DE10230224A1 - Verfahren zur Produktion von S-Adenosyl-L-Methionin durch Fermentation von genetisch modifizierten Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur Produktion von S-Adenosyl-L-Methionin durch Fermentation von genetisch modifizierten Mikroorganismen Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den folgenden Schritten: DOLLAR A a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm, DOLLAR A b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, DOLLAR A bei dem der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der Gene, ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18, oder eines seiner Homologen überexperimentiert oder in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene, ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQ5, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1,inaktiviert ist oder der eine Kombination dieser Überexpressionen und Geninaktivierungen aufweist. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin einen prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus, der mindestens eines der Gene, ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18, überexprimiert oder in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene, ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SAM3, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQ5, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1, inaktiviert ist oder der eine Kombination dieser Überexpressionen und Geninaktivierungen aufweist. DOLLAR A Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt die Verwendung der vorstehend ...

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM), mit den folgenden Schritten:
    • a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm,
    • b) gegebenenfalls Isolierung und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines seiner Homologen überexprimiert oder in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQ5, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist, oder der eine Kombination dieser Überexpressionen und Geninaktivierungen zeigt.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den vorstehenden Verfahrensschritten a) und b), dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der beiden Gene SAMT und SAM2 oder eines ihrer Homologen unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene aus der Gruppe bestehend aus den Phase 2, Phase 3-, Phase 4- und den Phase 5-Genen überexprimiert.
  • Zudem betrifft die Erfindung die vorstehend genannten, genetisch modifizierten prokaryontischen und eukaryontischen Organismen zur Herstellung von S-Adenosyl-L-Methionin (SAM), sowie deren Verwendung zur Herstellung von SAM.
  • S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) spielt im Organismus eine zentrale Rolle bei unterschiedlichen Biosynthesewegen. So ist SAM insbesondere als Methylgruppendonator in zahlreichen physiologischen Transmethylierungsreaktionen an wichtigen metabolischen Prozessen beteiligt. Weiterhin fungiert SAM als Vorläufermolekül bei der Biosynthese schwefelhaltiger Verbindungen wie beispielsweise Glutathion, Cystein, Taurin und Coenzym A. In EP 0 647 712 A1 wird offenbart, daß SAM zusätzlich durch seine Beteiligung an physiologischen Transsulfurierungsreaktionen für endogene Entgiftungsprozesse von großer Bedeutung ist.
  • SAM wird aufgrund seiner Beteiligung an zahlreichen Stoffwechselwegen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. So haben verschiedenste klinische und experimentelle Studien gezeigt, daß die Verabreichung von SAM hepatotoxische Effekte von anderen Medikamenten oder Chemikalien verhindern oder zumindest reduzieren können.
  • In US 4,369,177 wird weiterhin offenbart, daß sich die Verabreichung von SAM zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten eignet, so insbesondere von Adipositas hepatis (Fettleber), Hyperlipämie, Arteriosklerose, Arthritis deformans, bei Schmerzen bei verschiedenen neurologischen Syndromen, sowie von Schlaflosigkeit. Weiterhin wird SAM vorzugsweise zur Behandlung von depressiven Syndromen eingesetzt.
  • In US 4,956,173 wird die Nutzung eines SAM-Salzes zur Herstellung von pharmazeutischen und kosmetischen Präparationen beschrieben, die der Hautalterung entgegenwirken. SAM ist ebenfalls als aktive Komponente von Medikamenten zur Behandlung von degenerativer Osteoarthropathie bekannt. Hierbei spielt insbesondere die antiphlogistische (d.h. entzündungshemmende) Wirkung des SAM eine wichtige Rolle.
  • In US 4,376,116 werden decarboxylierte Derivate von SAM, insbesondere von S-Adenosyl-l,8-diamino-3-thiooctan, als Verbindungen offenbart, die die Polyaminbiosynthese hemmen. Solche Polyaminbiosyntheseinhibitoren werden vorzugsweise gemeinsam mit antiparasitischen Wirkstoffen eingesetzt und werden zur Behandlung von Krebs und zystischer Fibrose eingesetzt. In US 4,376,116 werden weiterhin die US 3,954,726 und US 4,028,183 zitiert, in denen die Herstellung von stabilen Salzen solcher Derivate des SAM beschrieben werden, welche sich von den als Polyaminbiosyntheseinhibitoren eingesetzten SAM-Derivaten ableiten.
  • Aufgrund seiner vielfältigen pharmazeutischen Anwendungsmöglichkeiten sind schon seit längerer Zeit verschiedene Verfahren zur industriellen Herstellung von SAM bekannt.
  • Die meisten dieser Verfahren basieren auf der Produktion und Anreicherung von SAM in Mikroorganismen, vorzugsweise in Hefen. Eines dieser Verfahren ist als Schlenk Anreicherungsmethode bekannt (Schlenk et al., Enzymologica 29, 238 (1965)).
  • Die industrielle SAM-Produktion umfaßt als klassisches Fermentationsverfahren analog der Schlenk Anreicherungsmethode folgende Verfahrensschritte:
    • – Kultivierung von bestimmten Mikroorganismen, die als Produktionsstämme eingesetzt werden. Hierbei werden vorzugsweise Hefen als Produktionsstämme zur Produktion und Anreicherung von SAM eingesetzt.
    • – intrazelluläre Anreicherung von SAM in den Produktionsstämmen nach Zugabe von Methionin in das Kulturmedium
    • – Isolierung des angereicherten SAM durch Zell-Aufschluß
    • – anschließende Aufreinigung und Konzentration des SAM aus dem Zellextrakt.
  • Im Rahmen der industriellen SAM-Produktion werden die ersten beiden der genannten Verfahrensschritte bis zur Anreicherung des SAM im eingesetzten Produktionsstamm in zwei verschiedenen Teilprozessen durchgeführt, im sogenannten Anreicherungsprozess und im sogenannten SAM-Fermentationsprozess.
  • Im Rahmen des ersten Teilprozesses, des Anreicherungsprozesses, kommt es bei der Kultivierung des eingesetzten Produktionsstammes, vorzugsweise des eingesetzten Hefestammes, zunächst unter Zugabe von Melasse als Kohlenstoff- und Energiequelle im sogenannten Zulaufverfahren (Fed-batch) zu einer deutlichen Biomasse-Produktion. Die so hergestellten Hefezellen werden mittels Methionin-Zugabe ins Kulturmedium mit SAM angereichert, indem das Methionin aus dem Medium durch endogene Permeasen in die Hefezellen aufgenommen und anschließend mittels endogener Hefe-Enzyme in SAM umgesetzt wird. Die Hefezellen werden anschließend konzentriert und dem zweiten Teilprozess, der SAM-Fermentation, zugeführt.
  • Der zweite Teilprozess, der SAM-Fermentationsprozess, wird mit der erneuten Zugabe von Methionin zum Kulturmedium, das Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle enthält, initiiert. Beim SAM-Fermentationsprozess findet im wesentlichen keine Biomasse-Produktion mehr statt. Der SAM-Fermentationsprozess ist vielmehr dadurch charakterisiert, daß die bereits vorhandenen Hefezellen das erneut zugegebene Methionin aus dem Medium mit Hilfe endogener Permeasen aufnehmen und in SAM umsetzen, welches in den Hefezellen akkumuliert wird. Am Ende des SAM-Fermentationsprozesses besitzen die Hefezellen einen SAM-Gehalt von ca. 12 – 20 g pro kg Feuchtzellgewicht.
  • Nach Durchführung des Anreicherungs- und des SAM-Fermentationsprozesses wird das in den Hefezellen angereicherte SAM durch Aufschluß der Zellen geerntet. Das sich nun im Zellextrakt befindliche SAM kann danach gegebenenfalls konzentriert und gereinigt werden.
  • Extrazelluläres SAM ist sehr instabil, intrazellulär kann SAM dagegen in hohen Konzentrationen gespeichert werden. Daher ist es zur Produktion großer Mengen von SAM notwendig, daß das vom Mikroorganismus bzw. von den Zellen produzierte SAM nicht in das umgebende Medium abgegeben wird, sondern in hohen Konzentrationen in der Zelle akkumuliert wird.
  • Zur Produktion und intrazellulären Speicherung von SAM im Rahmen der industriellen SAM-Produktion können als Produktionsstämme im weitesten Sinne alle Organismen oder Zellen eingesetzt werden, die auch natürlicherweise SAM synthetisieren können. Es kann sich hierbei um Zellen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder um prokaryontische oder eukaryontische Zellen bzw. Mikroorganismen handeln. Als prokaryontische Zellen bzw. Organismen werden vorzugsweise Prokaryonten der Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas eingesetzt. Als eukaryontische Zellen bzw. Organismen werden filamentöse Pilze eingesetzt der Gattung Aspergillus und Neurospora, vorzugsweise werden Hefen eingesetzt, stärker bevorzugt Hefen aus einer der Gattungen Saccharomyces, Candida, Zygosaccharomyces, Hansenula, Pichia, Debaryomyces. Besonders bevorzugt werden für die SAM-Herstellung Hefen aus der Gattung Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Insbesondere werden solche Hefen aus der Gattung Saccharomyces cerevisiae zur SAM-Herstellung eingesetzt, die dem der Saccharomyces cerevisiae Variante Sake zugehörigen Stamm K6, insbesondere der Mutante 7/181, oder dem industriellen Backhefestamm S47 angehören.
  • Durch steigenden Bedarf an SAM am Weltmarkt kam es bisher durch begrenzte Produktionskapazitäten zu Produktionsengpässen. Um zukünftig solche Engpässe zu vermeiden, ist das Interesse an einer Optimierung der Produktionsbedingungen und Verfahrensschritte des industriellen SAM-Herstellungsprozesses, sowie an der Produktivitätssteigerung des Prozesses im Hinblick auf die relativen SAM-Ausbeuten groß. Eine solche Optimierung des SAM-Produktionsprozesses kann entweder über die Verbesserung der Kulturbedingungen während des Produktionsprozesses oder über den Einsatz verbesserter und insbesondere gentechnisch modifzierter Hefen erfolgen, die eine stärkere Produktion und Anreicherung von SAM erlauben.
  • Im folgenden werden zahlreiche Veröffentlichungen zitiert, die sich mit der Optimierung des SAM-Produktionsprozesses, insbesondere mit der Verbesserung der Produktions- und Kulturbedingungen beschäftigen.
  • In US 4,621,056 wird ein Prozeß zur Herstellung und Aufreinigung von SAM in industriellem Maßstab beschrieben. Die industrielle Herstellung von SAM erfolgt hierbei durch Biotransformation mit Hilfe spezifischer Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Der beschriebene Prozess ist weiterhin dadurch charakterisiert, dass zunächst Hefezellen mit einem SAM-Gehalt von 12-20 g pro kg Feuchtzellgewicht hergestellt werden. Anschließend werden die Zellen lysiert und das SAM-reiche Lysat wird geerntet. Anschließend erfolgt die Ultrafiltration des Lysats, die Passage durch ein schwaches Ionenaustauscherharz und danach durch ein Adsorptionsharz, die Konzentration des SAM durch Umkehrosmose, sowie Sprühtrocknung der konzentrierten Lösung des SAM Salzes.
  • In US 4,562,149 wird ein Verfahren zur Herstellung von SAM beschrieben, bei dem Mikroorganismen, vorzugsweise Hefen, verwendet werden, welche nach Zugabe von Methionin zum Nährmedium mind. 10 % ihres Trockengewichts an SAM intrazellulär anreichern können. Diese hohe Anreicherungsrate an SAM in diesen Mikroorganismen wird durch besondere Kultivierungsbedingungen erreicht.
  • In US 3,962,034 wird ein weiteres Verfahren zur Herstellung von SAM und von Methylthioadenosin in Hefezellen beschrieben, wobei die Hefezellen in einem Kulturmedium wachsen, das mit Methionin versetzt ist. Auch bei diesem Verfahren wird die hohe Anreicherung von SAM und von Methylthioadenosin in den Hefezellen durch besondere Kultivierungsbedingungen erreicht.
  • Neben den relativ zahlreichen Publikationen, die sich mit der Optimierung der Produktions- und Kulturbedingungen beschäftigen, gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die zur Verbesserung des SAM-Produktionsprozesses den Einsatz gezielt genetisch modifizierter Mikroorganismen mit, verbesserten SAM-Produktions- und Speichereigenschaften offenbaren.
  • In solchen modifizierten Mikroorganismen mit verbesserten SAM-Produktions- und Speichereigenschaften kann insbesondere das Genexpressionsmuster des Organismus modifiziert werden. Dabei werden spezifische Gene, deren Genprodukte insbesondere bei der Biosynthese, dem Abbau, der metabolischen Verwertung und der Speicherung von SAM in der Zelle eine Rolle spielen, durch gezielte genetische Modifikationen überexprimiert oder auch inaktiviert.
  • So beschreibt US 5,100,786 die Herstellung von rekombinanten Hefestämmen, die SAM in höheren Konzentrationen akkumulieren können als nicht transformierte Referenzstämme. Diese rekombinanten Hefestämme werden durch Transformation mit einem Hefe-Expressionsvektor (yeast shuttle vector), der in einer hohen Kopienzahl in der Zelle vorliegt (high-copy Vektor), transformiert. Auf diesem Expressionsvektor befindet sich ein Gen, dessen Genprodukt eine Resistenz des transformierten Hefestamms gegenüber oxidierten Analoga von Methionin bewirkt.
  • In EP 0 647 712 A1 wird ein verbessertes Verfahren zur Produktion von SAM durch Fermentation von Bakterien beschrieben. Bei diesem Verfahren werden als Produktionsstämme Bakterien eingesetzt, welche zuvor mit einem Expressionsvektor umfassend die Sequenz der SAM-Synthetase aus der Ratte transformiert worden sind. Diese gezielte Überexpression der SAM-Synthetase der Ratte in den eingesetzten Bakterien führt im Rahmen des SAM-Produktionsprozesses zu einer stärkeren intrazellulären SAM-Anreicherung im Vergleich zu nicht transformierten Bakterien und somit zu einer entsprechenden Effektivitätssteigerung des SAM-Produktionsprozesses.
  • Die SAM-Synthetase, deren Überexpression nach EP 0 647 712 A1 zu einer großen Effektivitätssteigerung des SAM-Produktionsprozesses führt, ist für die Biosynthese von SAM durch Übertragung des Adenosylrests von Adenosintriphosphat (ATP) auf das Schwefel-Atom des Methionins verantwortlich. In allen bisher untersuchten Eukaryonten wurden verschiedene Formen der SAM-Synthetase beschrieben und es scheint, dass das Enzym aussergewöhnlich konserviert ist. In Saccharomyces cerevisiae wurden zwei SAM-Synthetasen nachgewiesen, die durch die Gene SAM1 und SAM2 kodiert werden.
  • In Saccharomyces cerevisiae wird die Expression der Gene SAM1 und SAM2 differenziell reguliert (Thomas, D. and Y. Surdin-Kerjan (1991). "The synthesis of the two S-adenosylmethionine synthetases is differently regulated in Saccharomyces cerevisiae." Mol. Gen. Genet. 226: 224-32). Die Expression des SAM2-Gens wird bei Methionin-Überschuß im Kulturmedium induziert, während die Expression von SAM 1 unter denselben Bedingungen reprimiert wird. Es wird daher davon ausgegangen, daß in Saccharomyces cerevisiae zwei verschiedene intrazelluläre SAM-Pools existieren, die jeweils durch die Aktivität einer der beiden spezifischen SAM-Synthetasen aufgebaut werden. Die zeitliche Regulation der Genexpression der SAM-Synthetasen der Hefe SAM1 und SAM2, insbesondere bei Methionin-Überschuß, scheint sehr komplex zu sein und kann daher nicht mit letzter Sicherheit aufgrund der physiologischen Funktion der SAM-Synthetasen vorausgesagt werden. Insbesondere unter den Bedingungen, die während der industriellen SAM-Produktion herrschen und die sich durch eine hohe intrazelluläre SAM-Konzentration und eine hohe extrazelluläre Methionin-Konzentration auszeichnen, läßt sich die zeitliche Regulation der Genexpression der SAM-Synthetasen nicht voraussagen, so daß es erforderlich ist, den tatsächlichen Verlauf der Expressionsprofile von SAM1 und SAM2 experimentell zu ermitteln.
  • So werden insbesondere die Expressionsniveaus von katabolischen und anabolischen Schlüsselenzymen wie SAM1 oder SAM2 häufig durch Rückkoppelungsmechanismen des enzymatischen Umsetzungsproduktes beeinflusst. Solche Rückkoppelungsmechanismen von Schlüsselenzymen des SAM-Stoffwechsels, zu geringe Expression von SAMsynthetisierenden (anabolischen) Enzymen oder zu hohe Expression von SAM-abbauenden (katabolischen) Enzymen könnten daher die SAM-Anreicherung in der Hefezelle während des Anreicherungsprozesses begrenzen. Eine zu jedem Zeitpunkt des SAM-Produktionsprozesses optimierte Expressionsregulation dieser Enzyme durch gezielte rekombinante Expression ihrer Gene unter der Kontrolle geeigneter Promotor bzw. durch Inaktivierung ihrer Gene könnte demnach die SAM-Produktions- und Speichereigenschaften der bisher zur SAM-Produktion eingesetzten Hefestämme deutlich verbessern.
  • Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die bisher für die großtechnische SAM-Produktion als Produktionsstämme eingesetzten Organismen, insbesondere die bisher eingesetzten Hefestämme derart genetisch zu modifizieren, daß sie verbesserte Eigenschaften, insbesondere verbesserte SAM-Produktions- und Speichereigenschaften aufweisen, sowie ein Verfahren zur SAM-Herstellung mit verbesserter relativer SAM-Produktivität bereitzustellen.
  • Diese Aufgabe wurde zum einen dadurch gelöst, daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus bereitgestellt wird, der mindestens ein Gen aus der Gruppe bestehend aus MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18 oder eines ihrer Homologen, überexprimiert und/oder in dem mindestens eine Kopie mindestens eines Gens ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQ5, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  • Unter der Überexpression eines Gens wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Expression des betroffenen Gens unter der Kontrolle eines solchen Promotors verstanden, der nicht der natürliche Promotor des betroffenen Gens ist. Die Überexpression eines Gens wird dabei durch das Einbringen einer Expressionskassette in den Organismus erreicht, die einen Promotor, der nicht der natürliche Promoter des entsprechenden Gens ist, gefolgt von dem kodierenden Bereich des entsprechenden Gens, sowie einen Terminator umfaßt. Die Expressionskassette kann hierbei von einem geeigneten Expressionsvektor umfaßt sein, welcher durch Transformation eingebracht wird oder auch permanent in das Genom des Organismus integriert sein.
  • Die erfindungsgemäße Aufgabe wird zum anderen auch dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den folgenden Schritte bereitgestellt wird:
    • a) Durchfiihrung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm,
    • b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen, überexprimiert und/oder in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQ5, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  • Zur Identifizierung der beiden Gruppen von Genen, deren Überexpression im Produktionsstamm einerseits oder deren Inaktivierung im Produktionsstamm andererseits zu verbesserten SAM-Produktions- und Speichereigenschaften des betreffenden Produktionsstammes führen, wurde das Genexpressionsmuster der Saccharomyces cerevisiae Variante Sake K6 zu verschiedenen Zeitpunkten des Anreicherungsprozesses analysiert. Zu diesem Zweck wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Anreicherungsprozesses Zellproben gezogen, daraus RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und markiert. Anschließend wurde die markierte cDNA-Mischung mit solchen DNA-Arrays hybridisiert, die rasterförmig angeordnete, immobilisierte Nukleinsäurefragmente von ca. 6000 Genen der Hefe Saccharomyces cerevisiae umfaßten. Der zeitliche Transkriptionsverlauf der einzelnen Gene des Hefe-Stammes Sake K6 während des Anreicherungsprozesses wurde durch die Quantifizierung der Hybridisierung der jeweiligen markierten cDNA-Proben mit dem DNA-Array bestimmt.
  • Durch den Vergleich der Transkriptionsanalysen mittels DNA-Array-Hybridisierungen zu verschiedenen Zeitpunkten des SAM-Produktionsprozesses konnten diverse Hefe-Gene identifiziert werden, die während des SAM-Produktionsprozesses auf Transkriptionsebene hoch- oder herunterreguliert werden.
  • Solche Gene des Hefe-Stammes Sake K6, deren Expression nach den oben beschriebenen Analysen im zeitlichen Verlauf des SAM-Produktionsprozesses besonders deutlichen Veränderungen, d.h. besonders deutlichen Hoch- oder Herunterregulierungen unterlagen, wurden als Kandidaten-Gene zur Modifikation ihrer Genexpression in Produktionsstämmen ausgewählt.
  • Anhand des für die Kandidaten-Gene jeweils ermittelten zeitlichen Transkriptionsverlaufs wurden diese in zwei Gruppen von Genen aufgeteilt.
  • Die erste Gruppe umfaßt hierbei solche Gene, deren gezielte Überexpression im Produktionsstamm nach ihrem Transkriptionsprofil zu einer Verbesserung der SAM-Produktions- und Speichereigenschaften führen sollte.
  • Die zweite Gruppe umfaßt hierbei solche Gene, deren gezielte Inaktivierung im Produktionsstamm nach ihrem Transkriptionsprofil zu einer Verbesserung der SAM-Produktions- und Speichereigenschaften führen sollte.
    Figure 00100001
    Tabelle 1: Stammverbesserung durch Überexpression eines der folgenden Gene
  • Tabelle 1 stellt die erste Gruppe von Genen dar, die – nach dem Verlauf ihres Expressionsprofils zu beurteilen – in den zur SAM-Produktion eingesetzten Hefestämmen überexprimiert werden müssen, um die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften zu verbessern.
  • Jedes Gen aus Tabelle 1 ist durch seinen systematischen Namen eindeutig identifiziert. Mit Hilfe des systematischen Namens kann der kodierende Bereich eines spezifischen Gens, sowie die außerhalb des kodierenden Bereichs liegenden regulatorischen Bereiche des Gens in einer der öffentlich zugänglichen Datenbanken identifiziert werden. Beispiele für Datenbanken in denen die Sequenzen der oben genannten Gene öffentlich zugänglich sind, sind die Saccharomyces Genome Database (SGD), Stanford, USA (Cherry JM, Ball C, Weng S, Juvik G, Schmidt R, Adler C, Dunn B, Dwight S, Riles L, Mortimer RK, Botstein D Nature 1997 387(6632 Suppl):67-73 Genetic and physical maps of Saccharomyces cerevisiae), sowie die Comprehensive Yeast Genome Database (CYGD), München (Mewes HW, Albermann K, Heumann K, Liebl S, Pfeiffer F MIPS: A database for Protein sequences, homology data and yeast genome information. Nucleic Acid Research 25: 28-30 (1997)).
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt demnach ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den folgenden Schritten:
    • a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm,
    • b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen, überexprimiert.
  • Unter einem Homologen eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18, wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein solches Gen verstanden, das über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 %, bevorzugt mindestens 50 %, stärker bevorzugt mindestens 70 % und insbesondere mindestens 90 % Identität zur DNA-Sequenz eines dieser Gene besitzt. Die DNA-Sequenzen sind hierbei in den einschlägigen Datenbanken unter den in Tab. 1 aufgeführten Identifikationsnummern der einzelnen Gene zu finden.
  • Unter der Überexpression eines bestimmten Gens wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Expression des betreffenden Gens unter der Kontrolle eines Promotors verstanden, der nicht den natürlichen Promotor dieses Gens darstellt und der vorzugsweise konstitutiv oder stärker bevorzugt nur in definierten Zeiträumen zu einer Erhöhung der Genexpression im Vergleich zur natürlichen Expression des betreffenden Gens im gleichen Zeitraum und unter gleichen Bedingungen führt.
  • Der Verfahrensschritt a) wird vorzugsweise wie in Beispiel 2.1. beschrieben durchgeführt.
  • Der vorstehend definierte Anreicherungsprozess wird in eine erste Teilphase mit starker Biomasseproduktion und in eine zweite Teilphase, geprägt durch die beginnende intrazelluläre Anreicherung von SAM, eingeteilt. Am Ende des Anreicherungsprozesses beträgt die intrazelluläre SAM-Konzentration mindestens 0,02 g SAM/g Trockenzellen (2% des Trockengewichts).
  • Die erste Teilphase des Anreicherungsprozesses dauert ca. 20 Stunden. Während dieser Teilphase erfolgt die Produktion von Biomasse durch Fütterung, von industriellen Substraten wie insbesondere Melasse, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat und Biotin. Die zweite Teilphase des Anreicherungsprozesses wird mit der Zugabe von Methionin in einer Konzentration von ca. 6 g/l eingeleitet. Danach beginnt die Anreicherung von intrazellulärem SAM. Am Ende des Anreicherungsprozesses werden die mit SAM angereicherten Zellen konzentriert, gewaschen und für den nächsten Teilprozess der SAM-Produktion, den SAM-Fermentationsprozess, bereitgestellt.
  • Der SAM-Fermentationsprozess wird mit einer erneuten Methionin-Zugabe eingeleitet und ist dadurch gekennzeichnet, dass dieses Methionin mittels endogener Permeasen in die Zellen aufgenommen wird, intrazellulär zu SAM umgesetzt wird. Hierbei wird SAM in den Zellen stark angereichert. Der SAM-Fermentationsprozess ist im wesentlichen nicht durch einer Biomasseproduktion geprägt. Die Nährlösung im SAM-Fermentationsprozess enthält neben Glucose und Methionin verschiedene Salze, insbesondere Ammoniumphosphat, Ammoniumsulphat und Magnesiumsulphat. Das Medium kann insbesondere wie bei Schlenk beschrieben (Schlenk et al., Enzymologica 29, 238 (1965)) hergestellt werden.
  • Im Verfahrensschritt b) wird das intrazellulär angereicherte SAM nach bekannten Methoden aus der Kultur durch Zellaufschluß isoliert (Schlenk und de Palma, J. Biol. Chem. 1957, 229: 1037-50).
  • Eine bevorzugte Methode zur Isolierung des intrazellulär akkumulierten SAM aus den Zellen des Produktionsstammes, vorzugsweise aus den Hefezellen, ist der Zellaufschluß durch Säureextraktion. Hierbei wird die (Hefe)-Kultur vorzugsweise mit einem 1/50 ihres Volumens konzentrierter Schwefelsäure versetzt, während einiger Sekunden bei 95 °C inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Der Zellextrakt wird anschließend durch Filtration über einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 μm filtriert. Das Filtrat kann danach zur Bestimmung der SAM-Konzentration mit Hilfe geeigneter Methoden verwendet werden.
  • Zur Überexpression der Gene aus Tabelle 1 in den zur SAM-Produktion eingesetzten Produktionsstämmen werden die betreffenden Organismen, mit einem Expressionsvektor permanent oder transient transformiert. Der eingesetzte Expressionsvektor führt hierbei zur Expression des betreffenden Gens unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren bzw. regulierten Promotors.
  • Eine Aufreinigung des so isolierten SAM nach bekannten Verfahren, insbesondere durch Ultrafiltration, Chromatographie kann gegebenenfalls im Anschluß erfolgen.
  • Bei diesem Verfahren werden als prokaryontische Organismen, die mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18 oder eines ihrer Homologen überexprimieren, vorzugsweise Prokaryonten der Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas eingesetzt.
  • Bei diesem Verfahren werden als eukaryontische Organismen, die mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18 oder eines ihrer Homologen überexprimieren, vorzugsweise Eukaryonten ausgewählt aus den Gattungen Neurospora, Aspergillus, Saccharomyces, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium eingesetzt.
  • Stärker bevorzugt werden Hefen aus der Gattung Saccharomyces cerevisiae eingesetzt, besonders bevorzugt werden solche Hefen aus der Gattung Saccharomyces cerevisiae eingesetzt, die dem Stamm K6 der Variante Sake, insbesondere der Mutante 7/181, oder dem industriellen Backhefestamm S47 angehören.
  • Die Überexpression eines oder mehrerer der oben genannten Gene kann hierbei sowohl durch transiente als auch durch permanente Transformation des eingesetzten Organismus mit Hilfe eines geeigneten Vektors erfolgen.
  • Als Vektor können alle Expressionsvektoren, mit denen sich die oben genannten prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen transformieren lassen, eingesetzt werden. Diese Vektoren umfassen in der Regel eine Expressionskassette umfassend mindestens eine Klonierungsregion zur Einklonierung des zu exprimierenden Zielgens und einen geeigneten Promotor, der in den oben genannten Organismen aktiv oder aktivierbar ist und der die Expression des einklonierten Zielgens steuert.
  • Für die Überexpression einzelner Gene in Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisisiae werden vorzugsweise solche Vektoren eingesetzt, die mindestens eine Sequenz umfassen, die für die autonome Replikation unabhängig von den Wirtschromosomen benötigt wird, insbesondere die Vektoren Ycp, Yrp (z.B. YCp50) etc. Ebenfalls vorzugsweise werden solche Vektoren eingesetzt, die mindestens einen Replikationsursprung des Hefe-2μ-Plasmids tragen, insbesondere die Yep-Vektoren (z.B. YEp13). Vektoren, die keines der oben genannten selbstreplizierenden Elemente enthalten, insbesondere die Yip-Vektoren (YIp = Yeast Integrative plasmid) können ebenfalls zur Überexpression einzelner Gene in Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisisiae eingesetzt werden. Weiterhin können alle der oben genannten Vektoren eingesetzt werden, die durch rekombinante DNA-Technologien verbesserte Eigenschaften erhalten haben, sowie alle Vektoren, die als lineare Fragmente in das Wirtsgenom permanent integriert werden können. Zur Überexpression einzelner Gene in einem der anderen der vorstehend genannten prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen können entsprechende, für die jeweilige Spezies bekannte Vektoren analog zu den oben beschriebenen Vektoren verwendet werden.
  • Bei der Überexpression einzelner der in Tabelle 1 aufgeführten Gene durch Transformation der Zelle mit einem Expressionsvektor wird die Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle dadurch garantiert, daß die Hefen während der SAM-Produktion unter solchen Kulturbedingungen gehalten werden, die die Anwesenheit des Vektors erfordern.
  • Für dieses selektive Wachstum von Vektor-haltigen Hefen muß der eingesetzte Expressionsvektor einen Selektionsmarker besitzen und die Hefe muß in einem Medium kultiviert werden, in dem dieser Selektionsmarker aktiv ist. Als Markergene können verschiedene Gene verwendet werden, z.B. Gene, die zur Resistenz gegenüber Antibiotika führen, Gene zur Biosynthese von Aminosäuren oder Nukleotiden (Auxotrophiemarker), Gene zur Biosynthese von Vitaminen oder andere. Ein Gen, welches der Wirtszelle Resistenz gegenüber einem Antibiotikum vermittelt, ist beispielsweise das KanMX-Gen aus dem E. coli Transposon 903, welches der transformierten Hefe eine Resistenz gegenüber Geniticin vermittelt (Wach et al., 1994, Yeast 10, 1793-1808) oder auch das Tn5ble-Gen aus E. coli, welches zur Resistenz der transformierten Hefe gegen Phleomycin führt (Wenzel et al. 1992, Yeast 8, 667-668).
  • Zur Überexpression von Genen mit Hilfe eines Vektors mit dem Ziel, in der Wirtszelle eine höhere SAM-Anreicherung zu erreichen, muß der kodierende Bereich des Gens von regulatorischen Sequenzen umgeben sein, die eine im Vergleich zur untransformierten Zelle erhöhte Transkriptionsrate des Gens ermöglichen. Die Initiation der Transkription geht dabei von der Promotorregion aus, die Ablösung der RNA-Polymerase von der DNA-Matrize erfolgt durch den Terminator.
  • Auf den zur Transformation eingesetzten Vektoren können die zu exprimierenden Zielgene sowohl unter der Kontrolle von konstitutiven Promotoren oder auch unter der Kontrolle von regulierten oder regulierbaren Promotoren stehen.
  • Als starke konstitutive Promotoren können insbesondere Promotoren des ADH1-Gens oder des PGK1-Gens eingesetzt werden. Der Einsatz von regulierten oder regulierbaren Promotoren ist gegenüber dem Einsatz von konstitutiven Promotoren bevorzugt.
  • Als Transkriptionsterminatoren können beliebige in Hefe als Transkriptionsterminatoren wirkende DNA-Fragmente verwendet werden. Beispiele hierfür sind die Terminatoren der Gene ADH1 und PGK1.
  • Zu den regulierbaren Promotoren gehören im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die klassischen induzierbaren Promotoren, d.h. vorzugsweise solche Promotoren, die erst durch das Hinzufügen oder das Eliminieren einer Substanz induziert, d.h. aktiviert werden, wie insbesondere die Promotoren der Gene GALT, PHO84, FBP1, CUP1. So wird beispielsweise der CUP1-Promotor erst durch die Zugabe von Kupfer-Ionen aktiviert.
  • Zu den regulierten Promotoren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch solche Promotoren gezählt, die in bestimmten Phasen des SAM-Produktionsprozesses induziert werden, ohne daß hierzu das gezielte Hinzufügen oder Eliminieren einer Substanz notwendig ist, d.h. ein Eingriff von außen in die bestehenden Reaktionsbedingungen des SAM-Produktionsprozesses ist nicht erforderlich. Solche nur in bestimmten Phasen des SAM-Produktionsprozesses aktive, regulierte Promotoren wie insbesondere die Promotoren der nachfolgend genannten Phase 1-, Phase 2-, Phase 3-, Phase 4- und Phase 5-Gene konnten ebenfalls mit Hilfe der vergleichenden Transkriptionsanalysen zu verschiedenen Zeitpunkten des SAM-Produktionsprozesses mittels DNA-Array-Techniken identifiziert werden und sind daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • In 15 A bis E werden die mittels Transkriptionsanalysen ermittelten Expressionsprofile geeigneter Promotoren zur Überexpression der in Tab. 1 aufgeführten Hefe-Gene im zeitlichen Verlauf des SAM-Produktionsprozesses dargestellt. Hierbei wurden Promotoren mit jeweils ähnlichem Expressionsverlauf während des SAM-Produktionsprozesses in Promotor-Gruppen zusammengefaßt. Auf diese Weise entstanden fünf verschiedene Gruppen von Promotoren, die im Prozessverlauf reguliert sind, bzw. während des Prozessverlaufs entweder induzierbar oder dereprimierbar sind und daher ihr nachgeschaltetes Zielgen zu jeweils definierten Zeitpunkten während des SAM-Produktionsprozesses exprimieren. Diese Gruppen wurden je nach der Phase im Anreicherungsprozess, in der die zugehörigen Gene exprimiert werden, Phase 1- bis Phase 5-Gene genannt. Je nach ermitteltem Expressionsprofil des Zielgens kann somit ein Promotor mit optimaler Expressionscharakteristik für das betreffende Zielgen zur gezielten Überexpression des Zielgens in bestimmten Phasen des Produktionsprozesses ausgewählt werden.
  • Die Methionin-Zugabe, die den Übergang von der durch Biomasse-Produktion geprägten ersten Phase des Anreicherungsprozesses in die zweite, durch SAM-Anreicherung geprägte Phase des Anreicherungsprozesses darstellt, erfolgt in allen Teilabbildungen der 15 zum Zeitpunkt Null.
  • In 15 A sind die Expressionsprofile der folgenden Gene im Verlauf der SAM-Fermentation dargestellt:
    Figure 00170001
  • Die Gene, für die die vorstehenden systematischen Namen stehen, werden im folgenden Phase 1-Gene genannt.
  • Die Phase 1-Gene sind zum Zeitpunkt der Methionin-Zugabe (t = 0) relativ hoch exprimiert, werden jedoch nach Methionin-Zugabe wieder relativ schnell, d.h. im Zeitraum von 2 Stunden auf ein geringes Niveau herunterreguliert (15 A).
  • In 15 B sind die Expressionsprofile der folgenden Gene im Verlauf der SAM-Fermentation dargestellt:
    Figure 00170002
  • Die Gene, für die die vorstehenden systematischen Namen stehen, werden im folgenden Phase 2-Gene genannt.
  • Die Phase 2-Gene sind zum Zeitpunkt der Methionin-Zugabe (t = 0) gering exprimiert, werden jedoch ca. 1 Stunde nach Methionin-Zugabe induziert, verbleiben bis ca. 4 Stunden nach Methionin-Zugabe auf einem hohen Expressionsniveau und werden anschließend wieder auf ein niedriges Niveau herunterreguliert (15 B).
  • In 15 C sind die Expressionsprofile der folgenden Gene im Verlauf der SAM-Fermentation dargestellt:
    Figure 00180001
  • Die Gene, für die die vorstehenden systematischen Namen stehen, werden im folgenden Phase 3-Gene genannt.
  • Die Phase 3-Gene sind zum Zeitpunkt der Methionin-Zugabe (t = 0) gering exprimiert und werden ca. 1,5 Stunde nach Methionin-Zugabe auf ein je nach Gen mehr oder weniger hohes Expressionsniveau hochreguliert. Etwa 6,5 Stunden nach Methionin-Zugabe werden die Phase 3-Gene wieder auf ein niedriges Niveau herunterreguliert (15 C).
  • In 15 D sind die Expressionsprofile der folgenden Gene im Verlauf der SAM-Fermentation dargestellt:
    Figure 00180002
  • Die Gene, für die die vorstehenden systematischen Namen stehen, werden im folgenden Phase 4-Gene genannt.
  • Die Phase 4-Gene sind zum Zeitpunkt der Methionin-Zugabe (t = 0) zunächst gering exprimiert, werden dann jedoch induziert und erreichen ca. 1 Stunde nach Methionin-Zugabe ein recht hohes Expressionsniveau. Dieses hohe Expressionsniveau wird anschließend kurzzeitig wieder herunterreguliert, erreicht ca. 1,5 Stunden nach Methionin-Zugabe ein Minimum, um dann wieder während der folgenden 8 Stunden auf ein mittleres Expressionsniveau hochreguliert zu werden. Ein neues Expressionsminimum wird erst wieder 10 Stunden nach Methionin-Zugabe erreicht (15 D).
  • In 15 E sind die Expressionsprofile der folgenden Gene im Verlauf der SAM-Fermentation dargestellt:
    Figure 00180003
    Figure 00190001
  • Die Gene, für die die vorstehenden systematischen Namen stehen, werden im folgenden Phase 5-Gene genannt.
  • Die Phase 5-Gene sind zum Zeitpunkt der Methionin-Zugabe (t = 0) zunächst gering exprimiert, verbleiben in den ersten 8 Stunden nach Methionin-Zugabe auf diesem geringen Expressionsniveau und werden dann im Zeitraum zwischen 8 bis 11,5 Stunden auf ein hohes Expressionsniveau hochreguliert (15 E).
  • Die Promotoren der oben genannten Gene der Phasen 1 bis 5 haben gegenüber den klassischen induzierbaren Promotoren den Vorteil, daß sie zur Überexpression von Zielgenen in Hefestämmen während der industriellen SAM-Produktion kein von außen zugeführtes Induktionsmittel wie beispielsweise Kupfer-Ionen oder Isopropylthiogalaktosid (IPTG) etc. benötigen, um die Expression des Zielgens in Gang zu setzen. Da viele der gängigen Induktionsmittel wie beispielsweise IPTG relativ teuer sind, ist ihre Verwendung im großtechnischen Maßstab zur SAM-Produktion nicht praktikabel.
  • Daher betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den folgenden Schritten:
    • a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm,
    • b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der beiden Gene SAM1 und SAM2 oder eines ihrer Homologen unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Phase 2-, Phase 3-, der Phase 4 und der Phase 5-Gene überexprimiert.
  • Unter einem Homologen der Gene SAM1 und SAM2 wird ein Gen verstanden, das über seinen gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 %, bevorzugt mindestens 50 %, stärker bevorzugt mindestens 70 %, insbesondere mindestens 90 % Identität zu der DNA-Sequenz von SAM1 oder SAM2 besitzt. Die DNA-Sequenzen sind hierbei in den einschlägigen Datenbanken unter den in Tab. 1 aufgeführten Identifikationsnummern der einzelnen Gene zu finden.
  • Hierbei werden die Zielgene SAMT und/oder SAM2 unter der Kontrolle eines geeigneten regulierten bzw. regulierbaren Promotors überexprimiert, vorzugsweise aber unter der Kontrolle von solchen Promotoren, welche erst in späteren Phasen des SAM-Fermentationsprozesses, bevorzugt in Phase 2 bis 5, besonders bevorzugt in Phase 5 induziert werden. Aufgrund seiner starken Induktion ca. 8 Stunden nach Methionin-Zugabe – und damit am Ende der Anreicherungsphase – ist insbesondere der Promotor des PHO84-Gens (Gen YDL106C) als Phase 5-Promotor zur Überexpression der Zielgene SAM1 und/oder SAM2 während des industriellen SAM-Produktionsprozesses geeignet. Eine Hochregulation SAM1- und SAM2-Expression im Produktionsstamm kurz vor Ende der Anreicherungsphase, die durch Expression dieser Gene unter der Kontrolle des Pho84-Promotors erreicht werden kann, sollte sich weiterhin deswegen besonders positiv auf die SAM-Anreicherungs- und Speicher-Eigenschaften des Produktionsstammes auswirken, weil in diesem Fall eine große Menge der SAM-produzierenden Enzyme SAM1 und SAM2 direkt zu Beginn der nächsten Phase, der SAM-Fermentationsphase, in der besonders viel SAM produziert wird, zur Verfügung steht, ohne daß Herunterregulierungen der Enzym-Expressionen durch Rückkoppelungsmechanismen bereits stattfinden konnten.
  • In EP 0 647 712 A1 wird zwar bereits – wie oben bereits erwähnt – ein Verfahren zur Produktion von SAM durch Fermentation von Bakterien beschrieben, die die SAM-Synthetase der Ratte unter der Kontrolle des Ga14-Promoters, welcher durch die Zugabe von IPTG induziert werden kann, überexprimieren. Da IPTG aber sehr teuer ist, ist die Zugabe von IPTG zur Induktion der zeitlich regulierten Überexpression in großtechnischem Maßstab nicht praktikabel. Die zeitlich definierte Überexpression der Zielgene SAM1 und SAM2 unter der Kontrolle der Promotoren der durch Transkriptionsanalyse im Rahmen dieser Erfindung identifizierten Phase 1- bis Phase 5-Gene, insbesondere aber unter der Kontrolle des PHO84-Promotors, hat daher aufgund des fehlenden Erfordernisses der Induktion durch teure Induktionsmittel große Vorteile für die großtechnische SAM-Produktion.
  • Wie Tabelle 4 in Beispiel 5 zeigt, führt die Überexpression von SAM1 unter der Kontrolle des PHO84-Promotors durch Transformation des Hefestamms S47 mit dem Expressionsvektor pRS316-PHO84-SAM1 tatsächlich mit einer Steigerung der relativen SAM-Produktivität von 118 % zur einer deutlich verbesserten relativen SAM-Produktion im Vergleich zu nicht transformierten Hefen.
  • Auch die übrigen Zielgene aus Tabelle 1 (MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18) werden vorzugsweise unter der Kontrolle der Promotoren der Gene der Phasen 1 bis 5 zu entsprechend definierten Zeitpunkten in den eingesetzten Organismen überexprimiert, um die SAM-Produktions- und Speichereigenschaften dieser Organismen zu verbessern. Stärker bevorzugt ist auch hier die Überexpression der Zielgene MUP1, MUP3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18 unter der Kontrolle eines Promoters der Gene der Phasen 2, 3, 4 und 5, besonders bevorzugt ist die Überexpression der Zielgene unter der Kontrolle des Promoters des Phase 5- Gens PHO84.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus, der mindestens ein Gen ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen überexprimiert, sowie die Verwendung eines solchen Organismus zur großtechnischen Produktion von SAM.
  • Hierbei sind wieder solche Organismen bevorzugt, in denen mindestens eines der Zielgene aus Tabelle 1 unter der Kontrolle eines regulierbaren oder eines regulierten Promotors exprimiert wird. Als regulierte Promotoren zur zeitlich definierten Expression der Zielgene dienen hierbei wiederum vorzugsweise die Promotoren der Gene der Phasen 1 bis 5, besonders bevorzugt die Promotoren der Gene der Phase 2 bis 5, insbesondere aber der Promotor des Phase 5-Gens Pho84.
  • Ein weiterer besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind prokaryontische Organismen ausgewählt aus den Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas, die mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen überexprimieren.
  • Ein anderer besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind eukaryontische Organismen ausgewählt aus den Gattungen Aspergillus, Neurospora, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium, Saccharomyces und insbesondere aus der Gattung Saccharomyces cerevisae, die mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen überexprimieren. Die Verwendung der vorstehenden prokaryontischen und eukaryontischen Organismen zur Produktion von SAM ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin einen Expressionsvektor, der ein Gen ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen unter der Kontrolle eines Promotors umfaßt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Expressionsvektor eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAST, PHO2, GCN4, SIP18 oder eines ihrer Homologen unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Phase 1- bis Phase 5-Gene, besonders bevorzugt unter der Kontrolle des Promotors eines der Phase 2- bis Phase 5-Gene, insbesondere unter der Kontrolle des Promotors des Phase 5-Gens PHO84.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionsvektor, der ein Gen ausgewählt aus der Gruppe SAMT und SAM2 unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene aus der Gruppe der Phase 1- bis Phase 5-Gene umfaßt.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft einen Expressionsvektor umfassend eines der beiden Gene SAMT und SAM2 unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene aus der Gruppe der Phase 2- bis Phase 5-Gene, bevorzugter aus der Gruppe der Phase 5-Gene, insbesondere unter der Kontrolle des Promotors des Phase 5-Gens PHO84.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus, der mit mindestens einem der vorstehend benannten Expressionsvektoren transient oder permanent transformiert worden ist.
  • Die Transformation des prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus kann hierbei über alle bekannten Methoden erfolgen.
  • Unter einer transienten Transformation wird das Einbringen eines Expressionsvektors in einen Organismus verstanden, wobei die Expressionskassette des Expressionsvektors sich nicht in das Genom des transformierten Organismus integriert.
  • Bei einer permanenten Transformation wird die Expressionskassette des Expressionsvektors in das Genom des transformierten Organismus integriert.
  • Die Gene aus Tabelle 1 lassen sich aufgrund ihrer physiologischen Funktionen und aufgrund des Verlaufs ihrer Transkriptionsregulation während des SAM-Produktionsprozesses in die folgenden Untergruppen einteilen:
    • 1.) Gene mit einer physiologischen Funktion im SAM Stoffwechsel: 1.1.) SAMT, SAM2: Die physiologische Funktion der SAM-Synthetasen SAM1 und SAM2, die SAM durch Übertragung des Adenosylrests von Adenosintriphosphat (ATP) auf das Schwefel-Atom des Methionins biosynthetisch herstellen, wurde bereits vorstehend beschrieben. Im Verlauf des industriellen SAM-Produktionsprozesses wird die Expression beider Gene durch die Methioninzugabe schnell reprimiert (siehe 1a (SAMT ) und 1b (SAM2)) und bleibt auch während der gesamten Anreicherungsphase relativ gering. Eine spezifische Überexpression von SAM1 und SAM2 in den eingesetzten Hefestämmen während der späten Phasen der industriellen SAM-Produktion, insbesondere während der späten Anreicherungsphase und der SAM-Fermentationsphase, sollte somit die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften dieser Hefestämme verbessern. Zur Überexpression von SAM1 und SAM2 während der späten Phasen der industriellen SAM-Produktion eignet sich eine Expression unter der Kontrolle aller regulierten und regulierbaren Promotoren, die erst in späteren Phasen des SAM-Produktionsprozesses, am Ende des Anreicherungsprozesses und im SAM-Fermentationsprozess induziert werden. Zur Überexpression von SAM1 und SAM2 während der späten Phasen der industriellen SAM-Produktion eignet sich insbesondere der Promotor des Phase 5-Gens PHO84, der das nachgeschaltete Strukturgen, in diesem Falle die Strukturgene von SAM1 und SAM2 erst relativ spät – in der Endphase des Anreicherungprozesses – auf ein hohes Niveau hochreguliert. Diesen für PHO84 typischen Expressionsverlauf zeigt 9. Eine zu frühe Hochregulierung von SAM1 und SAM2 beispielsweise durch den Einsatz konstitutiver Promotoren zur Überexpression von SAM1 oder SAM2 könnte sich aufgrund eventuell existierender Rückkoppelungsmechanismen ebenfalls negativ auf die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften der Hefe-Produktionsstämme auswirken. 1.2.) MUP1, MUP3: Methionin wird mit Hilfe zweier spezifischer Methionintransporter in die Zelle aufgenommen. So kodiert das Gen MUP1 für den niedrigaffinen Methionintransporter und MUP3 kodiert für den hochaffinen Methionintransporter. Die Transkription beider Transportsysteme wird in Folge der starken Erhöhung der Methioninkonzentration zu Beginn des Anreicherungsprozesses zunächst reduziert und nach ca. 3 Stunden wieder erhöht (2a (MUP 1) und 2b (MUP3)). Aufgrund der anfänglichen Herunterregulierung der beiden Methionintransporter MUP1 und MUP3 in den eingesetzten Hefestämmen nach Methionin-Zugabe während des Anreicherungsprozesses der industriellen SAM-Produktion sollte die Überexpression von MUP1 und MUP3 in den eingesetzten Hefestämmen die SAM-Ausbeute erhöhen. 1.3. SAM3: Das SAM3-Gen kodiert für eine hochaffine S-Adenosylmethionin-Permease. Sie dient dem Transport von SAM in die Hefezelle. Aus diesem Grund sollte die gezielte Modifikation des Expressionsprofils des SAM3-Gens einen Einfluß auf die SAM-Produktions- und Speichereigenschaften der eingesetzten Mikroorganismen haben. Die Überexpression des SAM3-Gens sollte insbesondere zu einem gesteigerten Transport von extrazellulärem SAM in die Zellen führen und damit die intrazelluläre SAM-Konzentration im Vergleich zum nicht-transformierten Stamm erhöhen.
    • 2.) Gene mit einer Funktion als Regulator eines relevanten Stoffwechselwegs: 2.1.) MET28: Das MET28-Gen kodiert für ein Protein des Cbf1-Met4-Met28 Transkriptionsaktivatorkomplexes, der die Methionin-Biosynthese und auch die SAM-Biosynthese in Abwesenheit von Methionin aktiviert. Die Expression des Gens wird unmittelbar nach Zugabe von Methionin reduziert und innerhalb weniger Minuten wieder induziert (3). Das Verhindern der anfänglichen Herunterregulation von MET28 unmittelbar nach Zugabe von Methionin während der industriellen SAM-Produktion durch Überexpression von MET28 sollte in den eingesetzten Hefestämmen zu verbesserten SAM-Produktions-Eigenschaften führen. 2.2.) BAS1, PHO2: Verschiedene Enzyme des Purin-Biosynthese-Stoffwechsels werden unmittelbar nach Zugabe von Methionin im industriellen SAM-Produktionsprozess induziert wie 4 zeigt. Diese Induktion könnte auf einem Mangel an intrazellulärem Adenin in Folge der erhöhten Verwertung von ATP für die SAM-Biosynthesereaktion beruhen. Es wird daher vermutet, daß die Purinbiosynthese für die SAM-Synthese limitierend sein könnte. Die Überexpression der Transkriptionsaktivatoren dieser Enzyme des Purin-Biosynthese-Stoffwechsels sollte daher zur Überexpression der Purinbiosynthesegene führen, eine Erhöhung der Adeninsynthese bewirken und somit letztlich die SAM-Produktion in der Hefe erhöhen. Die Gene BAS1 und PHO2 kodieren für solche Transkriptionsaktivatoren der Enzyme der Purinbiosynthese. Ihre Überexpression sollte zu einer Steigerung der SAM-Produktions- und Speichereigenschaften der eingesetzten Mikroorganismen führen. 2.3.) GCN4: Ähnlich wie die Gene der Enzyme der Purinbiosynthese werden auch die Gene der Aminosäurebiosynthese unmittelbar nach Methionin-Zugabe induziert. Das Gen GCN4 kodiert für einen Transkriptionsaktivator, der die Gene der Aminosäurebiosynthese, d.h. unter anderem auch die der Methionin-Biosynthese, und der Purinbiosynthese induziert. Die Überexpression von. GCN4 in den eingesetzten Hefestämmen sollte daher eine Erhöhung der SAM-Produktion in diesen Stämmen zur Folge haben.
    • 3.) Gene, die allein aufgrund ihres Expressionsprofils während des SAM-Produktionsprozesses, zur Überexpression in den eingesetzten Hefestämmen ausgewählt wurden: SIP18: Das Gen SIP18 kodiert für ein Protein mit bislang unbekannter Funktion. Das SIP18-Protein gehört zur Gruppe der sogenannten Hydrophiline, die durch einen hohen Glycingehalt von mehr als 8 % gekennzeichnet sind. Von SIP18 konnte gezeigt werden, daß es durch osmotischen Stress induziert wird. Während des Anreicherungsprozesses erfolgt eine starke Induktion des SIP18 Gens 3 bis 5 Stunden nach der Zugabe von Methionin. Die Expression bleibt danach bis zum Ende des Prozesses auf einem relativ hohen Niveau (6). Die Modifikation des Expressionsverlaufs des SIP18-Gens sollte demnach einen Einfluß auf die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften der eingesetzten Hefestämme haben. Insbesondere ist anzunehmen, daß eine Überexpression von SIP18 in den eingesetzten Hefestämmen nach Methionin-Zugabe die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften dieser Stämme verbessern sollten.
    Figure 00260001
    Tabelle 2: Stammverbesserung durch Inaktivierung bestimmter Zielgene
  • Tabelle 2 stellt die zweite erfindungsgemäße Gruppe von Genen dar, die – nach dem Verlauf ihres Expressionsprofils während des SAM-Produktionsprozesses zu beurteilen – in den zur SAM-Produktion eingesetzten Hefestämmen inaktiviert werden müssen, um die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften der Stämme zu verbessern. Auch die in Tabelle 2 aufgeführten Gene sind durch ihre systematischen Namen eindeutig charakterisiert.
  • Die Gene aus Tabelle 2 werden im Gegensatz zu den Genen aus Tabelle 1 in der Regel direkt nach Zugabe des Methionins während des industriellen SAM-Produktionsprozesses induziert.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von SAM mit den folgenden Schritten:
    • a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm,
    • b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  • Die Inaktivierung der genomischen Kopie oder bei diploiden Stämmen der beiden genomischen Kopien eines solchen Gens kann durch vollständige oder teilweise Ersetzung des kodierenden Bereichs des Gens durch einen Selektionsmarker erfolgen, ein Beispiel für eine solche Technik wird bei Wach et al. 1994 (Yeast 10, 1793-1808) beschrieben. Die Inaktivierung kann jedoch auch durch Interruption des Gens oder durch andere Techniken erfolgen (Antisense RNA Technik, spezifische Modifikation oder spezifische Proteolyse).
  • Unter einer Inaktivierung eines bestimmten Gens versteht man insbesondere auch die Inaktivierung lediglich einer Kopie dieses Gens im Genom, wobei weitere Kopien dieses Gens intakt bleiben können.
  • Als Inaktivierung eines Gens ist dabei auch die partielle Inaktivierung zu verstehen. Für eine solche partielle Inaktivierung werden bevorzugt die oben genannten Techniken eingesetzt.
  • Eine partielle Inaktivierung eines bestimmten Gens kann insbesondere durch die Verminderung der Expression des Gens durch Ersetzen seines natürlichen Promotors gegen einen anderen Promotor, der zur Reduktion der Genexpression im Vergleich zur natürlichen Expression unter gleichen Bedingungen führt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Verfahrens wird ein Produktionsstamm verwendet, in dem mindestens das Gen PEM1 inaktiviert ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Verfahrens wird ein Produktionsstamm verwendet, in dem die Inaktivierung der obigen Gene (Gene aus Tabelle 2) mit den Überexpressionen der Gene aus Tabelle 1 kombiniert wird.
  • Als Produktionsstamm wird vorzugsweise ein Prokaryont ausgewählt aus den Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas oder ein Eukaryont ausgewählt aus den Gattungen Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium, bevorzugter aus der Gattung Saccharomyces cerevisae eingesetzt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die vorstehend genannten Produktionsstämme, die prokaryontische oder eukaryontische Organismen sind und in denen mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist, sowie deren Verwendung zur Produktion von SAM.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen prokaryontische Organismen aus den Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas, in denen mindestens das PEM1-Gen inaktiviert ist oder auch eukaryontische Organismen ausgewählt aus den Gattungen Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium, bevorzugter aus der Gattung Saccharomyces cerevisae, in denen mindestens das PEM1-Gen, das für eine Phosphatidylethanolamine-N-Methyltransferase kodiert, inaktiviert ist, sowie die Verwendung dieser Organismen zur technischen SAM-Produktion.
  • Im Anschluß an die Identifikation der Kandidaten-Gene aus Tabelle 2, deren Expressionsprofil und physiologische Funktionen für ihre Inaktivierung in den eingesetzten Hefe-Stämmen sprechen, wurden Deletionsmutanten des Laborhefestammes BY4743 hergestellt, in denen jeweils eines der entsprechenden Kandidaten-Gene inaktiviert wurde (Winzeler et al., Science, 285 (1999), 901 – 906, Beispiel 4). Die einzelnen Hefe-Deletionsmutanten wurden anschließend jeweils als Produktionsstämme für die technische SAM-Produktion eingesetzt und die relative SAM-Produktivität wurde für die verschiedenen Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp-Stamm BY4743 bestimmt.
    Figure 00290001
    Tabelle 3: SAM Produktivität verschiedener Deletionsmutanten
  • Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse dieser Vergleiche der einzelnen Deletionsmutanten im Hinblick auf ihre SAM-Produktivität: Die Deletionsmutanten für die Zielgene PEM1, ERG6, HMT1, SPE2, BIO3, SNQ1 und ALD6 zeigen gegenüber dem Wildtyp-Stamm mit SAM-Produktivitätssteigerungen zwischen 112 % bis 217 % alle signifikante Verbesserungen bezüglich ihrer SAM-Produktions- und Speichereigenschaften.
  • Insbesondere die Deletionsmutante BY4743-ΔPEM1, in der das PEM1-Gen inaktiviert ist, zeigt mit einer Steigerung der relativen SAM-Produktivität von 217 % gegenüber dem Wildtypstamm erheblich verbesserte SAM-Produktions- und -Speicher-Eigenschaften.
  • Demnach betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von SAM mit den bereits definierten Verfahrensschritten, wobei als Produktionsstamm ein Organismus eingesetzt wird, in dem mindestens das PEM1-Gen inaktiviert ist.
  • Das Zielgen MIG1 aus Tabelle 2 ist ein allgemeiner Repressor der Katabolitrepression und reprimiert in Anwesenheit höherer Glucose-Konzentrationen die Atmung und damit auch eine der wichtigsten Adenosintriphosphat-Quellen (ATP-Quellen) der Zelle. Die Inaktivierung von MIG1 in der Zelle führt zumindest zur partiellen Derepression verschiedener Gene des Zitronensäure-Zyklus und der Atmung und damit letztlich wieder zu einer größeren Anreicherung an ATP in der Zelle. Somit könnte die Inaktivierung von MIG1 eine Steigerung der SAM-Produktion in Anwesenheit hoher Methioninkonzentrationen zur Folge haben.
  • Das Zielgen SNQ1 aus Tabelle 2 kodiert für ein membranlokalisiertes Transportprotein. Dieses Transportprotein ist Mitglied der DHA14-Familie der "Multidrug Efflux"-Proteine. Es war bisher nur bekannt, dass dieser Transporter durch Aminotriazol und Glucose induziert wird. Im industriellen SAM-Produktionsprozess wird das Gen SNQ1 ca. 1,5 Stunden nach Methionin-Zugabe deutlich induziert. Die Induktion wird nach etwa einer weiteren Stunde wieder aufgehoben und das Gen wird im weiteren Verlauf relativ schwach exprimiert (7). Die Modifikation des Expressionsverlaufs des SNQ1-Gens sollte demnach einen Einfluß auf die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften der eingesetzten Hefestämme haben. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, zeigt der Hefestamm BY7473, in dem SNQ1 inaktiviert ist, mit einer auf 112 % gesteigerten relativen SAM-Produktion im Vergleich zu Wildtyp-Stamm tatsächlich deutlich verbesserte SAM-Produktions- und -Speichereigenschaften.
  • Das Zielgen ALD6 aus Tabelle 2 kodiert für eine zytoplasmatische Aldehyd Dehydrogenase, die bei der Synthese von zytoplasmatischem Acetyl-CoA eine wichtige Rolle spielt. Die Expression des ALD6-Gens im Verlauf der industriellen SAM-Produktion ähnelt stark dem Verlauf der Gene, die für Enzyme der Methionin-Biosynthese kodieren. Das ALD6-Gen wird sofort nach Zugabe von Methionin reprimiert und die Expression des Gens bleibt über den weiteren Verlauf der Anreicherungsphase schwach (5). Die Modifikation des Expressionsverlaufs des ALD6-Gens sollte demnach einen Einfluß auf die SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften der eingesetzten Hefestämme haben.
  • Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, zeigt der Hefestamm BY7473, in dem ALD6 inaktiviert ist, mit einer auf 112 % gesteigerten relativen SAM-Produktion im Vergleich zu Wildtyp-Stamm tatsächlich deutlich verbesserte SAM-Produktions- und Speichereigenschaften.
  • Die übrigen Gene aus Tabelle 2 sind Gene, deren Genprodukte eine wichtige Rolle beim Abbau von SAM spielen (Enzyme des SAM-Katabolismus). Durch die starke intrazelluläre SAM-Anreicherung nach dem Methionin-Puls kann es zur Induktion der SAM-Abbau-Enzyme in der Hefezellen – und damit wieder zu einem verstärkten Abbau des zunächst synthetisierten SAM kommen. Dementsprechend spricht also auch die katalytische Funktion der meisten Gene aus Tabelle 2 dafür, daß diese Gene zur Verbesserung der SAM-Produktions- und Speicher-Eigenschaften der eingesetzten Hefestämme inaktiviert werden müssen, wie die Ergebnisse aus Tabelle 3 bestätigen.
  • Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.
  • Beispiel 1: Herstellung von Hefe-DNA-Arrays
  • Verschiedene Methoden sind zur Herstellung von Arrays aus biologischen Makromolekülen verfügbar, z. B. zur Herstellung von Arrays von Nukleinsäuremolekülen oder Proteinen.
  • Ein DNA-Array wird im allgemeinen hergestellt, indem gleiche Mengen von definierten Nukleinsäuren einer Sorte mit einer Pipettiervorrichtung jeweils auf eine definierte Position einer rasterartigen Oberfläche aufgebracht werden.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden DNA-Arrays verwendet, die dadurch charakterisiert sind, dass für nahezu alle bekannten 6200 Gene der Hefe Saccharomyces cerevisiae Gen-spezifische PCR-Produkte an definierten Orten auf einer positiv geladenen Nylonmembran (z.B. Hybond N+) fixiert wurden.
  • Zur Herstellung der PCR-Produkte wurde zunächst eine PCR durchgeführt mit Hilfe von Primerpaaren, die eine spezifische Amplifikation nahezu aller identifizierten offenen Leseraster (ORF) der Hefe S. cerevisiae erlauben. Diese Primer können anhand der veröffentlichten Genomsquenz von Saccharomyces cerevisiae definiert werden, sie sind auch kommerziell erhältlich, so z. B. bei Invitrogen Ltd, Scotland. Die PCR-Produkte wurden im Agarosegel auf Qualität und Quantität überprüft. Danach wurden sie direkt mit Hilfe eines Spottingroboters (z.B. Microgrid II, Biorobotics, Cambridge, UK auf die Oberfläche des Filters aufgebracht. Anschließend wurden die DNA-Proben alkalisch denaturiert und durch UV-, oder Hitzebehandlung auf der Oberfläche fixiert.
  • Beispiel 2: Transkriptionsanalyse von Hefe
    • 2.1. Zellkultivierung in industriellem Maßstab Die Kultivierung der verwendeten Hefestämme erfolgte unter Bedingungen, in denen SAM intrazellulär angereichert wird. Der gesamte industrielle SAM-Produktionsprozess wird in zwei Teilprozesse gegliedert. Der erste Teilprozess wird als Anreicherungsprozess bezeichnet. Er ist dadurch chaxakterisiert, dass die Zellen in einem komplexen Medium mit Melasse als Kohlenstoff- und Energiequelle bei 30°C und starker Belüftung gezüchtet werden. Die erste Phase des Anreicherungsprozesses ist durch eine starke Biomasseproduktion gekennzeichnet, an die sich nach Zugabe von Methionin die zweite Phase des Anreicherungsprozesses, gekennzeichnet durch die intrazelluläre Anreicherung von SAM anschließt. Die erste Phase des Anreicherungsprozesses dauert ca. 20 Stunden. Während dieser Phase erfolgt die Produktion von Biomasse durch Fütterung von industriellen Substraten (z. B. Melasse, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Biotin). Die zweite Phase des Anreicherungsprozesses wird mit der Zugabe von Methionin in einer geeigneten Konzentration eingeleitet. Danach erfolgt die Anreicherung von intrazellulärem SAM. Am Ende des Anreicherungsprozesses werden die mit SAM angereicherten Zellen konzentriert, gewaschen und für den nächsten Teilprozess, die SAM-Fermentation, bereitgestellt. Die SAM-Fermentation ist dadurch gekennzeichnet, dass Methionin intrazellulär zu SAM umgesetzt wird. Diese Umsetzung ist im wesentlichen nicht mit einer Biomasseproduktion verbunden. Die Nährlösung in der SAM-Fermentationsphase besteht neben Glucose und Methionin aus verschiedenen Salzen, z. B. Ammoniumphosphat, Ammoniumsulphat und Magnesiumsulphat. Das Medium kann z. B. wie bei Schlenk beschrieben (Enzymologica 29, 238 (1965)) hergestellt werden.
    • 2.2. Probennahme und Präparation von RNA Zur Analyse der Transkriptionsprofile wurden zunächst im Anreicherungsprozess unmittelbar vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von Methionin je 2 ml Kulturmedium entnommen. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert und sofort bei –40°C eingefroren. Die RNA-Präparation erfolgte nach bekannten Protokollen (z.B. Rneasy Protokoll, Qiagen GmBH, Hilden).
    • 2.3. Hybridisierung und Datenauswertung Zur Hybridisierung der aus den Kulturproben gewonnenen RNA mit den Hefe-DNA-Arrays (siehe Beispiel 1) wurde die RNA zunächst durch reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und dabei mit 33P-dCTP radioaktiv markiert. Die so markierte cDNA wurde aufgereinigt und mit einem Hefearrayfilter hybridisiert. Für die Hybridisierung wurde die Proben-cDNA zunächst bei 99°C 5 min lang denaturiert. Die Hefe-DNA-Arrays wurden mindestens 2 Stunden in 5 x SSC, 0.5 % SDS, 5 x Denhardt's Reagenz (Sambrook et al., 1989) prähybridisiert. Die Probenhybridisierung erfolgte in demselben Puffer für 20 Std. Danach wurden die Filter kurz mit 2 x Waschpuffer abgespült (2 x SSC, 0,1 % SDS), anschließend wurden sie 2 x 15 min bei 65 °C mit 2 x Waschpuffer sowie 2 x 15 min bei 65 °C mit 0.2 x Waschpuffer (0.2 x SSC, 0.1 % SDS) gewaschen. Die Signaldetektion erfolgte mit einem Fluoreszenz- und Radioisotop-Image-Analyser (Fujifilm FLA2000, Fuji Photo Film Co.). Die Bilder wurden direkt in eine Software zur Identifizierung und Quantifizierung der Signale importiert (Array Vision software, Imaging Research Inc., Ca). Zur weiteren Analyse wurden die Daten in geeignete Software importiert (Genespring Software, Silicon Genetics, USA), die eine weitere Auswertung der Daten ermöglichte. Zum Vergleich der Daten verschiedener Filter wurden die Signal-Intensitäten durch Division durch die mittleren Intensitäten aller Signale normalisiert. Die Signal-Intensitäten eines Gens wurden für die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommenen Proben miteinander verglichen. Unter Verwendung verschiedener mathematischer Algorithmen wurden die Expressionsmuster aller detektierbaren Gene miteinander verglichen und Gene, die ähnliche Muster aufwiesen, wurden gleichen Gruppen zugeordnet (siehe z. B. 4).
  • Beispiel 3: Transformation von Hefe
  • Die Transformation von Hefezellen der Stämme Saccharomyces cerevisiae var. sake K6 und Saccharomyces cerevisiae S47 mit den beschriebenen Expressionsvektoren erfolgte nach der sogenannten Lithium-Acetat-Methode nach Gietz et al. (1992. Nucleic Acid Res. 20, 1425).
  • Beispiel 4: Geninaktivierung durch genomische Deletion in Hefe
  • Die Inaktivierung chromosomaler Kopien der in Tabelle 2 aufgelisteten Zielgene erfolgte mit Hilfe des Plasmids pFA6-kanMX4 nach der von Wach et al. beschriebenen Methode (1994, Yeast, 10(13):1793-808). Die Transformation von Hefezellen erfolgte nach Gietz et al. (1992. Nucleic Acid Res. 20, 1425). Die Transformanten wurden unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen kultiviert und das intrazellulär akkumulierte SAM wurde analysiert.
  • Tabelle 3 zeigt die relative SAM-Produktivität für verschiedene Deletionsmutanten im Laborstamm BY4743.
  • Beispiel 5: Konstruktion eines Expressionsplasmids
  • Zur Konstruktion eines Expressionsplasmids erfolgte zunächst die Klonierung des KanMX-Selektionsmarkers aus Plasmid pFA6-kanMX4 (10 , Wach et al., 1994) in Hefevektor pRS316 (11, Sikorski und Hieter, 1989, Genetics 122, 19-27). Hierzu wurden bekannte Methoden der Molekularbiologie verwendet (J. Sambrook ; E. F. Fritsch; T. Maniatis. 1989 – 2nd edition, Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press). Zur Insertion einer Expressionkassette in den resultierenden Vektor pRS316-kanMX (12) wurde zunächst der Promotorbereich des ADHI -Gens mittels PCR-Amplifikation aus genomischer DNA des Hefestamms S288C amplifiziert und in diesen Vektor in geeignete Restriktionsschnittstellen eingefügt.
  • Anschließend wurde der Terminatorbereich des chromosomalen ADHI -Gens des Hefestamms S288C mittels PCR amplifiziert und zum ADH1-Promotorbereich benachbart in den Vektor pRS316-kanMX-ADHlpro kloniert. Die beiden Fragmente sind in dem resultierenden Vektor pRS316-kanMX-ADHlproter in der gleichen Orientierung kloniert und durch einen Polylinker, d. h. durch ein Oligonukleotid, das mehrere im Vektor singulär auftretende Restriktionsschnittstellen enthält, verbunden. Diese Konstruktion ermöglicht die Insertion der kodierenden Region von Zielgenen zwischen den ADHI-Promotor und den ADH1-Terminator in der Art, dass nach Transformation eines Hefestammes eine Expression des Zielgens vom Vektor aus unter Kontrolle des ADH1-Promotors und des ADH1-Terminators erfolgen kann. Die Konstruktion ist ausserdem dazu geeignet, den Promotor des ADH1-Gens durch andere Promotorbereiche zu ersetzen und die Expression des Zielgens gezielt beeinflussen zu können. Z. B. wurde in einer weiteren Ausführung des Expressionsvektors der ADH1-Promotorbereich durch ein etwa 1000 Basenpaar langes Fragment des Promotorbereichs des PHO84 Gens ersetzt (13). Mit diesem Vektor ist es möglich, die Expression des Zielgens in Abhängigkeit des PHO84-Promoters zu regulieren und damit das Zielgen gezielt in der letzten Phase des SAM-Produktionsprozesses zu induzieren (9). Auf diese Art läßt sich der ADH1-Promotorbereich auch durch die übrigen vorstehend beschriebenen Promotoren austauschen. Der ADH1-Promotorbereich kann insbesondere durch die Promotorbereiche der vorstehend beschriebenen Gene der Phasen 1 bis 5 ausgetauscht werden, die jeweils in den in 15 A bis E definierten Prozessphasen induziert werden, um die Überexpression in definierten Phasen des SAM-Produktionsprozesses zu ermöglichen.
  • In einer Ausführung dieses Patents erfolgte die Klonierung des kodierenden Bereichs des Gens SAM1 in den Linker zwischen PHO84-Promotor und den ADH1-Terminator des Plasmids pRS316-PH084pro-ADH1ter. Hierzu erfolgte die Amplifikation des kodierenden Bereichs des Gens mittels PCR mit spezifischen Primern. Das resultierende Fragment wurde nach Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen in den geöffneten Vektor ligiert. Danach wurden die Hefestämme Saccharomyces cerevisiae var. sake K6 und Saccharomyces cerevisiae S47 mit dem resultierenden Plasmid pRS316-PHO84-SAM1 (14) transformiert. Die Transformation von Hefezellen erfolgte nach der LiAc-Methode nach Schiestl und Gietz (siehe Beispiel 3). Die Transformanten wurden unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen kultiviert und das intrazellulär akkumulierte SAM wurde analysiert. Die Transformante wies unter diesen Bedingungen eine deutlich erhöhte SAM-Produktion auf (siehe Tabelle 4).
    Figure 00350001
    Tabelle 4: Produktion von SAM durch die Transformante S47-pRS316-PHO84-SAM1
  • In einer weiteren Ausführung wurde das SAM2-Gen anstelle des SAMT Gens in den Expressionsvektor kloniert und der Effekt der SAM2-Überxpression in transformierten Hefezellen wurde analog dem für SAMT beschriebenen Verfahren überprüft.
  • Weiterhin wurde der kodierende Bereich aller in Tabelle 1 aufgeführten Gene in den Expressionsvektor kloniert und der Effekt der Überexpression dieser Gene unter der Kontrolle des ADHI-Promotors wurde in den Transformanten überprüft.
  • Die unterschiedlichen Zielgene wurden ebenfalls unter der Kontrolle des Promotors des Phase 5-Gens PHO84-Gens exprimiert.
  • Beispiel 6: Kultivierung von transformierten Hefen zur Produktion von SAM
  • Die Kultivierung der Hefestämme zur Produktion von SAM unter Laborbedingungen kann in verschiedenen Medien erfolgen, die alle notwendigen Mineralsalze, Spurenelemente, Vitamine sowie eine fermentierbare Kohlenstoffquelle wie z.B. Glucose, Maltose, Galactose, Melasse, Äthanol oder andere enthalten. In der vorliegenden Erfindung wurde die Hefe in Medium kultiviert, das 1 % (w/v) Yeast Extract, 2 % Bacto Pepton (w/v) und 2 % Glucose enthielt. Zur Stabilisierung der Plasmide in transformierten Hefen wurde dem Medium noch die 200 mg/l G418 beigefügt. Zur Anreicherung von SAM wurden diesem Medium noch 6 g/l D/L Methionin hinzugefügt. Die Hefen wurden unter starker Belüftung mindestens 20 Stunden bei 28°C geschüttelt. Das SAM kann danach in einem weiteren Verfahrensschritt nach bekannten Methoden aus der Kultur isoliert werden (Schlenk et de Palma, J. Biol. Chem. 1957, 229: 1037-50).
  • Eine bevorzugte Methode zur Isolierung des intrazellulär akkumulierten SAM aus den Zellen des Produktionsstammes, vorzugsweise aus den Hefezellen, ist der Zellaufschluß durch Säureextraktion. Hierbei wird die Hefekultur vorzugsweise mit einem 1/50 ihres Volumens 17,5 %iger Schwefelsäure versetzt (vorzugsweise 20 μ1 17,5%ige Schwefelsäure auf 1 ml Hefekultur), während einiger Sekunden bei 95 °C inkubiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Der Zellextrakt wird anschließend durch Filtration über einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 μm filtriert. Das Filtrat kann danach zur Bestimmung der SAM-Konzentration mit Hilfe geeigneter Methoden verwendet werden.
  • Alternativ kann die Isolierung des intrazellulär akkumulierten SAM aus den Zellen des Produktionsstammes im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch mittels einer der in US 4,621,056 offenbarten Isolationsverfahren erfolgen, so vorzugsweise auch durch Behandlung der (Hefe)-Kultur mit Wasser und Ethylacetat für 15 bis 45 min, vorzugsweise für 30 min und anschließend mit Schwefelsäure mit einer Normalität zwischen 0,1 N bis 0,5 N für 1 bis 2 Stunden, vorzugsweise für 1,5 Stunden bei einer geeigneten Temperatur, die die Zelllyse und Extraktion des intrazellulär angereicherten SAMs in den Zell-Überstand verursacht.
  • Im Anschluß an die Isolierung des vom Produktionsstamm hergestellten SAMs durch die oben genannten Verfahren kann weiterhin eine Aufreinigung des SAMs vorzugsweise durch Ultrafiltration des Lysats, durch Chromatograpie, insbesondere durch Innenaustausch- oder Absorptionschromatographie, erfolgen. Weiterhin kann die weitere Aufreinigung bzw. Aufkonzentration des SAM durch reverse Osmose oder durch Gefriertrocknung der konzentrierten wäßrigen Lösung des SAM-Salzes erfolgen.
  • Isolierungsschritte durch Zellaufschluß für das vom Produktionsstamm hergestellte SAM, sowie Aufreinigungs- und Konzentrationsschritte für das hergestellte SAM wie in US 4,621,056 beschrieben sind damit ein integraler Bestandteil der vorliegenden Erfindung und durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Beisiel 7: Bestimmung der SAM Konzentration
  • Verschiedene HPLC-Protokolle können zur Bestimmung der intrazellulären SAM-Konzentration verwendet werden ( US 5 100 786 ) Auch andere Methoden zur Bestimmung der intrazellulären SAM-Konzentration sind bekannt (Shapiro und Ehninger, 1966, Anal. Biochem. 15: 323-333).
  • Die Erfindung wird weiterhin durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert.
  • Figuren:
  • 1: Transkriptionsverlauf der Gene SAMT (1a ) und SAM2 (1b ) während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 2: Transkriptionsverlauf der Gene MUP1 (2a) und MUP3 (2b) während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 3: Transkriptionsverlauf des MET28-Gens während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 4: Transkriptionsverlauf verschiedener Gene der Purinbiosynthese während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0) '
  • 5: Transkriptionsverlauf des ALD6-Gens während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 6: Transkriptionsverlauf des SIP18-Gens während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 7: Transkriptionsverlauf des SNQ1-Gens während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 8: Transkriptionsverlauf des PET56-Gens während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 9: Transkriptionsverlauf des PHO84 Gens während der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h); Zeitpunkt der Methionin-Zugabe t = 0)
  • 10: Restriktionskarte des Plasmids pFA6-kanMX4
  • 11: Restriktionskarte des Plasmids pRS316
  • 12: Restriktionskarte des Plasmids pRS316-kanMX
  • 13: Restriktionskarte des Plasmids pRS316-PHO84pro-ADH1ter
  • 14: Restriktionskarte des Plasmids pRS-PHO84-SAM1
  • 15: Übersicht über die unterschiedlichen Prozessphasen der Anreicherungsphase (I = Expressionshöhe des Gens; t = Zeit in Stunden (h):
    • A: Transkriptionsverlauf der Phase 1-Gene mit einem Maximum der Expression im Zeitraum der Stunden 0 bis 2 der Anreicherungsphase
    • B: Transkriptionsverlauf der Phase 2-Gene mit einem Maximum der Expression im Zeitraum der Stunden 1 bis 4 der Anreicherungsphase
    • C: Transkriptionsverlauf der Phase 3-Gene mit einem Maximum der Expression im Zeitraum der Stunden 1,5 bis 6,5 derAnreicherungsphase
    • D: Transkriptionsverlauf der Phase 4-Gene mit einer hohen Expression im Zeitraum der Stunden 1,5 bis 10 derAnreicherungsphase
    • E: Transkriptionsverlauf der Phase 5-Gene mit einem Maximum der Expression im Zeitraum der Stunden 8 bis 11,5 derAnreicherungsphase, wobei jeweils zum Zeitpunkt t = 0 die Zugabe von Methionin erfolgt.

Claims (32)

  1. Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den folgenden Schritten: a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm, b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 und eines Homologen dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen dieser Gene besitzt, überexprimiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der prokaryontische oder eukaryontische Organismus mindestens eines der Gene nach Anspruch 1 unter der Kontrolle eines regulierbaren oder eines regulierten Promotors überexprimiert.
  3. Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-Methionin (SAM) mit den folgenden Schritten: a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm, b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, der mindestens eines der beiden Gene SAM1 und SAM2 oder ein Homologes dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen von SAM1 oder SAM2 besitzt, unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Phase 2-, Phase 3-, der Phase 4 und der Phase 5-Gene überexprimiert.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor des Phase 5-Gens Pho84 ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus zusätzlich mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  6. Verfahren zur Herstellung von SAM mit den folgenden Schritten: a) Durchführung des Anreicherungsprozesses und des SAM-Fermentationsprozesses zur Anreicherung von SAM im Produktionsstamm, b) gegebenenfalls Isolierung durch Aufschluß der Zellen und gegebenenfalls Aufreinigung des im Produktionsstamm angereicherten SAM, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Produktionsstamm ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus ist, in dem mindestens das Gen PEM1 inaktiviert ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der' Organismus ein Prokaryont ausgewählt aus den Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas oder ein Eukaryont ausgewählt aus den Gattungen Neurospora, Aspergillus, Saccharomyces, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Stamm der Spezies Saccharomyces cerevisae ist.
  10. Prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus, der mindestens ein Gen aus der Gruppe bestehend aus MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4, SIP18 und eines Homologen dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen dieser Gene besitzt, überexprimiert.
  11. Prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das mindestens eine Gen unter der Kontrolle eines regulierbaren oder eines regulierten Promoters überexprimiert wird.
  12. Prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus, der mindestens eines der beiden Gene SAMT und SAM2 oder ein Homologes dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen von SAM1 oder SAM2 besitzt, unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Phase 2, Phase 3-, der Phase 4 und der Phase 5-Gene überexprimiert.
  13. Organismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor des Phase 5-Gens Pho84 ist.
  14. Organismus nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich in dem Organismus mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQ5, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  15. Prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus, in dem mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  16. Organismus nach Anspruch 15, in dem mindestens das Gen PEM1 inaktiviert ist.
  17. Organismus nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der; Organismus ein Prokaryont ausgewählt aus den Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas oder ein Eukaryont ausgewählt aus den Gattungen Neurospora, Aspergillus, Saccharomyces, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium ist.
  18. Organismus nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Stamm aus der Spezies Saccharomyces cerevisiae ist.
  19. Verwendung eines prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus zur Herstellung von SAM, wobei der Organismus mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18 und eines Homologen dieser Gene, das über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen dieser Gene besitzt, überexprimiert.
  20. Verwendung eines Organismus nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das mindestens eine Gen unter der Kontrolle eines regulierbaren oder eines regulierten Promoters überexprimiert wird.
  21. Verwendung eines prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus zur Herstellung von SAM, wobei der Organismus mindestens eines der beiden Gene SAM1 und SAM2 oder ein Homologes dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen von SAM1 oder SAM2 besitzt, unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe der Phase 2-, Phase 3-, der Phase 4 und der Phase 5-Gene überexprimiert.
  22. Verwendung eines Organismus nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor des Phase 5-Gens Pho84 ist.
  23. Verwendung eines Organismus nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich in dem Organismus mindestens eine Kopie mindestens eines der Gene ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist.
  24. Verwendung eines prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus, in dem mindestens eine Kopie mindestens eines Gens ausgewählt aus der Gruppe MIG1, SPE2, BIO3, ABD1, ERG6, STE14, PEM1, CTM1, HSL7, COQS, HMT1, NOP2, DIM1, PET56, ALD6 und SNQ1 inaktiviert ist, zur Herstellung von SAM.
  25. Verwendung eines Organismus nach Anspruch 24, in dem mindestens das Gen PEM1 inaktiviert ist.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Prokaryont ausgewählt aus den Gattungen Corynebakterium, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Lactobacillus, Brevibakterium, Streptococcus, Lactocossus, Pseudomonas oder ein Eukaryont ausgewählt aus den Gattungen Neurospora, Aspergillus, Saccharomyces, Candida, Schizosaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hansenula, Brettanomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium ist.
  27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Stamm aus der Spezies Saccharomyces cerevisiae ist.
  28. Expressionsvektor, der ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MUP1, MUP3, SAM3, MET28, BAS1, PHO2, GCN4 und SIP18 und eines Homologen dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen dieser Gene besitzt, unter der Kontrolle eines Promotors umfaßt.
  29. Expressionsvektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor eines der Gene aus der Gruppe bestehend aus den Phase 2-, Phase 3-, Phase 4- und den Phase 5-Gene ist.
  30. Expressionsvektor nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor des Phase 5-Gens Pho84 ist.
  31. Expressionsvektor, der mindestens eines der beiden Gene SAM1 und SAM2 oder ein Homologes dieser Gene, welches über den gesamten kodierenden Bereich mindestens 30 % Identität mit den DNA-Sequenzen von SAM1 oder SAM2 besitzt, unter der Kontrolle des Promotors eines der Gene aus der Gruppe bestehend aus der Phase 2, Phase 3, der Phase 4- und der Phase 5-Gene umfaßt.
  32. Expressionsvektor nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß als Promoter der Promotor des Phase 5-Gens Pho84 eingesetzt wird.
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