ES2283906T3 - Variantes de 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa con una reducida inhibicion por l-serina, y genes que las codifican. - Google Patents
Variantes de 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa con una reducida inhibicion por l-serina, y genes que las codifican. Download PDFInfo
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Abstract
3-Fosfoglicerato - deshidrogenasa (PGD) que tiene una sensibilidad, disminuida en comparación con una PGD de tipo salvaje de Escherichia coli, frente a una inhibición por serina, con una secuencia de aminoácidos, que corresponde a la PGD de tipo salvaje de Escherichia coli (SEQ ID NO: 2) exceptuando a la posición 372, caracterizada porque en la posición 372 se encuentra un aminoácido seleccionado entre el conjunto formado por I, D, Y, G, S, E, R, K, P, H, W, F, A, N, Q, V, L, M y C.
Description
Variantes de la 3-fosfoglicerato
- deshidrogenasa con una reducida inhibición por
L-serina, y genes que las codifican.
El invento se refiere a variantes de la
3-fosfoglicerato - deshidrogenasa con una reducida
inhibición por L-serina, y a genes que las
codifican.
La preparación de los veinte aminoácidos
proteinógenos naturales es realizada hoy en día predominantemente
por fermentación de microorganismos. En este caso se aprovecha el
hecho de que los microorganismos disponen de correspondientes rutas
de biosíntesis para la síntesis de los aminoácidos naturales.
Tales rutas de biosíntesis están sujetas, sin
embargo en cepas de tipo salvaje, a un estricto control, que
garantiza que los aminoácidos se preparen solamente para el consumo
propio de la célula. Un importante mecanismo de control en muchas
biosíntesis es, por ejemplo, el fenómeno de la retroinhibición (o de
la inhibición por los productos finales). En este contexto, en la
mayor parte de los casos, la enzima de una ruta de biosíntesis, que
cataliza la reacción enzimática iniciadora de esta ruta de
biosíntesis, es inhibida por el producto final de la ruta de
biosíntesis. La inhibición tiene lugar en la mayor parte de los
casos mediante una fijación alostérica del producto final a la
enzima y produce una modificación de la conformación a un estado
inactivo. De esta manera se asegura que, en el caso de una
acumulación del producto final en la célula, la síntesis ulterior
sea reprimida por inhibición de la etapa iniciadora.
Una producción industrial eficiente de productos
del metabolismo (tales como p.ej. aminoácidos) es posible, por lo
tanto, solamente cuando las restricciones pueden ser suprimidas
mediante una retroinhibición de una ruta de metabolismo y por
consiguiente se hagan disponibles unos microorganismos que, al
contrario que los organismos de tipo salvaje, tengan un rendimiento
de producción drásticamente aumentado para la preparación del
deseado producto del metabolismo.
La familia de aminoácidos formada por los
fosfogliceratos es definida por el hecho de que se trata de unos
aminoácidos, que en su biosíntesis se derivan del ácido
3-fosfoglicérico. La trayectoria natural del
metabolismo conduce en este caso primeramente, a través de los
compuestos intermedios
3-fosfohidroxi-piruvato y
3-fosfo-L-serina, a
la L-serina. La L-serina puede ser
convertida adicionalmente en glicina, o respectivamente, a través de
O-acetil-serina, en
L-cisteína. También el L-triptófano
ha de contarse dentro de este grupo, puesto que asimismo se deriva
de la L-serina en la biosíntesis. Asimismo, los
aminoácidos no naturales, que se preparan de acuerdo con el
procedimiento descrito en la solicitud de patente de los EE.UU. US
2002/0039767 A1, han de asignarse a la familia de los
fosfogliceratos.
Los compuestos, que se derivan del metabolismo
de C1, muestran asimismo una dependencia con respecto de la
biosíntesis de los aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos.
Esto se basa en el hecho de que, al realizarse la conversión de
L-serina en glicina, el tetrahidrofolato actúa como
aceptor de grupos C1, y el tetrahidrofolato cargado participa, como
donante principal de grupos metilo, en el metabolismo de C1 en
muchas biosíntesis (p.ej. en las de L-metionina,
nucleótidos, ácido pantoténico, etc.). Conforme al invento, los
compuestos que se derivan del metabolismo de C1 son, por
consiguiente, de manera preferida compuestos que en su biosíntesis
dependen de una transferencia de grupos C1 a través del ácido
tetrahidrofólico.
La etapa iniciadora de la biosíntesis de
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos, es la oxidación
del ácido D-3-fosfoglicérico para
dar un 3-fosfohidroxi-piruvato, y es
catalizada por la enzima 3-fosfoglicerato -
deshidrogenasa (PGD) [EC 1.1.1.95]. Como aceptor para el equivalente
de reducción que resulta en la reacción sirve el NAD^{+}, que es
convertido en NADH/H^{+}.
Las enzimas del tipo de PGD son conocidas a
partir de los más diferentes microorganismos (p.ej. Rattus
norvegicus, Arabidopsis thaliana, Escherichia coli,
Bacillus subtilis). En este caso, los representantes
microbianos mejor caracterizados están sujetos a una
retroinhibición por medio de L-serina.
En el plano de la secuencia de aminoácidos, las
enzimas PGD microbianas son muy similares entre ellas en la parte
terminal de N (aminoácidos 1-340 de la secuencia de
E. coli), al contrario de lo cual la parte terminal de C
tiene solamente pequeñas similaridades. Precisamente en esta parte
terminal de C está localizado el dominio regulador, que es
responsable de la inhibición por serina
(Peters-Wendisch y colaboradores, 2002, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 60:437-441).
La PGD mejor caracterizada es la que procede de
Escherichia coli. La enzima fue investigada bioquímicamente
de una manera detallada (Dubrow & Pizer, 1977, J. Biol. Chem.
252, 1.527-1.538) y está sujeta a una
retroinhibición alostérica por L-serina con una
constante de inhibición K_{i} de 5 \muM.
Esta retroinhibición se opone a una producción
eficiente de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos, y
por lo tanto ya era una meta de los enfoques biológicos
moleculares.
Así, en el documento de solicitud de patente
europea EP0620853A se describen variantes de la PGD procedente de
Escherichia coli con una sensibilidad disminuida frente a la
inhibición por serina, que tiene una modificación en el 25%
terminal de C de la PGD de tipo salvaje (es decir en los aminoácidos
307-410), de manera preferida una modificación en
la región de los últimos 50 radicales (es decir, los aminoácidos
361-410). Las mutantes descritas se obtuvieron por
medio de una mutagénesis por engarzadores, es decir por simple
aprovechamiento de sitios presentes de corte por restricción entre
el gen de serA de E. coli, y por subsiguiente empleo de
engarzadores de oligonucleótidos con una longitud de
8-14 pares de bases.
Tales mutagénesis por engarzadores son sin
embargo problemáticas en la mayor parte de los casos, puesto que
por la incorporación, o respectivamente la deleción, de varios
radicales se modifica muy grandemente la estructura de la proteína
y de esta manera se influye negativamente sobre la actividad global
o la estabilidad de la proteína. Realmente, la mayor parte de las
mutantes descritas en el documento EP0620853A muestran una actividad
apenas
detectable.
detectable.
También en microorganismos corineformes se
llevaron a cabo mutagénesis en el gen de serA, que cumplen la misión
de una disminución de la sensibilidad de las PGD frente a la
inhibición por serina:
- -
- Peters-Wendisch y colaboradores, (2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:437-441) describen deleciones en el extremo terminal de C de la PGD de Corynebacterium glutamicum. También en este caso, las deleciones conducen a mermas parcialmente grandes de la actividad enzimática.
- -
- La solicitud EP0943687A2 describe un cambio del radical de ácido glutámico en la posición 325 de la PGD procedente de Brevibacterium flavum. Este radical se encuentra, en relación con la PGD de Escherichia coli, en una alineación con el algoritmo GAP del programa GCG (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin) ya en la parte terminal de C variable de la proteína, y se correlaciona con el radical de asparagina 364 de la proteína de Escherichia coli. Puesto que esta modificación está situada en la parte terminal de C variable de la PGD no es posible ninguna conclusión acerca de la proteína de Escherichia coli.
Fue misión del presente invento poner a
disposición variantes de la PGD de Escherichia coli, que
tengan una sensibilidad disminuida frente a una inhibición por
serina, en comparación con la PGD de tipo salvaje de Escherichia
coli, frente a una inhibición por serina.
El problema planteado por esta misión se
resuelve por medio de una PGD de acuerdo con la reivindicación
1.
Una PGD conforme al invento puede tener de
manera adicional la mutación D en la posición 349 cuando en la
posición 372 se encuentra el aminoácido I.
El invento se refiere además a una secuencia de
ADN que codifica la PGD conforme al invento de acuerdo con la
reivindicación 1. Este alelo de serA se diferencia del gen de la PGD
de Escherichia coli (gen de serA, SEQ ID NO: 1) por el hecho
de que el codón 372 codifica un aminoácido natural, con excepción de
la treonina.
De manera preferida, la actividad enzimática del
producto génico corresponde a más de un 10% de la actividad del
producto génico de tipo salvaje.
Conforme al invento, las variantes de PGD se
pueden producir con técnicas clásicas de la biología molecular.
Para esto, en los correspondientes codones se introducen mutaciones
en el gen de serA que codifica la PGD. Se conocen métodos
correspondientes para la introducción de mutaciones en posiciones
específicas dentro de un fragmento de ADN.
Como material de partida para la mutagénesis
sirve de manera preferida el ADN del gen de serA procedente de
E. coli. El gen de serA, que se ha de mutar, puede ser
codificado de modo cromosomal o extracromosomal. De manera
preferida, el gen de serA es amplificado sin embargo mediante una
reacción en cadena de polimerasa, y es clonado en un vector.
Mediante aplicación de los antes mencionados métodos de mutagénesis,
uno o varios nucleótidos de la secuencia de ADN son modificados de
tal manera que la PGD codificada tenga un cambio de aminoácidos en
la posición 349 ó 372, siendo la posición 1 la metionina iniciadora
procedente de SEQ ID NO: 1.
Estas mutaciones dan lugar a que la PGD
codificada posea una sensibilidad disminuida frente a la inhibición
por medio de L-serina (= resistencia a la
retroacción). En este caso es especialmente ventajoso el hecho de
que las variantes de PGD conformes al invento, en ausencia de
L-serina, tienen una actividad de más del 10%,
preferiblemente una actividad inalterada.
Para la determinación de la magnitud de la
resistencia a la retroacción de una variante de PGD conforme al
invento se puede usar cualquier método, que permita determinar la
actividad de la enzima en presencia de L-serina.
Por ejemplo, la determinación de la actividad de la PGD se puede
efectuar apoyándose en el método descrito por MacKitrick y Pizer
(1980, J. Bacteriol. 141 : 235-245). La actividad
enzimática es medida con ayuda de la retrorreacción en una tanda
que contiene un fosfohidroxipiruvato y NADH/H^{+}. La reacción es
iniciada por medio de la adición de una enzima y es vigilada en un
fotómetro espectral a través de la disminución de la extinción a
340 nm, que es provocada por oxidación del NADH/H^{+}. La
inhibición de la actividad de la PGD es ensayada en presencia de
diferentes concentraciones de L-serina en la tanda
de reacción. La actividad catalítica de las diferentes variantes de
PGD es determinada en presencia y ausencia de
L-serina, y a partir de esto se determina la
constante de inhibición K_{i}. La K_{i} describe aquella
concentración del inhibidor, en la que la actividad es solamente un
50% de la actividad, que se había determinado en ausencia del
inhibidor.
Las enzimas del tipo de PGD, conformes al
invento, se pueden utilizar, a causa de su resistencia a la
retroacción, para la preparación de aminoácidos de la familia de
los fosfogliceratos o de compuestos que se derivan del metabolismo
de C1. Para esto, los alelos de serA conformes al invento son
expresados en una cepa anfitriona.
La expresión de un alelo de serA conforme al
invento se puede efectuar bajo el control del promotor propio,
localizado delante del gen de serA, o mediante utilización de otros
sistemas promotores apropiados, que son conocidos para un experto
en la especialidad. En este caso, el correspondiente alelo puede
encontrarse por ejemplo bajo el control de un promotor de este
tipo, ya sea en una copia o en varias copias, en el cromosoma del
organismo anfitrión. Las estrategias para la integración de genes en
el cromosoma constituyen un estado de la técnica. De manera
preferida, el alelo de serA que se ha de expresar es sin embargo
clonado en un vector, preferiblemente en un
plásmido.
plásmido.
El invento se refiere por lo tanto también a un
vector, que está caracterizado porque contiene un alelo de serA
conforme al invento bajo el control funcional de un promotor.
Para la clonación de los alelos de serA
conformes al invento se pueden utilizar unos vectores, que ya
contienen unos elementos genéticos (p.ej. promotores constitutivos
o regulables, terminadores), que hacen posible una expresión ya sea
permanente, o una expresión controlada, inducible, del gen que
codifica la PGD. Además, en un vector de expresión se encuentran de
manera preferida otros elementos reguladores, tales como sitios de
fijación ribosomales y secuencias de terminación, así como
secuencias que codifican marcadores selectivos y/o genes
reporteros. La expresión de tales marcadores de selección facilita
la identificación de los transformantes. Como marcadores de
selección son apropiados unos genes que codifican una resistencia
frente a p.ej. ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina
u otros antibióticos. Cuando el alelo de serA conforme al invento
debe ser replicado de manera extracromosomal, el vector plásmido
debería contener de manera preferida un sitio de origen de la
replicación. Son especialmente preferidos unos vectores plásmidos
tales como por ejemplo los vectores de E. coli pACYC184,
pUC18, pQE-70, pBR322, pSC101 y sus derivados. Como
promotores inducibles son apropiados por ejemplo el promotor de
lac, tac, trc, lamdba PL, ara o tet, o secuencias que se derivan de
éstos.
Por lo demás, son especialmente preferidos unos
vectores plásmidos, que ya contienen un gen o alelo, cuyo empleo
conduce asimismo a una sobreproducción de aminoácidos de la familia
de los fosfogliceratos o respectivamente de compuestos que se
derivan del metabolismo de C1, tal como por ejemplo para la
producción de:
- -
- L-serina (p.ej. los genes de serB, serC, Exportcarrier (portadores de exportación) tal como se describe en el documento de solicitud de patente alemana DE10044831A1)
- -
- N-acetil-serina, O-acetil-serina, cistina, cisteína o derivados de cisteína (p.ej. alelos de cysE como se describen en el documento de solicitud de patente internacional WO 97/15673, genes de eflujo como se describen en el documento EP0885962A1, el gen de cysB como se describe en el documento de patente alemana DE19949579C1, el gen de yfiK como se describe en el documento DE10232930A)
- -
- L-triptófano (p.ej. alelos de trpE, como se describen en el documento EP0662143A)
- -
- ácido pantoténico (p.ej. como se describe en el documento WO02061108).
Tales vectores hacen posible la producción
directa de cepas de microorganismos conformes al invento, con un
alto rendimiento de producción, a partir de una cepa arbitraria de
microorganismos, puesto que un plásmido de este tipo produce
también la supresión de otras restricciones de la ruta de
metabolismo en un microorganismo.
Mediante un método habitual de transformación
(p.ej. una electroporación) los plásmidos que contienen un alelo de
serA, conformes al invento, se introducen en microorganismos y se
seleccionan por ejemplo mediante resistencia a antibióticos en
clones portadores de plásmidos.
El invento se refiere por consiguiente también a
un procedimiento para la producción de una cepa de microorganismos
conforme al invento, caracterizado porque en una cepa de
microorganismos se introduce un vector conforme al invento.
También es posible introducir vectores con un
alelo de serA conforme al invento en microorganismos, que por
ejemplo ya expresan cromosomalmente genes o alelos individuales o
varios de los genes o alelos arriba mencionados, y ya tienen una
sobreproducción de un producto de metabolismo. En tales casos,
mediante la introducción de un alelo de serA conforme al invento,
se puede aumentar de nuevo el rendimiento de producción.
Generalmente, como organismo anfitrión para
vectores conformes al invento son apropiados todos los organismos
que tienen la ruta de biosíntesis para aminoácidos de la familia de
los fosfogliceratos, que son accesibles a procedimientos de
recombinación y que son cultivables mediante fermentación. Tales
microorganismos pueden ser hongos, levaduras o bacterias. De manera
preferida, pasan a emplearse bacterias del grupo filogenético de
las Eubacterias. Se prefieren especialmente microorganismos de la
familia de las Enterobacteriaceas y en particular de la especie
Escherichia coli.
El invento se refiere, por consiguiente, además
a una cepa de microorganismos que es apropiada para la preparación
por fermentación de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos
o de sus derivados, o respectivamente de compuestos que se derivan
del metabolismo de C1, que está caracterizada porque ella posee una
PGD conforme al invento.
Un objeto adicional del invento es la
preparación de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos o
respectivamente de compuestos que se derivan del metabolismo de C1,
por cultivación de una cepa de microorganismos conforme al
invento.
Para esto, la cepa de microorganismos conforme
al invento se cultiva por ejemplo dentro de un fermentador en un
medio nutritivo, que contiene una apropiada fuente de carbono, y una
apropiada fuente de energía, así como otras sustancias
aditivas.
Las sustancias formadas durante la fermentación,
tales como por ejemplo L-fosfoserina,
L-serina,
O-acetil-L-serina,
L-cisteína, glicina, L-triptófano,
1,2,4-triazol-2-il-L-alanina,
L-metionina o ácido pantoténico, se pueden
purificar a continuación.
Los siguientes Ejemplos sirven para la
explicación adicional del invento. Todos los procedimientos
empleados de biología molecular, tales como una reacción en cadena
de polimerasa, un aislamiento y una purificación de ADN, una
modificación de un ADN mediante enzimas de restricción, el fragmento
de Klenow y una ligasa, transformación, etc., se llevaron a cabo
del modo conocido para un experto en la especialidad, descrito en la
bibliografía y recomendado por los respectivos fabricantes
productores.
El gen de serA procedente de la cepa W3110 de
Escherichia coli (American Type Culture Collection [Colección
Americana de Tipos de Cultivos], ATCC27325) fue amplificado con
ayuda de la reacción en cadena de polimerasa. Como cebadores
específicos sirvieron los oligonucleótidos
El resultante fragmento de ADN fue digerido con
las enzimas de restricción NdeI e HindIII y los extremos colgantes
en 5' fueron rellenados con una enzima de Klenow. A continuación, el
fragmento de ADN fue purificado con ayuda de una electroforesis en
gel de agarosa y fue aislado con el método de GeneClean (estuche de
GeneClean BIO101 Apartado de correos P.O.BOX 2284, La Jolla,
California, 92038-2284). La clonación del fragmento
de serA, obtenido de esta manera, se efectuó en el vector de
expresión pQE-70 (de Qiagen, Hilden, Alemania). Para
esto, el vector fue primeramente cortado con SphI y BamHI y el
extremo colgante en 3' fue separado por digestión con una enzima de
Klenow, o respectivamente el extremo colgante en 5' fue rellenado
con una enzima de Klenow. A continuación, el fragmento de vector
fue purificado y ligado con el fragmento de serA. El resultante
vector lleva la denominación pFL209. Después de la verificación de
la construcción artificial mediante una secuenciación, la cepa JM109
de Escherichia coli (de Stratagene, Amsterdam, Holanda) fue
transformada y se seleccionaron con ampicilina unos
correspondientes transformantes. La cepa bacteriana de
Escherichia coli JM109 / pFL209 fue depositada en la DSMZ
(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
[Colección Alemana para Microorganismos y Cultivos Celulares S.A.]
D-38142, Braunschweig] bajo el número DSM 15628 de
acuerdo con el convenio de Budapest.
La mutagénesis específica para un sitio en los
codones 349 y 372 del gen de serA fue llevada a cabo mediante una
reacción en cadena de polimerasa inversa. Como matriz sirvió el
vector pFL209, descrito en el Ejemplo 1. Para la mutagénesis del
codón 349 se utilizaron los cebadores
El producto obtenido de la PCR fue circularizado
por ligación y transformado en el seno de la cepa de E. coli
JM109. Mediante secuenciación se determinó finalmente la mutación en
el codón 349 y se comprobó si era correcta la secuencia
restante.
Para la mutagénesis del codón 372 se procedió en
principio de igual manera, pero se utilizaron los cebadores
Para la determinación de las actividades
enzimáticas de PGD y de la influencia de L-serina
sobre la actividad, se inocularon 100 ml de un medio LB (triptona
10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l), que adicionalmente
contenía 100 mg/l de ampicilina, con 2 ml de un cultivo durante una
noche de las cepas con los alelos de serA codificados por
plásmidos, y se incubaron en un dispositivo sacudidor a 30ºC y 150
rpm. En el caso de una densidad óptica de 1,0, se indujo la
expresión de serA mediante la adición de 0,4 mM de
isopropil-\beta-tiogalactósido y
el cultivo se incubó durante 3 horas adicionales. Las células se
cosecharon a continuación mediante una centrifugación, se lavaron y
se volvieron a suspender en 2 ml de un tampón (fosfato de K 100 mM,
de pH 7,0; MgCl_{2} 10 mM; ditiotreitol 1 mM). La disgregación de
las células se efectuó mediante una prensa French (de Spectronic
Instruments, Inc., Rochester, NY, EE.UU.) a una presión de 18.000
psi (1.260 kg/cm^{2}). Los extractos brutos fueron clarificados
mediante centrifugación a 30.000 xg y la actividad de PGD se
determinó con el ensayo de McKitrick y Pizer (1980, J. Bacteriol.
141 :
235-245).
235-245).
Las siguientes Tablas muestran la actividad de
PGD de diferentes mutantes así como las correspondientes constantes
de inhibición K_{i}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una combinación de mutaciones en el codón 349 o
respectivamente 372 debería mostrar si los cambios tienen un efecto
sinérgico sobre la resistencia a la retroacción. Para esto se usó un
sitio singular de corte por restricción con HindII entre los dos
sitios de mutación. Así, mediante restricción con
HindII-HindIII del vector con el alelo de serA20,
se aisló un fragmento de 183 pb (pares de bases), que corresponde al
extremo en 3' del gen de serA y que contiene la mutación en el
codón 372. Este fragmento fue clonado con el alelo de serA40 en un
vector asimismo digerido con HindII-BamHI, y de esta
manera se obtuvo un clon que representa una mutante doble. La
siguiente Tabla muestra los correspondientes datos enzimáticos.
<110> Consortium fuer elektrochemische
Industrie GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes de la
3-fosfoglicerato deshidrogenasa con inhibición
reducida por L-serina y genes que las codifican
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Mutantes de serA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1230)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 410
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR
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<400> 3
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\hfill30
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<210> 4
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 4
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\hfill30
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<210> 5
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR
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<400> 5
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\hfill27
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<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR
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<400> 6
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\hfill18
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<210> 7
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<212> DNA
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\hfill29
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggcgatg ttgacgcc
\hfill18
Claims (9)
1. 3-Fosfoglicerato -
deshidrogenasa (PGD) que tiene una sensibilidad, disminuida en
comparación con una PGD de tipo salvaje de Escherichia coli,
frente a una inhibición por serina, con una secuencia de
aminoácidos, que corresponde a la PGD de tipo salvaje de
Escherichia coli (SEQ ID NO: 2) exceptuando a la posición
372, caracterizada porque en la posición 372 se encuentra un
aminoácido seleccionado entre el conjunto formado por I, D, Y, G,
S, E, R, K, P, H, W, F, A, N, Q, V, L, M y C.
2. 3-Fosfoglicerato
deshidrogenasa (PGD) que tiene una sensibilidad, disminuida en
comparación con una PGD de tipo salvaje de Escherichia coli,
frente a una inhibición por serina, con una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la PGD de tipo salvaje de Escherichia coli
(SEQ ID NO: 2), exceptuando a las posiciones 349 y 372,
caracterizada porque en la posición 349 se encuentra el
aminoácido D y en la posición 372 se encuentra el aminoácido I.
3. Alelo de serA que codifica una PGD de
acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se
diferencia del gen de la PGD de Escherichia coli (gen de
serA, SEQ ID NO: 1) en el hecho de que el codón 372 codifica un
aminoácido natural, con excepción de la treonina.
4. Alelo de serA de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado porque la actividad
enzimática del producto génico se conserva en un grado tal que
corresponde a más de un 10% de la actividad del producto génico de
tipo salvaje.
5. Vector, caracterizado porque
contiene un alelo de serA de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4
bajo el control funcional de un promotor.
6. Procedimiento para la producción de una
cepa de microorganismos, caracterizado porque en una cepa de
microorganismos se introduce un vector de acuerdo con la
reivindicación 5.
7. Cepa de microorganismos, que es apropiada
para la preparación por fermentación de aminoácidos de la familia de
los fosfogliceratos o de sus derivados o respectivamente de
compuestos que se derivan del metabolismo de C1,
caracterizada porque posee una PGD de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2.
8. Procedimiento para la preparación de
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos o respectivamente
de compuestos que se derivan del metabolismo de C1, por cultivación
de una cepa de microorganismos de acuerdo con la reivindicación
7.
9. Utilización de una PGD de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 para la preparación de aminoácidos de la
familia de los fosfogliceratos o de compuestos que se derivan del
metabolismo de C1.
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