JP2006503568A - 修飾されたc末端を有するフィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
metA構造遺伝子のカルボキシ末端部分の変異によるフィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼの生産
出発プラスミドとして、プラスミドpKP413GAPを使用し、これはE.Coliからの、GAPDHプロモーターのコントロール下の野生型metA遺伝子を含有し、及びDSM15221の番号でDeutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und ZellkulturenでBraunschweigにおいて寄託されている(図1)。基質としてpKP413GAPを用いて、VentPolymerase(New England Biolabs)を用いて、逆ポリメラーゼ連鎖反応を当業者に公知の規則によって実施した。プライマーとして、5′末端でリン酸化されたオリゴヌクレオチドの、配列
約4.3kbの大きさの生成物を電気泳動によって単離し、及びQIAquick Gel Extraction Kits(Qiagen)を使用して製造者の指示に従って精製した。この後、製造者の指示に従ってT4DNAリガーゼを用いた分子内ライゲーションが行われた。株DH5αのE.Coli細胞の形質転換は、CaCl2方法に従って当業者に公知の方法で行われた。形質転換バッチをLB−テトラサイクリン−寒天プレート(トリプトン10g/l、酵母抽出液5g/l、NaCl 10g/l、寒天15g/l、テトラサイクリン15mg/l)に対してまき、及び一晩37℃でインキュベートした。所望の形質転換体をプラスミド単離の後、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用い、制限分析によって同定した。切断部位Esp3I及びScaIの間の領域を、配列決定し、単離し及び同じ酵素で処理されたプラスミドpKP413GAPに挿入した。生じたプラスミドpBaBmetAdelはE.Coliからの、GAPDHプロモーターのコントロール下で生じる構造遺伝子metAを含有し、これは3′末端で、野生型と比較して表1に示された変異を示す。これらの遺伝子によりコードされたタンパク質の、変異したアミノ酸配列は同様に表1に示されている。
ホモセリントランススクシニラーゼ突然変異体の活性及びL−メチオニンに対するフィードバック耐性
様々なホモセリントランススクシニラーゼの、活性及び活性に対するL−メチオニンの影響は細胞抽出液を用いた酵素検査により決定され、前記細胞抽出液中ではそのつどのタンパク質が製造されている。このために、相応する、変異したホモセリントランススクシニラーゼをコードするプラスミドを形質転換により、当業者に公知の方法に従ってE.Coli株W3110(ATCC 27325)に導入した。形質転換バッチを、LB−テトラサイクリン−寒天プレート(トリプトン10g/l、酵母抽出液5g/l、NaCl 5g/l、寒天15g/l、テトラサイクリン15mg/l)に対してまき、及び一晩37℃でインキュベートした。得られた形質転換体をSM1培地(1l培地に対して:CaCl2×2H2O 0.0147g、MgSO4×7H2O 0.3g、Na2MoO4×2H2O 0.15mg、H3BO32.5mg、CoCl2×6H2O 0.7mg、CuSO4×5H2O 0.25mg、MnCl2×4H2O 1.6mg、ZnSO4×7H2O 0.3mg、KH2PO4 3.0g、K2HPO4 12.0g、(NH4)2SO4 5g、NaCl0.6g、FeSO4×7H2O 0.002g、Na3−シトラート×2H2O 1g、グルコース5g、トリプトン1g、酵母抽出液0.5g)において培養し、600nmでの約0.8の吸収で遠心分離し、50mM Tris pH7.5において洗浄し、及び新たに遠心分離した。細胞を50mM Tris/Cl pH7.5、2mMジチオトレイトール、0.5mMフェニルメチルスルホン酸フルオリドにおいて再懸濁し、及びフレンチプレスにおいて破砕した。更なる遠心分離の上清を、酵素抽出液として検査において使用した。酵素活性を50mM Tris/Cl pH7.6、1mM ホモセリン及び0.1mM スクシニルCoAを有するバッチにおいて決定し、この中で反応の際に発生する補酵素Aを、セリンアセチルトランスフェラーゼの活性の決定のためにKredich及びTomkinsによって記載された方法(Kredich N.M.und Tomkins G.M.、J.Biol.Chem.241、4955−4965(1966))にのっとって、232nmの際の吸光度検査を介して測光により定量化した。活性に対する、添加されたL−メチオニンの影響を決定し、阻害性をKiとして定量化した。Kiとして、ホモセリントランススクシニラーゼの活性がL−メチオニンの非存在下での活性の50%をまだなお有する際の、L−メチオニンに関するその濃度が決定された。
全てのホモセリントランススクシニラーゼ突然変異体は野生型と比較してL−メチオニンに関するより高いフィードバック耐性を示す。表2は結果の要約を示す。
SAMに対するホモセリントランススクシニラーゼのフィードバック耐性
様々なホモセリントランススクシニラーゼの活性に対するSAMの影響を様々なSAM(Cl塩、Sigma)濃度の存在下における活性の定量化により決定した。培養及び細胞抽出液の調製は実施例2に記載されたように行われた。活性試験はLee L.W.et al.、J.Biol.Chem.241、5479−5480(1966)に記載されたように行われ、この場合酵素抽出液を50mMリン酸カリウムバッファーpH7.5、3mMホモセリン及び0.3mMスクシニルCoAでインキュベートした。様々な時点の後、試験バッチ100μlをエタノール400μl、水400μl及び10mM5,5′−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)100μlからなる混合物に対する添加によって終了した。バッチを5分間室温でインキュベートした後に、412nmでの吸収を測光によって決定した。タンパク質濃度の決定の後に、吸光係数の使用下で酵素活性を算出した。SAMによる活性の阻害性のための大きさとして、Kiを決定した。
Claims (9)
- 部分配列TyrGlnXaaThrProを含有するアミノ酸配列を有し、前記部分配列のThrはアミノ酸配列の285〜310位にあり、及びこの際1位は開始メチオニンであるホモセリントランススクシニラーゼ野生型酵素と比較してL−メチオニン又はSAMに対して減少した感受性を示すホモセリントランススクシニラーゼにおいて、前記ホモセリントランススクシニラーゼは野生型酵素と比較して少なくとも2アミノ酸の変異を有し、前記の変異が部分配列のThr又は前記部分配列のC末端にあることを特徴とする、ホモセリントランススクシニラーゼ。
- ホモセリントランススクシニラーゼは、少なくとも5アミノ酸、有利には少なくとも10アミノ酸の変異を有することを特徴とする、請求項1記載のホモセリントランススクシニラーゼ。
- 野生型酵素と比較して、阻害剤SAM及び/又はL−メチオニンに対して、少なくとも2倍上昇した耐性(上昇したKi)を示すことを特徴とする、請求項1又は2記載のホモセリントランススクシニラーゼ。
- 表1にまとめられた突然変異を有することを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項記載のホモセリントランススクシニラーゼ。
- 請求項1から4までのいずれか1項記載のホモセリントランススクシニラーゼをコードするmetA対立遺伝子。
- 請求項5記載のmetA対立遺伝子を、プロモーターと共に含有することを特徴とするプラスミド。
- 請求項5記載のフィードバック耐性metA対立遺伝子を含有することを特徴とする微生物株。
- グラム陰性細菌株、特にE.Coliであることを特徴とする、請求項7記載の微生物株。
- 請求項7又は8記載の微生物株の培養によるL−メチオニン又はSAMの製造方法。
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