JPH01174386A - Ｓ−アデノシル−ｌ−メチオニンの蓄積を高める遺伝子およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｓ−アデノシル−し−メチオニン（以下ＳＡ
Ｍと呼ぶ）に関与する遺伝子に関する。更に詳しくは、
菌体内に高濃度にＳ　Ａ　Ｉｖｉを蓄積させる遺伝子に
関する。

従来の技術 ＳＡＭは生体内において脂肪、蛋白質、糖鎖などの代謝
に関与し、過度脂血症、動脈硬化、うつ病および神経病
系の精神病発現、変性間接症神経病痛感、不眠症、脳障
害などに対する治療効果のあることなどが見出されてお
り、その大量生産が期待されている。

ＳＡＭは非常に不安定な物質であり、菌体内では安定で
あるのに対し、培地中では５゛−メチルチオアデノシン
などに分解される。従って、菌体内にいかに高い濃度で
とし込めておくかがＳＡＭの大量生産にとって重要であ
る。メチオニンを含有する培地中で菌体を培養すれば、
該菌体中に高濃度までＳＡＭを含有しうろことはよく知
られており、例えば、酵母では、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、Ｂｉｏ１、Ｃｈｅ
ｍ）、１２１巻、２６７頁、１９５７年）、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１
、）、１２１巻、２６７頁、１９７５年）、特公昭５２
−１７１１８などが挙げられる。さらに、より高層度に
ＳＡＭを蓄積させるために、メチオニンだけでなくその
他の物質も含有させる方法もあり、非硫黄系アミノ酸を
含有させる方法、特開昭５８＝２８２９６、グリシノあ
るいはアラニンを含有させる方法、特開昭５８−３６３
９７、カルシウム、鉄などの重金属イオンを含有させる
方法；特開昭５８−４００９５、塩基類を含有させ乙方
法、特開昭５８−４００９６、アンモウ１１塩等を含有
させる方法、特開昭５８−１３８３９３、ニノピドリン
陽性反応物質を含有させる方法、特開昭５８−１４６２
７４、特定アミンを含有ざ」Ａる方法；特開昭５８−１
５２４９７、アデニル酸等を含有させる方法：特開昭６
０−７８５９４　ｔ、；どが列挙される。しかしながら
、上記のいずれの方法でＳＡＭを生成しても、菌体内の
ＳＡＭ含量は必ずしも高くできないこと、高価なメチオ
ニンを高濃度に含有する培地で培養する必要があること
など工業的に実施していくためには問題があった。

肌里卓邂決のための手戦 本発明者らは、酵母を培養するに際し、ＳＡＭの蓄積量
をさらに高めていくために種々の検討を加え鋭意努力し
た。その結果、遺伝子組み換えによりメチオニン類似物
質に耐性を示す遺伝子を担持したプラスミドＤＮＡを菌
体の中に移入したところ、それらの大半はＳＡＭの蓄積
を著しく抑制するものであったが、いくつかは、高濃度
に菌体内に蓄積できるものが存在することを発見し、本
発明に至った。一般に、変異処理等によりエチオニン耐
性をイ附与した菌が、バクテリア、酵母などのいくつか
の属について既に得られているが、それらはＳＡＭの高
含有菌ではなく、メヂオニンアデノンルトランスフェラ
ーゼ（以下ＭＡＴと呼ぶ）活性が低いためにメチオニン
のＳＡＭへの合成が抑えられ、菌体内のＳＡＭの含有量
が著しく抑制された菌（例えば、メルフ（Ｍｅｒｔｚ）
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ　、Ｂａ
ｔｅｒｉｏ１、）、１１１巻、７７Ｂ−７８３頁、１９
７２年）であった。該菌体は以下の理由によりエチオニ
ン耐性を示す。メチオニン類似物質、例えば、エチオニ
ンによる増殖阻害は、エチオニンがＭＡＴによりＳ−ア
デノシル−し−エチオニン（以下ＳＡＥと呼ぶ）に変換
され、これが、ＳＡＭのメチル化反応を阻害し、菌体の
増殖をも阻害する（例えば、ステコール（Ｓｔｅｋｏｌ
）、アドバンス・イン・エンザイモロジー（Ａｄｖａｎ
ｃｅ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５巻、３
６９−３９３頁、１９６３年）。エチオニン耐性菌では
、このＭＡＴの遺伝子が、変異処理により破壊され、Ｍ
ＡＴの活性が低い為に、エチオニンのＳＡＥへの合成が
阻害される（例えば、大腸菌Ｅ、Ｃｏ１１（グリーンら
；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リザー
チ・コムニケイション（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａ、　Ｂ
　１ｏｐｈｙｓｉｃａ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）、　
３８巻、１１２０−１１２６頁、１９７０年）。それゆ
え、エチオニン耐性を示すことができる。従って、該菌
体は、メチオニンのＳＡＭへの合成をも阻害し、メチオ
ニンが著量蓄積される。つまり、エチオニン耐性菌は、
菌体内のＳＡＭ含量の抑制された菌であった。一方、本
発明者が発見した遺伝子（以下ＳＡＭ遺伝子と呼ぶ）は
、エチオニン耐性を示すにもかかわらず、ＳＡＭを著量
菌体内に蓄積することができる遺伝子を担持するもので
あり、従来知られていたエチオニン耐性菌とは原理的に
も異なるものである。ＳＡＭ遺伝子がエチオニンに耐性
を示す理由は明らかではないが、ＳＡＭの蓄積許容能力
に密接に関連し、高濃度に菌体内にＳＡＭを蓄積しうる
ちのである。即ち、本発明は、少なくとも１種類のメチ
オニン類似物質に耐性を示し、且つ、菌体内にＳ−アデ
ノシル−し−メチオニンを高濃度に蓄積できる遺伝子で
あることを特徴とし、該遺伝子を、菌体に移入して培養
し、該菌体中にＳ−アデノシル−し−メチオニンを高濃
度に蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする。

以下に本発明をＳＡＭ遺伝子の取得方法とＳＡＭ遺伝子
により菌体内にＳＡＭを蓄積する方法に分けてより詳細
に説明する。

■ＳＡＭ遺伝子の取得方法 ＳＡＭ遺伝子を取得するには、ＤＮＡ供与体から取り出
したＤＮＡ断片をベクタープラスミドＤＮＡに挿入した
ものを、宿主となる酵母に移入し、一３Ａ遺伝子を担持
したものを選び出せば良い。

ここで、ｒＤＮＡ供与体」とは、ベクターに挿入しよう
とするＤＮＡを提供する細胞、微生物等を言う。ＲＮＡ
を鋳型として合成されたＤＮＡをベクターに挿入する場
合には、そのＲＮＡを提供する細胞、微生物をいう。Ｄ
ＮＡ供与体としては、例えば、あらゆる動物、植物由来
の細胞、あるいは、ペニシリウム（Ｐ　ｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ）属、アスペルギ５ｃｕｓ）属、ステムフィリウ
ム（Ｓ　ｔｅｍｐｈｙｒｉｕｍ）属、オオスボラ（Ｏｏ
ｓｕｐｏｒａ）属、ボツリチス（ＢｏｔｒｙｔｉＱ属等
のかび類、あるいは、アクロモバクタ−（戊ｃｈｒｏｍ
ｏｂａｃｔｅｒ）属、バシルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ）
属、ブレビバクテリウム（ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、コリネバク属、シュウトモナス（Ｐ　ｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属、ザルモ゛ネラ（Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）属、スタフィロコッカス（且叩辿ｙ　１ｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属等のバクテリア、あるいは、キャン属、トル
ロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｕｓｉｓ）属、ハンセヌラ（
）（Ｈ１３ｅｎｕｌａ）属、クロエケラ（Ｋ　１ｏｅｋ
ｅｒａ）属、プレタノミセス（Ｂ　ｒｅｔｔａｎｏｍｙ
ｃｅｓ）属、クリプトコツり属等の酵母などがあげられ
る。

ｒＤＮＡ供与体からＤＮＡ断片を得る」ためには、通常
の方法、例えば、染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵
素で切断することによりＤＮＡ供与体からのＤＮＡ断片
を得る方法、例えば、真核細胞では、フェノール法（バ
イオケミ力・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ’ｔａ）、７２巻、６１
９−６２９頁、１９６３年）の改良法を用いるか、ある
いは、ＤＮＡ供与体のメッセンシャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）を抽出した後、逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを
作成し、さらに２重鎖ＤＮＡを得る方法（例えば、真核
細胞では、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ）、１８７−２４−７頁、１
９８２年、コールド・スプリング・バーバー・ラボラト
リ−発行）などを用いる事によりＤＮＡ供与体からＤＮ
Ａ断片が得られる。

一方、「宿主」とは、ＤＮＡの組換え分子を移入される
生細胞を言う。宿主としては、本発明の意図から言えば
あらゆる動植物、微生物の細胞が適用されるが、例えば
、キャンデイグ（Ｃａｎｄ　１ｄａ）属、サッカロミセ
ス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ンゾザッカ０
フイセス（Ｓ　ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属、ピギア（Ｐ基丸到）属、デバリオマイセス（Ｄ　ｅ
ｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ）属、トルロプシス（工刃ｒｕｌｏｐｕｓｉ
ｓ）属、ハンセヌラ（ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クロエ
ケラ（Ｋ　１ｏｅｋｅｒａ）属、プロンノミセス（Ｂ　
ｒｅｔｔａｎ頒跋照）属、クリプトコツカス（Ｃｒｙｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、キュヘロミセス（Ｋ　ｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ロドスポリヂウム（Ｒｈｏｄｏ
ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属等の酵母が好ましいが、これら
の中でも比較的大きな液胞をもつ酵母がより好ましい。

さらに、「ベクター」とは宿主に異種のＤＮＡを運ぶＤ
ＮＡをいう。ベクターとしては宿主に対応し、宿主中で
、ＤＮＡ供与体からのＤＮＡ断片を発現せしめるものを
適宜選択すればよい。例えば、酵母のサツカロミセス属
のベクターとして、例えば、ザヅカロミセス・セルピッ
ノエのベクターでは、染色体と独立して自律的に増殖し
うるに必須なりＮＡ配列（ａｒｓ）を少なくとも１つ有
するもの、例えばＹＣｐ型プラプラスミドＲＩ）型プラ
スミド、２μプラスミドＤＮＡ由来の複製開始点（ＯＲ
Ｉ）を少なくとも１つ有するもの、例えば、ＹＥｐ型プ
ラプラスミドるいは、酵母第３染色体のセントロメア領
域（ＣＥ　Ｎ）を少なくとも１つ有するもの、あるいは
、そのうち、アルス（ａｒｓ）を含まないもの、例えば
、ＹＩｐ型プラプラスミドトコンドリア由来の複製開始
点（ｒｅｐｌ　、ｒｅｐ２．ｒｅｐ３）を少なくとも１
つ有するもの、その他、環状酵母へフタ一を制限酵素で
切って線状化し、その両末端部にテトラヒメナのりボゾ
ームＤＮＡの末端領域を付加した自己増殖の線状ベクタ
ー、その１つの末端を酵母染色体のテロメアで置換した
線状ベクター、λフアージＤＮＡの粘性末端を環状酵母
ベクターに挿入したコスミドベクター、あるいは、上記
のベクターに組換え技術を用いて改良を加えたものなど
いずれでもよい。また、宿主がサツカロミセス属であれ
ば、上記のベクターは、はとんどの場合発現し得る他、
その他の属、例えば、シゾサ、ソカロミセス（Ｓ　ｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の多くのザソカ
ロミセス属以外の属で発現できるため、その場合は、他
の属でも上記ベクターをもちいればよい。

また、キャンディダ属では、例えば、キャンデイグ・マ
ルトーサ（見。ｍａｌｔｏｓａ）で、アルスを有するベ
クター（酵母の増殖と利用、２７−３７頁、学会出版セ
ンター発刊）などを用いれば良い。

最近では、ハンセヌラ属、例えば、ハンセヌラベクター
系も開発されており（例えば、日経バイオチク、第１４
−０号、８頁）、これを利用してもよい。また、上記、
サツカロミセス属、キャンディダ属、ハンセヌラ属のベ
クターが発現しない宿主の場合も、全く上記のベクター
を作成した時と同様の方法に従って、それぞれの宿主由
来のセントロメア（ＣＥＮ）、アルス（ａｒｓ）、オリ
（ＯＲＩ）などを取り出し、ベクターを作成すればよい
。

「ベクターとＤＮＡ断片」との結合は、通常の方法、例
えば、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡ連結酵素を用いて結合
する方法、例えば、ゲレット（Ｇｅｌｌｅｔ）らの方法
（プロン−ディング・オブ・ニコークリエック・アシッ
ド・リザーチ（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄ、Ｒｅ５）、２巻、８７５−８８８頁、１９７１年）
に従って行うことができる。（以下、得られたベクター
とＤＮＡ供与体のＤＮＡ断片を結合したものをハイブリ
ッドプラスミドと呼ぶ。）「ハイブリッドプラスミドの
宿主への移入」（以下、移入されたものを形質転換体と
呼ぶ）は、公知の方法でよく、例えば、カルシウムイオ
ンとボリエチレングリコールの存在下でＤＮＡを細胞壁
溶解酵素処理によってプロトプラスト化した酵母に取込
ませる方法（プロシーディング・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、
Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７５巻、１９２９年）
、界面活性剤処理した酵母を用いる方法（昭和５７年度
日本農芸化学会大会要旨集５６８頁）、アルカリ金属あ
るいはチオールで処理した酵母を用いる方法（ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ　、Ｂ　ａｃｔｅｒｉ
ｏ１、）、１５３巻、１６３頁、１９８３年、アグリカ
ルヂャル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ
、　Ｂｉｏ１、　　Ｃｈｅｍ、　）、４７巻、１６９１
頁、１９８３年）などにより行える。

「ハイブリッドプラスミドを移入した酵母からＳＡＭ遺
伝子を担持した菌を選び出す」には、移入した酵母を一
度、メチオニン類似物質を含有しない増殖培地で一炭化
やし、その後、少なくとも１種類のメチオニン類似物質
を含有する寒天培地にまき親株が元来持っている耐性の
濃度よりも高い耐性を示すものを選別する（以下、１次
選択と呼ぶ）。ここで、耐性が高いとは、同一濃度のメ
チオニン類似物質を培地に含有した時、増殖速度が速い
ということを意味し、一般には、宿主自身が生えてこれ
ない濃度のメチオニン類似物質を含有する寒天プレート
にまき、生えてきたコロニーが耐性があると言える。メ
チオニン類似物質としては、いずれでもよく、例えば、
エチオニン（ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、セレノメチオニン
（ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、メチオニンハ
イドロキサメート（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　　ｈｙｄｒ
ｏｘａｍａｔｅ）、トリフロロメチオニン（ｔｒｉＨｕ
ｏｒｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、メチオニンメチルエス
テル（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　　ｍｅｔｈｙｌ　　ｅｓ
ｔｅｒ）、メチオニンエチルエステル（ｍｅｔｈｉｏｎ
ｉｎｅ　　ｅｔｈｙｌ　　ｅｓｔｅｒ）、フォルミルメ
チオニン（ＮＮ−Ｆｏｒｍｉｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
）、アセチルメチオニン（Ｎ　−ａｃｅｔｙｌ　−ｍｅ
ｔｈｉｏｎｉｎｅ）のそれぞれのＬ体、あるいは、ＤＬ
体等があげられる。使用濃度は、宿主に対応して適宜使
用すれば良く、例えば、酵母、例えば、サツカロミセス
では、エチオニンの場合、ｌｏ−１００μ９／酎の濃度
で、セレノメチオニンでは、１−１０μ９７ＨＱの濃度
で容易に選択できる。さらに、選択したそれぞれの転換
体に対して、メチオニンを含有する増殖培地で培養し、
ＳＡＭの濃度を調べる。この結果、大きく分けて２つの
タイプに分けられる。ひとつは、該耐性菌の大半を占め
るもので、菌体内のＳＡＭ含有量を著しく抑制する（以
下、クラス１と呼ぶ）ものであり、もうひとつは、該耐
性菌の少数を占めるもので、逆に、菌体内のＳＡＭ含有
量を著しく高めるもの（以下、クラス２と呼ぶ）である
。ＳＡＭ遺伝子は、クラス２に属するので、クラス２よ
りどれでも適宜取り出せば、ＳＡＭ遺伝子を担持した酵
母を得ることができる。

本発明の特徴のひとつは、上記の選別操作にある。即ち
、 １）ハイブリッドプラスミドを移入した後、−度、増殖
培地で生やすこと。

２）メチオニン類似物質を示すものの中から、さらに、
ＳＡＭを高濃度にできるものを再選別すること。

にある。■）の操作により、菌体内にＳＡＭのプ−ルが
、形成され、メチオニン類似物質に耐性を示すことがで
きるようになる。ハイブリッドプラスミドを移入したも
のを直接少なくともひとつメチオニン類似物質を含有す
る寒天培地にまき、親株が元来持っている耐性の濃度よ
りも高い耐性を示すものを選別すると、ＳＡＭ含有量の
著しく抑制されたクラスｌの形質転換体しか取得できな
い。

また、ｌ）の操作をしたものでも、大半は、クラスｌに
属する形質転換体であり、２）の操作により始めて、本
発明で言うＳＡＭ遺伝子を取得できる。即ち、メチオニ
ン類似物質、例えば、エチオニンに耐性を示すからとい
って、ＳＡＭを高濃度に蓄積できるとうことではない。

本発明の１）、２）の操作をしない場合には、該メチオ
ニン類似物質耐性菌はＳＡＭ含有量の抑制された菌にな
る。

かかる方法により得られたＳＡＭ遺伝子を移入された酵
母からＳＡＭの遺伝子を抽出し、精製するには、通常の
方法でよい。例えば、酵母では、ベクターに大腸菌との
シャトルベクターを使用し、酵母から抽出したプラスミ
ドを、大腸菌に移入し大量にふやしてから、セシウム−
クロリドの超遠心分離法により精製する方法がよく用い
られる。

精製されたプラスミドは、種々の制限酵素により適宜切
断することで、制限酵素による遺伝子の地図を作成でき
る。

■ＳＡＭ遺伝子により菌体内にＳＡＭを蓄積する方法 」−記の方法により得られたＳＡＭ遺伝子を用いてＳＡ
Ｍを菌体内に高濃度に蓄積させるためには、ＳＡＭ遺伝
子の部分を適宜取り出してヘクターに挿入したハイブリ
ッドプラスミドを宿主に移入し、通常の宿主の培養法で
培養すればよい。例えば、宿主として酵母を用いる場合
、培地としては、炭素源、窒素源、無機塩、あるいはそ
の他の有機栄養源などを適宜に含有する培地である。

炭素源として、糖類、例えば、クルコース、ンコークロ
ース、マルトース、フラクトース、ラクトース、でんぷ
ん、でんぷん加水分解物など、アルコール類、例えば、
メタノール、エタノール、プロパツール、ブタノール、
グリセリン、ソルビトール、高級アルコールなど、有機
酸類、例えば、コハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、酢
酸、プロピオン酸、酪酸、グルコン酸、フマール酸、安
息香酸、あるいはこれら有機酸とのアルカリ塩など、さ
らに、上記糖類もしくはアルコール類とのエステル、炭
化水素類、例えは、炭素数１−２５のアルカン類、アル
ケン類などが挙げられる。

窒素源として、アンモニウム塩、例えば、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、コハク酸
アンモニウム、クエン酸アンモニ　゛ラムなど、硝酸塩
、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなど、また、
アンモニア水、アンモニアガス、尿素、アミノ酸、ペプ
チド、核酸関連物質などが挙げられる。

無機塩として、りん酸塩、例えば、りん酸カルシウム、
りん酸ナトリウム、りん酸カリウムなど、カリウム塩、
例えば、塩化カリウムなど、カルシウム塩、例えば、塩
化カルシウムなど、マグネシウム塩、例えば、硫酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウムなど、ナトリウム塩、例え
ば、塩化ナトリ＝１９− ラム、炭酸ナトリウムなと、マンガン塩、例えば、硫酸
マンカン、塩化マンガンなど、重金属塩、例えば、鉄、
亜鉛、銅、コバルトなどの塩化物、硫酸化物、硝酸化物
などが挙げられる。

その他有機栄養源として、アミノ酸、例えば、グリノン
、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、ク
ルタミン酸、オルニチン、プロリン、ヂロノンなど、ペ
プチド類、例えば、ペプトン、カザミノ酸、クリノルグ
リノン、アラニルアラニン、アラニルアランンなど、ビ
タミン類、例えば、ビオチン、パントテン酸など、天然
由来物質、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽、麦芽
エキス、コーンステイブリカ、大豆粉、米糠、大豆蛋白
加水分解物、カゼイン加水分解物など、核酸関連物質、
例えば、ウラシル、ントソン、チミン、アデニン、プリ
ン、これらとリボース、デオギンリポースからなるヌク
レオシド、これらのモノりん酸、ノリン酸、トリりん酸
、あるいは、りん酸エステルなど、その他のもの、例え
ば、■。

２．４−トリアゾール類、例えば、３−アミノ−１，２
，４−トリアゾールなどが挙げられる。

メチオニンは、培地中に含有させなくても著量のＳＡＭ
を菌体内に蓄積させることができるが、より高濃度まで
、菌体内にＳＡＭを蓄積させるためにはメチオニンを培
地中に含有させればよい。

メチオニンの濃度は、５０ｍｍｏｌ／（２以下でよく、
さらに好ましくは、２０　ｍｍｏｌ／１２以下でよい。

メチオニンとしては、Ｌ−メチオニンあるいはり。

Ｌ−メチオニンのいずれでもよく、メチオニン源として
市販品の他、微生物発酵液をそのまま、または、その濃
縮物、さらにはその部分精製標品、あるいは、化学的あ
るいは酵素的に合成した粗製品などメチオニンを含有し
、菌体の培養に著しく悪影響があるものを含有していな
ければいずれでもよい。

培養は、好気、嫌気のいずれでも高濃度にＳＡＭを蓄積
でき、いずれでもよい。たたし、炭素源当たりのＳＡＭ
の収率を高めるためには、ｐＨ３−８，１５−４，０℃
で通気攪はんなどにより１．−５日間好気的に培養する
ことが好ましい。また、メチオニン当ｌこりの収率を高
めていくためには、例えば、培地１リットル当り乾燥菌
体１００９以上になるまで高菌体に培養するか、あるい
は、遠心分離機あるいはフィルターなどを用いて連続的
に菌体のみを除すながら連続培養することが好ましい。

本発明において、移入されたＳＡＭ遺伝子はベクターの
安定性に従って宿主にとどまることができる。より安定
に宿主中に留まら姐るためには、コピー数の多いベクタ
ー、例えば、酵母では、ＹＥｌ）系のベクター、あるい
は、２μの大きな断片を有するもの、例えば、ｐＹＸ（
プロソーディング・オブ・ナショナル・アカデミツク・
サイエンス・オブＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａｔ１
、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　９　Ａ）、７２巻、
４０８５−４０８９頁、１９７５年）、ｐＪＢ２１９（
セル・バイオロジー（Ｃｅｌｌ　　Ｂ　ｉｏ１、）、１
２巻、３９−４４頁、１９７５年）などを使用すればよ
い。また、あるいはＹｌｐ系のベクターを用いて染色体
中に組み入れる事もてきる。また、あるいは、組換え酵
母を組換えられていない酵母に対して選択的に増殖させ
てもよい。そのためには、例えば、ベクターに選択可能
な遺伝子（以下、マーカー遺伝子と呼ぶ）を挿入し、そ
の遺伝子の効果が出てくる培地で培養すればよい。

マーカー遺伝子としては、宿主菌体内で発現するもので
あればいずれでもよく、−例をあげると、薬剤耐性遺伝
子、アミノ酸生合成遺伝子、核酸生合成遺伝子、ビタミ
ン生合成遺伝子、その他の生体内物質の生合成遺伝子な
どであり、薬剤耐性を示す遺伝子としては、例えば、０
４１８（商品名ゲネティシン）に耐性を示す遺伝子（ジ
メンツ（Ｊｉｍｅｎｅｚ）ら：ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２８７巻、８６９゜１９８０年）、重金属、ある
いはメチルグリオキサールに耐性を示す遺伝子（相国ら
ニアブライド・アンド・エンバイロメンタル・ミクロバ
イオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　　ａｎｄ　　Ｅｎｖｉｒ
ｏｎｍｅｎｔａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、　
５０巻、１２００．１９８５年）などが知られている。

さらに、ＳＡＭ遺伝子自身メチオニン類似物質に耐性を
有するマーカー遺伝子であるため、メチオニン類似物質
、例えば、エチオニンを５０ｏ／ａ程度含有する培地で
培養してもよい。この際、ハイブリッドプラスミドが宿
主菌体内で極めて安定に存在するのみならず、理由はわ
からないが、ＳＡＭとアデノシルエチオニン（以下、Ｓ
ＡＥと呼ぶ）の菌体内合計含量をも著しく上昇でき、エ
チオニンを含まない場合の４倍近くにも及ぶ。

また、ＳＡＭ遺伝子の効果を高めるためには、ＳＡＭ遺
伝子を強く発現させるための読み込み遺伝子（以下、プ
ロモーターと呼ぶ）を挿入すればよい。強いプロモータ
ーとして、例えば、解糖体の酵素群などの菌体内で大量
に発現している酵素の遺伝子のプロモーター、例えば、
グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵
素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸
イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼ、エノラーゼ、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸
脱水酵素、さらに、培地により発現調節できるものとし
て、ガラクトース、ホスファターゼ等の遺伝子のプロモ
ーターが挙げられる。

かかる方法により得られたＳＡＭは通常用いられている
方法により精製すればよい。例えば、菌体内より抽出す
るためには抽出剤、例えば、過塩素酸、塩酸、硫酸、蟻
酸、酢酸など、界面活性剤、例えば、アニオン性界面活
性剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤な
ど、有機溶剤、例えば、アセトン、トルエンなど、熱水
などにより抽出する方法や、凍結、乾燥、機械的破壊、
超音波破壊などの膜破壊処理する方法などいずれでもよ
い。この抽出液を精製するためには、例えば、イオン交
換樹脂、例えば、陽イオン性交換樹脂、陰イオン性交換
樹脂、ノニオン性交換樹脂などにより分離精製する方法
、あるいは、ゲルろかにより分離精製する方法などいず
れでもよい。

以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが
、現在のところ組換えＤＮＡの宿主として認可されてい
る酵母は、サツカロミセス・セルビラン、：ｃ　（Ｓ　
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）の
実験室保存株（組換えＤＮＡ実験指針　昭和６０年８月
２４日改訂）たけである。それゆえ宿主としてサツカロ
ミセス属を用いる場合をより詳細Ｉこ説明を施すが、本
発明の基本的な概念は、ＳＡＭの蓄積を高めることにあ
り１．サツカロミセス属以外でも同様に行うことが可能
であることは言うまでもなく、これにより発明の思想が
限定を受けるものではないことは勿論である。

尚、実施例で用いたベクターであるベクタープラスミド
ＤＮＡ　　ＹＥｐｌ　３、宿主としての大腸菌ＤＩ（Ｉ
、Ｃ６００は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）より寄託番号、ＡＴ
ＣＣ３７１１５、ＡＴＣＣ３３８４９、ＡＴＣＣ２３７
２４として容易に入手できる。さらに、本発明で得たＤ
ＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＳＭＨ１は、工業技術院微生物工
業技術研究所より寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１６２９とし
て入手できる。

実施例１ ａ）酵母の遺伝子バンクの作成 酵母Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｖｉｓｉ
ａｅＤ　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ−Ｈ（ａ、ｔｒｐｌ　、］ｅｕ
２−３．１ｅｕ２−１１２　、ｈｉｓ３）をＤＮＡ供与
体の１例として使用した。即ち、ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ株を
ＹＰＤ培地（ペプトン２％、イーストイクストラクト１
％、グルコース２％）■ρ中、３０℃て２４時間終止期
まで振とう培養した。

菌体を集菌後、５ａｉｔｏ　　Ｍｉｕｒｏの方法（バイ
オケミ力・バイオフィジカ・アクタ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａ　ｅｔａ）、７２巻、６１
９−６２９頁、１９６３年）を用いて染色体ＤＮＡを抽
出した。即ち、菌体を緩衝液（ＩＭのソルビトール、１
４ｍＭのメルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐ＋−［＝８．０））に０．２ｇ菌体／Ｅ
ρ−緩衝液になるように懸副した。０　、１　ｍｇ／ｌ
ｔｔρになるようパに細胞壁溶解酵素ザイモリエース１
００Ｔ（生化学工業（株）製）を加え３０℃で１時間放
置した。

その後、１０％のＳＤＳを加え、６０℃で１５分放置す
ることで完全に菌体を破壊した後、４°Ｃまで冷却後、
フェノール−クロロホルム（等体積混合物）により数回
精製し、冷エタノール（−２０℃）を加えながらガラス
棒で析出したＤＮＡを巻き取り、染色体ＤＮＡ２ｍｇを
得た。次に、大腸菌由来のアンピシリン及びテトラザイ
クリン耐性遺伝子を保持しているプラスミドＤＮＡ　ｐ
ＢＲ３２２、酵母由来の２μｍプラスミドＤＮＡの一部
及び酵母染色体ＤＮＡのロインン合成能遺伝子（］ｅｕ
２）からなるプラスミドＤＮＡ　　ＹＥｐｌ　３を保持
したＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００（以下、Ｃ６００／ＹＥｐ
ｌ　３と呼ぶ）から、ベクタープラスミドＤＮＡ　　Ｙ
Ｅｐｌ３を精製した。即ちＣ６００／ＹＥ１３をＬ−培
地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、グルコース０
１％、塩化すｌ・リウム０５％、ｐＨ７，２）１４で培
養し０Ｄ（６１０ｎｍ）が０．５−０．６になった時点
で最終濃度が１５０−２００μ９／１１Ｑになるように
クロラムフェニコールを添加し３７°Ｃでさらに１５時
間培養しつづけた。菌体を集菌洗浄後、リゾチーム及び
ドデシル硫酸ナトリウムで溶菌させ、３５０００ｒ、ｐ
、ｍで１時間遠心して上澄みを得た。上澄みにフェノー
ル／クロロホルム混合液（等体積）を等量加えて静かに
攪拌し、遠心しく１０００　ｒ、ｐ、ｍ、　Ｉ　０分）
、蛋白質等を取り除き、３７℃においてリボ核酸分解酵
素で３時間処理し、次いてセシウムクロリド・エチジウ
ムプロミド平衡密度勾配遠心を３６０　Ｏｒ、ｐ、ｍで
４８時間行い、ＹＥｐｌ　３プラスミド１ｍｇを得た。

先に得た染色体ＤＮＡ２ｍｇを制限酵素５ａｕ３ＡＩで
３０分間処理して部分分解し、得られたＤＮＡ断片をア
ガロース電気泳動にかけ、分子ｆｆ１７．ＯＫｂ程度の
ＤＮＡをゲルから抽出した。一方、プラスミドＹＢＩ）
１３１ｍ＠を制限酵素ＢａｍＩ（Ｉで完全に切断させ、
セルフライゲーノヨンを防ぐためにアルカリフォスフォ
ターゼ処理した。さらに両反応液を混合し、Ｔ４ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼを用い、４°Ｃで１６時間結合
反応を行った。次いで、反応液に２倍容の冷エタノール
（−２０°Ｃ）を加え、−２０℃で一夜放置後１０００
０ｒ、ｐ、ｍで１０分間遠心して沈澱を集め、これを１
０ｍＭ０ｍＭトリスル衝液（＋）Ｈ７，５）０．１ｆｆ
ｌＱに溶解してＤＮＡ溶液（以下、ハイブリッドプラス
ミドＤＮＡ混合溶液と呼ぶ）とした。次に、このハイブ
リッドプラスミドＤＮＡ混合溶液を大腸菌旦、並其　Ｄ
ＨＩ（Ｆ　　ｇｙｒＡ９６　　　ｒｅｃＡｌ　　　ｒｅ
ｌＡｌ　　　ｅｎｄＡｌ　　　ｔｈｉ−ＩＨｄｓＲＩ　
７　５ｕｐＥ　４４λ−）に移入した。移入はコーエン
（Ｃｏｈｅｎ）らのカルシウム法（プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミツク・ザイエンス・オブＵ
ＳＡ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、４９巻、２＋１０−２１１４頁、１９７２年
）を用いた。即ち、２００ｚ１２のし一培地中、３７℃
で培養し、ＯＤが０３になったとき、集菌して、生理食
塩水で１回洗浄後、バッファー（５ｍＭの塩化マグネシ
ウム１、Ｏ１５Ｍの塩化カリウム、０．１Ｍの塩化カル
シウムを含有するトリス塩酸溶液（ｐＨ７、６））に懸
濁した。０℃で１時間放置した後、ＤＮＡ溶液を加え、
さらに３０分放置した。その後３７℃で２５分放置した
。これを、２時間り一培地で振とう培養し、２０μｆｉ
＋／１２のアンピシリンを含有するし一培地の寒天プレ
ート２０枚にまいた。その結果、プラスミドが移入され
たもの（以下、形質転換体と呼ぶ）が、少なくとも１０
７以上個生えてきた。これら、形質転換体をすべて集め
、プラスミドＤＮＡ　　ＹＥｐｌ　３を精製したときと
同じ方法で精製し、ハイブリッドプラスミドＤＮＡ混合
溶液（以下、溶液Ａと呼ぶ）を大量に得た。次に、アル
カリ金属による方法を用いて、酵母へこれらのハイブリ
ッドプラスミドＤＮＡを移入した。即ち、ＤＫＤ−５Ｄ
−Ｈ株をＹＰＤ培地４０祿、３０℃で振とう培養し１ｍ
（ｌ当たり２ＸＩＯ’個になった時点で３００　Ｏｒ、
ｐ。

ｍで遠心し、集菌した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス、
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）２ｍ１２に懸濁した
。

０．２Ｈずつ分注し、０．２Ｍの酢酸リチウム０゜２酎
を加え１時間、３０℃で放置し上記のＤＮＡ溶液０　、
１　ｍＱを加えさらに３０分放置した。その後、０．５
ｍＱの７０％ポリエチレングリコール４０００溶液を加
えさらに１時間放置した。４２℃で５分間放置した後、
水で洗浄、遠心分離を繰り返し、ＳＤ＋ＴＨの寒天培地
（グルコース２％、イーストニトロゲンＷ１０アミノア
シッド０．６７％。

トリプトファン２０１１ｇ／Ｑ、ヒスチジン２０肩ｇ／
１２）２０枚にまき、３日後生えてきた全コロニーを集
めた。前記の操作により、酵母の染色体ＤＮＡのすべて
の情報をコードした酵母の形質転換体、いわゆる酵母の
遺伝子バンクを得た。

ｂ）メチオニン類似物質に耐性を示し、菌体内のＳＡＭ
含有量を高める遺伝子の取得 この酵母の遺伝子バンクをＳ　Ｄ　＋　Ｔ　Ｈの寒天培
地中に５０μ９／駁のエヂオニンを含むプレートに１プ
レート当たり１０５個になるようにまいた。

３口径エチオニン耐性を示す菌１０５個に数個程度の割
合でエチオニン耐性菌を得た。これら耐性菌は、いずれ
もトリプトファンとヒスチジンの要求性を示し、ＤＫＤ
−５Ｄ−Ｈ株にＹＥｐｌ　３から作成したハイブリッド
プラスミドが入ったものであった。得られた耐性菌２５
菌について、それぞれ、２０ｍＭのし一メチオニンを含
有するＳＤ＋ＴＨ培地５０ＦｌＱ中で培養し、ＳＡＭの
含有量を測定したところ、少なくとも２つのクラスが存
在した。大半（コロニー数１８）は、菌体内のＳＡＭの
含有量が著しく抑制されており、乾燥菌体１ｇ−３２＝ 当たり２屑２以下であった（以下、クラスｌと呼ぶ）。

しかし、いくつか（コロニー数７）は、菌体内のＳＡＭ
の含有量が著しく高められており、乾燥菌体１ｇ当たり
１８０ｘ９以上であった（以下、クラス２と呼ぶ）。尚
、ブランクにあたるＤＫＤ−５Ｄ−ＨにＹＥＩ）１３自
身が移入された菌（以下、ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐｌ
　３）では、乾燥菌体１ｇ当たり６０Ｍ９程度であった
。そこで、クラス２に属する形質転換体から、郡家らの
方法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ　、Ｂ
ａｃｔｒｉｏｌ）、１４５１．３８２−３９０頁、１９
８１年）に従ってプラスミドＤＮＡ溶液を抽出し、大腸
菌ＤＨＩへのレスキューを行った。即ち、クラス２に属
する形質転換体をＳＤ＋ＴＨ培地１１２，３０℃で一昼
夜振とう培養した。３０００　ｒ、ｐ、ｍで遠心集菌し
た後、菌体を集菌後、菌体を緩衝液（１Ｍのソルビトー
ル、１４ｍＭのメルカプトエタノール、５０ｍＭのリン
酸カリウム緩衝液（＋）Ｉ（＝８．０））に０．２ｇ菌
体／１１Ｑ−緩衝液になるように懸濁した。０１肩９／
ｌσになるように細胞壁溶解酵素ザイモリエースを加え
３０°Ｃで１時間放置した。プロトプラスト化された菌
を集菌し、２０ｍ’Ｑの緩衝液（０８Ｍソルヒトールと
０．０１ＭのＥ　Ｔ）　ＴΔを含む０．１Ｍのくえん酸
−リン酸緩衝液）に懸濁し、１０％のＳＤＳを２ｍＱ加
えて菌体を破砕した。５Ｍの塩化ナトリウムを４２靜加
えた後、−２０°Ｃのエタノールを２倍容重加えて〜７
０℃で１０時間放置した。その後、遠心分離（１０００
０ｒ、ｐ、ｍ）で沈澱を回収し、少産のトリス−ＥＤＴ
Ａ緩衝液に溶かしプラスミド溶液を得た。これを、前述
のコーエンらの方法を用いて大腸菌ＤＨＩに移入した。

アンピシリンを含有するし一培地の寒天プレートで生え
てきたものを、前述のＹＥｐｌ　３を精製した時と同様
の方法で精製した。得られたプラスミドは制限酵素を用
いて適宜切断し、アガロースゲル電気泳動を行う事によ
り、制限酵素地図を作成した。得られたプラスミド（以
下、ｐＹＳＭＨ１と呼ぶ）は、第１図に示すごとくであ
る。

尚、菌体内のＳＡＭの分析は、以下の方法を使用した。

培養した菌体を３００　Ｏｒ、ｐ、ｍで集菌した後、１
０％過塩素酸溶液で１時間３０’Ｃで抽出し、Ｉ　ＯＯ
００ｒ、ｌ）、ｍで３０分遠心し上澄み分離後、１０％
過塩素酸溶液で希釈して５靜とした。

これを高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰ　ＬＣと
呼ぶ）によりＳＡＭを分析した。ＨＰ　Ｌ　Ｃの分析条
件は、カラムＧ５−３２０（旭化成（株））７６　Ｉ　
Ｄ−５００ｍｍＬ、移動相０，１Ｍリン酸ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液ｐ）１１０．０．流速２．０＋
（２７分、検出ＵＶ２６０ｎｍでおこなった。

実施例２ ハイブリッドプラスミドＤＮＡ混合溶液（実施例１に記
載の溶液Ａ）を実施例１に記載のアルカリ金属による方
法を用いて、酵母１）　Ｋ　Ｄ　−５Ｄ　−Ｉ−Ｔに移
入し、これを、Ｓ　Ｄ　＋Ｔ　Ｉ−１培地で一度増殖さ
せることなく直接、！５０ｍｇ／νのエチオニンを含有
するＳ　Ｄ　＋　Ｔ　Ｈの寒天プレートにまいた。４日
後得られた耐性菌２０個について、それぞれ、２０ｍＭ
のＬ−メチオニンを含有するＳ　Ｄ　＋　Ｔ　Ｉ−Ｔ培
地５０次ρ中で培養し、ＳＡＭの含有量を測定したとこ
ろ、得られたコロニーはすべてクラス１に属するもの、
即ち、菌体内のＳＡＭの含有量が著しく抑制されており
、乾燥菌体１ｇ当たり２ｍｇ以下であった。また、ｐＹ
ＳＭＨ１を実施例１に記載のアルカリ金属による方法を
用いて、酵母ＤＫＤ　−５Ｄ　−Ｈに移入し、これを、
ＳＤ＋ＴＨ培地で一度増殖させることなく直接、５０７
ｔ７．／Ｑのエチオニンを含有するＳ　Ｄ　＋　Ｔ　Ｈ
の寒天ブＬ−１・にまいたところ、生えてこなかった（
少なくと右、２週間）。

寒痰咋止 実施例１で、精製したＩ）Ｙ　ＳＭ　１．　ＹＥｐｌ　
３；ごそれぞれ、実施例１に記載のアルカリ金属による
方法を用いて、酵母ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈに再移入し、これ
を、Ｓ　Ｄ　＋　’Ｉ”　Ｈの寒天培地にまき、形質転
換体を得た。以下、酵母ＤＫＤ−５Ｄ−ＨにｐｙｓＭＨ
Ｉを再移入したちのをＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＳＭＨＩ
、酵母ＤＫＤ−５Ｄ−ＨにＹＥｐｌ　３を再移入したも
のをＤＫＤ−５Ｄ−１（／ＹＥｐ１３と呼ぶ。これらを
、メチオニン類似物質である一エチオニン、セレノメチ
オニン、メヂオニンエヂルエステル、エチオニンエチル
エステルについてその耐性を調べた。増殖速度でみると
、ＤＫＤ−５Ｄ−１−丁／ｐＹＳＭＨＩ　　は、　ＤＫ
Ｉ）−５Ｄ　〜Ｈ／ＹＥｐｌ　３に比べ、いずれも、６
−１０倍の増殖速度が得られた。即ち、メチオニン類似
物質に耐性を示した。

また、高濃度までメチオニン類似物質に耐性を示した。

例として、第２図にＤＬ−エチオニンに対する耐性の様
子を、第３図に１７−セレツメヂオニンに対する耐性の
様子を示す。第２図および第３図で・、ムはそれぞれＤ
ＫＤ−５Ｄ−Ｈ／Ｉ）ＹＳＭＨ１、、ＤＫＤ−５Ｄ−１
−（／ＹＥＩ）Ｉ　３を意味し、横軸は、培地中のメチ
オニン類似物質の濃度を、縦軸は、増殖速度を意味する
。

実施例４ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／Ｉ）ＹＳＭＨＩ及びＤＫＤ−５Ｄ−
トＩ／ＹＥｐｌ　３をそれぞれ０−５ｍＭのし一メヂオ
ニンを含有するＳＤ＋ＴＤ培地１００ｕ（２中で振とう
培養した。対数増殖後期において菌体を集菌し、ＳＡＭ
含有量を分析した。結果を第４図に示した。菌体重量は
、菌体を含む培養液を３００Ｏｒ、ｐ、ｍで遠心分離し
た後１回水洗後、１０５℃で６−８時間乾燥した乾燥菌
体の重量を用いた（以下ｄｒｙ−ｃｅｌｌと表示する）
。第４図で・、ムはそれぞれＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／Ｉ）Ｙ
ＳＭＨＩＳＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐｌ　３を意味し、
横軸は、培地中のメチオニン濃度を、縦軸は、乾燥菌体
重量当たりの菌体内に含まれるＳＡＭの重量を意味する
。この結果、ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹｓＭＨ１はメチオ
ニンを含まない場合でも２０　ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ−ｃｅ
ｌｌのＳＡＭを含有するばかりでなく、わずか５ｍＭの
メチオニンを培地に含有させただけで１８０　ｐｇ／ｙ
−ｄｒｙ−ｃｅｌｌのＳＡＭを含有できた。また、菌体
外にも菌体内にあるＳＡＭの総重量の約５％かいずれも
菌体外に出ており、菌体外の濃度もＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／
Ｉ）ＹＳＭＨＩのほうが高い。

さらに、５ｍＭのメチオニンを含有した場合、ＤＫＤ−
５Ｄ−Ｈ／ｌ）ＹＳＭＨＩはＳ−アデノシル−し−ホモ
システィンもＳＡＭの約１／１０重量、即ち、２０　ｍ
ｇ／ｇ−ｄｒｙ−ｃｅｌｌも生成しており、ＤＫＤ−５
Ｄ−Ｈ／ＹＥＩ）ｌ　３と比べ約１０倍にそれぞれあが
っていた。また、比較のためにＳＡＭ含量が高いとされ
ている清酒酵母ＩＦＯ２３４６（塩崎らニアグリカルチ
ャー・バイオロジカル・ケミストリー（Ａ　ｇｒｉｃ、
　Ｂ　ｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、）　、　４８巻、２２９
３．１９８４年）を、５ｍＭのし一メチオニンを含有す
るＳＤ培地（グルコース２％、イーストニトロゲンＷ１
０アミノアシッド０６７％）で培養した結果、８６Ｈ／
ｇ−ｄｒｙ−ｃｅｌｌのＳＡＭを含有した。

つまり、ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｌ）ＹＳＭＨＩのほうがＩ
Ｆ０２３４６よりも高かった。

実施例５ 実施例１で得た菌ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＳＭＨ１を５
０μｇ／ｍρのエチオニンを含むＳＤ＋ＴＨ培地で培養
し４００ｍｇ／Ｑの乾燥菌体重量になったとき培養をや
め、集菌後実施例１と同様の方法でＳＡＭの分析を行っ
た。その結果、ＳＡＭとＳ−アデノシル−Ｌ−エチオニ
ン（以下ＳＡ、Ｅと呼ぶ）を加えたものが菌体内に４１
０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ−ｃｅｌｌも蓄積した。

３９一 実施例６ 実施例１で得たプラスミドｐＹｓＭＨ１をアルカリ金属
による方法（実施例１に同じ）で清酒酵母Ｓ、Ｃｅｒｖ
ｉｓｉａｅＩ　ＦＯ２３４６、ＩＦＯ２３７６、及び、
パン酵母Ｓ、ＣｅｒｖｉｓｉａｅＩＦＯ２０４４に移入
しＳＤ寒天培地にまき、３日後生えてきたコロニーを集
め、１プレート当たり１０５個程鹿の割合で１００ｍ９
／Ｑ、及び、５００ｍｇ／ＱのＤＬ−エチオニンを含有
するＳ、Ｄ寒天プレートにまいた。

その結果、パン酵母では菌体自身の有するエチオニン耐
性が高く、５００仄９／（ｌのＤＬ−エチオニンを含有
するＳＤ寒天プレートにおいても、生えることが可能で
あり、この濃度では、形質転換された菌を選別できなか
った。しかし、清酒酵母では、形質転換された菌のみが
３日後、１００１１ｇ／ρ、及び、５００Ｈ／（ｌのい
ずれからも得られた。

以下、ｒｒ’０２３４６にｐＹＳＭＨｌを移入したもの
をＩＦ０２３４６／ｐＹＳＭＨ１、ＩＦ”０２３７６に
ｐＹＳＭＨｌを移入したものをｌＰＯ２３７６／ｐＹＳ
ＭＩ（１と呼ぶ。ＩＦ’０２３４６／ｐＹＳＭＨＩとＩ
ＦＯ２３７６／ｐＹｓＭＨ１をそれぞれ、実施例１で行
った方法と同じ方法で大腸菌Ｄ　Ｉ−１１にレスキコー
した。得られた転換体からプラスミドＤＮＡを、アルカ
リラピッド法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（
Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｒｉｏｌ　、）、１４５巻、１３６
５−１３７３頁、１９８１年）によりアガロースゲル電
気泳動を用いて調べたところ、プラスミドのバンドの位
置は、ｐＹＳＭＨ１のバンドの位置と一致し、清酒酵母
中でメチオニン類似物質に対する耐性が発現できた。特
にＩＦ’０２３７６は、菌体自身のメチオニン類似物質
への耐性が低く、該プラスミドｐＹＳＭＨＩが移入され
たものが、極めて明確に選択できた。そこで、ＩＦ０２
３７６とＩ　ＦＯ２３７６／ｐＹＳＭＨ１を５ｍＭのメ
チオニンを含有するＳＤ培地５０２Ｑ、中で培養した。

対数後期（ＯＤ＝２．０）のときに培養をやめ、集菌後
、菌体内のＳＡＭ含有量を実施例１と同じ方法で測定し
た。その結果、ＩＦＯ２３７６は、Ｉ　ｒ’　０２３４
６のそれ（実施例４を参照の事）より高＜　９８　ｍ９
／ｆｌ−ｄｒｙであったか、■Ｆ○２３７６／ｐＹ　５
Ｍ１（Ｉは、それよりもさらに高＜　１９０ｍｇ／ｇ−
ｄｒｙにも達した。尚、この測定した時点でのＴ　ＰＯ
２３７６／ｐＹＳＭ１１１のプラスミ）・の保持率は、
５０％以」−８０％以下であった。

杢ｙＵ肋のり １）該遺伝子を移入した酵母を用いる事により、メチオ
ニンを含有しない培地で培養しても、著量のＳＡＭを菌
体内に蓄積できろ。

２）該遺伝子を移入した酵母を用いる事により、メチオ
ニンを含有する培地で培養すればざらにＳＡＭの菌体内
含量はあがるが、メチオニンの濃度は極めて低濃度です
み、経済的である。

３）培地中にエヂオニンを含有させれば、さらに、高い
濃度のＳＡＭかえられる。

４　）Ｓ　ＡＭが著量菌体内に蓄積することに付随して
、菌体内のＳ　Ａ　Ｈも著仝生成てきる。

５）ＳＡＭ含荷量の高い酵母に該遺伝子を移入すれば、
ＳＡＭを極めて高含有する酵母を育種でき

【図面の簡単な説明】

第１図（Δ）はプラスミドｐＹｓＭＨ＋の制限酵素地図
、第１図（Ｂ）は該プラスミドに含まれるＳへＭ遺伝子
のより詳細な制限酵素地図、第２図は形質転換体のエヂ
オニンに対する耐性を示すグラフ、第３図は形質転換体
のセレノメチオニンに対する耐性を示すグラフ、第４図
（」、形質転換体を種々のメチオニン濃度で培養した時
の、菌体中のＳＡＭ含竜を示ずグラフである。 特許出願人　鐘淵化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、すくなくとも１種類のメチオニン類似物質に耐性を
   示し、かつ、菌体内にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
   を高濃度に蓄積できることを特徴とする遺伝子。 ２、酵母の遺伝子であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の遺伝子。 ３、酵母の遺伝子がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
   ｍｙｃｅｓ）属の遺伝子である特許請求の範囲第２項記
   載の遺伝子。 ４、第１図（Ｂ）で示される遺伝子断片である特許請求
   の範囲第３項記載の遺伝子。 ５、すくなくとも１種類のメチオニン類似物質に耐性を
   示し、かつ、菌体内にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
   を高濃度に蓄積できる遺伝子を有するハイブリッドプラ
   スミド。 ６、酵母のベクターとのハイブリッドプラスミドである
   特許請求の範囲第５項記載のハイブリッドプラスミド。 ７、ハイブリッドプラスミドがｐＹＳＭＨ１である特許
   請求の範囲第６項記載のハイブリッドプラスミド。 ８、すくなくとも１種類のメチオニン類似物質に耐性を
   示し、かつ、菌体内にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
   を高濃度に蓄積できる遺伝子を有するハイブリッドプラ
   スミドを移入された細胞。 ９、ハイブリッドプラスミドを移入された細胞が酵母で
   ある特許請求の範囲第８項記載の細胞。 １０、酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
   ｅｓ）属に属する酵母である特許請求の範囲第９項記載
   の細胞。 １１、ハイブリッドプラスミドがｐＹＳＭＨ１である特
   許請求の範囲第８項ないし第１０項のいずれかに記載の
   細胞。 １２、すくなくとも１種類のメチオニン類似物質に耐性
   を示し、かつ、菌体内にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニ
   ンを高濃度に蓄積できる遺伝子を有するハイブリッドプ
   ラスミドで形質転換された細胞を培養することにより、
   菌体内にＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを高濃度に蓄
   積せしめ、これを採取することを特徴とするＳ−アデノ
   シル−Ｌ−メチオニンの製造方法。 １３、細胞が酵母である特許請求の範囲第１２項記載の
   製造方法。 １４、細胞がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
   ｅｓ）属に属する酵母である特許請求の範囲第１３項記
   載の製造方法。 １５、ハイブリッドプラスミドがｐＹＳＭＨ１である特
   許請求の範囲第１２項ないし第１４項のいずれかに記載
   の製造方法。