JP2019068810A - タンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防ぐための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】細菌における組換えタンパク質の産生において、タンパク質へのノルロイシンの取り込みを防止するための方法及び組成物の提供。【解決手段】タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する変異微生物であり、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物。【選択図】図１１

Description

関連出願
本出願は、２０１３年３月１２日に出願された米国仮出願第６１／７７７７００号、及び２０１２年９月１９日に出願された米国仮出願第６１／７０３１４２号の利益を主張し、その両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。２０１３年７月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＰ４９６７Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、大きさは４５８４７バイトである。

本発明は、細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防止するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、本明細書において提供される方法及び組成物と共に使用するための微生物宿主細胞及び核酸分子を提供する。

アミノ酸のメチオニンの類似体である、ノルロイシンは、メチオニン残基の代わりにタンパク質中に組み込むことができる。大腸菌（E. coli）で発現される場合、多くの異種タンパク質は、メチオニン残基が現れるはずの場所に誤って組み込まれたノルロイシンを有する。タンパク質、特に組換え手段により生成された異種タンパク質におけるノルロイシン誤取り込みは、結果として生じる、望ましくない特性を有する改変されたタンパク質の生成に一部起因して、一般的に望ましくないと考えられている。

大腸菌における組換えタンパク質の生成の間のメチオニン位置でのノルロイシン誤取り込みは、５０年以上にわたって観察されている。（例えば、Munier and Cohen (1959) Biochim Biophys Acta 31:378-391; Cohen and Munier (1956) Biochim Biophys Acta 21:592-593; Cohen and Munier (1959) Biochim Biophys Acta 31:347-356;及びCowie et al., (1959) Biochim Biophys Acta 34:39-46を参照）。例えば、メチオニルウシソマトトロピン（ＭＢＳ）におけるメチオニン残基の約１４％は、大腸菌におけるこのタンパク質の組換え生成の最中にノルロイシン誤取り込みを示し、天然型大腸菌タンパク質中のメチオニン残基の約６％もノルロイシンで置換された。（Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-9を参照）。別の例において、最少培地の大腸菌発酵におけるインターロイキン２の生成は、組換えタンパク質中のメチオニン残基の約１９％がノルロイシンで置換される結果となった。（Tsai et al., (1988) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739）。他の研究では、タンパク質へのノルロイシン残基の誤取り込みは、内部のメチオニン残基とアミノ末端のメチオニン残基の両方で生じる可能性があることを示した。（Brown (1973) Biochim Biophys Acta 294:527-529；及びBarker and Bruton (1979) J Mol Biol 133:217-231を参照）。

ノルロイシンは、酵素メチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＧ）の乱雑な性質に起因して、タンパク質への組み込みについてメチオニンと競合する。（Trupin et al., (1966) Biochem Biophys Res Commun 24:50-55；及びFersht and Dingwall (1979) Biochemistry 18:1250-1256を参照）。大腸菌ＭｅｔＧ酵素での速度論的研究は、ＭｅｔＧのアシル化は、約ノルロイシンによるものと比較してメチオニンで約４倍多いことを示した。（van Hest et al., (2000) Am Chem Soc 122:1282-1288を参照）。ＭｅｔＧの緩和された基質特異性に起因して、ノルロイシンは、アシル化反応でメチオニンの代わりとなることができ、メチオニンの代わりにタンパク質へのノルロイシン誤取り込みをもたらす。

組換えタンパク質の生成におけるメチオニン残基に対するノルロイシン残基の誤取り込みは、一般的に望ましくないと考えられる。誤って取り込まれたノルロイシン残基を含む組換えタンパク質又はポリペプチドは、例えば、タンパク質分解に対する感受性の変化、生物学的活性の低下、又は免疫原性の増加など、改変された構造的及び機能的特徴を示し得る。

組換えタンパク質の生成中にノルロイシン誤取り込みを低下させる又は防止するために様々な戦略が開発されている。例えば、発酵プロセスの最中に（メチオニンの持続又はボーラス供給／添加により）メチオニンを含む細胞培地を補充することは、過剰のメチオニンが細胞に利用可能であり、従ってノルロイシンによるメチオニルｔＲＮＡの誤った荷電の可能性を減少させることを確実にするために使用されている。（例えば、米国特許第５５９９６９０を参照）。メチオニンの持続又はボーラス供給／添加は、組換えタンパク質におけるノルロイシン誤取り込みの程度を低下させたが、発酵プロセスの操作の複雑さとコストは増加し得る。更に、発酵の最中のメチオニンの持続又はボーラス供給／添加は、発酵槽の内容物の望ましくない希釈につながり、細胞密度の低下及び生成物収率の低下もたらす可能性がある。

ノルロイシン生合成経路に関与する遺伝子を除去すること、例えば、ロイシンオペロン（ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、及びｅｕＤ）の遺伝子を除去すること、又はｌｖＥ又はｔｙｒＢなどのトランスアミナーゼをコードする遺伝子を除去することが、タンパク質へのノルロイシン誤取り込みを減少させるために使用されている。（Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-539; Tsai et al., (1989) Biochem Biophys Res Commun 156:733-739；及びRandhawa et al., (1994) Biochemistry 33:4352-4362を参照）。ノルロイシン生合成に関与する多くの遺伝子はまた、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与しているので、ノルロイシン誤取り込みを防止するための、生合成経路遺伝子の除去は、しかしながら、発酵の間、培地に他のアミノ酸（例えばロイシン又はイソロイシンなど）の添加を必要とし得る。（Bogosian et al., (1989) J Biol Chem 264:531-539を参照；本明細書の図８を参照）。

ノルロイシン誤取り込みを防ぐために使用される別の戦略は、例えば、アミノ酸脱水素酵素及びアミノ酸オキシダーゼを含む、ノルロイシンを分解する酵素の共発現を含んでいた。しかしながら、このアプローチは、組換えタンパク質生成中には所望されず、組換えタンパク質の収率低下をもたらし得る、これらの酵素の過剰発現を必要とした。（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２００７／０００９９９５を参照）。更に、これらの酵素の過剰発現は、発酵プロセス中に他の類似のアミノ酸の分解をもたらし得る。メチオニンコドンを他のコドンと置換することによる、発現されるポリペプチドの一次アミノ酸配列の改変が、ノルロイシン誤取り込みを防ぐために行われた。（例えば、米国特許第５６９８４１８号を参照）。しかし、このような置換は、バイオテクノロジー産業における組換えタンパク質産生のために非常に望ましくない結果である、得られたタンパク質の活性の低下又は構造変化をもたらし得る。

上述したように、微生物における組換えタンパク質産生の間にノルロイシン誤取り込みを防止するために使用される現在の方法は、様々な欠点に関連しており；従って、特に、大腸菌などの微生物における組換えタンパク質生成の間に、タンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させために有用な新規な方法に対する必要性が存在する。

本発明は、微生物、例えば、細菌などにおける組換えタンパク質生成の間のノルロイシン誤取り込みを防ぐのに効果的である、操作された微生物宿主細胞を提供することによって、この必要性を満たす。本発明は、とりわけ、タンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを低減する又は防止するのに十分な程度又は量に微生物によるメチオニンの生成を生じる、変異したｍｅｔＡ及びｍｅｔＫ対立遺伝子（すなわち、改変されたｍｅｔＡ及びｍｅｔＫの核酸配列）を含む大腸菌宿主細胞を提供する。このような宿主細胞を利用した、生成される組換えタンパク質の分析は、メチオニン残基の代わりにノルロイシン残基の誤取り込みが解消されることを示した。本発明は更に、宿主細胞の増殖、及びそのような大腸菌宿主細胞を利用した組換えタンパク質生成物の力価を含む、大腸菌宿主細胞を使用した発酵プロセスのパフォーマンスは、対照宿主細胞において観察されたものと同等であったことを示している。

本発明は、一つには、タンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させための方法及び組成物を提供する。本発明の方法及び組成物は、微生物、例えば細菌（例えば、大腸菌）により発現される、異種性（例えば、組換え）タンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに有用である。

幾つかの実施態様において、本発明は、微生物により発現される、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する方法を提供する。幾つかの実施態様において、微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。他の実施態様において、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物である。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、ここで、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２７でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置６４でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換を含む、ＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。本明細書において本明細書に記載されるＭｅｔＡアミノ酸の位置は、図７Ａ及び配列番号２９に示されるように野生型ＭｅｔＡアミノ酸配列を参照する。

他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。

上記のように、本発明は、微生物により発現される、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、微生物により発現されるタンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された（de-repressed）微生物である。幾つかの実施態様において、微生物は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素の部分的な機能喪失に起因してメチオニン生成について抑制解除される。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む。幾つかの実施態様において、変異ＭｅｔＫ対立遺伝子は、ＭｅｔＫの部分的な機能喪失を生じる。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、アミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換を含む、ＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基位置１１３２でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。本明細書に記載されるＭｅｔＫアミノ酸の位置は、図８Ａ及び配列番号３０に示されるように野生型ＭｅｔＫアミノ酸配列を参照する。本明細書に記載されるｍｅｔＫ核酸の位置は、図８Ｂ及び配列番号３２に示されるように野生型ｍｅｔＫ核酸配列を参照する。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及びｍｅｔＫ対立遺伝子を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ＭｅｔＡのアミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換をコードする核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ＭｅｔＫのアミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及びｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ｍｅｔＡのアミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換をコードする核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基位置１１３２でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。

他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２４の核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７の核酸配列を含む。更に他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２４の核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２８の核酸配列を含む。

本発明は更に、微生物宿主細胞によって発現されるタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために有用な微生物宿主細胞を提供する。本発明はまた、微生物宿主細胞によるタンパク質又はポリペプチドにおいて使用のための微生物宿主細胞を提供し、発現されたタンパク質又はポリペプチドはノルロイシン誤取り込みを含まない。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

本発明は、微生物（例えば、微生物宿主細胞）を提供し、微生物は、微生物により発現されるタンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供し、ここで、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２７でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置６４でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子が、ＭｅｔＡにおける一以上のアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ＭｅｔＡにおけるアミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、及びＭｅｔＡにおけるアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、ここで微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

本発明は、微生物（例えば、微生物宿主細胞）を提供し、微生物は、微生物により発現されるタンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された微生物である。幾つかの実施態様において、メチオニン生成について抑制解除された微生物は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素の部分的な機能喪失によって生じる。他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、アミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換を含むＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子において核酸残基位置１１３２にてシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

幾つかの実施態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

本発明はまた、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子の様々な組み合わせを含む微生物宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換を含むＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、アミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換を含むＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換を含むＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基位置１１３２で核酸シトシンの欠失を含む。幾つかの実施態様において、本発明は微生物を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２４の核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７の核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は微生物を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２４の核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２８の核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、微生物宿主細胞は細菌である。他の実施態様において、微生物宿主細胞は大腸菌である。

本発明はまた、本方法における使用のための単離された核酸分子を提供する。幾つかの態様において、本発明は、単離されたｍｅｔＡ核酸分子（すなわち、ＭｅｔＡをコードする単離された核酸分子）を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、単離されたｍｅｔＡ核酸分子を提供し、ここで、ｍｅｔＡ核酸分子は、アミノ酸位置２７でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置６４でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明により提供される単離されたｍｅｔＡ核酸分子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させることに使用のための、微生物の生成のための、これらの単離されたｍｅｔＡ核酸分子及びその配列の使用が、本発明により本明細書に具体的に与えられる。

本発明はまた、単離されたｍｅｔＫ核酸分子（すなわち、ＭｅｔＫをコードする単離された核酸分子）を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、ｍｅｔＫ核酸分子を提供し、ｍｅｔＫ核酸分子は、アミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換を含むＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む。他の実施態様において、本発明は、ｍｅｔＫ核酸分子を提供し、ｍｅｔＫ核酸分子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基１１３２にて核酸シトシンの欠失を含む。他の実施態様において、本発明により提供されるｍｅｔＫ核酸分子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させることにおける使用のための微生物の生成のための、これらの単離されたｍｅｔＫ核酸分子及びその配列の使用が、本発明により本明細書に具体的に与えられる。

本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号３３の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列である。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号３３に対応する核酸配列を有する核酸及び配列番号３４に対応する核酸配列を有する核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号３３の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列である。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号３３に対応する核酸配列を有する核酸及び配列番号３４に対応する核酸配列を有する核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号３３の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列である。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号３３に対応する核酸配列を有する核酸及び配列番号３４に対応する核酸配列を有する核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号４８のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号４８のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号４８のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号５０のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号５２のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号５０のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号５２のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、本発明は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む核酸を含む微生物を提供し、微生物は、配列番号５０のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号５２のアミノ酸配列をコードする核酸を更に含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの態様において、微生物は、細菌、例えば、大腸菌である。

本発明は、ノルロイシン誤取り込みを含まないタンパク質又はポリペプチドを微生物宿主細胞内で生成するための方法であって、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む方法を更に提供し、細菌宿主細胞は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まないタンパク質又はポリペプチドを生成する。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

本発明はまた、微生物宿主細胞内で抗体又は抗体断片を生成するための方法であって、抗体又は抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗体又は抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗体又は抗体断片を生成する。一態様において、本発明に従って、ノルロイシン誤取り込みを含まずに、細菌宿主細胞内で抗体又は抗体断片を生成するための方法は、細菌宿主細胞内で抗体重鎖ポリペプチドをコードする核酸及び抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を発現させることを含む。幾つかの態様において、抗体重鎖ポリペプチドは、抗体Ｆａｂ断片重鎖ポリペプチドであり、抗体軽鎖ポリペプチドは、抗体Ｆａｂ断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

幾つかの実施態様において、本発明は、微生物宿主細胞内で抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片を生成するための方法であって、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片を生成する。幾つかの実施態様において、方法は、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖ポリペプチド又は抗ＶＥＧＦ抗体断片の重鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸、及び抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖ポリペプチド又は抗ＶＥＧＦ抗体断片の軽鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む。幾つかの態様において、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖及び抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗ＶＥＧＦ抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖は、抗体Ｆａｂ断片重鎖ポリペプチドであり、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖は、抗体Ｆａｂ断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、抗ＶＥＧＦ抗体軽鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号３４の核酸配列である。幾つかの実施態様において、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３３の核酸配列である。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

本発明は更に、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片を提供し、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片は、ノルロイシン誤取り込みを含まない。

幾つかの実施態様において、本発明は、微生物宿主細胞内で抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片を生成するための方法であって、抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片を生成する。幾つかの実施態様において、方法は、抗Ｄ因子抗体重鎖ポリペプチド又は抗Ｄ因子抗体断片の重鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸、及び抗Ｄ因子抗体軽鎖ポリペプチド又は抗Ｄ因子抗体断片の軽鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む。幾つかの態様において、抗Ｄ因子抗体重鎖及び抗Ｄ因子抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗Ｄ因子抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗Ｄ因子抗体重鎖は、抗体Ｆａｂ断片重鎖ポリペプチドであり、抗Ｄ因子抗体軽鎖は、抗体Ｆａｂ断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、抗Ｄ因子抗体重鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、抗Ｄ因子抗体軽鎖は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

本発明は更に、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片を提供し、抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片は、ノルロイシン誤取り込みを含まない。

幾つかの実施態様において、本発明は、微生物宿主細胞内で抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片を生成するための方法であって、抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片がノルロイシン誤取り込みを含まない方法を提供し、方法は抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まない抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片を生成する。幾つかの実施態様において、方法は、抗ＭＥＴ抗体重鎖ポリペプチド又は抗ＭＥＴ抗体断片の重鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸、及び抗ＭＥＴ抗体軽鎖ポリペプチド又は抗ＭＥＴ抗体断片の軽鎖ポリペプチド又はその断片をコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含む。幾つかの態様において、抗ＭＥＴ抗体重鎖及び抗ＭＥＴ抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗ＭＥＴ抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗ＭＥＴ抗体重鎖は、抗体Ｆａｂ断片重鎖ポリペプチドであり、抗ＭＥＴ抗体軽鎖は、抗体Ｆａｂ断片軽鎖ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、抗ＭＥＴ抗体重鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、抗ＭＥＴ抗体重鎖断片は、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、及び抗ＭＥＴ抗体軽鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

本発明は更に、本明細書中に記載の任意の方法によって生成される抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片を提供し、抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片は、ノルロイシン誤取り込みを含まない。

様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む変異微生物は細菌であり；他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性（例えば、組換え）ポリペプチド及び異種性（例えば、組換え）タンパク質の生成のための、本明細書に記載の変異微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され、実質的に減少され、実質的に解消され又は防止される。

図１は、配列番号２３に対応するｍｅｔＡ（Ｒ２７Ｃ）の核酸配列を示す。 図２は、配列番号２４に対応するｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）の核酸配列を示す。 図３は、配列番号２５に対応するｍｅｔＡ（Ｉ２９６Ｓ／Ｐ２９８Ｌ）の核酸配列を示す。 図４は、配列番号２６に対応するｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ）の核酸配列を示す。 図５は、配列番号２７に対応するｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ）の核酸配列を示す。 図６は、配列番号２８に対応するｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ）の核酸配列を示す。 図７Ａ及び７Ｂは、配列番号２９及び配列番号３１にそれぞれ対応する野生型ＭｅｔＡのアミノ酸配列及び核酸配列を示す。 図８Ａ及び８Ｂは、配列番号３０及び配列番号３２にそれぞれ対応する野生型ＭｅｔＫのアミノ酸配列及び核酸配列を示す。 図９は、ノルロイシン及びノルロイシン類似体の構造を示す。ノルロイシンはメチオニンの構造的類似体であり、硫黄（Ｓ）原子はメチレン基（即ち、−ＣＨ_２）により置換される。 図１０は、大腸菌におけるノルロイシン生合成経路の模式図を示す。点線の矢印は、複数の工程が関与していることを示している。ピルビン酸は、ロイシンオペロンｌｅｕＡＢＣＤによってコードされる酵素によって触媒されるケト酸鎖伸長工程を介する３つ経路によって、α−ケトカプロン酸に変換される。中間のα−ケトイソカプロン酸はトランスアミナーゼＩｌｖＥ又はＴｙｒＢによりノルロイシンにアミノ基転移される。 図１１は、大腸菌におけるメチオニン生合成及び制御を示す。点線の矢印は、フィードバック阻害を示し、オープン矢印は抑制を示している。メチオニン及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、酵素のＭｅｔＡのフィードバック阻害剤である。リプレッサーのＭｅｔＨとそのコリプレッサーＳＡＭは、メチオニンレギュロンにおける酵素の転写を阻害する。 図１２Ａは、図１２Ｂ、及び１２Ｃは、１０Ｌの大腸菌の発酵のＯＤ_５５０（図１２Ａ）及びｉＯＤ_５５０（図１２Ｂ）によって測定される増殖傾向を説明する。対照宿主（６０Ｅ４）の発酵は、持続的なメチオニン（ｎ）又は持続的な水の供給（■）を伴い実行された（図１２Ａ）。６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）宿主発酵は、持続的な水の供給と共に（△）又は全く供給無しで実施された（▲）（図１２Ａ）。図１２Ｃは、給餌無しの対照宿主６０Ｅ４（□）、メチオニンを供給された対照宿主（○）及び給餌無しの宿主６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ（△）についての増殖傾向を示す。他の全ての変異体を用いた発酵は、持続的な水の供給と共に行われた。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、持続的な水の供給を伴った対照宿主（■）及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）（△）宿主細胞発酵についての細胞外（図１３Ａ）及び細胞内（図１３Ｂ）メチオニンレベルを示す。持続的な水の供給と共に行われた対照宿主細胞（■）及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ宿主細胞（Ｙ２９４Ｃ）（△）発酵について、細胞外培地中のリン酸レベルもまた点線プロットに示される（図１３Ａ）及び（図１３Ｂ）。 図１４Ａ及び１４Ｂは、本発明の変異宿主細胞株についての細胞外（図１４Ａ）及び細胞内（図１４Ｂ）メチオニンレベルを示す。持続的なメチオニンの供給（ｎ）又は持続的な水の供給（■）と共にそれぞれ行われた、細胞外及び細胞内のメチオニンレベルが、２つの対照宿主細胞の発酵について示されている。 図１５は発酵中の細胞外リン酸レベルを示す。 図１６Ａ及び１６Ｂは、大腸菌宿主細胞発酵の実行終了時の力価（図１６Ａ）と経時過力価（図１６Ｂ）を示す。対照宿主細胞（６０Ｅ４）の発酵は、持続的なメチオニン供給（ｎ）は持続的な水の供給（■）と共に行われた。６０Ｅ４ ｍｅｔＡ宿主細胞（Ｙ２９４Ｃ）の発酵は、持続的な水の供給と共に（△）又は水の供給無しで行った（▲）。他の全ての変異宿主細胞を用いた発酵は、持続的な水の供給と共に行った。 図１７Ａ及び１７Ｂは、６０Ｅ４宿主細胞（対照宿主細胞）及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ宿主細胞（Ｙ２９４Ｃ）のそれぞれの発酵中に得られた全細胞ブロスサンプルで実施されたウェスタンブロットの結果を記載している。 図１８Ａ及び図１８Ｂは、配列番号３３及び配列番号３４にそれぞれ対応する、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）抗体Ｆａｂ断片の軽鎖及び重鎖の核酸配列を示す。 図１９Ａ及び１９Ｂは、ＯＤ_５５０により測定される１０Ｌの大腸菌の発酵の増殖傾向を説明する。対照宿主（６６Ｆ８又は６４Ｂ４）発酵プロセスであるＡＦ２又はＡＦ３は、それぞれ、給餌無しで（四角）又は持続的なメチオニン供給と共に（○）実行された。６６Ｆ８ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）及び６４Ｂ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）宿主発酵は給餌無しで（△）実行された。 図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、宿主株６０Ｅ４（対照宿主）及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）、６６Ｆ８（対照宿主）及び６６Ｆ８ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）、並びに６４Ｂ４（対照宿主）及び６４Ｂ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）のそれぞれを用いた組換えタンパク質生成物の収率を記載する。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、配列番号４６及び配列番号４７にそれぞれ対応する、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）抗体Ｆａｂ断片の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す。 図２２Ａ及び図２２Ｂは、配列番号４８及び配列番号４９にそれぞれ対応する、抗Ｄ因子抗体Ｆａｂ断片の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ、２３Ｂ、及び２３Ｃは、抗ＭＥＴ抗体軽鎖（配列番号５０）、重鎖（配列番号５１）及び重鎖断片（配列番号５２）のアミノ酸配列を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する方法及び組成物を提供する。本発明はまた、本発明の方法において使用のための微生物宿主細胞及び核酸分子を提供する。

一般的な方法
本発明の実行は、特に明記しない限り、周知であり当業者に利用可能である細胞生物学の従来の技術、細胞培養、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学、及び免疫学を用いるであろう。そのような技術は、Molecular Cloning: A laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；及びShort Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)などの文献に記載されている。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現は、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、及び第５，８４０，５２３号に記載されている（また、大腸菌における抗体断片の発現を記述している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003）、頁２４５−２５４も参照）。

別に定義しない限り、一般的に、本発明が属する当業者によって理解されるように、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は同じ意味を持つ。

定義
用語「異種タンパク質」又は「異種ポリペプチド」は、天然に合成されないか又は目的の細胞若しくは生物（例えば、微生物）によって生成されないタンパク質又はポリペプチドを指す。例えば、大腸菌細胞は、ヒトタンパク質又はヒトポリペプチドを生成することができ、そのように生成されるヒトタンパク質又はヒトポリペプチドは、異種タンパク質又は異種ポリペプチドである。本発明の文脈において特に興味深いのは、メチオニンを含むそれらの異種タンパク質又は異種ポリペプチドである。本明細書で用いられる異種タンパク質又は異種ポリペプチドはまた、組換えタンパク質又は組換えポリペプチドを指す。

用語「ノルロイシン誤取り込み」は、メチオニン残基がタンパク質又はポリペプチドをコードする対応する核酸によってコードされるタンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン残基の取り込みを指す。

用語「変異対立遺伝子」又は「変異型対立遺伝子」とは、野生型対立遺伝子の（すなわち、目的の細胞又は微生物内で自然に見出されるような）核酸配列とは異なるか又は改変されている核酸配列を有する対立遺伝子を指す。

用語「変異微生物」又は「変異型微生物」は、一以上の変異対立遺伝子又は変異型対立遺伝子を含む微生物を指す。

本明細書で用いる「実質的に減少した」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が、２つの値の間の差異が、その値（例えばタンパク質又はポリペプチド中のノルロイシンの含量）によって測定される生物学的特性という文脈の中で、統計学的に有意であると考慮するであろうほどに、２つの数値（一般には、一つは分子に関連するもの、他方は参照／比較分子に関連するもの）の間の十分に高度な違いを指す。

「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。

「単離されたｍｅｔＡ核酸分子」又は「単離されたｍｅｔＫ核酸分子」は、ＭｅｔＡ又はＭｅｔＫをそれぞれコードする一以上の核酸分子を指し、単一ベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子及び宿主細胞中の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。「単離されたｍｅｔＡ核酸分子」又は「単離されたｍｅｔＫ核酸分子」はまた、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子又は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を指す。

「ノルロイシン誤取り込みの無いタンパク質又はポリペプチド」なる句は、検出可能なレベルのノルロイシン残基を含まないタンパク質又はポリペプチドを指す。

本明細書で使用される単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に指示がない限り、複数の言及が含まれる。

本明細書において「約」の値又はパラメーターへの言及は、この技術分野における当業者に容易に知られるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体を対象にする態様を含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は「Ｘ」の記述が含まれる。

ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させる方法
本発明は、とりわけ細菌における組換えタンパク質の産生の間にタンパク質及びポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために有用な方法及び組成物に関する。

大腸菌における組換えタンパク質生成の間の、メチオニン残基の代わりにノルロイシン残基の誤取り込みは以前に記載されている。ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために現在使用される一つのアプローチは、発酵プロセスの間における培地へのメチオニンの持続的又はボーラス供給によるものである。この戦略はノルロイシン誤取り込みを減少させることにおいて有効であるが、幾つかの操作上の不都合は、発酵プロセスの間のメチオニンの持続的若しくはボーラス供給又は添加することに関連している。例えば、培養物への持続的又はボーラス供給は、発酵プロセスの操作上の複雑さと全体的なコストを増加させる。加えて、メチオニンの供給は、低い細胞密度及び恐らくは低い生成物収率をもたらす発酵培地の望ましくない希釈につながる。

これらの不都合を克服するために、本発明者らは、異種タンパク質又はポリペプチドの生成におけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるために持続的又はボーラスメチオニン供給の代替を提供している。特に、本発明は、高い宿主細胞密度で行われる組換えタンパク質の生成を含む、組換えタンパク質生成の間に、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成するように操作された微生物（例えば、大腸菌）宿主細胞を提供する。

大規模なメチオニン生成に有用な大腸菌宿主細胞の変異体は、以前に報告されている。（例えば、Chattopadhyay et al., (1991) J Gen Microbiol 137:685-691; Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185; Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234；国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／１１１２０２ ２００５；及び米国特許出願公開番号ＵＳ２００９／０２９８１３５を参照）。これらの変異大腸菌株の多くは、メチオニン生合成の調節に関連する３つの遺伝子：ｍｅｔＪ、ｍｅｔＡ、及びｍｅｔＫに変異を含んでいた。

大腸菌におけるメチオニン生合成の転写調節は、酵素のＭｅｔＪ（ｍｅｔＪ遺伝子産物）を含む。ＭｅｔＪは、そのコリプレッサーのＳアデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合した場合、メチオニンレギュロンにおける遺伝子の転写を抑制し、従って、細胞におけるメチオニンのレベルを調節する転写リプレッサーである。（例えば、Marincs (2006) et al., Biochem J 396:227-234を参照）。以前に報告されたように、大腸菌の化学的突然変異誘発と続くエチオニン（毒性メチオニン類似体）に対する増殖に関する選択は、メチオニン生合成酵素の抑制解除とメチオニン生成の増加をもたらす、ＭｅｔＪのアミノ酸位置５４（Ｓ５４Ｎ）でセリンのアスパラギンへの変異の単離へと導いた。（Nakamori et al., (1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:179-185を参照）。ｍｅｔＪ遺伝子の完全な破壊はまた、メチオニン生合成経路及びメチオニン過剰産生に関与する酵素の抑制解除をもたらした。（Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234を参照）。

大腸菌におけるメチオニン生合成はまた、メチオニン生合成の最初のステップに関与する酵素であるホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ遺伝子産物）のフィードバック阻害により（メチオニンとＳＡＭにより）調節される。（例えば、Born and Blanchard (1999) Biochemistry 38:14416-14423を参照）。メチオニン生合成の調節解除につながる大腸菌でのフィードバック耐性ＭｅｔＡ（ｍｅｔＡの遺伝子産物）変異体は、毒性メチオニン類似体であるαメチルメチオニンに対する増殖に関して選択することにより以前に単離されていた。（Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234；及び国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／１１１２０２を参照）。

ｍｅｔＫ遺伝子は、メチオニンをＳ−アデノシルメチオニンに変換する酵素Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードする。（Markham et al., (1980) J Biol Chem 255:9082-9092を参照）。低レベルのＳＡＭ、よってメチオニン生合成酵素の抑制解除を生じるＭｅｔＫ変異体の部分的な機能喪失は（ＳＡＭはＭｅｔＪのコリプレッサーである）、毒性メチオニン類似体、ノルロイシン及びエチオニンに対する増殖に関して選択することにより以前に単離されている。（Chattopadhyay et al., (1991) Gen Microbiol 137:685-691; Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234；及び国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／１１１２０２を参照）。

本発明において、野生型ｍｅｔＡ遺伝子において特定の核酸残基が変異され、ＭｅｔＡの以下のアミノ酸置換をもたらす（図７Ａ及び野生型ＭｅｔＡアミノ酸配列に対する配列番号２９を参照）：アミノ酸位置２７でのアルギニンのシステインへの置換（Ｒ２７Ｃ）；アミノ酸位置６４でのグルタミンのグルタミン酸への置換（Ｑ６４Ｅ）；アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換（Ｙ２９４Ｃ）；アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換（Ｉ２９６Ｓ）；及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換（Ｐ２９８Ｌ）。これらのＭｅｔＡアミノ酸置換の一以上を含む大腸菌宿主細胞は、発現された異種タンパク質におけるノルロイシン誤取り込みの防止をもたらすのに十分な程度又は量にメチオニンを生成した。

幾つかの実施態様において、本発明は、（野生型ＭｅｔＡアミノ酸配列；図７及び配列番号２９と比較して）ＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換、Ｒ２７Ｃ、Ｑ６４Ｅ、Ｙ２９４Ｃ、Ｉ２９６Ｓ、及びＰ２９８Ｌをコードする様々な変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を提供する。このような変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、フィードバック耐性のＭｅｔＡ酵素をもたらした。変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、対立遺伝子交換法を用いて大腸菌宿主細胞（６０Ｅ４）に導入され（下記の材料と方法を参照）、変異大腸菌宿主細胞株６６Ｈ６（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｒ２７Ｃ））、６６Ｈ８（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ））、６７Ｂ８（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ））、及び６７Ｂ９（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｉ２９６Ｓ Ｐ２９８Ｌ））を得た。得られた変異大腸菌宿主細胞は、持続的メチオニン供給無しで実行された組換えタンパク質の生成中のノルロイシン誤取り込みについて評価された。（以下の実施例４を参照）。

ＭｅｔＡにおけるアミノ酸位置に対する全ての参照は、配列番号２９及び配列番号３１に対応する図７Ａ及び７Ｂに示す大腸菌のｍｅｔＡ遺伝子によってコードされるホモセリンスクシニルトランスフェラーゼに基づいている。アミノ酸位置への参照は、アミノ酸位置番号１として数える最初のアミノ酸のメチオニンにより行われる。他の生物由来のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ酵素における対応する領域の相対的な位置は、例えば、単純な配列アラインメントによって、当業者によって同定することができる。

本発明では、野生型ｍｅｔＫ遺伝子において核酸が変異され、ＭｅｔＫにおいてアミノ酸位置１８５におけるバリンのグルタミン酸へのアミノ酸置換をもたらす。（野生型ＭｅｔＫアミノ酸配列については図８Ａ及び配列番号３０を参照）。加えて、ｍｅｔＫ遺伝子中のシトシン塩基位置１１３２で特定の核酸が欠失されていた（ｃ１１３２ｄｅｌ）。これらの変異ｍｅｔＫ対立遺伝子の一以上を含む大腸菌宿主細胞は、発現された異種タンパク質におけるノルロイシン誤取り込みの防止をもたらすのに十分な程度又は量にメチオニンを生成した。

幾つかの実施態様において、本発明はまた、ｍｅｔＫ対立遺伝子において、アミノ酸置換Ｖ１８５Ｅ又は位置１１３２におけるシトシン塩基の欠失をコードする種々な変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を提供する。このような変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ＭｅｔＫ酵素の部分的な機能喪失をもたらす。変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、対立遺伝子交換法（下記の材料と方法を参照）を用いて様々な大腸菌宿主細胞に導入され（６６Ｈ８；６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）、上記参照）、それぞれ大腸菌宿主細胞株６７Ｃ２（６６Ｈ８ ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ））及び６７Ｃ３（６６Ｈ８ ｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ））を得た。得られた変異大腸菌宿主細胞は、持続的メチオニン供給無しで実行された組換えタンパク質の生成中のノルロイシン誤取り込みについて評価された。（以下の実施例４を参照）。

ＭｅｔＫにおけるアミノ酸位置に対する全ての参照は、配列番号３０及び配列番号３２に対応する図８Ａ及び８Ｂに示す大腸菌のｍｅｔＡ遺伝子によってコードされるＳ−アデノシルメチオニン合成酵素に基づいている。アミノ酸位置への参照は、アミノ酸位置番号１として数える最初のアミノ酸のメチオニンにより行われる。他の生物由来のＳアデノシルメチオニン合成酵素における対応する領域の相対的な位置は、例えば、単純な配列アラインメントによって、当業者によって同定することができる。

ｍｅｔＡ及びｍｅｔＫの核酸分子
一例として、本発明は、野生型ｍｅｔＡ及びｍｅｔＫの核酸配列とは異なるｍｅｔＡ及びｍｅｔＫの核酸配列を含む単離された核酸分子を使用する。本発明によって提供されるｍｅｔＡ及びｍｅｔＫの核酸配列は、野生型ｍｅｔＡによってコードされるもの（システインで置換されたアミノ酸位置２７のアルギニン（Ｒ２７Ｃ）；グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置６４のグルタミン（Ｑ６４Ｅ）；システインで置換されたアミノ酸位置２９４のチロシン（Ｙ２９４Ｃ）；セリンで置換されたアミノ酸位置２９６のイソロイシン（Ｉ２９６Ｓ）；ロイシンで置換されたアミノ酸位置２９８のプロリン（Ｐ２９８Ｌ）；セリンで置換されたアミノ酸位置２９６のイソロイシン（Ｉ２９６Ｓ）；ロイシンで置換されたアミノ酸位置２９８のプロリン（Ｐ２９８Ｌ））；及び野生型ｍｅｔＫによってコードされるもの（グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置１８５のバリン（Ｖ１８５Ｅ）及び位置１１３２でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列（ｃｄｅｌ１１３２ｄｅｌ））への種々のアミノ酸置換をコードする。これらのアミノ酸置換をもたらす、ｍｅｔＡ対立遺伝子又はｍｅｔＫ対立遺伝子をコードする任意の核酸配列の使用が、本発明の方法における使用のために本明細書中で具体的に意図される。

本発明はまた、様々な改変されたＭｅｔＡ酵素をコードする（即ち、様々な変異ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする）単離されたｍｅｔＡ核酸分子を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は単離された核酸分子を提供し、ここで核酸分子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。

本発明はまた、様々な改変されたＭｅｔＫ酵素をコードする（即ち、様々な変異Ｓ−アデノシルメチオニン酵素をコードする）単離されたｍｅｔＫ核酸分子を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は単離された核酸分子を提供し、ここで核酸分子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。

また、本発明は、一例として、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子と、ＭｅｔＡにおいて以下のアミノ酸置換：システインで置換されたアミノ酸位置２７のアルギニン（Ｒ２７Ｃ）；グルタミン酸で置換されたアミノ酸位置６４のグルタミン（Ｑ６４Ｅ）；システインで置換されたアミノ酸位置２９４のチロシン（Ｙ２９４Ｃ）；セリンで置換されたアミノ酸位置２９６のイソロイシン（Ｉ２９６Ｓ）；ロイシンで置換されたアミノ酸位置２９８のプロリン（Ｐ２９８Ｌ）；セリンで置換されたアミノ酸位置２９６のイソロイシン（Ｉ２９６Ｓ）；ロイシンで置換されたアミノ酸位置２９８のプロリン（Ｐ２９８Ｌ）をコードする核酸配列を含む対応する単離された核酸分子との種々の組合せを提供する。幾つかの態様において、本発明によって提供される変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、フィードバック耐性（即ち、フィードバック非感受性）ＭｅｔＡ酵素を生じる。アミノ酸の位置は、図７Ａ及び配列番号２９に示されるように野生型ＭｅｔＡアミノ酸配列を参照する。

また、本発明によって提供されるのは、一例として、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子と、ｍｅｔＫにおいて次のアミノ酸置換：アミノ酸位置１８５のバリンのグルタミン酸による置換（Ｖ１８５Ｅ）をコードする核酸配列を含む対応する単離された核酸分子との様々な組み合わせである。本発明はまた、ｍｅｔＫ対立遺伝子の位置１１３２におけるシトシン塩基の欠失を含む核酸配列（ｃ１１３２ｄｅｌ）を提供する。幾つかの態様において、本発明によって提供される変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ＭｅｔＫ酵素の部分的な機能喪失をもたらす。アミノ酸の位置は、図８Ａ及び配列番号３０に示されるように野生型ＭｅｔＫアミノ酸配列を参照する。

本発明の方法で使用するための微生物
例として本明細書中に記載されるように、大腸菌宿主細胞は、高い宿主細胞密度で行われる組換えタンパク質の生成を含む、組換えタンパク質生成の間に、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する細菌として操作された。従って、本明細書で提供されるいくつかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に（例えば、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に、又は異種タンパク質又は異種ポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量に）メチオニンを生成する、変異微生物菌株（即ち、変異微生物宿主細胞）を提供する。

本明細書で提供される方法における使用に適した開始の大腸菌宿主細胞としては、例えば、（限定されるものではないが）大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌２９４、大腸菌Ｘ１７７６などが含まれる。大腸菌宿主細胞のこれらの例は限定ではなく例示である。大腸菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株である。上述した大腸菌宿主細胞株の何れかの変異大腸菌宿主細胞は、その後、本明細書に記載される変異したｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＫ対立遺伝子を含むように更に改変される出発宿主細胞として用いることができる。

本発明は、種々の変異対立遺伝子、及び組換えタンパク質生成におけるｍｅｔＡ及びｍｅｔＫの変異対立遺伝子の組み合わせを含む大腸菌宿主細胞の使用は、発現された組換えタンパク質へのノルロイシン誤取り込みを防止するのに有効であったことを示している。（以下の実施例４を参照）。

本発明は、微生物を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防ぐ又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。幾つかの態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供する。他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ＭｅｔＡにおけるＲ２７Ｃアミノ酸置換、ＭｅｔＡにおけるＱ６４Ｅアミノ酸置換、ＭｅｔＡにおけるＹ２９４Ｃアミノ酸置換、ＭｅｔＡにおけるＩ２９６Ｓアミノ酸置換、又はＭｅｔＡにおけるＰ２９８Ｌアミノ酸置換をコードする。幾つかの実施態様において、本発明は、例えば、ＭｅｔＡにおけるＩ２９６Ｓアミノ酸置換及びＰ２９８Ｌアミノ酸置換をコードする変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む、上述される一以上のアミノ酸置換をコードする変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供する。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり；他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性（例えば、組換え）ポリペプチド及び異種性（例えば、組換え）タンパク質の生成のための、本明細書に記載の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。

上述したように、本発明は、一以上の変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、ＭｅｔＡにおいてＲ２７Ｃアミノ酸置換をコードする、ＭｅｔＡにおいてＱ６４Ｅアミノ酸置換をコードする、ＭｅｔＡにおいてＹ２９４Ｃアミノ酸置換をコードする、又はＭｅｔＡにおいてＩ２９６Ｓアミノ酸置換及びＰ２９８Ｌアミノ酸置換をコードする変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、それぞれ、配列番号２３（Ｒ２７Ｃ）、配列番号２６（Ｑ６４Ｅ）、配列番号２４（Ｙ２９４Ｃ）、又は配列番号２５（Ｉ２９６Ｓ及びＰ２９８Ｌ）を含む核酸配列によりコードされる。他の実施態様において、本発明により提供される微生物は、配列番号２３（Ｒ２７Ｃ）、配列番号２６（Ｑ６４Ｅ）、配列番号２４（Ｙ２９４Ｃ）、又は配列番号２５（Ｉ２９６Ｓ及びＰ２９８Ｌ）を含む核酸配列によりコードされる。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり；他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性（例えば、組換え）ポリペプチド及び異種性（例えば、組換え）タンパク質の生成のための、本明細書に記載の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。

上記のように、本発明は、微生物により発現される、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する微生物である。幾つかの態様において、本発明は、微生物を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された微生物である。幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供する。他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子が、ＭｅｔＫにおけるＶ１８５Ｅ酸置換をコードする、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供し、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基１１３２にて核酸シトシンの欠失を含む。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり；他の態様では微生物は大腸菌である。本発明は、異種性（例えば、組換え）ポリペプチド及び異種性（例えば、組換え）タンパク質の生成のための、本明細書に記載の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。

上述したように、本発明は、一以上の変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、ＭｅｔＫにおけるＶ１８５Ｅ酸置換をコードする又はｍｅｔＫ対立遺伝子において核酸残基１１３２にて核酸シトシンの欠失を含む変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７を含む核酸配列（Ｖ１８５Ｅ）又は配列番号２８を含む核酸配列（ｃ１１３２ｄｅｌ）をそれぞれ含む核酸配列によりコードされる。他の実施態様において、本発明により提供される微生物は、配列番号２７（Ｖ１８５Ｅ）又は配列番号２８（ｃ１１３２ｄｅｌ）を含む核酸配列によりコードされる。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり；他の態様では、微生物は大腸菌である。本発明は、異種性（例えば、組換え）ポリペプチド及び異種性（例えば、組換え）タンパク質の生成のための、本明細書に記載の任意の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。

本明細書に記載されるアミノ酸置換をもたらす、ｍｅｔＡ又はｍｅｔＫ対立遺伝子をコードする任意の核酸配列の使用が、本発明の方法における使用のために本明細書中で具体的に意図される。

他の実施態様において、本発明は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物を提供する。幾つかの実施態様において、本発明により提供される微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物であり、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ＭｅｔＡにおけるＹ２９４Ｃアミノ酸置換をコードし、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子はＭｅｔＫにおけるＶ１８５Ｅアミノ酸置換をコードする。幾つかの実施態様において、本発明により提供される微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物であり、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ＭｅｔＡにおけるＹ２９４Ｃアミノ酸置換をコードし、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基１１３２で核酸シトシンの欠失を含む。様々な態様において、本発明によって提供される核酸配列の何れか一以上を含む微生物は細菌であり；他の態様では微生物は大腸菌である。本発明は、異種性（例えば、組換え）ポリペプチド及び異種性（例えば、組換え）タンパク質の生成のための、本明細書に記載の任意の微生物の使用を具体的に提供し、ここで異種性ポリペプチド及び異種性タンパク質へのノルロイシン誤取り込みは減少され又は防止される。

微生物株の生成
本発明は微生物（例えば、微生物宿主細胞）を生成するための方法を提供し、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する。一例として、当技術分野で公知であり、先に説明したような対立遺伝子交換方法を使用して変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び／又は変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が作成された。（Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7; and Bass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61を参照；本明細書の材料及び方法の項を参照．。）本発明は、それによって変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異体ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞が産生される手段に限定されるものではない。変異対立遺伝子を導入するため又は別の方法で変異対立遺伝子を含む微生物株（例えば、細菌、大腸菌）を生成するための様々な方法は当業者に周知である。

ノルロイシン誤取り込みの防止又は低減
本発明の方法及び組成物は、異種又は組換えタンパク質若しくはポリペプチドの生成に適用することができ、大小両方の規模のタンパク質又はポリペプチドの生成に使用することができる。本発明の方法及び組成物は、組換えタンパク質及びポリペプチドの生成のために、微生物、例えば、大腸菌宿主細胞の高密度発酵のために特に有用である。本発明によって提供される方法及び組成物は、組換えタンパク質及びポリペプチドの組換え生成のために、特に、例えば、種々な研究及び治療用途における使用のための組換えタンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みが所望されない、タンパク質及びポリペプチドの組換え生成のために有用である。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物はフィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である。他の実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、メチオニン生成について抑制解除された（de-repressed）微生物である。幾つかの実施態様において、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含む微生物である。幾つかの実施態様において、メチオニン生成について抑制解除された微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物である。他の実施態様において、ノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させることに使用のための微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、ＭｅｔＡをコードする核酸配列を含み、核酸配列はＲ２７Ｃ、Ｑ６４Ｅ、Ｙ２９４Ｃ、Ｉ２９６Ｓ、及びＰ２９８Ｌからなる群から選択されるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする。他の実施態様において、核酸配列は、Ｉ２９６Ｓ及びＰ２９８Ｌの両方からなるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする。アミノ酸の位置は、図７Ａ及び配列番号２９に示されるように野生型ＭｅｔＡアミノ酸配列を参照する。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物においてタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、ＭｅｔＫをコードする核酸配列を含み、核酸配列はＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換Ｖ１８５Ｅをコードする。他の実施態様において、核酸配列は、ＭｅｔＫ対立遺伝子における核酸残基位置１１３２でシトシン塩基の欠失を含む。アミノ酸の位置は、図８Ａ及び配列番号３０に示されるように野生型ＭｅｔＫアミノ酸配列を参照する。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、更に、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は配列番号２４の核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は配列番号２７の核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は配列番号２４の核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は配列番号２８の核酸配列を含む。

幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子はＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換Ｙ２９４Ｃをコードする核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子はＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換Ｖ１８５Ｅをコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドにおけるノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法であって、微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含む方法を提供し、微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子はＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換Ｙ２９４Ｃをコードする核酸配列を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子はｍｅｔＫ対立遺伝子における核酸残基位置１１３２でシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む。アミノ酸の位置は、図７Ａ及び配列番号２９に示されるように野生型ＭｅｔＡアミノ酸配列を参照し、図８Ａ及び配列番号３０に示されるように野生型ＭｅｔＫアミノ酸配列を参照する。

本明細書において提供される微生物によるタンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを減少させる又は防止するための方法の幾つかの態様において、微生物は細菌、特に大腸菌である。他の態様において、タンパク質又はポリペプチドは異種タンパク質若しくは異種ポリペプチド、又は組換えタンパク質若しくは組換えポリペプチドである。例えば、微生物は、微生物に対して異種性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を含むことができ；例えば、微生物は、微生物に対して異種性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸（例えば、組換え発現ベクターの使用による場合の、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）とすることができる）で形質転換される。他の態様において、本方法は、タンパク質又はポリペプチドを発現するために適した条件下で微生物を培養することを更に含む。幾つかの実施態様において、微生物は、培地が低濃度のメチオニンを含有する培地中で増殖される。タンパク質又はポリペプチドは、次いで、回収され、精製することができ；その回収は、例えば、微生物のペリプラズム又は培地からのものであってもよい。幾つかの態様において、培養は、例えば、高細胞密度発酵の条件下での培養など、発酵槽内で行われる。

異種タンパク質又はポリペプチドをコードする異種核酸は、適切なプロモーターの制御下で、微生物中での発現のために複製可能なベクター中へ適切に挿入される。多くのベクターが、この目的のために利用可能であり、適切なベクターの選別は、例えば、ベクターに挿入される核酸の大きさ、又はそのベクターで形質転換される特定の微生物宿主細胞に依存するであろう。適切なベクターは、当業者に周知である。

本発明によって提供される方法及び組成物は、例えば、種々な治療、医療、研究、及び診断用途における使用のための組換えタンパク質及びポリペプチドにおいて、ノルロイシン誤取り込みが所望されない、組換えタンパク質及びポリペプチドの生成のために特に有用である。例えば、本発明の方法及び組成物は、例えば、医療及び薬学的用途のためのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体など、治療用抗体の組換え生成のために適用される。医療及び薬学的用途のためのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の例としては、限定されないが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｄ因子抗体、抗肝細胞増殖因子受容体抗体（例えば、抗ＭＥＴ抗体）等を含む。

本発明の方法及び組成物はまた、抗体断片の生成のために有用である。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。本方法、組成物及び微生物によって提供されるような組換え抗体の生成は、上述される微生物（例えば、細菌宿主細胞、大腸菌）内における、抗体の重鎖ポリペプチドをコードする核酸の発現及び抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸の発現によって行うことができる。幾つかの態様において、抗体重鎖及び抗体軽鎖は、完全長重鎖及び軽鎖抗体ポリペプチドである。他の態様において、抗体重鎖は、抗体Ｆａｂ断片重鎖であり、抗体軽鎖は、抗体Ｆａｂ断片軽鎖である。

本発明の方法及び組成物はまた、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の生成のために有用である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。典型的な多重特異性抗体は、タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得るか、又は２つの異なるタンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製することができる。多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）；国際出願公開番号ＷＯ９３／０８８２９号；Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991）を参照）及び「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。

更に、本発明の方法及び組成物は、治療及び研究用途のための他の生体分子、例えば、ヒト成長ホルモン（ソマトロピン）、インスリン等の生成に有用である。

以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

材料と方法
細菌株、プラスミド及び増殖条件
本明細書に記載される実施例において使用される細菌株は、大腸菌株Ｗ３１１０の誘導体である。（Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557を参照）。抗生物質の選択は、以下の濃度：カルベニシリン（プラスミド又は染色体）、５０μｇ／ｍｌ；カナマイシン（染色体）、３０μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン（プラスミド又は染色体）、１０μｇ／ｍｌで全てのマーカーにおいて維持された。

菌株及びプラスミドの構築
プラスミド及び細菌株（即ち、大腸菌）の構築に用いたオリゴヌクレオチドは以下の表１に記載される。標準的な技術が、クローニング、ＤＮＡ分析、ＰＣＲ増幅、形質転換、電気穿孔、及びＰ１形質導入のために使用された。染色体対立遺伝子は、Ｐ１形質導入によって移動された。ｍｅｔＪ：：Ｋａｎ^Ｒ対立遺伝子は、大腸菌遺伝子ストックセンター（ＣＧＳＣ、エール大学）から入手した細菌株ＪＷ３９０９−１から由来した。全ての対立遺伝子の置換は、ＰＣＲ分析によって確認した。

ｍｅｔＡ遺伝子は、プライマーのＳａｃＩ−ｍｅｔＡｆｌａｎｋ−Ｆ及びＳａｌＩ−ｍｅｔＡｆｌａｎｋ−Ｒを用いて細菌株Ｗ３１１０（Bachmann (1972) Bacteriol Rev 36:525-557）からＰＣＲ増幅され、ＳａｃＩ及びＳａｌＩにより消化され、ＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化されたプラスミドｐＳ１０８０に連結され、プラスミドｐＳ１０８０−ｍｅｔＡｆｌａｎｋを得た。プラスミドｐＳ１０８０−ｍｅｔＡｆｌａｎｋ（Ｒ２７Ｃ）、ｐＳ１０８０−ｍｅｔＡｆｌａｎｋ（Ｑ６４Ｅ）、ｐＳ１０８０−ｍｅｔＡｆｌａｎｋ（Ｙ２９４Ｃ）、及びｐＳ１０８０−ｍｅｔＡｆｌａｎｋ（Ｉ２９６ＳＰ２９８Ｌ）は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Stratagene）及び以下のプライマーの組：（ＱＣ−ｍｅｔＡＲ２７Ｃ−Ｆ；ＱＣ−ｍｅｔＡＲ２７Ｃ−Ｒ）、（ＱＣ−ｍｅｔＡＱ６４Ｅ−Ｆ；ＱＣ−ｍｅｔＡＱ６４Ｅ−Ｒ）、（ＱＣ−ｍｅｔＡＹ２９４Ｃ−Ｆ；ＱＣ−ｍｅｔＡＹ２９４Ｃ−Ｒ）及び（ＱＣ−ｍｅｔＡＩ２９６ＳＰ２９８Ｌ−Ｆ；ＱＣ−ｍｅｔＡＩ２９６ＳＰ２９８Ｌ−Ｒ）をそれぞれ使用してｐＳ１０８０−ｍｅｔＡｆｌａｎｋを変異誘発することによって構築された。

ｍｅｔＫ遺伝子は、プライマーのＳａｃＩ−ｍｅｔＫｆｌａｎｋ−Ｆ及びＳａｌＩ−ｍｅｔＫｆｌａｎｋ−Ｒを用いて細菌株Ｗ３１１０からＰＣＲ増幅され、ＳａｃＩ及びＳａｌＩにより消化され、そしてＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化されたプラスミドｐＳ１０８０に連結され、プラスミドｐＳ１０８０−ｍｅｔＫｆｌａｎｋを得た。プラスミドｐＳ１０８０−ｍｅｔＫｆｌａｎｋ（Ｖ１８５Ｅ）及びｐＳ１０８０−ｍｅｔＫｆｌａｎｋ（ｃ１１３２ｄｅｌ）はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Stratagene）及び以下のプライマーの組：（ＱＣ−ｍｅｔＫＶ１８５Ｅ−Ｆ；ＱＣ−ｍｅｔＫＶ１８５Ｅ−Ｒ）、及び（ＱＣ−ｍｅｔＫｃ１１３２ｄｅｌ−Ｆ；ＱＣ−ｍｅｔＫｃ１１３２ｄｅｌ−Ｒ）をそれぞれ使用して、プラスミドｐＳ１０８０−ｍｅｔＫｆｌａｎｋを変異誘発することによって構築された。

対立遺伝子交換は、前述の方法を用いて行われた。（Metcalf et al., (1994) Gene 138:1-7；及びBass et al., (1996) J Bacteriol 178: 1154-61を参照）。

上述したように、Ｍｅｔｃａｌｆら（上掲）により記載され、Ｂａｓｓら（上掲）により改変されたプロトコールを使用して行われた。共組換え体は、６０Ｅ４宿主細胞バックグラウンド又は６６Ｈ８宿主細胞バックグラウンドへ移された。スクロース対抗選択に続いて、スクロース耐性コロニーは、ＬＢ寒天プレート及びカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上において複製画線することによりカルベニシリン感受性についてスクリーニングされた。続いて、カルベニシリン感受性のコロニーを単離し、対立遺伝子交換は、ｍｅｔＡ又はｍｅｔＫリーディングフレーム全体のＰＣＲ増幅と続くＤＮＡ配列決定により確認された。自滅プラスミドベクターｐＳ１０８０は、コンディショナルＲ６Ｋγ起点及びカルベニシリン耐性選択可能マーカー、並びにスクロース感受性を付与する対抗選択可能ｓａｃＢ遺伝子を含む。

本明細書に記載の実験で使用される細菌株及びプラスミドは以下の表２に記載される。

発酵
大腸菌宿主株６０Ｅ４は、抗ＶＥＧＦ抗体抗原結合（Ｆａｂ）断片の軽鎖及び重鎖（それぞれ配列番号３３及び配列番号３４）をコードするポリ核酸を含むｐＢＲ３２２に基づく発現プラスミドで形質転換した。（国際出願公開番号ＷＯ１９９８／４５３３１；国際出願公開番号ＷＯ２００２／４０６９７（抗ＶＥＧＦ抗体Ｙ０３１７の発酵を記述する実施例２）；及びChen et al., (1999) J Mol Biol 293:865-881、抗ＶＥＧＦ抗体Ｙ０３１７を参照。これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される）。

大腸菌宿主株６０Ｅ４は、抗Ｄ因子抗体抗原結合（Ｆａｂ）断片の軽鎖及び重鎖（それぞれ配列番号４８及び配列番号４９に対応する）をコードするポリ核酸を含む発現プラスミドで形質転換した。（国際出願公開番号ＷＯ２００９／１３４７１１の抗Ｄ因子抗体番号２３８−１及び国際出願公開番号ＷＯ２００８／０５５２０６の抗Ｄ因子抗体番号１１１を参照、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される）。

大腸菌宿主株６４Ｂ４は、抗ＭＥＴ抗体の軽鎖、重鎖及び重鎖断片（それぞれ配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２に対応する）をコードするポリ核酸を含む発現プラスミドで形質転換した。

組換え重鎖及び軽鎖Ｆａｂ断片ポリペプチドの発現は、培地中の無機リン酸の枯渇時に生じる誘導によるｐｈｏＡプロモーターにより制御された。（Laird et al., (2005) Protein Expr Purif 39:237-246を参照）。重鎖及び軽鎖Ｆａｂ断片ポリペプチドは、ＳＴＩＩシグナル配列による、生成物が構築される大腸菌ペリプラズムへの移出に対して向けられた。前述のように、１０Ｌの作業容量（ＷＶ）で高細胞密度発酵が実施された。（Simmons et al., (2002) J Immunol Methods 263:133-147を参照）。約２００ＯＤ_５５０の細胞密度で、持続的な３％メチオニン又は水の供給が開始され、発酵プロセスの残りの部分にわたり供給された。

三つの異なる発酵プロセスは、宿主細胞６０Ｅ４（発酵プロセスのＡＦ１）、宿主細胞６６Ｆ８（発酵プロセスのＡＦ２）、及び宿主細胞６４Ｂ４（発酵プロセスＡＦ３）を用いて検討された。（実施例５及び下記の表４を参照）

精製
発酵が完了した後、全細胞ブロスを発酵槽中で＜１５℃に冷却し、冷却されたブロスはタンパク質精製用に処理された。冷却ブロスの１容量を硫酸マグネシウムの０．０６容量と混合し（６０ｍＭの最終濃度）、クエン酸（１Ｍ）でｐＨ３．８に滴定した。次いで、細胞を約１２，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを用いて破壊し（Microfluidics, Redwood Shores, CA）、破壊された細胞は、連続的に振盪しながら３時間３５℃でインキュベートした。ホモジネートを冷精製水で３倍に希釈し、希釈したホモジネートを２０分間４℃で固定角ローターを用いて６，０００×ｇで遠心分離した。上清を０．２２μｍのフィルターを用いて濾過し、１．５Ｍトリス塩基によりｐＨ７．５に滴定した。

組換えＦａｂタンパク質は、以下のように、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ポリプレップクロマトグラフィーカラム（Bio Rad）を、プロテインＧセファロース４ファストフロー樹脂（GE Healthcare）で充填し、ＰＢＳの少なくとも５カラム体積、ｐＨ７．２で平衡化した。濾過した上清は、プロテインＧを充填したカラムにロードし、ＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭのクエン酸で溶出した。最終のＦａｂタンパク質プールは１．５Ｍトリス塩基でｐＨ７に滴定され、下記のようにノルロイシン含有量について分析された。これは、発酵プロセスのＡＦ１のための精製に対応する。

発酵プロセスＡＦ１（宿主細胞６０Ｅ４用）、ＡＦ２（宿主細胞６６Ｆ８用）、又はＡＦ３（宿主細胞６４Ｂ４用）に各々特異的である、三つの異なる組換えタンパク質生成物の精製プロセスが使用された。（実施例７及び下記の表６を参照）。

アミノ酸分析
細胞内のメチオニンレベルを決定するために、８７．６×１０^９細胞を含む全細胞ブロスサンプルを、４℃で５分間、１７０００×ｇでペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、その後、抽出緩衝液（１０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ６．８）に再懸濁した。次いで、細胞は２サイクルの超音波処理によって溶解され、次いで、細胞破片を除去するために、１３，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を０．２μｍマイクロ遠心チューブフィルター（Bio Rad）に移し、４℃で５分間、１７０００×ｇで遠心分離した。濾液を希釈し、アミノ酸は前述のように分析した（Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097）。細胞外のメチオニンレベルを決定するために、１４，０００×ｒｐｍで３分間遠心分離後に、発酵中に収集された全細胞ブロスから調製された上清サンプルは、希釈され、下記のようにアミノ酸分析された。（Feeney et al., (2013) Biotechnology and Bioengineering, 110:1087-1097を参照）。

アミノ酸濃度は、逆相ＨＰＬＣ法を用いて分析された。アミノ酸を含有するサンプルは、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートで処理し、非常に蛍光性の誘導体を生成した。（Cohen and Michaud (1993) Anal Biochem 211:279-287を参照。）使用したＨＰＬＣアッセイは０．０１ｍＭの検出限界で以下のアミノ酸を検出した：ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、オルニチン、システイン、リジン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファン。

リン酸レベル
リン酸レベルは、以前に公開された方法に従ってＣＯＢＡＳインテグラ４００（Roche Diagnostics）を用いて測定した。（Taussky and Shorr (1953) J Biol Chem 202:675-685を参照）。

力価測定
全細胞ブロスサンプルは、抽出緩衝液（１０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＩＡＭ、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ６．８）で６倍に希釈し、氷上で１０分間インキュベートした。２ラウンドの超音波処理の後、サンプルは４℃で２０分間１７０００×ｇで遠心分離した。生成物の力価はＨＰＬＣを使用して上清から決定した。

積分されたＯＤ_５５０の測定
積分されたＯＤ_５５０は、以下の式を用いた台形積分を使用して決定された：

ここで
ｊ＝培養時間の２４時間の時点又はその後に行われた最初の測定のインデックス；行われたＯＤ_５５０測定の総数；ｔ_ｉ＝測定ｉにおける経過培養時間；ＯＤ_５５０ｉ＝測定ｉにおけるＯＤ_５５０。

ノルロイシン分析
ノルロイシン含有量の分析のために、精製された組換えタンパク質サンプルは、以前に記載された方法に基づいて、トリプシン消化に供された。（Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290を参照）。ペプチドマップの分析は、前述のように、逆相ＨＰＬＣ及びオンライン液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて行った。（Yu et al., (2009) Anal Chem 81:9282-9290；及びYu et al., (2011) Anal Chem 83:5912-5919を参照。）高分解能質量決定は、ｍ／ｚ ４００で６００００に設定された分解能を持つ完全ＭＳサーベイスキャン、続いて目的のイオンのイオントラップＭＳ２スキャンを用いてＬＴＱ−オービトラップＸＬ機器（Thermo Scientific, San Jose, US）により行った。ポリペプチド内のノルロイシンの相対レベルを決定するために、抽出されたイオンクロマトグラムは、モノアイソトピックｍ／ｚが±１０ｐｐｍの抽出ウインドウによる最も豊富な荷電状態を使用してメチオニン含有ペプチド及びノルロイシン含有ペプチドの双方に対して生成された。メチオニン含有種に対するノルロイシン含有種の相対量は、それぞれ積分されたピーク面積を用いて計算した。

ウェスタンブロット
発酵中に得られた全細胞ブロスサンプルは、抽出緩衝液（１０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＩＡＭ、０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、ｐＨ６．８）で６倍に希釈し、氷上で１０分間インキュベートした。２ラウンドの超音波処理の後、サンプルは４℃で２５分間１７０００×ｇで遠心分離した。サンプルは、非還元条件下で４〜１２％のトリス−グリシンゲル上にロードした。タンパク質はｉＢｌｏｔブロッティングシステム（Invitrogen）を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をＮＥＴ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス、０．０５％トリトンＸ−１００）中の０．５％ゼラチンで３０分間ブロックし、ブロッキング緩衝液中のヒトＩｇＧのＦａｂ（MP Biomedical）に対して１：３００，０００希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギＩｇＧ画分中でインキュベートした。ＮＥＴ緩衝液で３回洗浄した後、ブロットを、５秒の曝露後にウェスタンライトニングＥＣＬ基質（PerkinElmer）を用いてＸ線フィルム上で可視化した。

実施例１．大腸菌発酵中のノルロイシン誤取り込み
上述したように、ノルロイシン誤取り込みは、多くの場合、大腸菌における組換えタンパク質生成の間に生じる。組換えタンパク質生成中のノルロイシン誤取り込みの程度は、例えば、組換えタンパク質の性質、使用した発酵プロセス、及び発酵培地の内容物など幾つかの要因に依存する。（例えば、Bogosian et al., (1989) Biol Chem 264:531-539を参照）。

組換えタンパク質発現の発酵プロセスにおけるノルロイシン誤取り込みを調べるために、以下の研究を実施した。大腸菌宿主株６０Ｅ４は、Ｆａｂ抗体断片の軽鎖及び重鎖をコードする核酸配列（それぞれ配列番号３１及び配列番号３２）を含むプラスミドで形質転換し、上記の方法に従って、水供給又はメチオニン供給を用いた以下の発酵研究に使用した。次いで、発現された組換えタンパク質を、上記の方法を用いて、ノルロイシン含量について分析した。

以下の表３に示されるように、連続的メチオニン供給が無い場合（即ち、水供給）、大腸菌宿主細胞６０Ｅ４で発現された組換えポリペプチドのそれぞれで、約５〜１０％のノルロイシン誤取り込みが観察された。予想されるように、連続的なメチオニン供給のもとで、ノルロイシンは、発現された組換えポリペプチドの何れにおいても検出されなかった（ＮＤ）。

これらの結果は、ノルロイシン誤取り込みが、メチオニン供給の非存在下で細菌において組換えタンパク質生成で発生したことを確認した。

実施例２．メチオニン生合成経路の変異大腸菌宿主細胞の構築
上述のように、組換えタンパク質発酵の最中のメチオニンの連続的供給は、多くの場合、ノルロイシン誤取り込みを防止するために使用される。上記実施例１に示されるように、連続的なメチオニンの供給は、十分なメチオニンが宿主細胞のために利用可能であり、従って組換えタンパク質生成の間のノルロイシンの誤取り込みを防止することができることを確実にした。連続的メチオニン供給を用いる代わりに、変異ｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＫ対立遺伝子を含む大腸菌宿主細胞を使用することの、ノルロイシン誤取り込みに与える影響を調べるために、以下の研究を行った。

本研究では、フィードバック耐性ｍｅｔＡをもたらす変異Ｒ２７Ｃ、Ｑ６４Ｅ、Ｙ２９４Ｃ、Ｉ２９６Ｓ、及びＰ２９８Ｌを含むｍｅｔＡ対立遺伝子が対立遺伝子交換法を用いて６０Ｅ４宿主細胞に導入され（上記の材料および方法を参照）、それぞれ、細菌宿主細胞株６６Ｈ６（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｒ２７Ｃ））、６６Ｈ８（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ））、６７Ｂ８（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ））及び６７Ｂ９（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｉ２９６Ｓ Ｐ２９８Ｌ））を得た（上記の表２及び３を参照）。

ＭｅｔＫ酵素の部分的機能喪失をもたらす、変異Ｖ１８５Ｅ及びｃ１１３２ｄｅｌ（ｍｅｔＫ遺伝子内の位置１１３２におけるシトシン塩基の欠失）を含むｍｅｔＫ対立遺伝子が、対立遺伝子交換法を用いて、６６Ｈ８（６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ））宿主細胞へ導入され（上記の材料及び方法を参照）、それぞれ細菌宿主細胞株６７Ｃ２（６６Ｈ８ ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ））及び６７Ｃ３（６６Ｈ８ ｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ））を得た。（上記の表２及び表３を参照）。

これらの大腸菌宿主細胞は、持続的メチオニン供給無しで実行された培養プロセスにおける組換えタンパク質の生成中のノルロイシン誤取り込みについて評価された。（以下の実施例３を参照）。

実施例３．発酵の結果
連続的メチオニン供給の無い小規模な発酵（１０Ｌ）が、本研究で構築したメチオニン生合成経路の変異細菌株を利用して実行された。（表１を参照）。水の供給又は全く供給無しのどちらかと置き換えられたメチオニンの供給が、これらの実験において、発酵プロセスの間に使用された。対照宿主細胞株６０Ｅ４を使用して、３つの１０Ｌ発酵が以下のように実施された：１）連続的メチオニン供給、２）連続的水供給及び３）全く供給無し。

ＯＤ_５５０でモニターされる細胞増殖の発酵傾向が図１２Ａに示される。供給物の性質（メチオニン、水、又は全く供給無し）に関わらず、メチオニン生合成経路変異細菌宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｒ２７Ｃ）、６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）、６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ）、及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ）の増殖は、発酵増殖期の間（５〜２８時間）に対照宿主細胞で観察されたものと同等であった。しかし、二重変異宿主細胞の６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ）、及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ）は、対照宿主細胞発酵で観察されるものと比較してより低いｉＯＤ_５５０（２４時間から発酵の終了時までの増殖曲線下の面積）を有していた。（図１２Ｂを参照）。宿主細胞６０Ｅ４及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）を使用して水の供給と共に実行された発酵は、メチオニン供給と共に実行された対照宿主細胞発酵及び全く供給無しで実行された６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）宿主細胞において観察されたものと比較して若干高いｉＯＤ_５５０を有していた。変異細胞６０Ｅ４ ΔｍｅｔＪ：：ｋａｎ^Ｒ及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｉ２９６Ｓ Ｐ２９８Ｌ）は長い適応期を持っており、その結果、対照宿主細胞発酵で観察されたものに比べて低いｉＯＤ５５０を有していた。（図１２Ａ及び１２Ｂを参照）。変異体宿主細胞の６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ）は、発酵槽では増殖は不十分であり、最大ＯＤ_５５０は１５０に達し、それは他の変異宿主細胞を用いた発酵において観測された最大ＯＤ_５５０と比較して約３０−４０％低い。（図１２Ａを参照）。２０時間後、変異宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ）の増殖はが飽和状態に達し、その結果、この変異宿主細胞を用いた発酵は、最低のｉＯＤ_５５０を有していた。（図１２Ａ及び１２Ｂを参照）。

発酵中のメチオニンの供給の有無は、６０Ｅ４宿主細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。（図１２Ｃを参照）。

メチオニン生合成経路の変異体を用いた発酵は、対照宿主細胞発酵で観察されるものと比較して、インビボ（即ち、細胞内）及び細胞外培地の両方で、より高いレベルのメチオニンを蓄積した。（図１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、及び１４Ｂを参照）。発酵プロセスの開始時には、発酵培地中に過剰のメチオニン（＞３ｍＭ）がある。細胞が成長し始めると、それらは、タンパク質合成、メチル供与体の役割とその他の機能のためにメチオニンを取り込む。結果として、細胞が成長し続けるにつれて細胞外のメチオニン濃度が徐々に低下し、そして細胞外メチオニンレベルは約１６時間で検出可能なレベル未満（＜１０μＭ）に達する。（図１３Ａ及び１４Ａを参照）。

１６時間で、異なる宿主間で細胞内のメチオニン濃度は０．５−２．５ｍＭ（濃度は、細胞の容量に基づく）で変化する。（図１３Ｂ及び１４Ｂを参照）。このような高い細胞内メチオニン濃度では、野生型ＭｅｔＡは強く抑制されることになるが；しかし、フィードバック耐性ＭｅｔＡ変異体は弱く阻害されるだけであり、従って、変異宿主細胞が生合成経路を介してメチオニンを生成することを可能とする。（Usuda and Kurahashi (2005) Appl Environ Microbiol 71:3228-3234を参照）。しかし、細胞内のメチオニンレベルは、約２８時間まで減少し続け、その時点では、細胞の増殖はかなり速度を落としていた。発酵の細菌の増殖期（５−２８時間）の間に、メチオニンがタンパク質合成及び他の細胞機能のために利用される割合は、メチオニンが生体内で合成される割合を超え得ることが可能である。このことは、増殖期の終了までの細胞内のメチオニンレベルの緩やかな減少を説明することができる。

発酵の組換えタンパク質の生成期の間（発酵の終了時までの２８時間）メチオニン過剰産生宿主細胞は、インビボでメチオニンを合成し続け、細胞内のメチオニンレベルは、発酵プロセスのこの段階の間に増加し続けた。（図１３Ｂ及び１４Ｂを参照）。これらの結果は、発酵の組換えタンパク質生成期の間に、メチオニン生合成の割合は、メチオニンが種々の細胞内機能のために利用される割合を超えたことを示唆している。

連続的な水の供給と共に行われた宿主細胞の発酵の間に、細胞外及び細胞内のメチオニンレベルは減少し続け、細胞外メチオニンについては約１６時間で、細胞内のメチオニンについては約２４時間でアッセイの検出限界未満のレベル（１０μＭ）に到達した。連続的メチオニン供給と共に行われる対照宿主発酵の場合、その供給は、供給が開始される時点で、約２６時間後に細胞中に過剰のメチオニンが存在することを保証している。発酵の生成期の間に、二重変異宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ）は、連続的メチオニン供給と共に行われる宿主細胞発酵で観察されるものと比較して、より多くの細胞内メチオニンを蓄積した。

対照宿主細胞内で観察されたものと比較して、宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｉ２９６Ｓ Ｐ２９８Ｌ）及び６０Ｅ４ ΔｍｅｔＪ：：ｋａｎ^Ｒの長い適応期並びに宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ）の成長不良は、潜在的にはホメチオニン生合成経路における毒性中間体である、高レベルのホモシステインに起因する可能性がある。（Roe et al., (2002) Microbiology 148:2215-2222を参照；図１２Ａを参照）。ホモシステインは、イソロイシン生合成経路の最初のステップに関与する酵素である、スレオニンデアミナーゼを阻害し、成長阻害を引き起こすことが以前に実証されている。（Tuite et al., (2005) J Bacteriol 187:4362-4371を参照）。これは、変異宿主細胞において細胞内イソロイシンレベルを測定することにより調べられた。分析は、細胞内のイソロイシンのレベルは、発酵中に対照宿主細胞において観察されたものとは同等であることを示した（データ非表示）。細胞増殖に対する他の毒性作用を有するホモシステインの可能性を完全に除外することはできない。この時、しかし、変異体間の増殖におけるこれらの違いは、完全には理解されていない。

タンパク質生成物の力価の時間経過及びウェスタンブロットデータは、図１６Ａ、図１６Ｂ、及び図１７に示される。宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ）から植菌された発酵は、他の宿主細胞において観察されるものより少ない生成物を生成した。４５〜５０時間の間の短時間を除いて、リン酸レベルは、６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｑ６４Ｅ）宿主の発酵の間に枯渇することは無く（図１５）；従って、組換えタンパク質の合成は少なかった。変異宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｉ２９６Ｓ Ｐ２９８Ｌ）及び６０Ｅ４ ΔｍｅｔＪ：：ｋａｎ^Ｒの拡張した適応期は、通常観察されるよりも約１２時間遅い４０時間後にリン酸の欠乏をもたらし；従って、これらの宿主細胞を用いた発酵は、以前のリン酸を枯渇した他の変異宿主細胞において観察されたものと比較してより低いタンパク質生成物の力価を有していた。（図１２Ａ、図１５及び図１６Ａを参照）。宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｒ２７Ｃ）及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）を用いた発酵は、試験した全ての変異宿主細胞の中で最も高いタンパク質生成物の力価を生じた。

ｍｅｔＡ ｍｅｔＫ二重変異宿主細胞の６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ）及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ）を用いた発酵は、対照宿主細胞に対して同等の増殖を有するにもかかわらず、やや低いタンパク質生成物の力価を生じた。これらの二重変異宿主細胞は、ＭｅｔＫの部分的機能喪失をもたらすｍｅｔＫ遺伝子に変異を有している。ｍｅｔＫの生成物は、細菌細胞中で多くの反応についてメチル供与体である、ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）である。しかしながら、なぜはＳＡＭのレベルの減少がタンパク質生成物の力価に影響を与えるのか知られていない。発酵プロセスの最中の連続的供給は、恐らくより低い細胞密度及び恐らくより低い生成物力価をもたらし得る培地の希釈をもたらし得るであろう。いかなる供給も無い宿主細胞６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）の発酵の増殖及び力価は、同じ宿主細胞を使用して連続的な水の供給と共に行われる発酵において観察されたものに匹敵した。

実施例４．ノルロイシン誤取り込み
上述したように、細胞内のメチオニンのレベルに起因するタンパク質中のノルロイシン誤取り込みは十分低いので、タンパク質合成中のメチオニルｔＲＮＡの荷電において、ノルロイシンはメチオニン残基を競合することができる。実施例１に示すように、メチオニン供給無しで実行された対照宿主細胞の発酵は、組換えタンパク質において高レベルのノルロイシン誤取り込みをもたらした。メチオニン供給無しで実行された対照宿主細胞の発酵の生成期の間の低い細胞内メチオニンのレベルは、ノルロイシン残基は、組換えタンパク質中のメチオニン残基を競合することができることを示していた。しかしながら、細胞外及び細胞内の高レベルのメチオニンが、変異宿主細胞の発酵の生成期の間に観察された。（図１３Ｂ及び１４Ｂを参照）。細胞内のメチオニンレベルの上昇の結果として、ノルロイシン誤取り込みは、そのような宿主細胞の発酵を使用して最小限になるか又は排除することが期待される。

組換えタンパク質のトリプシン消化は２つのメチオニン含有ペプチド：ペプチド１：ＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭ^３４ＮＷＶＲ（配列番号３５）；及びペプチド２：ＳＴＡＹＬＱＭ^８３ＮＳＬＲ（配列番号３６）を得た。ペプチドマップの分析では、変異宿主細胞の発酵から精製された組換えタンパク質のプールは、検出可能なレベル未満のノルロイシン誤取り込みを含んでいたが、一方、メチオニン供給無しで実行された宿主細胞発酵は、メチオニンを含む両方のペプチドにおいて、高レベルのノルロイシンを蓄積することを示していた。（表３を参照）。これらの結果は、本発明の大腸菌宿主細胞株の使用は、異種（例えば、組換え）ポリペプチドへのノルロイシンの取り込みの低減又は防止をもたらすことを示した。

実施例５．更なる細菌宿主細胞
宿主細胞６０Ｅ４又は宿主細胞６０Ｅ４に由来する宿主細胞を用いて行われた実験に加えて、二つの他の細菌宿主細胞が開発され、以下のように、増殖、ノルロイシン誤取り込み、及び組換えタンパク質の生成について調べられた。

細菌宿主細胞６６Ｆ８及び６４Ｂ４（並びに細菌宿主細胞６０Ｅ４）が表２に説明される。表２に示すように、宿主細胞６６Ｆ８及び６４Ｂ４（類似の遺伝子型を共有する）と比較して、宿主細胞６０Ｅ４の遺伝子型にはいくつかの違いがある。

三つの異なる発酵プロセスは、宿主細胞６０Ｅ４（発酵プロセスのＡＦ１）、宿主細胞６６Ｆ８（発酵プロセスのＡＦ２）、及び宿主細胞６４Ｂ４（発酵プロセスＡＦ３）を用いて検討された。以下の表４は、検討された発酵プロセス（ＡＦ１、ＡＦ２、およびＡＦ３）の各々の種々の発酵パラメーター（ｐＨ、攪拌、培養時間、及び供給開始時間）の違いを示す。

ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）対立遺伝子は、宿主細胞６０Ｅ４について実施例１で上述したような方法を使用して宿主細胞６６Ｆ８及び６４Ｂ４に導入された。発酵プロセスＡＦ２及びＡＦ３をそれぞれ用いて、６６Ｆ８ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）及び６４Ｂ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）を用いて行った発酵は、それらの親宿主細胞で観察されたものに匹敵する、宿主細胞の増殖を示した。（図１９Ａ及び１９Ｂ；及び以下の表５を参照）

実施例６．大腸菌宿主細胞の増殖速度及び組換えタンパク質生成物の収率の比較
増殖速度及び組換えタンパク質生成物の収率は、発酵プロセスＡＦ１、ＡＦ２、ＡＦ３をそれぞれ用いて、大腸菌宿主株６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）、６６Ｆ８ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）及び６４Ｂ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）の各々で調べられた。各発酵プロセスについて上記表４に概説される発酵プロセスの改変を用いて、６０Ｅ４株の宿主細胞について実施例３に上述したように、１０Ｌの発酵が行われた。

６０Ｅ４株の様々な宿主細胞について観察された増殖速度と組換えタンパク質生成物の収率は、上記実施例３に詳細に説明される。

図２０Ａ、２０Ｂ、及び２０Ｃに示されるように、宿主株６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）、６６Ｆ８ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）及び６４Ｂ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）を用いて得られた組換えタンパク質生成物の収率は、宿主株６０Ｅ４、６６Ｆ８及び６４Ｂ４を用いて観察されたものに匹敵した。（以下の表５も参照）。メチオニン供給の有無は、６０Ｅ４宿主細胞発酵から得られた組換えタンパク質の収率に影響を与えなかった。

実施例７．ノルロイシン誤取り込みの比較
発酵プロセスＡＦ１（宿主細胞６０Ｅ４用）、ＡＦ２（宿主細胞６６Ｆ８用）、及びＡＦ３（宿主細胞６４Ｂ４用）に各々特異的である、三つの異なる組換えタンパク質生成物の精製プロセスが使用された。下の表６は、調べられた発酵プロセス（即ち、ＡＦ１は、ＡＦ２及びＡＦ３）の各々において使用された種々の精製プロセスの違いを示す。

ノルロイシンの定量化は、上述のように組換えタンパク質生成物の各々のトリプシンペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を用いて行われた。

６０Ｅ４宿主によって生成された組換えタンパク質のトリプシン消化は、２つのメチオニン含有ペプチドを生じた（表７）。６６Ｆ８宿主によって生成された組換えタンパク質のトリプシン消化は、３つのメチオニン含有ペプチドを生じた（表８）。６４Ｂ４宿主によって生成された組換えタンパク質のトリプシン消化は、６つのメチオニン含有ペプチドを生じた（表９）。

６０Ｅ４宿主を使用して、メチオニン供給無しで行われたＡＦ１発酵プロセスから精製された組換えタンパク質は、タンパク質中の２つのメチオニン残基で５．１％及び１０％ノルロイシンを蓄積した（表７）。宿主６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）（表７）、６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｒ２７Ｃ）、６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（Ｖ１８５Ｅ）、及び６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）ｍｅｔＫ（ｃ１１３２ｄｅｌ）を用いて、メチオニン供給無しで行われたＡＦ１発酵から精製された組換えタンパク質においてノルロイシンは検出されなかった（データ非表示）。

６０Ｅ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）宿主の発酵は、発酵培地中にノルロイシンを添加した場合には（０．１５ｍＭの最終濃度）、組換えタンパク質中でノルロイシンは観察されず、本発明の細菌宿主細胞は、組換えタンパク質の合成中にノルロイシン誤取り込みを防止するために細胞内に十分なメチオニンを作ることを示している。

約２．７％、０．７％、及び１％のノルロイシン誤取り込みが、６６Ｆ８宿主を使用して、メチオニン供給無しで行われたＡＦ２発酵プロセスを用いて生成された組換えタンパク質から得られた３つのメチオニン含有トリプシンペプチドで観察された。（表８を参照）。同様に、６４Ｂ４宿主を使用してｍｅｔ供給無しで行われたＡＦ３プロセスを用いて生成された組換えタンパク質から得られた６つのメチオニン含有トリプシンペプチドにおいて、約１．３％、１．３％、２．４％、２．２％、１．５％、及び１．３％のノルロイシン誤取り込みが存在した。（表９を参照）。しかし、６６Ｆ８ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）宿主及び６４Ｂ４ ｍｅｔＡ（Ｙ２９４Ｃ）宿主をそれぞれ使用した、ＡＦ２及びＡＦ３発酵プロセスから精製された組換えタンパク質ではノルロイシンは検出されなかった。（上記の表８及び表９を参照）。

トリプシンペプチドマップの分析では、変異宿主細胞の発酵から精製された組換えタンパク質のプールは、検出可能なレベル未満のノルロイシン誤取り込みを含んでいたが、一方、メチオニン供給無しで実行された宿主細胞発酵は、メチオニン含有ペプチドにおいて、高レベルのノルロイシンを蓄積することを示していた。これらの結果は、本発明の大腸菌宿主細胞株の使用は、異種（例えば、組換え）ポリペプチドへのノルロイシンの取り込みの低減又は防止をもたらすことを示した。

前述の発明は、理解を明確にする目的のために、例示と実施例によりある程度詳細に記載してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が援用される。

Claims (36)

1. タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるための方法であって、該方法は微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることを含み、微生物は、タンパク質又はポリペプチドへのノルロイシン誤取り込みを防止する又は減少させるのに十分な程度又は量にメチオニンを生成する変異微生物である、方法。
2. 微生物は、細菌である、請求項１に記載の方法。
3. 微生物は、大腸菌である、請求項１に記載の方法。
4. 微生物は、フィードバック耐性又はフィードバック非感受性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの微生物である、請求項１に記載の方法。
5. 微生物は、メチオニン生成について抑制解除される、請求項１に記載の方法。
6. 微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
7. 微生物中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることは、培地に外因的に添加されたメチオニンの非存在下で又はメチオニン供給無しで行われる、請求項１に記載の方法。
8. 変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含む微生物。
9. 微生物は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２７でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置６４でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、アミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換、及びアミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含む、請求項８に記載の微生物。
10. 微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項９に記載の微生物。
11. 変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、アミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換を含むＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列、又はｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基位置１１３２でのシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む、請求項８に記載の微生物。
12. 微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１１に記載の微生物。
13. 微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、アミノ酸位置２７でのアルギニンのシステインへの置換、アミノ酸位置６４でのグルタミンのグルタミン酸への置換、アミノ酸位置２９４でのチロシンのシステインへの置換、アミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換、アミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換、及びアミノ酸位置２９６でのイソロイシンのセリンへの置換及びアミノ酸位置２９８でのプロリンのロイシンへの置換からなる群から選択されるＭｅｔＡにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列を含み、更に、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、アミノ酸位置１８５でのバリンのグルタミン酸への置換を含むＭｅｔＫにおけるアミノ酸置換をコードする核酸配列、又はｍｅｔＫ対立遺伝子の核酸残基位置１１３２でのシトシン塩基の欠失を含む核酸配列を含む、請求項８に記載の微生物。
14. 微生物は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択される核酸配列を含み、更に、微生物は、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子は、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１３に記載の微生物。
15. 抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸を更に含む、請求項８に記載の微生物。
16. 抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸は、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項１５に記載の微生物。
17. 抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸は、配列番号３３を含む核酸配列及び配列番号３４を含む核酸配列からなる群から選択される、請求項１５に記載の微生物。
18. 抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸を更に含む、請求項８に記載の微生物。
19. 抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸は、配列番号４８のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項１８に記載の微生物。
20. 抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸を更に含む、請求項８に記載の微生物。
21. 抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸は、配列番号５０のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号５２のアミノ酸配列をコードする核酸からなる群から選択される、請求項２０に記載の微生物。
22. 細菌宿主細胞内でタンパク質又はポリペプチドを生成するための方法であって、タンパク質又はポリペプチドはノルロイシン誤取り込みを含まず、方法は、タンパク質又はポリペプチドを発現するために適した培養条件下で、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を細菌宿主細胞内で発現させることを含み、細菌宿主細胞は、変異ｍｅｔＡ対立遺伝子、変異ｍｅｔＫ対立遺伝子、又は変異ｍｅｔＡ対立遺伝子及び変異ｍｅｔＫ対立遺伝子を含み、それによってノルロイシン誤取り込みを含まないタンパク質又はポリペプチドを生成する、方法。
23. 細菌宿主細胞は、請求項９に記載の微生物、請求項１０に記載の微生物、請求項１１に記載の微生物、請求項１２に記載の微生物、請求項１３に記載の微生物、及び請求項１４に記載の微生物からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. タンパク質又はポリペプチドは抗体又は抗体断片である、請求項２２に記載の方法。
25. タンパク質又はポリペプチドは抗体又は抗体断片である、請求項２３に記載の方法。
26. 抗体又は抗体断片は抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片である、請求項２４に記載の方法。
27. 抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸は、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４７のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項２６に記載の方法。
28. 抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片をコードする核酸は、配列番号３３を含む核酸配列及び配列番号３４を含む核酸配列からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
29. 抗体又は抗体断片は抗因子Ｄ抗体又は抗因子Ｄ抗体断片である、請求項２４に記載の方法。
30. 抗Ｄ因子抗体又は抗Ｄ因子抗体断片をコードする核酸は、配列番号４８のアミノ酸配列をコードする核酸及び配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸である、請求項２９に記載の方法。
31. 抗体又は抗体断片は抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片である、請求項２４に記載の方法。
32. 抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片をコードする核酸は、配列番号５０のアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号５１のアミノ酸配列をコードする核酸、及び配列番号５２のアミノ酸配列をコードする核酸からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
33. 細菌宿主細胞中でタンパク質又はポリペプチドを発現させることは、培地に外因的に添加されたメチオニンの非存在下で又はメチオニン供給無しで行われる、請求項２２に記載の方法。
34. 請求項２６、請求項２７、又は請求項２８に記載の方法に従って生成される抗ＶＥＧＦ抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体断片。
35. 請求項２９又は請求項３０に記載の方法に従って生成される抗因子Ｄ抗体又は抗因子Ｄ抗体断片。
36. 請求項３１又は請求項３２に記載の方法に従って生成される抗ＭＥＴ抗体又は抗ＭＥＴ抗体断片。

Images