (figura 12A). La figura 12C muestra las tendencias de crecimiento para el hospedador de control 60E4 sin alimentación (cuadrados), para el hospedador de control 60E4 con alimentación de metionina (círculos), y el hospedador 60E4metA(Y294C) sin alimentación (triángulos). Las fermentaciones que usan todos los otros mutantes se realizaron con alimentación continua de agua.

Las figuras 13A y 13B muestran niveles extracelulares (figura 13A) e intracelulares (figura 13B) de metionina para el hospedador de control (?) y 60E4metA(Y294C) (D) fermentaciones de células hospedadoras realizadas con alimentación continua de agua. También se muestran los niveles de fosfato en el medio extracelular en gráficas de líneas punteadas (figura 13a) y (figura 13B) para células hospedadoras de control (?) y célula hospedadora 60E4íT¡etA(Y294C) (D) fermentaciones realizadas con alimentación continua de agua.

Las figura 14A y 14B muestran los niveles extracelulares (figura 14A) e intracelulares (figura 14B) de metionina para cepas de células hospedadora mutantes de la presente invención. También se muestran los niveles extracelulares e intracelulares de metionina para dos fermentaciones de células hospedadoras de control realizadas con alimentación continua de metionina (?) o continua de agua (?), respectivamente.

La figura 15 muestra los niveles extracelulares de fosfato durante las fermentaciones.

Las figuras 16A y 16B muestran el final de título de corrida (figura 16A) y el título de transcurso de tiempo (figura 16B) de fermentaciones de células hospedadoras de E. coli . La fermentación de células hospedadoras de control (60E4} se realizó con una alimentación continua de metionina (?) o continua de agua (?). La fermentación de las células hospedadoras 60E4metA(Y294C) se realizó con una alimentación continua de agua (D) o sin alimentación (A). Las fermentaciones que usan todas las otras células hospedadoras utantes se realizaron con alimentación continua de agua.

Las figuras 17A y 17B exponen los resultados de transferencias Western realizados en muestras de caldo celular completo obtenidas durante las fermentaciones de células hospedadoras 60E4 (célula hospedadora de control) y células hospedadoras 60E4 metA(Y294C), respectivamente.

Las figuras 18A y 18B muestran las secuencias de ácido nucleico de una cadena pesada y cadena ligera de fragmento Fab de anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular (anti-VEGF) que corresponden a SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente.

Las figuras 19A y 19B exponen las tendencias de crecimiento de fermentación de de E. coli de 10 L, como se mide por OD550· Los procesos de fermentación AF2 o AF3 de hospedadores de control (66F8 o 64B4), respectivamente, se ejecutaron sin alimentación (cuadrados) o una alimentación continua de metionina (círculos). Las fermentaciones de los hospedadores 66F8metA(Y294C) y 64B4metA(Y294C) se realizaron sin alimentación (triángulos).

Las figuras 20A, 20B, y 20C exponen los rendimientos de productos de proteína recombinante usando cepas hospedadoras 60E4 (hospedador de control) y 60E4mefcA (Y294C), 66F8 (hospedador de control) y 66F8n?etA(Y294C), y 64B4 (hospedador de control) y 64B4mefcA(Y294C), respectivamente.

Las figuras 21A y 21B muestran las secuencias de aminoácidos de una cadena pesada y cadena ligera de fragmento Fab de anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular (anti-VEGF) que corresponde a SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47, respectivamente.

Las figuras 22A y 22B muestran las secuencias de aminoácidos de una cadena pesada y cadena ligera de fragmento Fab de anticuerpo anti-Factor D que corresponde a SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, respectivamente.

Las figuras 23A, 23B, y 23C muestran las secuencias de aminoácidos de un fragmento de cadena ligera (SEQ ID NO: 50), de cadena pesada (SEQ ID NO: 51), y de cadena pesada (SEQ ID NO: 52) de un anticuerpo anti-MET.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona, ínter alia, métodos y composiciones para impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas y polipéptidos, en particular, durante la producción de proteínas recombinantes en microorganismos. La presente invención también proporciona células hospedadoras de microorganismos y moléculas de ácido nucleico para el uso en los métodos de la invención.

Métodos generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, téenicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, bioquímica, e inmunología, que se conocen y están disponibles para un experto en la técnica. Estas técnicas se describen en la literatura, tal como, Molecular Cloning: A laboratory Manual, tercera edición (Sambrook et al., 2001) Coid Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshncy, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Poly erase Chain Reaction (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Iimunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); y Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999). La expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias se describe en, por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos.5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Ver también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, que describe la expression de fragmentos de anticuerpo en E. coli) .

A menos que se defina de otro modo, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica la cual corresponde a la invención. Definiciones Los términos "proteína heteróloga" o "polipéptido heterólogo" se refieren a una proteína o un polipéptido no sintetizado ni producido de forma natural por una célula u organismo (por ejemplo, un microorganismo) de interés. Por ejemplo, una célula de E. coli puede producir una proteína humana o un polipéptido humano, y una proteína humana o un polipéptido humano producido de este modo es una proteína heteróloga o un polipéptido heterólogo. De interés particular en el contexto de la presente invención son proteínas heterólogas o polipéptidos heterólogos que comprenden metionina. Una proteína heteróloga o un polipéptido heterólogo, como se usa en la presente también se refiere a una proteína recombinante o un polipéptido recombinante.

El término "mala incorporación de norleucina" se refiere a la incorporación de un residuo de norleucina en una proteína o polipéptido para el cual se codifica un residuo de metionina por el correspondiente ácido nucleico que codifica para la proteína o polipéptido.

Los términos "alelo mutante" o "alelo mutado" se refieren a un alelo que tiene una secuencia de ácido nucleico que es diferente de o está alterada de la secuencia de ácido nucleico del alelo tipo silvestre (es decir, como se encuentra de manera natural dentro de la célula o microorganismo de interés).

Los términos "microorganismo mutante" o "microorganismo mutado" se refieren a un microorganismo que contiene uno o más alelos mutantes o alelos mutados.

La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en la presente, se refiere a un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia comparadora) tal que uno experto en la téenica consideraría la diferencia entre los dos valores que es de significado estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por estos valores (por ejemplo, contenido de norleucina en una proteína o polipéptido).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen ordinariamente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de manera extra-cromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

"Molécula aislada de ácido nucleico de metA" o "molécula aislada de ácido nucleico de aislado metK" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para MetA o MetK, respectivamente, incluyendo las moléculas de ácido nucleico en un vector individual o vectores separados, y estas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora. "Molécula aislada de ácido nucleico de metA" o "molécula aislada de ácido nucleico de metK" también se refiere a un alelo metA mutante o un alelo metK mutante.

La frase "proteína o polipéptido libre de mala incorporación de norleucina" se refiere a una proteína o polipéptido que no contiene niveles detectadles de residuos de norleucina.

Como se usa en la presente, la forma singular de "un", "uno", y "el", "la" incluyen las referencias plurales a menos que se indique de otro modo en la presente.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro se refiere en la presente al intervalo usual de error para el valor respectivo conocido fácilmente para la persona experta en el campo téenico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro incluye en la presente y describe aspectos que se refieren a ese valor o parámetro, per se . Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Métodos para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina La presente invención se refiere, en parte, a métodos y composiciones útiles para prevenir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas y polipéptidos, en particular durante la producción de proteínas recombinantes en microorganismos.

La mala incorporación de residuos de norleucina en lugar de residuos de metionina durante la producción de proteínas recombinantes en E. coli se ha descrito anteriormente. Un planteamiento actualmente usado para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina es por alimentación continua o en bolo de metionina al medio de cultivo durante el proceso de fermentación. Aunque esta estrategia es efectiva para reducir la mala incorporación de norleucina, se asocian varias desventajas operativas con la alimentación o adición continua o en bolo de metionina durante el proceso de fermentación bolo. Por ejemplo, alimentación continua o en bolo al cultivo incrementa la complejidad operativa y el costo total del proceso de fermentación. Además, la alimentación de metionina conduce a dilución indeseable del medio de fermentación que da por resultado menores densidades celulares y posiblemente menores rendimientos de producto.

Para superar estas desventajas, los presentes inventores han proporcionado una alternativa a la alimentación continua o en bolo de metionina a fin de impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en la producción de polipéptidos o proteínas heterólogas. En particular, la presente invención proporciona células hospedadoras de microorganismos (por ejemplo, de E . coli) manejadas para producir metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteína recombinante, incluyendo la producción de proteína recombinante realizada en altas densidades de células hospedadoras.

Los mutantes de células hospedadoras de E. coli útiles para la producción a gran escala de metionina se reportaron previamente. (Ver, por ejemplo, Chattopadhyay et al., (1991) J Gen Microbiol 137:685-691; Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185; Usuda y Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234; Publicación de Solicitud de Patente internacional No. W02005/111202 2005; y Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US2009/0298135). Muchas de estas cepas mutantes de E. coli contuvieron las mutaciones en tres genes asociados con la regulación de biosíntesis de metionina: metJ, met A y metK.

La regulación transcripcional de la biosíntesis de metionina en E. coli comprende la enzima MetJ (producto génico metJ) . MetJ es un represor transcripcional que, cuando se une a su co-represor S-adenosilmetionina (SAM), reprime la transcripción de genes en el reguión de metionina, regulando de este modo los niveles de metionina en la célula. (Ver, por ejemplo, Marines (2006) et al, Biochem J 396:227-234). Como se reportó anteriormente, la mutagénesis química de E. coli seguida por la selección para el crecimiento en etionina (un análogo tóxico de metionina) condujo al aislamiento de una mutación de serina a asparagina en la posición de aminoácidos 54 (S54N) en MetJ, que da por resultado la des-represión de enzimas de biosíntesis de metionina y la producción incrementa de metionina. (Ver Nakamori et al, (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185). Una interrupción completa del gen metJ también da por resultado la des-represión de enzimas comprendidas en la ruta de biosíntesis de metionina y la sobreproducción de metionina. (Ver Usuda y Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234).

La biosíntesis de metionina en E. coli también se regula por inhibición de la retroalimentación (por metionina y SAM) de homoserina-succiniltransferasa (producto génico metA) , la enzima comprendida en el primer paso de la biosíntesis de metionina. (Ver, por ejemplo, Born y Blanchard (1999) Biochemistry 38:14416-14423). Los imitantes de MetA resistentes a retroalimentación (producto génico metA) en E. coli que conduce a la desregulación de la biosíntesis de metionina se aislaron previamente al seleccionar para crecimiento en el análogo tóxico de metionina, a-metil-metionina. (Ver Usuda y Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234; y la publicación de solicitud de patente internacional No. W02005/111202).

El gen metK codifica para la enzima S-adenosilmetionina-sintasa, que convierte metionina a £-adenosilmetionina. (Ver Markham et al, (1980) J. Biol Chem 255:9082-9092). La pérdida parcial de función de los mutantes de MetK que da por resultado bajos niveles de SAM y por lo tanto des-represión de enzimas de biosíntesis de metionina (SAM es un co-represor de MetJ) se aislaron previamente al seleccionar para crecimiento en análogos tóxicos de metionina, norleucina, y etionina. (Ver Chattopadhyay et al, (1991) Gen Microbiol 137:685-691; Usuda y Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234; y publicación de solicitud de patente internacional No. W02005 /111202).

En la presente invención, se mutaron residuos específicos de ácido nucleico en el gen metA tipo silvestre dando por resultado las siguientes sustituciones de aminoácido en MetA (ver figura 7A y SEQ ID NO: 29 para la secuencia de aminoácidos de MetA tipo silvestre): sustitución de arginina a cisteína en la posición de aminoácido 27 (R27C); sustitución de glutamina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 64 (Q64E); sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294 (Y294C); sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296 (I296S); y sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298 (P298L). Las células hospedadora de E. coli que comprenden una o más de estas sustituciones de aminoácido de MetA produjeron metionina a un grado o proporción suficiente para dar por resultado la prevención de la mala incorporación de norleucina en las proteínas heterólogas expresadas.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona varios alelos metA mutantes que codifican para las sustituciones de aminoácido en MetA de R27C, Q64E, Y294C, I296S y P298L (en comparación a la secuencia de aminoácidos de MetA tipo silvestre; figura 7A y 7B y SEQ ID NO: 29). Estos alelos metA mutantes dieron por resultado la enzima MetA resistente a retroalimentación. Los alelos metA mutantes se introdujeron en células hospedadoras de E. coli (60E4) usando un método de intercambio de alelo (ver materiales y métodos posteriores) para obtener una cepa 66H6 (60E4 metA(R27C)), 66H8 (60E4 metA(Y294C)), 67B8 (60E4 metA(Q64E)), y 67B9 (60E4 metA(I296S P298L)) de células hospedadora de E. coli mutante. Las células hospedadora de E. coli mutante resultantes obtenidas se evaluaron para la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteína recombinante realizadas sin una alimentación continua de metionina. (Ver ejemplo 4 posterior).

Todas las referencias a las posiciones de aminoácido en MetA se hacen en base a la homoserina-succiniltransferasa codificada por el gen metA de E. coli mostrada en las figuras 7A y 7B, que corresponde a SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 31. La referencia a las posiciones de aminoácido se hace con el primer aminoácido metionina que cuenta como la posición de aminoácido 1. Las posiciones relativas de regiones correspondientes en enzimas homoserina-succiniltransferasa de otros organismos se pueden identificar por una persona experta en la téenica, por ejemplo, por alineación simple de secuencias.

En la presente invención, se mutó un ácido nucleico en el gen met K tipo silvestre, dando por resultado la sustitución de aminoácido en MetK de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185 (V185E)). (Ver figura 8A y SEQ ID NO.: 30 para la secuencia de aminoácidos de MetK tipo silvestre). Adicionalmente, se suprimió un ácido nucleico específico en la posición de base de citosina 1132 en el gen metK (cll32del). Las células hospedadoras de E. coli que comprenden uno o más de estos alelos MetK mutantes produjeron metionina a un grado o proporción suficiente para dar por resultado la prevención de la mala incorporación de norleucina en proteínas heterólogas expresadas.

En algunas modalidades, la presente invención también proporciona varios alelos met K imitantes que codifican para la sustitución de aminoácido V185E o una supresión de la base citosina en la posición 1132 del alelo metK (cll32del). Estos alelos metK mutantes dan por resultado pérdida parcial de función de las enzimas MetK. Los alelos metK mutantes se introdujeron en varias células hospedadoras de E. coli (66H8; 60E4metA(Y294C), ver anteriormente) usando un método de intercambio de alelos (ver materiales y métodos posteriores) para obtener las cepas 67C2 (66H8metíC(V185E)) y 67C3(66H8i73etK(cll32del)) de de células hospedadoras de E. coli , respectivamente. Las células hospedadoras de E. coli mutantes resultantes obtenidas, se evaluaron para la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteína recombinante realizada sin una alimentación continua de metionina. (Ver ejemplo 4 posterior).

Todas las referencias a las posiciones de aminoácido en MetK se hacen en base a la S-adenosilmetionina-sintasa codificada por el gen metK de E. coli mostrada en las figuras 8A y 8B, que corresponde a SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32. La referencia a las posiciones de aminoácido se hace con el primer aminoácido metionina que cuenta como la posición de aminoácido 1. Las posiciones relativas de las regiones correspondientes en las enzimas de S-adenosilmetionina-sintasa de otros organismos se pueden identificar por una persona experta en la téenica, por ejemplo por la alineación simple de secuencia.

Moleculas de ácido nucleico para metA y metK A manera de ejemplo, la presente invención uso moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico de metA y metK que difieren de las secuencias de ácido nucleico de metA y metK tipo silvestre. Las secuencias de ácido nucleico de metA y metK proporcionadas por la presente invención codifican para varias sustituciones de aminoácido a aquellas codificadas por metA tipo silvestre (arginina en la posición de aminoácido 27 reemplazada con cisteína (R27C); glutamina en la posición de aminoácido 64 reemplazada con ácido glutámico (Q64E); tirosina en la posición de aminoácido 294 reemplazada con cisteína (Y294C); isoleucina en la posición de aminoácido 296 reemplazada con serina (I296S); prolina en la posición de aminoácido 298 reemplazada con leucina (P298L); e isoleucina en la posición de aminoácido 296 reemplazada con serina (I296S) y prolina en la posición de aminoácido 298 reemplazada con leucina (P298L)); y aquellas codificada por metK tipo silvestre (valina en la posición de aminoácido 185 reemplazada con ácido glutámico (V185E) y las secuencias de ácido nucleico que comprenden una supresión de la base citosina en la posición 1132 (cdelll32del)). El uso de cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica para un alelo metA o un alelo metK que de por resultado estas sustituciones de aminoácido se contempla de manera específica en la presente para el uso en los métodos de la presente invención.

La presente invención también proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico de met A que codifican para varias enzimas met A alteradas (es decir, que codifican para varias enzimas mutantes de homoserina-succiniltransferasa). En algunas modalidades, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.

La presente invención también proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico de met K que codifican para varias enzimas metK alteradas (es decir, que codifican para varias enzimas mutantes de S-adenosilmetionina). En algunas modalidades, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

La presente invención también proporciona, a manera de ejemplo, varias combinaciones de alelos metA mutantes y las correspondientes moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para las siguientes sustituciones de aminoácidos en MetA: arginina en la posición del aminoácido 27 sustituida con cisteína (R27C); glutamina en la posición de aminoácido 64 sustituida con ácido glutámico (Q64E); tirosina en la posición de aminoácido 294 sustituida con cisteína (Y294C); isoleucina en la posición de aminoácido 296 sustituida con serina (I296S); prolina en la posición de aminoácido 298 sustituida con leucina (P298L); e isoleucina en la posición aminoácido 296 sustituida con serina (I296S) y prolina en la posición de aminoácido 298 sustituida con leucina (P298L). En algunos aspectos, los alelos metA mutantes proporcionados por la presente invención dan por resultado enzimas metA resistentes a retroalimentación (es decir, insensibles a retroalimentación). Las posiciones de aminoácido son con referencia a la secuencia de aminoácidos de MetA tipo silvestre como se muestra en la figura 7A y SEQ ID NO: 29.

También se proporciona por la presente invención, a manera de ejemplo, varias combinaciones de alelos metK mutantes y las correspondientes moléculas aisladas de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para la siguiente sustitución de aminoácido en MetK: valina en la posición de aminoácido 185 sustituida con ácido glutámico (V185E). La presente invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que comprenden una supresión de la base de citosina en la posición 1132 (cll32del) del alelo metK. En algunos aspectos, los alelos metK mutantes proporcionados por la presente invención dan por resultado la pérdida parcial de función de las enzimas MetK. Las posiciones de aminoácidos son en referencia a la secuencia de aminoácidos de MetK tipo silvestre como se muestra en la figura 8A y SEQ ID NO: 30.

Microorganismos para el uso en los presentes métodos Como se describe en la presente y a manera de ejemplo, se manejaron células hospedadora de E. coli para las bacterias para producir metionina a un grado o proporción suficiente para la prevención o reducción de la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes, incluyendo producción de proteínas recombinantes realizadas a altas densidades de células hospedadoras. Por consiguiente, en algunas modalidades proporcionadas en la presente, la presente invención proporciona cepas mutantes de microorganismos (es decir, células hospedadoras mutantes de microorganismos) que producen metionina a un grado o proporción suficiente para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos (por ejemplo, a un grado o proporción suficiente para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas recombinantes o polipéptidos recombinantes, o a un grado o proporción suficiente para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas heterólogas o polipéptidos heterólogos).

Las células hospedantes de E. coli de inicio adecuadas para el uso en los métodos proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, (pero no se limitan a) E. coli W3110, E. coli 294, E. coli X1776, etcétera. Estos ejemplos de células hospedadoras de E. coli son ilustrativos en lugar de ser limitantes. La cepa de W3110 de E. coli es una cepa hospedadora común para fermentaciones de productos de ADN recombinantes. Las células hospedadoras de E. coli mutantes de cualquiera de las cepas de células hospedadoras de E. coli mencionadas anteriormente también se pueden emplear como las células hospedadoras de inicio que entonces se modifican adicionalmente para contener los alelos metA y/o met K mutados, descritos en la presente.

La presente invención muestra que el uso de células hospedadoras de E. coli que comprenden varios alelos mutantes y combinaciones de alelos mutantes para metA y metK en la producción de proteínas recombinantes fue efectiva para impedir la mala incorporación de norleucina en proteínas recombinantes expresadas. (Ver ejemplo 4 posterior).

La presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos.

En algunos aspectos, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo de homoserina-succiniltransferasa insensible a retroalimentación. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante codifica para una sustitución de aminoácidos R27C en metA, una sustitución de aminoácido Q64E en metA, una sustitución de aminoácido Y294C en metA, lina sustitución de aminoácido y I296S en metA, o una sustitución de aminoácido P298L en metA. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA mutante que codifica para más de una sustitución aminoácido descrito anteriormente, incluyendo, por ejemplo, un alelo metA mutante que codifica para una sustitución de aminoácido I296S y una sustitución de aminoácido P298L en MetA. En varios aspectos, el microorganismo que comprende cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas por la presente invención es una bacteria; en otros aspectos, el microorganismo es E. coli . La presente invención proporciona de manera específica el uso de microorganismos descritos en la presente para la producción de polipéptidos heterólogos (por ejemplo, recombinantes) y proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinantes), en donde se reduce o impide la mala incorporación de norleucina en los polipéptidos heterólogos y proteínas heterólogas.

Como se describe anteriormente, la presente invención proporciona microorganismos que comprenden uno o más alelos me tA mutantes. En algunas modalidades, los alelos me tA mutantes que codifican para una sustitución de aminoácido R27C en MetA, que codifican para una sustitución de aminoácido Q64E en MetA, que codifica para una sustitución de aminoácido Y294C en MetA, o que codifican para una sustitución de aminoácido I296S y una sustitución de aminoácido P298L en MetA, se codifican por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 23 (R27C), SEQ ID NO: 26 (Q64E), SEQ ID NO: 24 (Y294C), o SEQ ID NO: 25 (I296S y P298L), respectivamente. En otras modalidades, el microorganismo proporcionado por la presente invención comprenden alelos me tA mutantes codificados por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 23 (R27C), SEQ ID NO: 26 (Q64E), SEQ ID NO: 24 (Y294C), O SEQ ID NO: 25 (I296S y P298L). En varios aspectos, un microorganismo que comprende cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas por la presente invención es una bacteria; en otros aspectos, el microorganismo es E. coli . La presente invención proporciona de manera específica el uso de microorganismos descritos en la presente para la producción de polipéptidos heterólogos (por ejemplo, recombinantes) y proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinantes), en donde se reduce o impide la mala incorporación de norleucina en los polipéptidos heterólogos y proteínas heterólogas.

Como se señala anteriormente, la presente invención proporciona métodos para impedir o reducir la mal incorporación de norleucina en proteínas y polipéptidos expresados por un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo que produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en proteínas o polipéptidos. En algunos aspectos, la presente invención proporciona un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo des-reprimido para la producción de metionina. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metK mutante. En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante codifica para una sustitución de aminoácido V185E en metK. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una supresión de la citosina de ácido nucleico en el residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK. En varios aspectos, un microorganismo que comprende cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas por la presente invención es una bacteria; en otros aspectos, el microorganismo es E. coli . La presente invención proporciona de manera específica el uso de los microorganismos descritos en la presente para la producción de polipeptidos heterólogos (por ejemplo, recombinantes) y proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinantes), en donde se reduce o impide la mala incorporación de norleucina en los polipéptidos heterólogos y proteínas heterólogas.

Como se describe anteriormente, la presente invención proporciona microorganismos que comprenden uno o más alelos metK mutantes. En algunas modalidades, los alelos metK mutantes que codifican para una sustitución de aminoácido V185E en MetK o que comprenden una supresión de la citosina de ácido nucleico en el residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK, se codifican por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 27 (V185E) o una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 28 (cll32del), respectivamente. En otras modalidades, los microorganismos proporcionados por la presente invención comprenden alelos metK mutantes codificados por una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 27 (V185E) o SEQ ID NO: 28 (cll32del). En varios aspectos, el microorganismo que comprende cualquiera de una o más de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas por la presente invención es una bacteria; en otros aspectos, el microorganismo es E. coli . La presente invención proporciona de manera específica el uso de cualquier microorganismo descrito en la presente para la producción de polipéptidos heterólogos (por ejemplo, recombinantes) y proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinantes), en donde la mala incorporación de norleucina en los polipéptidos heterólogos y proteínas heterólogas se reduce o impide.

El uso de cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique para los alelos metA o metK que da por resultado las sustituciones de aminoácido descritas en la presente, se contemplan de manera específica en la presente para el uso en los métodos de la presente invención.

En otras modalidades, la presente invención proporciona un microorganismo que comprende un alelo metA utante y un alelo metK mutante. En algunas modalidades, un microorganismo proporcionado por la presente invención es un microorganismo que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante codifica para una sustitución de aminoácido Y294C en MetA y el alelo metK mutante codifica para una sustitución de aminoácido V185E en MetK. En algunas modalidades, proporcionadas por la presente invención, el microorganismo es un microorganismo que comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante codifica para una sustitución de aminoácido Y294C en MetA y el alelo metK mutante comprende una supresión de la citosina de ácido nucleico en el residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK. En varios aspectos, un microorganismo que comprende cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas por la presente invención es una bacteria; en otros aspectos, el microorganismo es E. coli . La presente invención proporciona de manera específica el uso de cualquier microorganismo descrito en la presente para la producción de polipéptidos heterólogos (por ejemplo, recombinantes) y proteínas heterólogas (por ejemplo, recombinantes), en donde se reduce o impide la mala incorporación de norleucina en los polipéptidos heterólogos y proteínas heterólogas.

Producción de cepas de microorganismos La presente invención proporciona métodos para producir un microorganismo (por ejemplo, células hospedadoras de E. coli) , en donde el microorganismo produce metionina a un grado o proporción suficiente para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en polipéptidos y proteínas. A manera de ejemplo, se generaron células hospedadoras de E. coli que comprenden alelos metA mutantes y/o alelos metK mutantes usando métodos de intercambio de alelos como se conoce en la téenica y como se describe previamente. (Ver Metcalf et al, (1994) de Gene 138:1-7; y Bass et al, (1996) J. Bacteriol 178:1154-1161; ver sección de materiales y metodos de la presente especificación). La presente invención no se limita a los medios por los cuales se producen las células hospedadoras de E. coli que comprenden alelos met A mutantes y alelos MetK mutantes. Son bien conocidos por el experto en la téenica varios métodos para introducir alelos mutantes o producir de otro modo cepas de microorganismos (por ejemplo, bacterias, E. coli) que comprenden alelos mutantes.

Prevención o reducción de la mala incorporación de norleucina Los métodos y composiciones de la presente invención se pueden aplicar a la producción de polipéptidos o proteínas heterólogas o recombinantes, y se pueden usar tanto con la producción a gran escala como a pequeña escala de proteínas y polipéptidos. Los métodos y composiciones de la presente invención son particularmente útiles para la fermentación de alta densidad de microorganismos, tal como, por ejemplo, células hospedadoras de E. coli, para la producción de polipéptidos y proteínas recombinantes. Los métodos y composiciones proporcionadas por la presente invención son útiles para la producción recombinante de proteínas y polipéptidos, en particular para la producción recombinante de polipéptidos y proteínas en las cuales es indeseable la mala incorporación de norleucina, tal como, por ejemplo, en polipéptidos y proteínas recombinantes para el uso en varias aplicaciones terapéuticas y de investigación.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo de homoserina-succiniltransferasa resistente a retroalimentación o insensible a retroalimentación. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo des-reprimido para la producción de metionina. En algunas modalidades, el microorganismo de homoserina-succiniltransferasa resistente a retroalimentación o insensible retroalimentación es un microorganismo que comprende un alelo metA mutante. En algunas modalidades, el microorganismo des-reprimido para la producción de metionina es un microorganismo que comprende un alelo metK mutante. En otras modalidades, el microorganismo para el uso en la prevención o reducción de la mala incorporación de norleucina comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, y SEQ ID NO: 26. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para MetA, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica para una sustitución de aminoácido en MetA seleccionado del grupo que consiste de R27C, Q64E, Y294C, I296S, y P298L. En otras modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para las sustituciones de aminoácidos en MetA que consisten en tanto de I296S como P298L. Las posiciones de aminoácido son con referencia a la secuencia de aminoácidos de MetA tipo silvestre como se muestra en la figura 7A y SEQ ID NO: 29.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo met K mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo met K mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para MetK, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica para sustitución de aminoácido V185E en MetK. En otras modalidades, la secuencia de ácido nucleico comprende una supresión de la base de citosina en la posición de residuo de ácido nucleico 1132 en el alelo MetK. Las posiciones de aminoácidos son con referencia a la secuencia de aminoácidos de MetK tipo silvestre como se muestra en la figura 8A y SEQ ID NO: 30.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, y en donde además el alelo met A mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y el alelo metK mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24, y el alelo metK mutante comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para sustitución de aminoácido Y294C en MetA, y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la sustitución de aminoácido V185E en MetK. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo comprende un alelo et A mutante y un alelo metK, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para sustitución de aminoácido Y294C en MetA, y el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una supresión de la base de citosina en la posición de residuo de ácido nucleico 1132 en alelo metK. Las posiciones de aminoácidos son con referencia a la secuencia de aminoácidos de MetA tipo silvestre como se muestra en la figura 7A y SEQ ID NO: 29 y en referencia a la secuencia de aminoácidos de MetK tipo silvestre como se muestra en la figura 8A y SEQ ID NO: 30.

En algunos aspectos de los métodos para reducir o impedir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido por un microorganismo proporcionado en la presente, el microorganismo es una bacteria, en particular una E. coli . En otros aspectos, la proteína o polipéptido es una proteína heteróloga o un polipéptido heterólogo, o una proteína recombinante o un polipéptido recombinante. Por ejemplo, el microorganismo puede comprender un ácido nucleico que codifica para una proteína o polipéptido heterólogo al microorganismo; por ejemplo, el microorganismo se transforma con un ácido nucleico que codifica para una proteína o polipéptido heterólogo al microorganismo, que puede ser, por ejemplo, ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), como por el uso de un vector de expresión recombinante. En otros aspectos, el método comprende además cultivar el microorganismo en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína o polipéptido. En algunas modalidades, el microorganismo se cultiva en un medio de cultivo, en donde el medio de cultivo contiene una baja concentración de metionina. La proteína o polipéptido entonces se puede recuperar, purificar, etcétera; la recuperación puede ser de, por ejemplo, el periplasma o medio cultivo de microorganismo. En algunos aspectos, el cultivo toma lugar en un fermentador, tal como, por ejemplo, cultivo bajo condiciones de fermentación de alta densidad celular.

Un ácido nucleico heterólogo que codifica para una proteína o polipéptido heterólogo se inserta de manera adecuada en un vector replicable para la expresión en el microorganismo bajo el control de un promotor adecuado. Están disponibles para este propósito muchos vectores, y la selección del vector apropiado dependerá de, por ejemplo, del tamaño del ácido nucleico que se va a insertar en el vector o la célula hospedadora particular de microorganismo que se va a transformar con el vector. Los vectores adecuados son bien conocidos por un experto en la téenica.

Los métodos y composiciones proporcionadas por la presente invención son particularmente útiles para la producción de proteínas y polipéptidos recombinantes en los cuales es indeseable la mala incorporación de norleucina, tal como, por ejemplo, en proteínas y polipéptidos recombinantes para el uso en varias aplicaciones terapéuticas, médicas, de investigación, y de diagnóstico. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención son aplicables para la producción recombinante de anticuerpos terapéuticos, tal como, por ejemplo, anticuerpos policlonales y monoclonales para uso médico y farmacéutico. Los ejemplos de anticuerpos policlonales y monoclonales para uso médico y farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos VEGF, anticuerpos anti-factor D, anticuerpos anti-receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (por ejemplo, anticuerpos anti- ET), etcétera.

Los métodos y composiciones de la presente invención también son útiles para la producción de fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena individual (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecífíeos formados de fragmentos de anticuerpo. La producción de anticuerpos recombinantes como se proporciona por los presentes métodos, composiciones, y microorganismos, se puede realizar por la expresión de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo y la expresión de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo dentro de un microorganismo como se describe anteriormente (por ejemplo, célula hospedadora bacteriana, E. coli) . En algunos aspectos, la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo son polipéptidos de anticuerpo de cadena pesada y de cadena ligera de longitud completa. En otros aspectos, la cadena pesada del anticuerpo es una cadena pesada de fragmento Fab de anticuerpo, y la cadena ligera de anticuerpo es una cadena ligera de fragmento Fab de anticuerpo.

Los métodos y composiciones de la presente invención también son útiles para la producción de anticuerpos multi-específicos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos multi-específicos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos diferentes epítopos. Los anticuerpos multi-específicos de ejemplo pueden unirse a dos diferentes epítopos de la proteína, o pueden unirse a dos diferentes epítopos de dos proteínas diferentes. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las téenicas para elaborar anticuerpos multi-específicos incluyen, pero no se limitan a, co-expresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (ver Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983); publicación de solicitud internacional No. WO93/08829; Traunecker et al, EMBO J.10:3655 (1991)); y la teenología de "botón en ojal" (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No.5,731,168).

Adicionalmente, los métodos y composiciones de la presente invención son útiles para la producción de otras biomoléculas para aplicaciones terapéuticas y de investigación, tal como, por ejemplo, hormona de crecimiento humana (somatropina), insulina, etcétera.

Ejemplos Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden practicar varias modalidades diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Materiales y métodos Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento Las cepas bacterianas usadas en los ejemplos descritos en la presente son derivados de la cepa de W3110 de E . coli . (Ver Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557.) La selección antibiótica se mantuvo para todos los marcadores a las siguientes concentraciones: carbenicilina (plásmido o cromosómicas), 50 mg/ml; kanamicina (cromosómica), 30 pg/ml; tetracielina (plásmido o cromosómica), 10 pg/ml.

Construcción de plásmido y cepa Los oligonucleótidos usados en la construcción de plásmidos y cepas bacterianas (es decir, E. coli) se listan en la tabla 1 posterior. Se usan téenicas normales para clonación, análisis de ADN, amplificación por PCR, transformación, electroporación, y la transducción P1. Los alelos cromosómicos se movieron por transducción P1. El alelo jretJ::KanR se derivó de la cepa bacteriana JW3909-1, que se obtuvo del The Coli Genetic Stock Center (CGSC, Yale University). Todos los reemplazos de alelos se conformaron por análisis de PCR.

Tabla 1 aResiduos de ácidos nucleicos subrayados introducen mutaciones de aminoácido. Los residuos de ácido nucleico en minúsculas indican residuos diferentes de la secuencia de ácido nucleico tipo silvestre.

El gen metA se amplificó por PCR de la cepa bacteriana W3110 (Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557) usando los cebadores SacI-metAflank-F y SalI-metAflank-R, se digirió con SacI y Salí, y se ligó en el plásmido pS1080 digerido con SacI y Salí para obtener el plásmido pS1080- metAflank. Los plásmidos pS1080-metAflank(R27C), pS1080- metAflank(Q64E), pS1080-metAflank(Y294C), y pS1080- metAflank(I296SP298L) se construyeron al mutagenizar el plásmido pS1080-metAflank usando un equipo QuikChange (Stratagene) y los siguientes conjuntos de cebadores: (QC- ¡netAR27C-F;QC- metAR27C-R), (QC-metAQ64E-F;QC-metAQ64E-R), (QCmetAY294C-F; QC-metAY294C-R) y (QC-metAI296SP298L-F; QC- znetAI296SP298L-R), respectivamente.

El gen metK se amplificó por PCR de la cepa bacteriana W3110 usando los cebadores SacI-metíCflank-F y Sall-metfCflank-R, se digirió con SacI y Salí, y se ligó en el plásmido SacI y Salí digerido con pS1080 para obtener el plásmido pSlOeO-metfflank. Los plásmidos pS1080-metiIflank (V185E) y pS1080-.met.fiflank (cll32del) se construyeron al mutagenizar el plásmido pS1080-etJCflank usando un equipo QuikChange (Stratagene) y el siguiente conjunto de cebadores: (QC-metkV185E-F;QC etJiV185E-R), y (QC-metücll32del-F;QC-metJCcll32del-R), respectivamente.

Se llevó a cabo el intercambio de alelos usando los métodos previamente descritos. (Ver Metcalf et al, (1994) Gen 138:1-7; y Bass et al, (1996) J Bacteriol 178: 1154-1161).

Como se señala anteriormente, se llevó a cabo el intercambio de alelos usando el protocolo descrito por Metcalf et al. (supra) , como se modifica por Bass et al. ( supra ) . Se transfirieron los cointegrados en el fondo de célula hospedadora 60E4 o el fondo de célula hospedadora 66H8. Después de contra-selección con sacarosa, las colonias resistentes a sacarosa se examinaron para la sensibilidad carbenicilina por rayado en réplica en agar LB y placas de agar LB que contienen carbenicilina. Las colonias sensibles a carbenicilina se aislaron de manera subsiguiente y se confirmó el intercambio de alelos por amplificación por PCR del cuadro de lectura completo me tA o metK seguido por secuenciación de ADN. El vector de plásmido suicida pS1080 contiene el origen R6K7 condicional y el marcador seleccionable de resistencia a carbenicilina, así como un gen sacB contra-seleccionable, que confiere sensibilidad a sacarosa.

Las cepas bacterianas y plásmidos usados en los experimentos descritos en la presente se listan en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Fermentación La cepa hospedadora 60E4 de E. coli se transformó con un plásmido de expresión a base de pBR322 que contiene ácido polinucleico que codifica para una cadena ligera y una cadena pesada de un fragmento (Fab) de unión a antígeno de anticuerpo anti-VEGF (SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente). (Ver anticuerpo anti-VEGF Y0317 en la publicación de solicitud internacional No. W01998/45331; publicación de solicitud internacional No. W02002/40697 (Ejemplo 2, que describe fermentación de anticuerpo anti-VEGF Y0317); Y Chen et al, (1999) J Mol Biol 293:865-881, anticuerpo anti-VEGF Y0317, cada uno de los cuales se incorpora en la presente en su totalidad como referencia).

La cepa hospedadora 66F8 de E. coli se transformó con un plásmido de expresión que contiene ácido polinucleico que codifica para una cadena ligera y una cadena pesada de un fragmento (Fab) de unión a antígeno de anticuerpo anti-Factor D, que corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49, respectivamente. (Ver anticuerpos anti-Factor D número 238-1 en la publicación de solicitud internacional No. W02009/134711 y anticuerpo anti-Factor D número 111 en publicación de solicitud internacional No. W02008/055206, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad como referencia).

La cepa hospedadora 64B4 de E. coli se transformó con un plásmido de expresión que contiene ácido polinucleico que codifica para una cadena ligera, una cadena pesada, y un fragmento de cadena pesada de un anticuerpo anti-MET que corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, y SEQ ID NO: 52, respectivamente).

La expresión de los polipéptidos de fragmento de Fab de cadena pesada y de cadena ligera recombinantes se controló por el promotor phoA con la inducción que se presenta en el agotamiento de fosfato inorgánico en el medio. (Ver Laird et al, (2005) Protein Expr Purif 39:237-246). Los polipéptidos de fragmento de Fab de cadena pesada y cadena ligera se dirigieron para la exportación al periplasma de E. coli por una secuencia de STII señal, donde se montó el producto. Las fermentaciones de alta densidad celular al volumen de trabajo 10 L (WV) se llevaron a cabo como se describe previamente. (Ver Simmons et al, (2002) J Immunol Methods 263:133-147). A una densidad celular de aproximadamente 200 OD550, se inició una alimentación continua de metionina al 3% o agua y alimentación a través del resto del proceso de fermentación.

Se examinaron tres diferentes procesos de fermentación usando la célula hospedadora 60E4 (proceso de fermentación AF1), la célula hospedadora 66F8 (proceso de fermentación AF2), y la célula hospedadora 64B4 (proceso de fermentación AF3). (Ver ejemplo 5 y tabla 4 posterior). Purificación Después de que se agotaron las fermentaciones, el caldo de células enteras se enfrió a <15°C en el fermentador y el caldo enfriado para procesó para purificación de proteínas. Un volumen del caldo enfriado se mezcló con 0.06 volúmenes de MgSO4 (concentración final 60 mM) y se tituló a pH 3.8 con ácido cítrico (1 M). Las células entonces se interrumpieron usando un microfluidizador a aproximadamente 12,000 lb/pulgada2 (816.5 atmósferas) (Microfluidics, Redwood Shores, CA) y las células interrumpidas se incubaron a 35°C durante 3 horas con agitación continua. El homogenizado se diluyó 3 veces con agua fría purificada y el homogenizado diluido se centrifugó a 6000 x g usando un rotor de ángulo fijo a 4°C durante 20 minutos. El sobrenadante se filtró usando filtros de 0.22 mm y se tituló a pH 7.5 con base Tris 1.5 M.

La proteína Fab recombinante se purificó usando cromatografía de afinidad de proteína G como sigue. Columnas de cromatografía poli-prep (Bio Rad) se empacaron con resins de flujo rápido de proteína G Sefarosa 4 (GE Healthcare) y se pusieron en equilibrio con al menos 5 volúmenes de columna de PBS, pH 7.2. El sobrenadante filtrado se cargó en la columna empacada de proteína G, se lavó dos veces con PBS, y se eluyó con ácido cítrico 50 mM. La mezcla final de proteínas Fab se tituló a pH 7 con base Tris 1.5 M y se analizó para el contenido de norleucina como se describe más adelante. Esto corresponde a la purificación para el proceso de fermentación AF1.

Se usaron tres diferentes procesos de purificación de producto de proteína recombinante, cada uno específico para el proceso de fermentación AF1 (para célula hospedadora 60E4), AF2 (para célula hospedadora 66F8), o AF3 (para célula hospedadora 64B4). (Ver ejemplo 7 y tabla 6 posterior).

Análisis de aminoácidos Para determinar los niveles intracelulares de metionina, se sedimentaron muestras de caldo de células enteras que contiene 87.6xl09 células a 17,000xg durante 5 minutos a 4°C, se lavó una vez en PBS, y luego se volvió a suspender en amortiguador de extracción (Tris 10 mM, EDTA 5 M, yodoacetamida 5 mM (IAM), 0.2 mg/ml de lisozima, pH 6.8). Las células entonces se U saron por dos ciclos de tratamiento con ultrasonido y luego se centrifugaron durante 20 min a 13,500 rpm para remover el desecho celular. Los sobrenadantes se transfirieron a filtros de tubo de microcentrífuga de 0.2 mm (Bio Rad) y se centrifugaron a 17,000xg durante 5 minutos a 4°C. Los filtrados se diluyeron y los aminoácidos se analizaron como se describe previamente (Feency et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097). Para determinar los niveles extracelulares de metionina, las muestras de sobrenadante preparadas de caldo de células enteras, recolectadas durante la fermentación, después de la centrifugación durante 3 min a 14,000xrpm se diluyeron y los aminoácidos se analizaron como se describe más adelante. (Ver Feency et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097.) Se analizaron las concentraciones de aminoácidos usando un método de HPLC de fase invertida. Las muestras que contienen aminoácidos se trataron con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo-carbamato para producir derivados altamente fluorescentes. (Ver Cohén y Michaud (1993) Anal Biochem 211:279-287.) Los ensayos de HPLC usados, detectaron los siguientes aminoácidos con un límite de detección de 0.01 mM: histidina, asparagina, serina, glutamina, arginina, glicina, aspartato, gluta ato, treonina, alanina, prolina, ornitina, cisterna, lisina, tirosina, metionina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina y triptófano.

Niveles de fosfato Se midieron los niveles de fosfato usando COBAS Integra 400 (Roche Diagnostics) de acuerdo a los métodos publicados previamente. (Ver Taussky y Shorr (1953) J Biol Chem 202:675-685.) Mediciones de título Las muestras de caldo de células enteras se diluyeron 6 veces con amortiguador de extracción (Tris 10 mM, EDTA 5 mM, IAM 5 mM, 0.2 mg/ml de lisozima, pH 6.8) y se incubaron durante 10 minutos en hielo. Después de dos rondas de tratamiento con ultrasonido, las muestras se centrifugaron a 17,000xg durante 20 minutos a 4°C. El título del producto se determinó de sobrenadantes usando HPLC.

Mediciones de OR550 integrado Se determinó OD550 integrado al usar integración trapezoidal usando la siguiente fórmula: donde, j = índice de la primera medición realizada en o después de 24 horas de tiempo de cultivo; k = número total de mediciones de OD550 realizadas; ti = tiempo transcurrido de cultivo en horas en la medición i; OD550,Í = OD550 en la medición i.

Análisis de norleucina Para el análisis del contenido de norleucina, las muestras purificadas de proteínas recombinantes se sometieron a digestión con tripsina en base a un método previamente descrito. (Ver Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290.) Se realizó el análisis de mapa peptídico usando HPLC de fase invertida y espectrometría en masa tándem con cromatografía líquida en línea (LC/MS) como se describe previamente. (Ver Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290; y Yu et al., (2011) Anal Chem 83:5912-5919.) Se realizó la determinación de masa de alta resolución con un instrumento LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific, San José, US) usando una exploración de encuesta completa-MS con resolución ajustada a 60,000 a m/z 400, seguido por exploraciones MS2 de trampa iónica para iones de interés. Para la determinación del nivel relativo de norleucina dentro de los polipéptidos, los cromatogramas iónicos extraídos se generaron para péptidos tanto que contiene metionina como que contienen norleucina usando el estado de carga más abundante con una ventana de extracción de monoisotópico m/z ± 10 ppm. La cantidad relativa de especie que contiene norleucina con relación a aquella de la especie que contiene metionina se calculó usando las respectivas áreas pico integradas.

Transferencias Western Muestras de caldo de células enteras obtenidas durante la fermentación se diluyeron 6 veces con amortiguador de extracción (Tris 10 mM, EDTA 5 mM, IAM 5 mM, 0.2 mg/ml de lisozima, pH 6.8) y se incubaron durante 10 minutos en hielo. Después de dos rondas de tratamiento con ultrasonido, las muestras se centrifugaron a 17,000xg durante 25 minutos a 4°C. Las muestras se cargaron en geles de Tris-Glicina al 4-12% bajo condiciones no reductoras. La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa usando un Sistema de Transferencia iBlot (Invitrogen). Las membranas se bloquearon con gelatina al 0.5% en amortiguador NET (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 50 mM, TritonX-100 al 0.05%) durante 30 minutos, seguido por incubación en una dilución 1:300,000 de fracción de IgG de cabra conjugada con peroxidasa a Fab de IgG humana (MP Bio edical) en el amortiguador de bloqueo. Despues de un lavado de 3 veces con amortiguador NET, las transferencias se visualizaron en película de rayos X usando el Substrato Western Lightning ECL (PerkinElmer) después de una posición de 5 segundos.

Ejemplo 1. Mala incorporación de norleucina durante fermentación de E. coli Como se describe anteriormente, la mala incorporación de norleucina se presenta frecuentemente durante la producción de proteínas recombinantes en E. coli . El grado de mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes depende de varios factores tal como por ejemplo, la naturaleza de la proteína recombinante, el proceso de fermentación usado y los contenidos del medio de fermentación. (Ver, por ejemplo, Bogosian et al . , (1989) Biol Chem 264:531-539.) Para examinar la mala incorporación de norleucina en un proceso de fermentación de expresión de proteínas recombinantes, se realizó el siguiente estudio. La cepa hospedadora 60E4 de E. coli se transformó con un plásmido que contiene secuencias de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera y una cadena pesada de un fragmento de anticuerpo Fab (SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32, respectivamente) y se usó en los siguientes estudios de fermentación usando una alimentación de agua o alimentación de metionina de acuerdo a los métodos descritos anteriormente. Las proteínas recombinantes expresadas entonces se analizaron para el contenido de norleucina usando los métodos descritos anteriormente.

Como se muestra en la Tabla 3 posterior, se observó aproximadamente 5-10% de mala incorporación de norleucina en cada uno de los polipéptidos recombinantes expresados en la célula hospedadora 60E4 de E. col i en ausencia de una alimentación continua de metionina (es decir, una alimentación de agua). Como se espera, en la presencia de una alimentación continua de metionina, no se detectó norleucina (ND) en ningún polipéptido recombinante expresado.

Tabla 3 Estos resultados confirmaron que la mala incorporación de norleucina se presentó en la producción de proteínas recombinantes en bacterias en ausencia de una alimentación de metionina.

Ejemplo 2. Construcción de celulas hospedadoras mutantes de E. coli por la ruta biosintética de metionina Como se señala anteriormente, frecuentemente se usa la alimentación continua de metionina durante la fermentación de proteína recombinantes para impedir la mala incorporación de norleucina. Como se muestra anteriormente en el Ejemplo 1, la alimentación continua de metionina aseguró que estuviera disponible suficiente metionina para la célula hospedadora, reduciendo de este modo o impidiendo de este modo la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes. Para examinar el efecto y usar una célula hospedadora de E. coli que contiene los alelos metA y/o metK mutantes en la mala incorporación de norleucina, en lugar de usar una alimentación continua de metionina, se realizaron los siguientes estudios.

En los presentes estudios, los alelos metA que contienen las mutaciones R27C, Q64E, Y294C, I296S, y P298L, que dan por resultado MetA resistente a retroalimentación, se introdujeron en células hospedadoras 60E4 usando un método de intercambio de alelo (ver materiales y métodos anteriormente) para obtener las cepas de células hospedadoras bacterianas 66H6 (60E4 metA(R27C)), 66H8 (60E4 metA(Y294C)), 67B8 (60E4 jnetA(Q64E)), y 67B9 (60E4 metA (I296S P298L)), respectivamente (Ver Tablas 2 y 3 anteriores).

Los alelos metK que contienen las mutaciones V185E y cll32del (supresión de la base citosina en la posición 1132 del gen metK) , que da por resultado pérdida parcial de la función de enzimas MetK, se introdujeron en células hospedadoras 66H8 (60E4 metA(Y294C)) usando un método de intercambio de alelos (ver Materiales y Métodos anteriormente) para obtener las cepas de células hospedadoras bacterianas 67C2 (66H8 metK(V185E)) y 67C3 (66H8 netK(cll32del)), respectivamente. (Ver Tablas 2 y 3 anteriores).

Estas células hospedadoras de E. coli se evaluaron para la mala incorporación de norleucina durante la producción de proteínas recombinantes en un proceso de fermentación realizados sin una limitación continua de metionina. (Ver Ejemplo 3 posterior).

Ejemplo 3. Resultados de Fermentación Las fermentaciones a pequeña escala (10 L) sin una alimentación continua de metionina se ejecutaron utilizando las cepas bacterianas mutantes de la ruta biosintética de metionina construidas en este estudio. (Ver Tabla 1). La alimentación de metionina ya sea se reemplazó con alimentación de agua o sin alimentación se usó durante el proceso de fermentación en estos experimentos. Se realizaron tres fermentaciones de 10 L usando la cepa de célula hospedadora de control 60E4 como sigue: 1) una alimentación continua de metionina, 2) una alimentación continua de agua, y 3) si alimentación.

En la Figura 12A se muestran las tendencias de la fermentación para el crecimiento celular, monitorizadas por OD550. A pesar de la naturaleza de la alimentación (metionina, agua, o sin alimentación), el crecimiento de las células hospedadoras bacterianas, mutantes, de ruta biosintética de metionina 60E4 metA(R27C), 60E4 metA (Y294C), 60E4 metA(Y294C) metK(V185E), y 60E4 mefcA(Y294C) iT?et.íí(cll32del) fue comparable a aquella observada en células hospedadoras de control durante la fase de crecimiento de la fermentación (5-28 horas). Sin embargo, células hospedadoras doblemente mutantes 60E4 metA(Y294C) metiC(V185E), y 60E4 metA(Y294C) metfC(cll32del) tienen iOD550 menor (área bajo la curva de crecimiento de 24 horas hasta el término de la fermentación) en comparación a aquella observada en fermentaciones de células hospedadoras de control. (Ver Figura 12B). Las fermentaciones realizadas con alimentación de agua usando las células hospedadoras 60E4 y 60E4 JnetA(Y294C) tuvieron iOD550 ligeramente mayor en comparación a aquel observado en la fermentación de células hospedadoras de control realizada con una alimentación de metionina y fermentación de células hospedadoras 60E4 metA(Y294C) realizadas sin alimentación, respectivamente. Las células mutantes 60E4 AmefcJ::kanR y 60E4 metA(I296S P298L) tuvieron fases de adaptación más prolongadas y como resultado tuvieron iOD550 menor en comparación a aquel observado en fermentaciones de células hospedadoras de control. (Ver Figuras 12A y 12B). La célula hospedadora mutante 60E4 metA(Q64E) creció pobremente en el termentador, alcanzando un O?550 máximo de 150, que es aproximadamente 30-40% menor en comparación al OD550 máximo observado en fermentaciones usando otras células hospedadoras mutantes. (Ver Figura 12A). Después de 20 horas, el crecimiento de la célula hospedadora mutante 60E4 metA(Q64E) alcanzó saturación y como resultado, la fermentación usando esta célula hospedadora mutante tiene el más bajo iOD55o. (Ver Figuras 12A y 12B).

La presencia o ausencia de una alimentación de metionina durante la fermentación no afecta el crecimiento de las células hospedadoras 60E4. (Ver Figura 12C.) Las fermentaciones usando los mutantes de la ruta biosintética de metionina acumularon mayores niveles de metionina tanto in vivo (es decir, intracelular) como en el medio extracelular en comparación a aquel observado en fermentación de célula hospedadora de control. (Ver Figuras 13A, 13B, 14A, y 14B). Al comienzo del proceso de fermentación, hay un exceso de metionina (>3 mM) en el medio de fermentación. Conforme empiezan a crecer las células, captan metionina para la síntesis de proteína, el papel de donador de metilo, y otras funciones. Como resultado, la concentración extracelular de metionina disminuye gradualmente conforme las células continúan creciendo y los niveles extracelulares de metionina alcanzan menos que los niveles detectables (<10 mM) a aproximadamente la hora 16. (Ver Figuras 13A y 14A), En la hora 16, las concentraciones intracelulares de metionina varían de 0.5-2.5 mM (concentración es en base al volumen celular) entre los diferentes hospedadores. (Ver Figuras 13B y 14B). A estas altas concentraciones intracelulares de metionina, MetA tipo silvestre se inhibirá fuertemente; sin embargo, los mutantes de MetA resistentes a retroalimentación solo se pueden inhibir débilmente y permiten de este modo que las células hospedadoras mutantes produzcan metionina mediante la ruta biosintética. (Ver Usuda y Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234), Sin embargo, los niveles intracelulares de metionina continúan disminuyendo hasta aproximadamente la hora 28, punto en el cual se desaceleró considerablemente el crecimiento celular. Es posible que durante la fase de crecimiento bacteriano (5-28 horas) de las fermentaciones, la velocidad a la cual se utiliza la metionina para la síntesis de proteínas y otras funciones celulares puede acceder la velocidad a la cual se sintetiza in vivo la metionina. Esto explica la disminución gradual en los niveles intracelulares de metionina hasta el final de la fase de crecimiento.

Durante la fase de producción de proteínas recombinantes de la fermentación (28 horas hasta el final de la fermentación), las células hospedadoras sobreproductoras de metionina continúan sintetizando metionina in vivo y los niveles intracelulares de metionina continúan incrementándose durante esta fase del proceso de fermentación. (Ver Figuras 13B y 14B). Estos resultados sugirieron que durante la fase de producción de proteína recombinante de la fermentación, la velocidad de biosíntesis de metionina excedió la velocidad a la cual se utilizó metionina para varias funciones intracelulares.

Durante la fermentación de células hospedadoras de control realizada con una alimentación continua de agua, los niveles de metionina tanto extracelulares como intracelulares continuaron disminuyendo, alcanzando niveles menores que el límite de detección del ensayo (10 mM) en aproximadamente 16 horas para metionina extracelular y en aproximadamente 24 horas para metionina intracelular. Para una fermentación de hospedador de control realizada con una alimentación continua de metionina, la alimentación asegura que exista un exceso de metionina en la célula después de aproximadamente 26 horas, punto en el cual se inicia la alimentación. Durante la fase de producción de fermentación, la célula hospedadora doblemente mutante 60E4 metA(Y294C) metíC(V185E) acumuló más metionina intracelular en comparación a aquella observada en la fermentación de célula hospedadora de control realizada con una alimentación continua de metionina.

La fase prolongada de adaptación de las células hospedadoras 60E4 metA(I296S P298L) y 60E4 AmetJ: :kanR y el pobre crecimiento de la célula hospedadora 60E4 n?etA(Q64E) en comparación a aquella observada en las células hospedadoras de control puede ser potencialmente debido a los altos niveles de acumulación de homocisteína, un tóxico intermedio en la ruta biosintética de metionina. (Ver Roe et al . , (2002) Microbiology 148:2215-2222; Ver Figura 12A). Se demostró previamente que la homocisteína inhibe la enzima comprendida en el primer paso de la ruta biosintética de isoleucina, treonina deaminasa, provocando inhibición de crecimiento. (Ver Tuite et al . , (2005) J Bacteriol 187:4362-4371). Esto se examinó al medir los niveles intracelulares de isoleucina en las células hospedadoras mutantes. El análisis mostró que los niveles intracelulares de isoleucina fue comparable a aquel observado en células hospedadoras de control durante la fermentación (datos no mostrados). La posibilidad de la homocisteína que tiene otros efectos tóxicos en el crecimiento celular no puede ser descartada completamente. En este momento, sin embargo, no se entiende completamente estas diferencias en el crecimiento entre los mutantes.

El transcurso de tiempo para los títulos de producto de proteína y los datos de transferencia western se muestran en las Figuras 16A, 16B, y 17. La fermentación inoculada de la célula hospedadora 60E4 metA(Q64E) produjo menos producto que aquel observado en otras células hospedadoras. Excepto por un breve período entre 45-50 horas, los niveles de fosfato nunca se agotaron durante la fermentación del hospedador 60E4 metA(Q64E) (Figura 15); de esta manera, fue baja la síntesis de proteína recombinantes. La prolongada fase de adaptación de las células hospedadoras mutantes 60E4 metA(I296S P298L) y 60E4 ¡ metJ-. :kanR dio por resultado el agotamiento de fosfato después de la hora 40 que es aproximadamente 12 horas más tarde que como se observa usualmente; por lo tanto, las fermentaciones que usan estas células hospedadoras tienen menores títulos de producto de proteína en comparación a aquel observado en otras célulashospedadoras mutantes que agotaron antes el fosfato. (Ver Figuras 12A, 15 y 16A). Las fermentaciones usando las células hospesadoras 60E4 metA(R27C) y 60E4 mefcA (Y294C) produjeron los títulos más altos de producto de proteína entre todas las células mutantes examinadas.

Las fermentaciones usando las células hospedadoras doblemente mutantes me tA met K, 60E4 metA(Y294C) metK(V185E) y 60E4 metA(Y294C) etK(cll32del), produjeron títulos algo bajos de producto de proteína a pesar de tener crecimiento comparable a las celulas hospedadoras de control. Esas células hospedadoras doblemente mutantes tienen una mutación en el gen met K que da por resultado una pérdida parcial de función de MetK. El producto de MetK es s-adenosilmetionina (SAM), un donador de metilo para muchas reacciones en células bacterianas. No se conoce, sin embargo, porque disminuyeron los niveles de SAM que afectaron los títulos de producto de proteína. Una alimentación continua durante el proceso de fermentación puede dar por resultado la dilución del medio de cultivo que posiblemente puede dar por resultado menores densidades celulares y posiblemente menores títulos de producto. El crecimiento y títulos de la fermentación de la célula hospedadora 60E4 metA(Y294C) sin ninguna alimentación fue comparable a aquel observado en fermentaciones que usan la misma célula hospedadora realizada con una alimentación continua de agua.

Ejemplo 4. Mala Incorporación de Norleucina Como se describe anteriormente, la mala incorporación de norleucina en proteínas debido a los niveles de metionina en células son suficientemente bajos de modo que la norleucina puede competir por los residuos de metionina en la carga de metionil-ARNt durante la síntesis de proteína. Como se muestran en el Ejemplo 1 anterior, la fermentación de células hospedadoras de control, realizadas sin una alimentación de metionina dio por resultado altos niveles de mala incorporación de norleucina en la proteína recombinante (Tabla 3). Los bajos niveles intracelulares de metionina durante la fase de producción de la fermentación de células hospedadoras de control realizadas sin una alimentación de metionina indicó que los residuos de norleucina pueden estar compitiendo por los residuos de metionina en la proteína recombinante. Sin embargo, se observaron altos niveles de metionina extracelular e intracelular mediante la fase de producción de las fermentaciones de células hospedadoras mutantes. (Ver Figuras 13B y 14B). Como resultado de los niveles intracelulares elevados de metionina, se espera que la mala incorporación de norleucina sea mínima o se elimine al usar estas fermentaciones de células hospedadoras.

La digestión con tripsina de la proteína recombinante produjo dos péptidos que contienen metionina: péptido 1: LSCAASGYDFTHYGM34NWVR (SEQ ID NO:35); y péptido 2: STAYLQM83NSLR (SEQ ID NO:36). El análisis por mapa peptídico indicó que la mezcla de proteínas recombinantes purificada de las fermentaciones de células hospedadoras mutantes contuvo menos que niveles detectables de mala incorporación de norleucina, en tanto que la fermentación de célula hospedadora de control, realizadas sin una alimentación de metionina acumuló altos niveles de norleucina en ambos péptidos que contienen metionina. (Ver Tabla 3). Estos resultados mostraron que el uso de cepas de células hospedadoras de E. coli de la presente invención, da por resultado la reducción o prevención de la mala incorporación de norleucina en polipéptidos heterólogos (por ejemplo, recombinante).

Ejemplo 5. Células hospedadoras bacterianas adicionales Además de los experimentos realizados usando la célula hospedadora 60E4 o células hospedadoras derivadas de 60E4, se desarrollaron otras dos células hospedadoras bacterianas y se examinaron para crecimiento, mala incorporación de norleucina y producción de proteínas recombinantes como sigue.

Las células hospedadoras bacterianas 66F8 y 64B4 (así como la célula hospedadora bacteriana 60E4) se describe anteriormente en la Tabla 2. Como se muestra en la Tabla 2, hay varias diferencias en el genotipo de células hospedadoras 60E4 en comparación a las células hospedadora 66F8 y 64B4 (que comparten un genotipo similar).

Se examinaron tres diferentes procesos de fermentación usando la célula hospedadora 60E4 (proceso de fermentación AF1), célula hospedadora 66F8 (proceso de fermentación AF2), y célula hospedadora 64B4 (proceso de fermentación AF3). La Tabla 4 posterior muestra las diferencias en los varios parámetros de fermentación (pH, agitación, duración de cultivo y tiempo de inicio de alimentación) de cada uno de los procesos de fermentación (AFl, AF2, y AF3) examinados.

Tabla 4 a Después de que las células alcanzan un OD550 de 200, se reduce la agitación a 800 y entonces gradualmente por 100 rpm cada 2 horas hasta que se alcanzan 500 rpm.

El alelo metA(Y294C) introdujo en las células hospedadoras 66F8 y 64B4 usando métodos como se describe anteriormente en el Ejemplo 1 para las célula hospedadora 60E4. La fermentación realizada usando las 66F8 metA(Y294Cj y la 64B4 metA(Y294C), usando los proceso de fermentación AF2 y AF3, respectivamente, mostraron crecimientos de células hospedadoras comparable a aquel observado con sus células hospedadoras de origen. (Ver Figuras 19A y 19B; y Tabla 5 posterior).

Ejemplo 6. Comparación de velocidades de crecimiento de celulas hospedadoras de E. coli y rendimientos de producto de proteínas recombinantes Las velocidades de crecimiento y los rendimientos de producto de proteína recombinantes se examinaron en cada una de las cepas hospedadoras de E. coli 60E4 metA(Y294C), 66F8 metA(Y294C), y 64B4 metA(Y294C) usando los procesos de fermentación AF1, AF2, AF3, respectivamente. Se realizaron fermentaciones de 10L como se describe anteriormente en el Ejemplo 3 para células hospedadoras de la cepa 60E4, usando modificaciones de proceso de fermentación como se resume anteriormente en la Tabla 4 para cada proceso de fermentación.

Las velocidades de crecimiento y los rendimientos de producto de proteínas recombinantes, observados para las varias células hospedadoras de la cepa 60E4 se analizan en detalle anteriormente en el Ejemplo 3.

Como se muestra en las Figuras 20A, 20B, y 20C, los rendimientos de producto de proteína recombinantes, obtenidos usando las cepas hospedadoras 60E4 metA(Y294C), 66F8 metA(Y294C), y 64B4 mefcA(Y294C) fue comparable a aquel observado usando las cepas hospedadoras 60E4, 66F8, y 64B4. (Ver también Tabla 5 posterior). La presencia o ausencia de alimentación de metionina no afecta los rendimientos de proteínas recombinantes obtenidos de la fermentación de la célula hospedadora 60E4.

Tabla 5 a Para los hospedadores 60E4 metJ y 60E4 metA metA (I296S P298L) , el tiempo entre 6-14 horas y 14-22 horas respectivamente se usó para calcular m. Para todos los otros hospedadores, se usaron 2-10 horas para calcular m. Los valores de m mostrados son el promedio de n=2 corridas. b Los valores mostrados son el promedio de n=2 corridas. c Bolo de norleucina a una concentración final de 0.15 mM se adicionó durante la fermentación cuando las células alcanzaron OD550 de 200.

Ejemplo 7. Comparación de mala incorporación de norleucina Se usaron tres diferentes procesos de purificación de productos de proteínas recombinantes, cada uno específico al proceso de fermentación AF1 (para célula hospedadora 60E4), AF2 (para célula hospedadora 66F8), y AF3 (para célula hospedadora 64B4). La Tabla 6 a continuación muestra las diferencias en los varios procesos de purificación usados para cada uno de los procesos de fermentación (es decir, AF1, AF2, y AF3) examinados.

Tabla 6 Concentraciones finales indican para el floculante Se realizó la cuantificación de norleucina usando análisis LC-MS en péptidos trípticos para cada uno de los productos de proteínas recombinantes como se describe anteriormente.

La digestión con tripsina de la proteína recombinante producida por el hospedador 60E4 produjo 2 péptidos que contienen metionina (Tabla 7). La digestión con tripsina de la proteína recombinante producida por el hospedador 66F8 produjo tres péptidos que contienen metionina (Tabla 8). La digestión con tripsina en la proteína recombinante producida por el hospedador 64B4 produjo 6 péptidos que contienen metionina (Tabla 9).

Tabla 7 Tabla 8 Tabla 9 La proteína recombinante purificada del proceso de fermentación AF1 realizados sin ninguna alimentación de metionina usando el hospedador 60E4 acumuló 5.1% y 10% de norleucina en los dos residuos de metionina en la proteína (Tabla 7). No se detectó norleucina en la proteína recombinante purificada de las fermentaciones AF1 realizadas sin ninguna fermentación de metionina usando el hospedador 60E4 metA (Y294C) (Tabla 7), 60E4 metA (R27C) , 60E4 met A (Y294C) metK (V185E) , y 60E4 metA (Y294C) metK(cll32del) datos no mostrados).

Cuando la fermentación del hospedador 60E4 metA (Y294C) se complementó con norleucina (concentración final 0.15 mM) en el medio de fermentación, no se observó norleucina en la proteína recombinante, indicando que las células hospedadoras bacterianas de la presente invención hacen suficiente metionina en la célula para impedir la mala incorporación de norleucina durante la síntesis de proteínas recombinantes.

Se observó aproximadamente 2.7%, 0.7%, y 1% de mala incorporación de norleucina en los tres péptidos trípticos que contienen metionina, obtenidos de la proteína recombinante producida usando el proceso de fermentación AF2 realizados sin alimentación de metionina usando el hospedador 66F8. (Ver Tabla 8.) De manera similar, u aproximadamente 1.3%, 1.3%, 2.4%, 2.2%, 1.5%, y 1.3% mala incorporación de norleucina en los seis péptidos trípticos que contienen metionina obtenidos de la proteína recombinante producida usando el proceso AF3 realizado sin alimentación de metionina usando el hospedador 64B4. (Ver Tabla 9). Sin embargo, no se detectó norleucina en las proteínas recombinantes purificadas de los procesos de fermentación AF2 y AF3 usando el hospedador 66F8 metA{Y294C) y el hospedador 64B4 metA(Y294C), respectivamente. (Ver Tablas 8 y 9 anteriores).

El análisis de mapa de péptidos trípicos indicó que las mezclas de proteínas recombinantes purificadas de las fermentaciones de células hospedadoras mutantes contuvo niveles menores a los detectable de mala incorporación de norleucina, en tanto que la fermentación de la célula hospedadora de control realizadas sin ninguna alimentación de metionina acumuló altos niveles de norleucina en los péptidos que contienen metionina. Estos resultados mostraron que el uso de cepas ce células hospedadoras de E. coli de la presente invención dieron por resultado la reducción o prevención de mala incorporación de norleucina en péptidos heterólogos (por ejemplo, recombinante).

Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no se deben considerar como que limiten el alcance de la invención. Las descripciones de toda la literatura científica de patente citada en la presente se incorpora expresamente en su totalidad como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en una proteína o polipéptido, el método que comprende expresar la proteína o el polipéptido en un microorganismo, en donde el microorganismo es un microorganismo mutante que produce metionina a un grado o proporción suficiente para impedir o reducir la mala incorporación de norleucina en la proteína o polipéptido.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es una bacteria.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es E. coli .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es un microorganismo de homoserina-succiniltransferasa insensible a retroalimentación o resistente a retroalimentación.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el microorganismo está des-reprimido para la producción de metionina.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el microorganismo comprende un alelo met ? mutante, un alelo metK mutante, o un alelo met A mutante y un alelo metK mutante.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la expresión de la proteína o el polipéptido en el microorganismo se realiza en la ausencia de metionina exógenamente adicionada al medio de cultivo o sin una alimentación de metionina.

8. Un microorganismo que comprende un alelo metA mutante, un alelo metK mutante o un alelo metA mutante y un alelo etK mutante.

9. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA seleccionada del grupo que consiste de una sustitución de arginina a cisteína en la posición de aminoácido 27, una sustitución de glutamina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 64, una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294, una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido position 296, una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298, y una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296 y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298.

10. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 9, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, y SEQ ID NO:26.

11. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetK que comprende una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185 o una secuencia de ácido nucleico que comprende una supresión de la base citocina en la posición de residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK.

12. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 11, en donde el microorganismo comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28.

13. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo me tA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetA seleccionada del grupo que consiste de una sustitución de arginina a cisterna en la posición de aminoácido 27, una sustitución de glutamina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 64, una sustitución de tirosina a cisteína en la posición de aminoácido 294, una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296, una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298, y una sustitución de isoleucina a serina en la posición de aminoácido 296 y una sustitución de prolina a leucina en la posición de aminoácido 298, y en donde además el alelo et K mutante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una sustitución de aminoácido en MetK que comprende una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición de aminoácido 185 o una secuencia de ácido nucleico que comprende una supresión de la base citosina en la posición de residuo de ácido nucleico 1132 del alelo metK.

14. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 13, en donde el microorganismo comprende un alelo metA mutante, en donde el alelo metA mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, y SEQ ID NO:26, en donde además el microorganismo comprende un alelo metK mutante, en donde el alelo metK mutante comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que c consiste de SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28.

15. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, que comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF.

16. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF es ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46 y ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47.

17. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 15, en donde el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 33 y la secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:34.

18. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, que comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D.

19. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 18, en donde el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D es ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48 y ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9.

20. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, que comprende además ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET.

21. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET se selecciona del grupo que consiste de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51, y ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:52.

22. Un método para producir una proteína o un polipéptido o una célula hospedadora bacteriana en donde la proteína o el polipéptido está libre de la mala incorporación de norleucina, el método que comprende expresar en la célula hospedadora bacteriana un ácido nucleico que codifica para la proteína o el polipéptido bajo condiciones de cultivo adecuadas para permitir la expresión de la proteína o el polipéptido, en donde la célula hospedadora bacteriana comprende un alelo met K mutante, o un alelo metA mutante y un alelo metK mutante, produciendo de este modo una proteína o un polipéptido libre de mala incorporación de norleucina.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde la célula hospedadora bacteriana se selecciona del grupo que consiste del microorganismo de la reivindicación 9, el microorganismo de la reivindicación 10, el microorganismo de la reivindicación 11, el microorganismo la reivindicación 12, el microorganismo de la reivindicación 13, y el microorganismo de la reivindicación 14.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde la proteína o el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la proteína o el polipéptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de anticuerpo anti-VEGF es ácido nucleico que codifica para la se secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46 y ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de anticuerpo anti-VEGF se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 33 y la secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:34.

29. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti- Factor D.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-Factor D o el fragmento de anticuerpo anti-Factor D es ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48 y ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49.

31. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, en donde el ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-MET se selecciona del grupo que consiste de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51, y ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52.

33. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde la expresión de la proteína al polipéptido en la célula hospedadora bacteriana se realiza en la ausencia de metionina exógenamente adicionada al medio de cultivo o sin una alimentación de metionina.

34. Un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo anti-VEGF producido de acuerdo al método de la reivindicación 26, reivindicación 27, o reivindicación 28.

35. Un anticuerpo anti-Factor D o un fragmento de anticuerpo anti-Factor D producido al método de la reivindicación 29 o reivindicación 30.

36. Un anticuerpo anti-MET o un fragmento de anticuerpo anti-MET producido de acuerdo al método de la reivindicación 31 o reivindicación 32.