CN116018400A

CN116018400A - 改进的产生半胱氨酸的菌株

Info

Publication number: CN116018400A
Application number: CN202080102380.3A
Authority: CN
Inventors: 鲁珀特·普法勒; 约翰娜·科赫
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2023-04-25
Also published as: EP4172310A1; WO2021259491A1; US20230265473A1; KR20230025010A; JP2023532871A

Abstract

本发明涉及适用于L‑半胱氨酸的发酵生产的微生物菌株，其特征在于由KEGG数据库中的编号EC 2.7.9.2标识的酶类的相对酶活性是灭活的或基于野生型酶的比活性是降低的，并且与具有野生型酶活性的微生物菌株相比，由KEGG数据库中的编号EC 2.′I.9.2表示的酶类形成增加量的L‑半胱氨酸，其中编码该酶活性的基因由ppsA表示。本发明还提供了使用这些微生物细胞产生L‑半胱氨酸的方法。

Description

改进的产生半胱氨酸的菌株

技术领域

本发明涉及适于发酵生产L-半胱氨酸的微生物菌株，其特征在于KEGG数据库中编号EC2.7.9.2所标识的酶类的相对酶活性是失活的或相对于野生型酶的比活性是降低的，并且与具有KEGG数据库中编号EC2.7.9.2所标识的酶类的野生型酶活性的微生物菌株相比，其形成增加量的L-半胱氨酸，其中编码所述酶活性的基因由ppsA标识。此外，本发明提供了使用这些微生物细胞生产L-半胱氨酸的方法。

背景技术

半胱氨酸(缩写为Cys或C)是具有侧链-CH₂-SH的α-氨基酸。因为天然存在的对映异构体形式是L-半胱氨酸，并且因为仅L-半胱氨酸是蛋白原氨基酸，所以在本发明的上下文中，当术语半胱氨酸不带有描述符号时是指L-半胱氨酸。巯基的氧化可以导致两个半胱氨酸残基一起形成二硫键，随后形成胱氨酸，相同的陈述适用于胱氨酸，即在没有描述符号的情况下，其在本发明中是指L-对映异构体(或L-胱氨酸，或(R,R)-3,3′-二硫代双(2-氨基丙酸))。L-半胱氨酸是人的半必需氨基酸，因为其可以由氨基酸甲硫氨酸形成。

在所有生物体中，半胱氨酸在以下中占据关键位置：硫代谢并用于蛋白质、谷胱甘肽、生物素、硫辛酸、硫胺素、牛磺酸、甲硫氨酸和其他含硫代谢物的合成。此外，L-半胱氨酸充当辅酶A生物合成的前体。

已经在细菌，尤其是在肠道细菌中详细地研究了半胱氨酸的生物合成。半胱氨酸生物合成的概述可见于Wada and Takagi,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2006)73:48-54.

氨基酸L-半胱氨酸具有经济重要性。

例如，其用作食品添加剂(特别是在烘焙业中)、用作化妆品中的原料、以及用作用于生产活性药物成分(特别是N-乙酰半胱氨酸和S-羧甲基半胱氨酸)的起始材料。

除了通过从含角蛋白的材料(如头发、鬃毛、角、蹄和羽毛)中提取半胱氨酸的经典制备，或通过前体的酶转化进行的生物转化之外，还存在用于发酵生产半胱氨酸的方法。关于使用微生物发酵制备半胱氨酸的现有技术例如公开于EP 0858510B1、EP 0885962B1、EP1382684B1、EP 1220940B2、EP 1769080B1和EP 2138585B1中。使用的细菌宿主生物体包括棒状杆菌属的菌株和肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。

各种方法可用于改善微生物菌株中的半胱氨酸生产。除了通过突变和选择获得改善的半胱氨酸生产菌的经典方法之外，还对菌株进行特异性遗传修饰以实现半胱氨酸的有效过量生产。

例如，引入cysE等位基因导致半胱氨酸产生增加，cysE等位基因编码具有降低的半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸O-乙酰转移酶(EP 0858510B1；Nakamori et al.,Appl.Env.Microbiol.(1998)64:1607-1611)。抗反馈的CysE酶在很大程度上使O-乙酰基-L-丝氨酸(半胱氨酸的直接前体)的形成与细胞中的半胱氨酸水平脱离。

O-乙酰基-L-丝氨酸由L-丝氨酸和乙酰基-CoA形成。因此，非常重要的是提供足够量的L-丝氨酸用于半胱氨酸生产。这可以通过引入serA等位基因来实现，serA等位基因编码具有降低的L-丝氨酸反馈抑制性的3-磷酸甘油酸脱氢酶。因此，L-丝氨酸的生物合成前体3-羟基丙酮酸盐的形成很大程度上与细胞中的L-丝氨酸水平脱离。此类SerA酶的实例描述于EP 0620853B1和EP 1496111B1中。可替代地，Bell et al.,Eur.J.Biochem.(2002)269:4176-4184公开了对serA基因的修饰以去调控酶活性。

此外，已知可以通过减弱或破坏编码半胱氨酸降解酶(如色氨酸酶TnaA或胱硫醚β-裂解酶MalY或MetC)的基因来增加发酵中的半胱氨酸产率(EP 1571223B1)。

增加半胱氨酸转运出细胞是增加培养基中产物产量的另一种方式。这可以通过过表达所谓的外排基因(efflux gene)来实现。所述基因编码介导半胱氨酸输出出细胞的膜结合蛋白。

已经描述了用于半胱氨酸输出的多种外排基因(EP 0885962B1、EP 1382684B1)。从细胞输出半胱氨酸到发酵培养基中具有几个优点：

1)从细胞内反应平衡中连续抽出L-半胱氨酸，结果是该细胞中这种氨基酸的水平保持较低，并且因此由L-半胱氨酸对敏感酶的反馈抑制停止：

(1)L-半胱氨酸(细胞内)<->L-半胱氨酸(培养基)

2)分泌到培养基中的L-半胱氨酸在氧气存在下氧化形成二硫化物L-胱氨酸，其在培养期间引入培养基(EP 0885962B1)：

(2)2L-半胱氨酸+1/2O₂->L-胱氨酸+h₂O

由于L-胱氨酸在中性pH的水溶液中的溶解度与半胱氨酸相比非常低，因此二硫化物已经以低浓度沉淀并形成白色沉淀：

(3)L-胱氨酸(溶解)->L-胱氨酸(沉淀物)

L-胱氨酸的沉淀降低了溶解在介质中的产物的水平，由此还引起(1)和(2)的反应平衡被引导至产物侧。

3)如果氨基酸可以直接从发酵培养基中获得，则纯化该产物比该产物在细胞内积累并且首先需要细胞破坏的情况显著更不复杂。

除了半胱氨酸生产菌株的基因修饰，发酵过程的优化，即如何培养细胞也在有效生产方法的发展中起重要作用。各种培养参数，例如碳源和能源的性质和计量、温度、氧的供应(EP 2707492B1)、培养基的pH和组成可对半胱氨酸发酵生产中的产物产量和/或产物谱产生影响。

由于原材料和能量成本不断上升，因此一直需要增加半胱氨酸生产中的产物产率，从而改善该方法的经济可行性。

发明内容

本发明的目的是提供用于发酵生产半胱氨酸的微生物菌株，借助于该微生物菌株，与来自现有技术的已知菌株相比，可以在发酵中实现更高产量的L-半胱氨酸或L-胱氨酸。

该目的通过适于L-半胱氨酸发酵生产的微生物菌株实现，其特征在于KEGG数据库中编号EC2.7.9.2所标识的酶类的相对酶活性是失活的或相对于野生型酶的比活性是降低的，并且与具有KEGG数据库中编号EC2.7.9.2所标识的酶类的野生型酶活性的微生物菌株相比，其形成增加量的L-半胱氨酸，其中编码所述酶活性的基因由ppsA标识。

在KEGG数据库中由数字EC 2.7.9.2标识的酶类的酶活性被定义为其可以根据下式在可逆反应中由磷酸烯醇丙酮酸盐产生丙酮酸盐：

(4)磷酸烯醇丙酮酸盐+磷酸+AMP<->丙酮酸盐+H₂O+ATP

(AMP：腺苷单磷酸；ATP：三磷酸腺苷)

因此该酶活性也称为磷酸烯醇丙酮酸盐合酶(PEP合酶，EC 2.7.9.2)或同义地称为丙酮酸盐-H₂O双激酶。编码该蛋白的基因在本发明的上下文中缩写为ppsA。

酶活性的检测(酶测定，PEP合酶测定)：

微生物菌株的PEP合酶活性可以通过以下来确定：将来自培养物的细胞在液体培养基中造粒，洗涤所述细胞，并且制备细胞提取物，例如借助于FastPrep-24 ^TM 5G细胞匀浆器(MP Biomedicals)。提取物的蛋白含量可以例如通过“

蛋白测定试剂盒”(ThermoFisher Scientific)来确定。

根据等式(4)，例如，借助于“孔雀石绿磷酸盐测定试剂盒”(Sigma Aldrich)，可以通过由丙酮酸盐与ATP的反应化学计量产生磷酸盐来测量PEP合酶酶活性。可替代地，还可以确定AMP或磷酸烯醇丙酮酸盐的化学计量产生或丙酮酸盐或ATP的化学计量消耗(参见等式4)。例如，在Berman and Cohn,J.Biol.Chem.(1970)245:5309-5318中描述了一种用于经由丙酮酸盐的ATP依赖性消耗来确定PEP合酶酶活性的测定。Berman and Cohn,J.Biol.Chem.(1970)245:5309-5318还描述了磷酸烯醇丙酮酸盐的ATP依赖性形成的测定。

通过将酶活性基于细胞提取物的1mg总蛋白(无任何进一步纯化或处理)(U/mg蛋白)来计算比酶活性。应当注意的是，不同PEP合酶的比较需要以相同的方式制备细胞提取物。如已经描述的，细胞提取物可以例如借助于FastPrep-24 ^TM 5G细胞匀浆器(MPBiomedicals)来制备。

可替代地，还可以通过使比活性基于以相同方式分别纯化的1mg酶(U/mg纯化的蛋白质)来比较不同的酶。一种用于纯化PEP合酶并且用于确定纯化蛋白的比活性的方法例如描述于Berman and Cohn,J.Biol.Chem.(1970)245:5309-5318中。

相对酶活性可以通过将携带Wt等位基因的微生物菌株(相对于编码该PEP合酶的基因)的PEP合酶测定中确定的比酶活性设置为100％来确定。在PEP合酶测定中针对样品的比酶活性测量的值被标识为相对于具有Wt酶的这种菌株的百分比。

开放阅读框(ORF，与cds或编码序列同义)是指DNA或RNA的区域，其以起始密码子开始并以终止密码子结束，并且编码蛋白质的氨基酸序列。ORF也称为编码区或结构基因。

基因是指含有用于产生生物活性RNA的所有基本信息的DNA部分。基因含有通过转录产生单链RNA拷贝的DNA部分，以及涉及该拷贝过程调节的表达信号。表达信号包括例如至少一个启动子、转录起始、翻译起始和核糖体结合位点。此外，终止子和一个或多个操纵子有可能作为表达信号。

在本发明的上下文中，蛋白质，例如PpsA以大写字母开始，而编码所述蛋白质(cds)的序列由小写字母(例如，ppsA)标识。

因此，大肠杆菌ppsA是指来自大肠杆菌的ppsA基因的cds，如在SEQ ID NO：1中核苷酸333-2711所标识。大肠杆菌PpsA是指由所述cds(大肠杆菌ppsA)编码并在SEQ ID NO：2中标识的蛋白质。所述蛋白质是磷酸烯醇丙酮酸盐合酶。

菠萝泛菌(P.ananatis)ppsA是指来自菠萝泛菌的ppsA基因的cds，如在SEQ IDNO：3中核苷酸417-2801标识的。菠萝泛菌PpsA是指由所述cds(菠萝泛菌ppsA)编码并在SEQID NO：4中标识的蛋白质。

缩写WT(Wt)是指野生型。野生型基因是指通过进化天然产生且存在于野生型基因组中的基因的形式。Wt基因的DNA序列可在数据库如NCBI中公开获得。

等位基因限定可以通过突变(即通过对DNA的核苷酸序列的改变)彼此转化的基因的状态。天然存在于微生物中的基因被称为野生型等位基因，并且从其衍生的变体被称为基因的突变等位基因。

同源基因或同源序列应理解为是指所述基因或DNA区段的DNA序列是至少80％一致的，优选至少90％一致的并且特别优选至少95％一致的。

DNA同一性程度通过可以在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/处找到并且基于blastn算法的“核苷酸blast”程序来确定。默认参数用作两个或更多个核苷酸序列的比对的算法参数。默认的一般参数为：最大靶序列＝100；短查询(Short queries)＝“自动调整用于短输入序列的参数”；期望阈值＝10；字大小＝28；自动调整短输入序列的参数＝0。相应的默认打分参数为：匹配/不匹配分数＝1，-2；间隙成本(Gap Costs)＝线性。

使用“蛋白质blast”程序在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/比较蛋白质序列。该程序使用blastp算法。默认参数用作两个或更多个蛋白质序列比对的算法参数。默认的一般参数为：最大靶序列＝100；短查询＝“自动调整用于短输入序列的参数”；期望阈值＝10；字大小＝3；自动调整短输入序列的参数＝0。默认评分参数为：Matrix＝BLOSUM62；间隙成本＝存在：11延伸：1；组成调节＝条件组成分数矩阵调节。

在根据本发明的微生物中，在KEGG数据库中由数字EC 2.7.9.2标识的酶类的相对酶活性是灭活的或相对于野生型酶的比活性降低优选至少10％，特别优选至少25％，尤其优选至少60％，并且特别优选至少70％。由降低至少10％(或25％/60％/70％)的ppsA基因编码的酶的酶活性也称为至多90％(或75％/40％/30％)的残留活性。

在优选的实施方式中，所述微生物菌株的特征在于其不再具有KEGG数据库中EC2.7.9.2号标识的酶类的任何酶活性，即相对于野生型酶的比活性，KEGG数据库中EC2.7.9.2号标识的酶类的相对酶活性降低了100％。

在本发明的上下文中，“与(相应的)野生型酶相比/与(相应的)野生型酶比较/与(相应的)野生型酶相关”意指与由来自微生物的基因的非突变形式(即，由通过进化天然产生且存在于所述微生物的野生型基因组中的基因)编码的蛋白质的活性相比。

适于发酵生产L-半胱氨酸的微生物菌株包括含有失调的生物合成代谢途径(同源或异源)的所有微生物，所述途径导致半胱氨酸、胱氨酸或衍生自其的衍生物的合成。此类菌株例如在EP 0885962B1、EP 1382684B1、EP 1220940B2、EP 1769080B1和EP 2138585B1中公开。

适于L-半胱氨酸发酵生产的微生物的特征优选在于它们具有以下修饰之一：

a)所述微生物菌株的区别在于修饰的3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)，其具有的L-丝氨酸反馈抑制与相应的野生型酶(如EP 1950287B1中所述)相比降低了至少两倍。

与相应的野生型酶相比，3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)的特别优选的变体的L-丝氨酸反馈抑制降低至少5倍，尤其优选降低至少10倍，在更优选的实施方式中，降低至少50倍。

b)所述微生物菌株含有丝氨酸O-乙酰转移酶(cysE)，与相应的野生型酶相比，所述丝氨酸O-乙酰转移酶(cysE)具有半胱氨酸的反馈抑制，所述反馈抑制降低至少2倍(例如，如EP 0858510B1或Nakamori et al.,Appl.Env.Microbiol.(1998)64:1607-1611)。

与相应的野生型酶相比，丝氨酸O-乙酰转移酶(cysE)的特别优选的变体具有半胱氨酸的反馈抑制，该反馈抑制被降低至少5倍，尤其优选降低至少10倍，并且在更优选的实施方式中，降低至少50倍。

c)与相应的野生型细胞相比，所述微生物菌株表现出半胱氨酸从细胞中输出，由于外排基因的过表达，所述半胱氨酸增加了至少2倍。

与野生型细胞相比，外排基因的过表达优选导致半胱氨酸输出出细胞，其增加了至少5倍，特别优选增加了至少10倍，尤其优选增加了至少20倍。

该外排基因优选地来自以下组成的组：来自大肠杆菌的ydeD(参见EP0885962B1)、yfiK(参见EP 1382684B1)、cydDC(参见WO 2004/113373A1)、bcr(参见US2005-221453AA)以及emrAB(参见US 2005-221453AA)。大肠杆菌或来自不同微生物的相应同源基因。

此类菌株由例如EP 0858510B1和EP 0885962B1是已知的。

此外，适合于L-半胱氨酸的发酵生产的微生物菌株的特征优选在于，至少一种半胱氨酸降解酶被减弱至与野生型细胞相比该细胞仅包含最多50％的这种酶活性的程度。半胱氨酸降解酶优选地来自由以下组成的组：色氨酸酶(TnaA)和胱硫醚β-裂解酶(MalY，MetC)。

前述段落中描述的适于发酵生产L-半胱氨酸的微生物菌株在其半胱氨酸方面而言是失调的，使得它们与在半胱氨酸代谢方面不失调的并且具有KEGG数据库中编号EC2.7.9.2所标识的酶类的野生型酶活性的微生物菌株相比形成增加量的L-半胱氨酸。因为，在半胱氨酸代谢未失调且具有KEGG数据库中EC2.7.9.2号标识的酶类的野生型酶活性的微生物菌株的细胞中，培养物中L-半胱氨酸的量为约0g/l(cf.表2)，增加的量是指在培养24小时后在培养物中测量的超过0.05g/LLg/l L-半胱氨酸的任何量。

优选地，该微生物菌株的特征在于该微生物菌株是来自肠杆菌科或棒状杆菌科的菌株，特别优选地是来自肠杆菌科的菌株。此类菌株可从例如DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures GmbH(Braunschweig)商购获得。

优选地，该微生物菌株选自由以下组成的组：大肠杆菌、菠萝泛菌和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，特别优选地选自由以下组成的组：大肠杆菌和菠萝泛菌。特别优选地，微生物菌株是大肠杆菌物种的菌株。

特别优选地，大肠杆菌菌株选自大肠杆菌K12，特别优选地选自大肠杆菌K12。大肠杆菌K12 W3110。这些菌株可从DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures GmbH(Braunschweig)商购获得，例如包括E。大肠杆菌K12 W3110 DSM 5911(id.ATCC 27325)和菠萝泛菌DSM 30070(id.atcc 11530)。PpsA优选地是具有SEQ ID NO：2的来自大肠杆菌的PpsA或SEQ ID NO：4的来自菠萝泛菌的PpsA。

优选地，所述微生物菌株的特征在于其在ppsA基因中含有至少一个突变。同时，在这个优选实施方式中，与野生型细胞相比，该菌株还形成增加量的L-半胱氨酸。优选地，与野生型酶的比活性相比，ppsA基因中的遗传修饰引起所述基因表达的蛋白质具有降低的由KEGG数据库中编号EC 2.7.9.2标识的酶类的相对酶活性，或不具有这种酶活性。

此外，可以对根据本发明的生产菌株进行进一步优化以进一步改进半胱氨酸生产。

例如，可以通过另外表达适合于改进生产特性的一种或多种基因来遗传地实现优化。所述基因可以在生产菌株中以本身已知的方式作为单独的基因构建体或作为表达单元(作为所谓的操纵子)组合地表达。

此外，可通过灭活除ppsA基因之外的其他基因来优化生产菌株，这些基因的基因产物对半胱氨酸生产具有不利影响。

然而，以本身已知的方式，通过诱变和选择具有改善的半胱氨酸生产的菌株，优化也是可能的。

在本发明的上下文中，ppsA基因中的遗传修饰定义为意指

a)ppsA基因的编码序列部分或全部缺失，

b)ppsA基因的编码序列通过一个或多个插入或5’和/或3’延伸修饰，

c)ppsA结构基因包含一个或多个突变，尤其是点突变，这些突变导致表达的磷酸烯醇丙酮酸盐合酶具有减弱的酶活性或完全无活性，

d)ppsA结构基因包含一个或多个突变，尤其是点突变，这些突变导致ppsA表达的强衰减或完全抑制或mRNA稳定性的降低，或

e)由于对5’和/或3’非编码的ppsA序列(启动子、5’-UTR、Shine-Dalgarno序列和/或终止子)的遗传修饰，减弱或完全抑制ppsA基因的表达或ppsA mRNA的翻译

并且该序列表达的蛋白质相对于野生型酶的比活性具有降低的相对PEP合酶活性。

在本发明的上下文中，在a)至e)中列出的ppsA基因中的遗传修饰的任何组合也是可能的。总之，因此在本发明的上下文中，可以形成更少的PpsA蛋白或不形成任何蛋白和/或表达的PpsA蛋白较不活跃或不活跃。

在可替代的方法中，还可以通过本领域技术人员已知的所谓的“反义RNA”策略在基因转录水平下减弱或完全灭活ppsA酶活性。还可想到通过添加抑制剂(其是化学抑制剂或蛋白抑制剂)使ppsA酶活性减毒或完全失活。

优选地，修饰根据本发明的菌株中的ppsA基因涉及完全或部分缺失ppsA结构基因、以引起酶活性减弱或酶失活的方式突变ppsA结构基因、或以引起ppsA基因的表达或翻译的减弱或完全抑制或另外降低ppsA mRNA的稳定性的方式突变ppsA结构基因和/或其未转录或未翻译的基因区，这些基因区调节表达并且在5’和3’侧翼上。

特别优选地，根据本发明的菌株中ppsA基因的失活是由ppsA cds的完全或部分缺失(即，在大肠杆菌的ppsA cds，SEQ ID NO：1的核苷酸333–2711的情况下，或在菠萝泛菌的ppsA cds，SEQ ID NO：3的核苷酸417-2801的情况下)或通过以引起酶活性减弱或酶失活或mRNA稳定性降低的方式突变ppsA结构基因。

在优选的实施方式中，该微生物菌株的特征在于该突变的基因选自由以下组成的组：来自大肠杆菌的ppsA基因、来自菠萝泛菌的ppsA基因、以及与这些基因同源的基因。来自大肠杆菌的ppsA基因公开于具有基因ID 946209的NCBI基因数据库的条目中，并且来自菠萝泛菌的ppsA基因公开于具有基因ID 11796889的NCBI基因数据库中的条目中。对于术语“同源基因”，以上给出的定义适用。特别优选地，突变的ppsA基因是来自大肠杆菌的ppsA基因。在另外的优选实施方式中，cds是来自大肠杆菌的ppsA基因的cds，公开于SEQ ID NO：1核苷酸333-2711(编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质)或来自菠萝泛菌的ppsA基因的cds，公开于SEQ ID NO：3核苷酸417-2801(编码具有SEQ ID NO：4的蛋白质)。

在优选的实施方式中，该微生物菌株的特征在于，ppsA基因的编码DNA序列是SEQID NO：5或与其同源的序列，特别优选地是SEQ ID NO：5。对于术语“同源序列”，以上给出的定义适用。

在这种情况下，根据具有SEQ ID NO：5中的DNA序列的ppsA-MHI基因，在SEQ IDNO：1中标识的DNA序列中的突变导致在SEQ ID NO：2中标识的WT蛋白序列中的三个氨基酸的突变，即位置126处的缬氨酸突变成甲硫氨酸(V126M)、位置427处的精氨酸突变成组氨酸(R427H)以及位置434处的缬氨酸突变成异亮氨酸(V434I)，编码具有如SEQ ID NO：6中所公开的氨基酸序列的ppsA-MHI蛋白。

用于使ppsA基因失活和突变的不同方法是本领域技术人员已知的。在最简单的情况下，亲本菌株可以以已知的方式进行诱变(例如，通过诱变化学品如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍的化学方法或通过UV辐射的物理方法)，其中突变在基因组DNA中随机产生，并且然后所希望的ppsA突变体选自所产生的多种突变体，例如在这些突变体各自被单个化之后，通过基于酶活性的颜色反应的不存在或通过通过检测有缺陷的ppsA基因的遗传方法。

与复杂的随机诱变和所寻求的ppsA突变体的选择相反，可以以相对简单的方式对ppsA基因进行靶向灭活，例如通过已知的同源重组机制。通过同源重组用于靶向基因失活的克隆系统是本领域技术人员已知的并且是可商购的，例如在“Quick and Easy E.coliGene Deletion Kit”的使用者手册中公开的，基于来自Gene Bridges GmbH的

技术(参见“Technical Protocol,Quick&Easy E.coli Gene Deletion Kit,by

Recombination,Cat.No.K006,Version 2.3,June 2012”和其中引用的参考文献)。

根据现有技术，可以分离出ppsA基因或部分基因，并在ppsA基因中克隆外源DNA，从而打断了ppsA基因的蛋白定义开放阅读框。因此，适用于靶向灭活ppsA基因的DNA构建体可以由与基因组ppsA基因同源的DNA的5’部分、接着是包含外源DNA的基因区段、接着是与基因组ppsA基因再次同源的DNA的3’部分组成。

因此，用于同源重组的ppsA基因中的可能区域可以不仅包括编码磷酸烯醇丙酮酸盐合酶的区域。该可能的区域还可以包含DNA序列，这些DNA序列侧接ppsA基因，即在编码区开始之前的5’区域中(基因转录启动子，例如SEQ ID NO：1中的核苷酸1-332，或SEQ ID NO：3中的核苷酸1-416)并且在该编码区的末端之后的3’区(基因转录终止子，例如SEQ ID NO：1中的核苷酸2712-3000，或SEQ ID NO：3)中的核苷酸2802-3062)，通过同源重组对其的修饰可以导致ppsA基因的失活，就像编码区的修饰一样。

外源DNA优选是选择标记表达盒。它由功能性地连接至实际选择标记基因的基因转录启动子组成，可选地随后为基因转录终止子。在这种情况下，选择标记还含有ppsA基因的5’和3’侧翼同源序列。

优选地，选择标记含有ppsA基因的5’和3’侧翼同源序列，其各自具有至少30个核苷酸，特别优选至少50个核苷酸的长度。

因此，用于灭活ppsA基因的DNA构建体可以从5’端开始，由以下组成：与ppsA基因同源的序列，随后是例如选自抗生素抗性基因的类别的选择标记的表达盒，并且随后是与ppsA基因同源的另外的序列。

在优选的实施方式中，用于灭活ppsA基因的DNA构建体从5’端开始由以下组成：与长度为至少30个核苷酸的ppsA基因同源的序列，尤其优选长度为至少50个核苷酸，接着是选自抗生素抗性基因类别的选择标记的表达盒，并且随后是与长度为至少30个核苷酸的ppsA基因同源的另外的序列，尤其优选长度为至少50个核苷酸。

选择标记基因通常是这样的基因，其基因产物使得亲本菌株能够在原始亲本菌株不能生长的选择性条件下生长。

优选的选择标记基因选自抗生素抗性基因的组，例如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或新霉素抗性基因。其他优选的选择标记基因允许具有代谢缺陷(例如，氨基酸营养缺陷体)的亲本菌株由于通过所述选择标记基因的表达来校正代谢缺陷而在选择性条件下生长。最后，另一种可能性是选择标记基因，其基因产物化学地改变亲本菌株的固有毒性化合物并因此使所述化合物失活(例如，乙酰胺酶基因，其将对许多微生物有毒的化合物乙酰胺裂解为无毒产物乙酸和氨)。

在选择标记基因中，氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因是特别优选的。四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因是特别优选的。

还存在基于同源重组的系统，其除了靶向基因失活之外，还提供从基因组中去除选择标记的选择，由此使得可能产生双重和多重突变体。这种系统例如是所谓的“LambdaRed”技术，作为“Quick and Easy E.coli Gene Deletion Kit”是可商购的，基于来自GeneBridges GmbH的

技术(参见“Technical Protocol,Quick&Easy E.coli GeneDeletion Kit,by

Recombination,Cat.No K006,Version 2.3,June 2012”和其中引用的参考文献)。

具有失活ppsA基因的根据本发明的菌株的实例是实施例中公开的大肠杆菌W3110-ppsA和菠萝泛菌ppsA。两种菌株的特征在于它们的ppsA基因已经通过同源重组失活。

基于同源重组的靶向基因失活的另一种此类系统是本领域技术人员已知的且描述于实例3中的基因失活或遗传修饰的方法，并且是基于Lambda Red重组与反选择筛选的组合。所述系统例如描述于Sun et al.,Appl.Env.Microbiol.(2008)74:4241-4245。使用DNA构建体来使例如ppsA基因失活，从5’端开始，该构建体由与ppsA基因同源的序列组成，接着是处于任何顺序的两个表达盒，这些表达盒由以下各项组成：a)选自抗生素抗性基因的类别的选择标记的表达盒以及b)编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因的表达盒，并且最后接着是与ppsA基因同源的另外的序列。

在第一步中，将DNA构建体转化到生产菌株中，并分离抗生素抗性克隆。获得的克隆的特征在于以下事实：由于共结合的sacB基因，它们不能在蔗糖上生长。可以通过反选择的原理去除这两个标记基因，因为在第二步中，适合的DNA片段通过同源重组替代这两个标记基因。在这一步骤中获得的克隆然后恢复它们在蔗糖上生长的能力，并且然后还恢复它们对抗生素的敏感性。该方法用于实施例3中以交换E的ppsA WT基因。对于下面描述的三重突变体ppsA-MHI(SEQ ID NO：5)的大肠杆菌(SEQ ID NO：1)。

实施例中公开了作为根据本发明的菌株的实例的大肠杆菌菌株W3110-ppsA-MHI，该菌株由于ppsA基因的编码序列的突变而具有减弱的PpsA酶活性。W3110-ppsA-MHI包含PpsA三突变体PpsA-V126M-R427H-V434I(ppsA-MHI)的cds。ppsA-MHI的突变基因的cds对应于DNA序列SEQ ID NO：5并且编码具有序列SEQ ID NO：6的PpsA蛋白。PpsA-MHI的特征在于，与SEQ ID NO：2中所标识的WT序列相比，具有序列SEQ ID NO：6的蛋白质在氨基酸序列中包含以下变化：位置126处的缬氨酸突变成甲硫氨酸(V126M)，位置427处的精氨酸突变成组氨酸(R427H)，并且位置434处的缬氨酸突变成异亮氨酸(V434I)。

由于这些突变，与特异性野生型酶活性相比，PpsA-MHI蛋白仅具有26.8％的相对酶活性(参见实施例5，表1)。

在大肠杆菌ppsA基因的情况下，优选的是，cds中的至少一个突变导致SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的以下改变中的至少一个：位置126处的缬氨酸、位置427处的精氨酸和/或位置434处的缬氨酸，其中这三个氨基酸中的任一个可以交换为任何其他氨基酸。

特别优选的是导致SEQ ID NO：2中标识的WT蛋白的氨基酸序列中的三个氨基酸同时突变的突变。

以本身已知的方式将根据本发明的ppsA-MHI基因中的突变引入ppsA WT基因中，例如通过使用可商购的克隆试剂盒的所谓的“定点”诱变，如例如在来自Agilent的“QuickChange II定点诱变试剂盒”的用户手册中公开的。可替代地，根据本发明的ppsA-MHI基因还可以通过DNA合成以已知的方式产生。

根据本发明的菌株，其特征在于以引起酶活性减弱的方式突变ppsA结构基因，例如大肠杆菌ppsA-MHI三突变体可以通过使用Lambda Red重组与对遗传修饰的反选择筛选的上述组合来产生(参见，例如Sun et al.,Appl.Env.Microbiol.(2008)74:4241-4245)，如在实施例中公开的。

特别优选的菌株是大肠杆菌W3110ΔppsA(描述于实施例1中)和大肠杆菌W3110ppsA-MHI(描述于实施例3中)。

本发明进一步提供了用于生产L-半胱氨酸的发酵方法，其特征在于使用根据本发明的微生物细胞。

形成的本发明方法的主要产物是L-半胱氨酸，由其可形成化合物L-胱氨酸和噻唑烷。L-胱氨酸和噻唑烷在发酵期间形成并在培养物上清液和沉淀物中积累。噻唑烷是2-甲基-2,4-噻唑烷二羧酸，可以作为半胱氨酸生产的副产物形成的半胱氨酸和丙酮酸盐的加合物(EP 0885962B1)。

在本发明的上下文中，总半胱氨酸的产率定义为所产生的半胱氨酸、胱氨酸和噻唑烷的总和。如实施例7所述，这由整个培养物测定。例如，其可以借助于Gaitonde(Gaitonde,M.K.(1967)Biochem.J.104,627-633)，的比色测定来定量。

现有技术没有公开可以通过减弱或灭活磷酸烯醇丙酮酸盐合酶活性来改善氨基酸，特别是半胱氨酸的产生的任何方法或生产菌株。

如本申请实施例所示，在适于半胱氨酸生产的微生物菌株中减弱或失活ppsA酶活性显著增加了发酵过程中总半胱氨酸(即产生的半胱氨酸、胱氨酸和噻唑烷的总和)的产率。从现有技术中，这是完全出乎意料的。

如实施例7的表4中所概述，出乎意料的是与相应的野生型菌株相比，在大肠杆菌W3110的ppsA突变体的发酵中实现显著更高的半胱氨酸产率。与现有技术相反并且对于本领域技术人员而言出乎意料地，磷酸烯醇丙酮酸盐合酶活性的减弱或失活导致改进的产生半胱氨酸的菌株。

通过实施例6的表2和表3中总结的结果确认了用于改善产半胱氨酸菌株的该新颖的和创造性的方法，其中在大肠杆菌中，使ppsA基因或突变的ppsA基因失活，从而产生具有减弱的酶活性的PpsA酶，并且在菠萝泛菌中使ppsA基因失活已经导致在摇瓶中的培养中提高的半胱氨酸产率。

因此，对于本领域技术人员而言，磷酸烯醇丙酮酸盐合酶活性的减弱或失活也是用于改进其他产生半胱氨酸的菌株中的半胱氨酸生产的新的有用措施。

因此，在根据本发明的并且适合于半胱氨酸生产的微生物菌株中，由该生产菌株中的ppsA基因编码的蛋白质的酶活性被减弱或完全抑制，并且同时，半胱氨酸生产增加。实施例7表明，与含有ppsA WT基因的菌株相比，可以产生半胱氨酸并且编码具有降低的PpsA酶活性的ppsA突变体ppsA-MHI(而不是Wt酶)的菌株在发酵中实现显著更高的半胱氨酸产率。

在所讨论的发酵方法中，所形成的不仅是根据本发明的生产菌株的生物质，而且是半胱氨酸及其氧化产物胱氨酸。生物质和半胱氨酸的形成可以在时间上相关，或生物质和半胱氨酸可以随时间推移以相互脱离的方式形成。以本领域技术人员熟知的方式进行培养。为此，培养可以在摇瓶(实验室规模)中或者另外通过发酵(生产规模)进行。

优选发酵体积大于1L的发酵生产规模方法，优选生产规模大于10L，特别优选生产规模大于1000L，特别优选发酵体积大于10000L。

从微生物培养的实践，培养培养基是本领域技术人员熟悉的。它们通常由碳源、氮源和添加剂如维生素、盐和微量元素以及优化细胞生长和半胱氨酸产生的硫源组成。

碳源是那些可以被生产菌株用于形成半胱氨酸产物的碳源。这些包括所有形式的单糖，包括C6糖(己糖)，例如像葡萄糖、甘露糖、果糖或半乳糖，以及C5糖(戊糖)，例如像木糖、阿拉伯糖或核糖。

然而，根据本发明的生产方法还涵盖二糖形式的所有碳源，特别是蔗糖、乳糖、麦芽糖或纤维二糖。

此外，根据本发明的生产方法还包括处于具有超过两个糖单元的高级糖、糖苷或碳水化合物形式的所有碳源，例如麦芽糊精、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶或通过水解从其释放的单体或低聚物(酶促或化学地)。高级碳源的水解可以在根据本发明的生产方法的上游，或者在根据本发明的生产方法期间原位发生。

除糖或碳水化合物之外的其他可用的碳源是乙酸(或源自其的乙酸盐)、乙醇、甘油、柠檬酸(及其盐)或丙酮酸盐(及其盐)。然而，气态碳源如二氧化碳或一氧化碳也是可设想的。

与根据本发明的生产方法相关的碳源包括已经分离的纯物质或为了提高经济效率而没有进一步纯化的单独碳源的混合物，如可以通过化学或酶消化植物原料作为水解产物来获得。这些包括例如淀粉(葡萄糖单糖)、甜菜(葡萄糖、果糖和阿拉伯糖单糖)、甘蔗(蔗糖二糖)、果胶(半乳糖醛酸单糖)或木质纤维素(来自纤维素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖的葡萄糖单糖和来自半纤维素的半乳糖单糖、以及非碳水化合物木质素)的水解产物。此外，来自植物原材料的消化的废产物也可以用作碳源，例如糖蜜(甜菜)或甘蔗渣(甘蔗)。

用于培养生产菌株的优选碳源是葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖以及可以从淀粉、木质纤维素、甘蔗或甜菜获得的植物水解产物。

特别优选的碳源是以分离的形式或作为植物水解产物的组分的葡萄糖和蔗糖。

特别优选的碳源是葡萄糖。

氮源是可以由生产菌株用于形成生物质的那些。这些包括呈气态形式或呈NH₄OH水溶液形式的氨，或其盐，例如像硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵或硝酸铵。此外，合适的氮源是已知的硝酸盐，例如KNO₃、NaNO₃、硝酸铵、Ca(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂和其他氮源，例如尿素。氮源还包括氨基酸的复杂混合物，例如像酵母提取物、蛋白胨、麦芽提取物、大豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆(液体或者干燥为所谓的CSD)以及NZ胺和酵母氮碱。

为了有效生产半胱氨酸和半胱氨酸衍生物，需要计量加入硫源，或者作为分批形式的一次性添加或者作为连续进料。连续计量加入可以作为纯的进料溶液或以与另外的进料组分(例如像葡萄糖)的混合物进行。

合适的硫源是硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、硫代硫酸盐或硫化物的盐，并且还可以在给定稳定性下使用相应的酸。

优选的硫源是硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化物的盐。

特别优选的硫源是硫酸盐和硫代硫酸盐。

尤其优选的是硫代硫酸盐，例如像硫代硫酸钠和硫代硫酸铵。

培养可以以所谓的分批模式进行，包括用生产菌株的起子培养物接种培养基，然后在不进一步供给营养物源的情况下细胞生长。

培养还可以以所谓的分批补料模式进行，包括在分批模式的生长的初始阶段之后另外补料营养物源(补料)以补偿其消耗。饲料可以由碳源、氮源、硫源、一种或多种维生素或对于生产重要的微量元素、或前述的组合组成。这些进料组分可以作为一种混合物一起计量加入或者另外在单独的进料段中单独地计量加入。此外，也可以将其他培养基成分加入到饲料中，也可以加入特异性增加半胱氨酸生产的添加剂。进料可以连续地或部分地(不连续地)提供，或者以连续进料和不连续进料的组合提供。优选以补料分批模式进行培养。

进料中优选的碳源是葡萄糖、蔗糖、以及含葡萄糖或蔗糖的植物水解产物，以及优选的碳源以任何混合比率的混合物。

进料中特别优选的碳源是葡萄糖。

优选地，将培养物的碳源计量加入，使得生产阶段期间在发酵罐中碳源的含量不超过10g/L。2g/L的最大浓度是优选的，0.5g/L是特别优选的，0.1g/L是尤其优选的。

进料中优选的氮源是氨，以气态形式或以NH₄OH的水溶液形式，及其盐硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵和氯化铵，以及另外尿素、KNO₃、NaNO₃和硝酸铵，酵母提取物，蛋白胨，麦芽提取物，大豆蛋白胨，酪蛋白氨基酸，玉米浸液以及NZ胺和酵母氮碱。

饲料中特别优选的氮源是氨或铵盐、尿素、酵母提取物、大豆蛋白胨、麦芽提取物或玉米浆(液体或干燥形式)。

进料中优选的硫源是硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化物的盐。

进料中特别优选的硫源是硫酸盐和硫代硫酸盐。

作为进料中的硫源，尤其优选硫代硫酸盐，例如硫代硫酸钠和硫代硫酸铵。

作为另外的介质添加剂，元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙、铁的盐，以及可以添加痕量(即，以μM浓度)的元素钼、硼、钴、锰、锌、铜和镍的盐。此外，有机酸(例如，乙酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，异亮氨酸)和维生素(例如，维生素B1、维生素B6)可以添加至培养基。

在促进生产菌株的生长和半胱氨酸产生的pH和温度条件下进行培养。有用的pH范围是从pH5至pH9。优选pH范围为pH5.5至pH8。特别优选的是pH范围是从pH6.0至pH7.5。

生产菌株生长的优选温度范围为20℃至40℃。温度范围特别优选为25℃至37℃，特别优选为28℃至34℃。

生产菌株的生长可以可选地在不供应氧的情况下(厌氧培养)或另外在供应氧的情况下(好氧培养)发生。优选的是用氧进行好氧培养。

在需氧培养根据本发明的菌株用于半胱氨酸生产的情况下，针对氧含量设定至少10％(v/v)、优选地至少20％(v/v)并且特别优选地至少30％(v/v)的饱和度。根据现有技术，培养物中的氧饱和度通过气体供应和搅拌速度的组合来自动调节。

氧气的供应通过引入压缩空气或纯氧气来确保。优选通过引入压缩空气的有氧培养。需氧培养中压缩空气供应的有用范围是0.05vvm至10vvm(vvm：将压缩空气引入到以每升发酵体积/分钟的压缩空气升标识的发酵批次中)。优选引入0.2vvm-8vvm的压缩空气，特别优选引入0.4-6vvm的压缩空气，特别优选引入0.8-5vvm的压缩空气。

最大搅拌速度是2500rpm，优选2000rpm并且特别优选1800rpm。

培养时间为10h至200h。优选的是20h至120h的培养时间。特别优选的是30h至100h的培养时间。

通过上述方法获得的培养批次含有在培养上清液中溶解形式或沉淀形式氧化为胱氨酸的半胱氨酸。培养批次中所含的半胱氨酸或胱氨酸可以无需进一步后处理而直接进一步使用或另外从培养批次分离。

优选地，该方法的特征在于所形成的半胱氨酸是分离的。本身已知的方法步骤可用于分离半胱氨酸和胱氨酸，包括离心、倾析、粗产物与无机酸的溶解、过滤、萃取、层析或结晶、或沉淀。所述工艺步骤可以按任何形式组合以便分离所希望纯度的半胱氨酸。所希望的纯度取决于进一步的用途。

后处理获得的胱氨酸可被还原为半胱氨酸供进一步使用。在EP 0235908中公开了在电化学方法中将L-胱氨酸还原为L-半胱氨酸的方法。

用于标识、定量和确定半胱氨酸或胱氨酸产物的纯度的各种分析方法是可用的，包括分光光度法、NMR、气相色谱法、HPLC、质谱法、重量分析法或这些分析方法的组合。

本发明还可以用于生产用于发酵生产化合物的改进的微生物菌株，其生物合成从3-磷酸甘油酸开始并且经由L-丝氨酸导致L-半胱氨酸和L-胱氨酸。本发明还包括用于发酵生产L-丝氨酸和L-半胱氨酸衍生物的微生物菌株，包括磷酸丝氨酸、O-乙酰丝氨酸、N-乙酰丝氨酸和噻唑烷，L-半胱氨酸和丙酮酸盐的缩合产物。

附图说明

附图显示了实施例中所用的质粒。

图1示出了在实例1和实例2中使用的3.4kb载体pKD13。

图2示出了在实例1和实例3中使用的6.3kb载体pKD46。

图3示出了在实例3中使用的5kb载体pKa-SacB。

图4显示实施例4中使用的4.2kb载体pACYC184。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例进一步说明，而不受它们的限制：

实施例1：在大肠杆菌中生产ppsA缺失突变体

用于基因分离和用于菌株发育的亲本菌株是大肠杆菌K12 W3110(以菌株号DSM5911商购自DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)。

基因失活的靶是来自大肠杆菌的ppsA基因的编码序列。来自大肠杆菌K12的ppsA基因的DNA序列(Genbank GeneID：946209)公开于SEQ ID NO：1中。核苷酸333–2711(由大肠杆菌ppsA标识)编码具有SEQ ID NO：2(大肠杆菌PpsA)中公开的氨基酸序列的磷酸烯醇丙酮酸盐合酶蛋白。

使用来自Gene Bridges GmbH的

技术，将大肠杆菌ppsA基因灭活，如以下详述(描述于“Quick and Easy E.coli Gene Deletion Kit”的用户手册中，参见“Technical Protocol,Quick&Easy E.coli Gene Deletion Kit,by

Recombination,Cat.No.K006,Version 2.3,June 2012”和其中引用的参考文献，例如Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000):6640-6645)。为此，使用质粒pKD13、pKD46和pCP20：

-3.4kb质粒pKD13(图1)在登录号AY048744.1下在“GenBank”

基因数据库中公开。

-6.3kb质粒pKD46(图2)在登录号AY048746.1下在“GenBank”

基因数据库中公开。

-9.4kb质粒pCP20公开于Cherepanov and Wackernagel,Gene 158(1995):9–14中。

为了使用Lambda Red系统通过同源重组使大肠杆菌W3110中的ppsA基因失活，进行以下步骤：

1.用质粒pKD46(所谓的“红色重组酶”质粒，图2)转化大肠杆菌W3110并且分离氨苄青霉素抗性克隆(称为W3110 x pKD46)。

2.在PCR反应(“Phusion^TM高保真”DNA聚合酶，ThermoScientific^TM)中，用质粒pKD13(图1)和引物pps-5f(SEQ ID NO：7)和pps-6r(SEQ ID NO：8)的DNA产生适合于其失活的ppsA特异性DNA片段。

引物pps-5f包含来自ppsA基因的5’区(SEQ ID NO：1中的nt 333-362)的30个核苷酸(nt)并且与其连接的对质粒pKD13具有特异性的20nt(在图1中称为“pr-1”)。

引物pps-6r包含来自ppsA基因的3’区的30nt(SEQ ID NO：1中的nt 2682-2711，以反向互补形式)和与其连接的对质粒pKD13特异的20nt(在图1中称为“pr-2”)。

使用质粒pKD13的DNA，使用引物pps-5f和pps-6r，产生1.4kb PCR产物，该产物在5’端和3’端均包含对于来自大肠杆菌W3110的ppsA基因具有特异性的DNA的30nt部分。此外，PCR产物含有pKD13中所含的卡那霉素抗性基因的表达盒以及在卡那霉素表达盒的5’和3’末端侧翼，所谓的“FRT同向重复”(在图1中称为“FRT1”和“FRT2”)，DNA的短区段，其在稍后用于去除抗生素标记卡那霉素的工作步骤中用作“FLP重组酶”(包含在质粒pCP20上)的标识序列。

3.分离1.4kbPCR产物，并用本领域技术人员熟悉的限制性内切核酸酶Dpn I处理，其仅切割甲基化DNA，以去除残留的pKD13质粒DNA。来自PCR反应的非甲基化DNA不被降解。

4.将对ppsA基因具有特异性并且包含卡那霉素抗性基因的表达盒的1.4kb PCR产物转化到大肠杆菌W3110 x pKD46中并且将卡那霉素抗性克隆在30℃下在LBkan板上分离。LBkan板包含LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)、1.5％琼脂和15mg/L卡那霉素。

5.将获得的卡那霉素抗性克隆中的十个在LBkan板上纯化(即，通过单个化分离克隆)并且在PCR反应中检查以确定卡那霉素抗性盒是否已经被正确地整合到ppsA基因中。

使用DNA分离试剂盒(Qiagen)从来自在Lbkan培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15mg/L卡那霉素)中的大肠杆菌W3110的卡那霉素抗性克隆的培养的细胞中分离用于PCR反应(“Phusion^TM高保真”DNA聚合酶，Thermo Scientific^TM)的基因组DNA。将大肠杆菌W3110野生型菌株的基因组DNA用作对照。用于PCR反应的引物是pps-7f(SEQ IDNO：9)和pps-8r(SEQ ID NO：10)。反向互补形式的引物pps-7f包含来自SEQ ID NO：1的nt167-188，并且引物pps-8r包含来自SEQ ID NO：1的nt 2779-2800。

大肠杆菌W3110野生型DNA在PCR反应中产生了2630bp的DNA片段，如对于完整基因所预期的。相比之下，在研究中的卡那霉素抗性克隆在PCR反应中产生了约1660bp的DNA片段，如预期的，如果该1.4kb PCR产物已经在ppsA基因中在由引物pps-5f和pps-6r限定的位点处整合。这个结果显示卡那霉素抗性基因已经成功地整合在ppsA基因的基因座处，并且因此ppsA基因已经被灭活。选择含有失活的ppsA基因的克隆并且将其标识为W3110-ΔppsA::kan。

6.为了消除卡那霉素选择标记，用质粒pCP20转化W3110-ΔppsA::kan并且在30℃下选择转化体。9.4kb载体pCP20公开于Cherepanov and Wackernagel(1995),Gene 158:9-14中。存在于载体pCP20上的是FLP重组酶的基因。FLP重组酶标识卡那霉素抗性基因的表达盒侧翼的FRT序列并且引起卡那霉素表达盒的去除。为此，将在30℃获得的克隆在37℃下孵育。在这些条件下，诱导FLP重组酶的表达并抑制pCP20载体的复制。

这个步骤的结果是其中ppsA基因已经失活并且已经恢复了对卡那霉素的敏感性的克隆(抗生素选择标记的所谓的“治愈”)。从ΔppsA突变体的基因组中去除卡那霉素盒允许引入另外的突变，以产生双重或多重突变体。

W3110-ΔppsA::kan在用pCP20质粒处理后恢复卡那霉素敏感性，检查如下：

-通过在LB和LBkan板上铺板：

LB板上的生长是阳性的，而在LBkan板上不再观察到生长，这表明卡那霉素盒成功地从基因组去除。

-通过PCR反应：

为此，从卡那霉素敏感克隆(Qiagen DNA分离试剂盒)中分离基因组DNA并且使用引物pps-7f(SEQ ID NO：9)和pps-8r(SEQ ID NO：10)用于PCR反应(“Phusion ^TM高保真”DNA聚合酶，Thermo Scientific^TM)。大肠杆菌W3110野生型DNA在PCR反应中产生大约2630bp的DNA片段，如对于完整基因所预期的。相反，卡那霉素敏感克隆在PCR反应中产生约300bp的DNA片段，其对应于同源重组后剩余的失活ppsA基因的5’和3’片段的预期大小。

将从这一步骤中分离的菌株标识为大肠杆菌W3110-ΔppsA。该菌株的突出之处在于以下事实：其包含灭活的ppsA基因，并且所述菌株恢复了对抗生素卡那霉素的敏感性。

实施例2：在菠萝泛菌中产生ppsA缺失突变体

用于基因分离和用于菌株发育的亲本菌株是菠萝泛菌(以菌株号DSM30070可商购自DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)。

基因失活的靶是来自菠萝泛菌的ppsA基因。来自菠萝泛菌的ppsA基因的DNA序列(Genbank GeneID：31510655)公开于SEQ ID NO：3中。核苷酸417–2801(由菠萝泛菌ppsA标识)编码具有SEQ ID NO：4(P)中公开的氨基酸序列的磷酸烯醇丙酮酸盐合酶蛋白(菠萝泛菌PpsA)。

使用如下文详述的来自Gene Bridges GmbH的

技术(描述于“Quick andEasy E.coli Gene Deletion Kit”的用户手册中，参见“Technical Protocol,Quick&EasyE.coli Gene Deletion Kit,by

Recombination,Cat.No.K006,Version 2.3,June 2012”和其中引用的参考文献，例如Datsenko and Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000):6640-6645)使菠萝泛菌ppsA基因失活。为此，使用质粒pKD13和pRedET。

-3.4kb质粒pKD13(图1)在登录号AY048744.1下在“GenBank”

基因数据库中公开。

-在“Quick and Easy E.coli Gene Deletion Kit”的使用者手册中公开了可商购的9.3kb质粒pRedET，参见“Technical Protocol,Quick&Easy E.coli Gene DeletionKit,by

Recombination,Cat.No.K006,Version 2.3,June 2012。”

为了利用Lambda Red系统通过同源重组灭活菠萝泛菌中的ppsA基因，进行以下步骤：

1.用质粒pRedET(所谓的“红色重组酶e”质粒)转化菠萝泛菌并分离四环素抗性克隆(称为菠萝泛菌x pRedET)。

2.在PCR反应(“Phusion^TM高保真”DNA聚合酶，Thermo Scientific^TM)中，用质粒pKD13(图1)和引物ppsapa-3f(SEQ ID NO：11)和ppsapa-4r(SEQ ID NO：12)的DNA产生适合于其失活的ppsA特异性DNA片段。

引物ppsapa-3f包含来自ppsA基因的5’区的49nt(SEQ ID NO：3中的nt 417-465)和与其连接的对质粒pKD13特异的20nt(在图1中称为“pr-1”)。

引物ppsapa-4r包含来自ppsA基因的3’区的49nt(处于反向互补形式的SEQ IDNO：3中的nt 2753-2801)和与其连接的对质粒pKD13特异的20nt(在图1中称为“pr-2”)。

使用质粒pKD13的DNA，使用引物ppsapa-3f和ppsapa-4r，产生1.4kb PCR产物，该产物在5’端和3’端均包含对来自菠萝泛菌的ppsA基因具有特异性的DNA的49nt部分。此外，PCR产物含有pKD13中所含的卡那霉素抗性基因的表达盒以及在卡那霉素表达盒的5’和3’末端侧翼，所谓的“FRT同向重复”(在图1中称为“FRT1”和“FRT2”)，DNA的短区段，这些短区段允许根据需要去除ppsA缺失突变体中的抗生素标记卡那霉素。

4.将对ppsA基因具有特异性并且包含卡那霉素抗性基因的表达盒的1.4kb PCR产物转化到P中。在30℃在LBkan板上分离菠萝泛菌x pRedET以及卡那霉素抗性克隆。LBkan板包含LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)、1.5％琼脂和15mg/L卡那霉素。

5.在LBkan板上纯化卡那霉素抗性克隆(即，通过单个化分离克隆)并且在PCR反应中检查以确定卡那霉素抗性盒是否已经正确地整合到ppsA基因中。

使用DNA分离试剂盒(Qiagen)从来自Lbkan培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15mg/L卡那霉素)中的菠萝泛菌的卡那霉素抗性克隆的培养的细胞中分离用于PCR反应的基因组DNA(“Phusion^TM高保真”DNA聚合酶，Thermo Scientific^TM)。使用菠萝泛菌野生型菌株的基因组DNA作为对照。用于PCR反应的引物是ppsapa-1f(SEQ ID NO：13)和ppsapa-2r(SEQ ID NO：14)。以反向互补形式，引物ppsapa-1f包含SEQ ID NO：3中的nt 281-302，并且引物ppsapa-2r包含SEQ ID NO：3中的nt 2901-2922。

菠萝泛菌野生型DNA在PCR反应中产生2640bp的DNA片段，如对完整基因所预期的。相比之下，研究中的卡那霉素抗性克隆在PCR反应中产生大约1670bp的DNA片段，如预期的，如果该1.4kb PCR产物已经在ppsA基因中在由引物ppsapa-3f(SEQ ID NO：11)和ppsapa-4r(SEQ ID NO：12)限定的位点处整合。这个结果显示卡那霉素抗性基因已经成功地整合在ppsA基因的基因座处，并且因此ppsA基因已经被灭活。选择含有灭活的ppsA Gen的克隆并且将其标识为菠萝泛菌-ΔppsA::kan。

实施例3：大肠杆菌W3110-ppsA-MHI的产生

通过使用本领域技术人员已知的Lambda Red重组和对基因修饰的反选择筛选的组合，产生大肠杆菌W3110-ppsA-MHI，其特征在于以引起酶活性减弱的方式的ppsA结构基因的突变(参见例如Sun et al.,Appl.Env.Microbiol.(2008)74:4241-4245)。基因ppsA-MHI的DNA序列公开于SEQ ID NO：5(ppsA-MHI)中，编码具有如SEQ ID NO：6(PpsA-MHI)所标识的序列的蛋白质。

程序如下：

1.通过PCR，使用引物pps-7f(SEQ ID NO：9)和pps-8r(SEQ ID NO：10)从大肠杆菌W3110的基因组DNA中分离包含ppsA WT基因(SEQ ID NO：1中的nt 167至nt 2800)，即cds以及5’和3’侧翼序列的部分的2.6kb DNA片段。

2.通过“定点”诱变将突变连续引入到ppsA WT基因中，从ppsA WT基因获得ppsA-MHI。这是使用来自Agilent的可商购的克隆试剂盒“QuickChange II定点诱变试剂盒”根据用户手册中的指令进行的。

3.为了将大肠杆菌W3110的ppsA WT基因交换为ppsA-MHI，首先进行的是使用引物pps-9f(SEQ ID NO：15)和pps-10r(SEQ ID NO：16)通过PCR从质粒pKan-SacB(图3)中分离3.2kb Kan-sacB盒。

质粒pKan-sacB包含卡那霉素(Kan)抗性基因和编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因的表达盒。

引物pps-9f含有从ppsA基因的起始ATG开始的30nt(SEQ ID NO：1中的nt 333-362)以及与其连接的对质粒pKa-SacB具有特异性的20nt(在图3中称为“pr-f”)。

引物pps-10r包含来自ppsA基因的终止密码子的30nt(处于反向互补形式的SEQID NO：1中的nt 2682-2711)和与其连接的对质粒pKa-SacB具有特异性的21nt(在图3中称为“pr-r”)。

4.用ppsA特异性3.2kb PCR产物转化大肠杆菌W3110 x pKD46(用于其生产，参见实施例1)，并分离卡那霉素抗性克隆。

5.将这些克隆接种到LBSC板(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、7％蔗糖、1.5％琼脂以及15mg/L卡那霉素)上。

含有整合的sacB基因的克隆从蔗糖产生毒性果聚糖，并且这导致生长抑制。选择此类克隆并且在PCR反应中检查以确定Kan-sacB盒是否已经正确地整合到ppsA基因中。先前已经使用DNA分离试剂盒(Qiagen)从来自Lbkan培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15mg/L卡那霉素)中的大肠杆菌W3110的卡那霉素抗性克隆的培养的细胞中获得用于PCR反应的基因组DNA(“Phusion^TM高保真”DNA聚合酶，Thermo Scientific^TM)。将大肠杆菌W3110野生型菌株的基因组DNA用作对照。用于PCR反应的引物是pps-7f(SEQ IDNO：9)和pps-8r(SEQ ID NO：10)。

大肠杆菌W3110野生型DNA在PCR反应中产生2630nt的DNA片段，如对于完整基因所预期的。相比之下，卡那霉素抗性克隆在PCR反应中产生大约3400nt的DNA片段，如预期的，如果3.2kb PCR产物已经在ppsA基因中由引物pps-9f(SEQ ID NO：15)和pps-10r(SEQ IDNO：16)限定的位点处整合。该结果显示Kan-sacB盒已经成功地整合在ppsA基因的基因座处，并且因此ppsA基因已经被灭活。选择含有整合的Kan-sacB盒的克隆并且将其标识为W3110-ΔppsA::kan-sacB x pKD46。

6.在下一步骤中，用Kan-sacB盒交换ppsA-MHI基因。为此，在PCR反应(“Phusion^TM高保真”DNA聚合酶，Thermo Scientific^TM)中，使用引物pps-11f(SEQ ID NO：17)和pps-12r(SEQ ID NO：18)，从来自步骤2的ppsA-MHI DNA片段扩增2.5kb DNA片段。以反向互补形式，引物pps-11f包含SEQ ID NO：1中的nt300-319，并且引物pps-12r包含SEQ ID NO：1中的nt2743-2763。

7.将2.5kb ppsA-MHI基因转化到大肠杆菌W3110-ΔppsA::kan-sacB x pKD46中，并且在没有卡那霉素的LBS板(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、7％蔗糖、1.5％琼脂)上选择克隆。只有不再含有活性sacB基因的克隆才能在LBS平板上生长。

将这些克隆接种到LBkan板上以便选择那些也不再含有活性Kan基因并且在卡那霉素存在下其生长被抑制的克隆。

选择在蔗糖存在下显示阳性生长并且在卡那霉素存在下显示阴性生长的克隆，并且在PCR反应中检查以确定Kan-sacB盒是否已经被ppsA-MHI基因正确地替换。

使用DNA分离试剂盒(Qiagen)从来自LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl)中的培养的细胞获得基因组DNA。将大肠杆菌W3110野生型菌株的基因组DNA用作对照。用于PCR反应的引物是pps-7f(SEQ ID NO：9)和pps-8r(SEQ ID NO：10)。通过DNA测序(Eurofins Genomics)分析预期大小为2630nt的PCR产物。含有正确整合的ppsA-MHI基因的克隆产生如在SEQ ID NO：5中公开的DNA序列，该DNA序列编码对应于来自SEQ ID NO：6的序列的蛋白质。选择含有含有突变V126M、R427H和V434I的正确ppsA-MHI基因的克隆并且将其标识为大肠杆菌W3110-ppsA-MHI。

实施例4：半胱氨酸生产菌株的产生

使用的半胱氨酸特异性生产质粒是来源于亲本载体pACYC184的质粒pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317(图4)。pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317是EP0885962B1中公开的质粒pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306的衍生物。质粒pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306不仅包含复制起点和四环素抗性基因(亲本载体pACYC184)，还包含cysEX等位基因，其编码具有降低的半胱氨酸反馈抑制的丝氨酸O-乙酰转移酶，和外排基因ydeD(ORF306)，其表达受组成型GAPDH启动子控制。

此外，pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317另外含有serA317基因片段，该片段在ydeD(ORF306)外排基因之后被克隆并且编码SerA蛋白的N-末端317个氨基酸(总长：410个氨基酸)。大肠杆菌serA基因公开于具有基因ID 945258的“GenBank”基因数据库中。serA317公开于Bell et al.,Eur.J.Biochem.(2002)269:4176-4184，在此称为“NSD：317”，并且编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的丝氨酸反馈抗性变体。serA317的表达受serA启动子控制。

菌株大肠杆菌W3110、大肠杆菌W3110-ΔppsA、大肠杆菌W3110-ppsA-MHI、菠萝泛菌和菠萝泛菌-ΔppsA::kan各自用质粒pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317(在以下实施例中称为pCYS)进行转化。转化根据现有技术通过电穿孔进行，如EP 0885962B1中所述。

在LBtet琼脂板(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、1.5％琼脂、15mg/L四环素)上选择带有质粒的转化体。通过QIAprep Spin Plasmid试剂盒(Qiagen)的质粒分离和限制性分析，针对转化的pCYS质粒检查所选择的转化体。培养包含正确掺入的质粒pCYS的转化体以检查ppsA酶活性(实施例5)并且确定半胱氨酸产生(实施例6和实施例7)。

实施例5：ppsA酶活性的测定

确定了各自用生产质粒pCYS转化的大肠杆菌菌株W3110、W3110-ΔppsA、W3110-ppsA-MHI的ppsA酶活性(实施例4)。将来自在50ml SM1培养基(其组成，参见实施例6)中的三种菌株的摇瓶培养的细胞通过离心10分钟沉淀并且用10ml 0.9％(w/v)NaCl洗涤一次。将细胞沉淀吸收在10ml的测定缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2)并制备细胞提取物。

使用来自MP Biomedicals的细胞匀浆器FastPrep-24^TM 5G。为此，在由制造商预制并且包含玻璃珠(“Lysing Matrix B”)的1.5ml管中破坏2x1ml的细胞悬浮液(3x 20秒，以6000rpm的摇动频率，在间隔之间每次暂停30秒)。将所得匀浆离心，并且将上清液用作用于确定活性的细胞提取物。

提取物的蛋白含量通过来自Thermo Fisher Scientific的Qubit 3.0荧光计使用“

蛋白测定试剂盒”根据制造商的说明书确定。

为了测定ppsA酶活性，根据制造商的说明书使用来自Sigma Aldrich的磷酸盐检测试剂盒“孔雀石绿磷酸盐测定试剂盒”(目录号MAK307)。其基础是通过ppsA酶活性在平衡反应(4)中用ATP转化丙酮酸盐以形成磷酸烯醇丙酮酸盐。这产生化学计量的磷酸盐，其用于测定活性。

-这些测定包含1ml测定缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl₂)。

-将各种测定在30℃下温育。

-在开始温育后0分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟，去除50μl的相应测定，添加至750μl的H₂O中，并且最后与来自“孔雀石绿磷酸盐测定试剂盒”的200μl的试剂混合。

-在温育30min之后，借助于磷酸盐标准曲线并且根据制造商的说明书，通过测定620nm处的吸光度来测定所形成的磷酸盐的量。最后，基于从相应测定中取样的时间，从所测量的磷酸盐的量确定U/ml提取物(1U＝μmol底物周转/分钟)中的ppsA酶活性。通过使ppsA酶活性基于1mg细胞提取物的总蛋白(U/mg蛋白)来计算比ppsA酶活性。

表1：ppsA酶活性的测定

实施例6：在摇瓶中产生半胱氨酸

作为用于在摇瓶中培养的预培养物，将另外包含15mg/L四环素的3mlLB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl)用相应的菌株接种并且在振荡器中在30℃和135rpm下温育16h。研究的菌株是大肠杆菌W3110、W3110-ΔppsA、W3110-ppsA-MHI，以及在第二实验中，是菠萝泛菌和菠萝泛菌-ΔppsA::kan，各自用生产质粒pCYS转化(实施例4)。

主培养物：此后，将相应的预培养物的一部分转移到含有30ml SM1培养基的300ml锥形瓶(带挡板的)中，所述SM1培养基含有15g/L葡萄糖、5mg/L维生素B1和15mg/L四环素。

SM1培养基的组成：12g/L K₂HPO₄、3g/L KH₂PO₄、5g/L(NH₄)₂SO₄、0.3g/L mgSO₄ x7H₂O、0.015g/L CaCl₂ x 2H₂O、0.002g/L FeSO₄ x 7H₂O、1g/L柠檬酸钠2H₂O、0.1g/L NaCl；1ml/L微量元素溶液。

微量元素溶液的组成：0.15g/L Na₂MoO₄ x 2H₂O、2.5g/L H₃BO₃、0.7g/LCoCl₂ x6H₂O、0.25g/L CuSO₄ x 5H₂O、1.6g/L MnCl₂ x 4H₂O、0.3g/L ZnSO₄x 7H₂O。

用足够的预培养物接种主培养物以建立0.025/ml的初始细胞密度OD₆₀₀/ml(主培养物的光密度，在600nm下测量)。从这开始，将整个30ml批次在30℃和135rpm下温育24h。

24h后，取样并且测定细胞密度OD₆₀₀/ml和培养上清液中的总半胱氨酸含量，Gaitonde(Gaitonde,M.K.(1967),Biochem.J.104,627-633)的比色测定用于半胱氨酸的定量测定。应当注意，在高酸性反应条件下，该测定不能区分半胱氨酸与半胱氨酸和丙酮酸盐的缩合产物2-甲基噻唑烷-2,4-二甲酸(噻唑烷)，这描述于EP 0885962B1中。L-胱氨酸(根据等式(2)通过两个半胱氨酸分子的氧化形成)同样在测定中通过用二硫苏糖醇在pH8.0的稀溶液中还原来检测为半胱氨酸。所提及的大肠杆菌菌株的结果报告在表2中，并且菠萝泛菌菌株的结果报告在表3中。

表2：在摇瓶中培养24小时后的细胞密度和总半胱氨酸含量

表3：在摇瓶中培养24小时后的细胞密度和总半胱氨酸含量

实施例7：在发酵罐中产生半胱氨酸：

在生产规模的补料分批发酵中，在大肠杆菌W3110 x pCYS、W3110-ppsA-MHI xpCYS与W3110-ΔppsA x pCYS之间进行了比较。

预培养物1：

将含有15mg/L四环素的20ml LB培养基用相应菌株接种于100ml Erlenmeyer烧瓶中并在振荡器(150rpm，30℃)上温育7小时。

预培养物2：

此后，将整个预培养物1转移到补充有5g/L葡萄糖、5mg/L维生素B1和15mg/L四环素的100ml SM1培养基中(对于SM1培养基的组成，参见实施例6)。

将培养物在30℃在锥形瓶(1L体积)中以150rpm振荡17h(Infors温育器振荡器)。在此温育之后，细胞密度OD₆₀₀/ml为3至5。

主要培养：

发酵在来自Eppendorf的“

平行生物反应器微生物系统”发酵罐中进行。使用总体积为1.8L的培养容器。发酵培养基(900ml)包含15g/L葡萄糖、10g/L胰蛋白胨(Difco)、5g/L酵母提取物(Difco)、5g/L(NH₄)₂SO₄、1.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L NaC1、0.3g/LMgSO₄ x 7H₂O、0.015g/L CaCl₂ x 2H₂O、0.075g/L FeSO₄ x 7H₂O、1g/L柠檬酸钠x 2H₂O和1ml微量元素溶液(参见实施例6)、0.005g/L维生素B1和15mg/L四环素。

最初通过在25％ NH₄OH溶液中泵送将发酵罐中的pH调节至6.5。在发酵过程中，通过用25％ NH₄OH自动校正将pH维持在6.5的值。为了接种，将100ml的预培养物2泵送到发酵罐容器中。因此，初始体积为约1L。培养物最初以400rpm搅拌，并用通过无菌过滤器灭菌的压缩空气以2vvm(空气体积/体积培养基/分钟)的通气速率通气。在这些起始条件下，在接种之前将氧探针校准至100％饱和。

将发酵过程中的O₂饱和度的目标值设定为30％。在O₂饱和度已经下降到目标值以下之后，启动调节级联以便使O₂饱和度恢复到目标值。这涉及首先连续地增加气体供应(至最大5vvm)并且然后连续地增加搅拌速度(至最大1500rpm)。

在30℃的温度下进行发酵。在2h的发酵时间之后，以1.5ml/小时的速率进料处于硫代硫酸钠x 5H₂O的无菌60％(w/v)储备溶液形式的硫源。

一旦发酵罐中的葡萄糖含量从最初的15g/L下降至约2g/L，连续计量加入56％(w/w)的葡萄糖溶液。调整进料速率，使得发酵罐中的葡萄糖浓度从那时起不再超过2g/L。使用来自YSI(Yellow Springs，Ohio，USA)的葡萄糖分析仪确定葡萄糖。

发酵时间是48h。此后，从发酵批次中取出样品，并且分开测定培养上清液(主要是L-半胱氨酸和噻唑烷)和沉淀物(L-胱氨酸)中的L-半胱氨酸及其衍生衍生物的含量。为此目的，在每种情况下使用Gaitonde(Gaitonde,M.K.(1967),Biochem.J.104,627-633)比色测定。沉淀中存在的L-胱氨酸首先必须在8％(v/v)盐酸中溶解，之后以相同方式定量。最后，半胱氨酸的总量被确定为球粒和上清液中的半胱氨酸的总和。

如表4中所概述，研究的菌株的细胞密度OD₆₀₀/ml是相当的，尽管对于对照菌株W3110xpCYS稍微更高。相比之下，半胱氨酸的体积产生(以g/L计)在W3110-ppsA-MHIxpCYS中以及在W3110-ΔppsAxpCYS中(高出约3倍)均显著高于含有野生型ppsA基因的对照菌株W3110xpCYS中。

因此，在受控的发酵条件下，对于生产规模所达到的结果是减弱活性或失活ppsA酶活性导致显著改进的半胱氨酸生产，因此是用于改进菌株的合适量度，该结果在之前没有描述，并且由于现有技术对于本领域技术人员来说也是出乎意料的。

表4：发酵罐中培养24小时后的细胞密度和总半胱氨酸含量

附图中使用的缩写：

bla：赋予氨苄青霉素抗性的基因(β-内酰胺酶)

rrnB term：用于转录的rrnB终止子

kanR：赋予卡那霉素抗性的基因

ORI：复制起点

pr-1：引物的结合位点1

pr-2：引物的结合位点2

FRT1：FLP重组酶的标识序列1

FRT2：FLP重组酶的标识序列2

araC：araC基因(阻遏物基因)

P araC：araC基因的启动子

P araB：araB基因的启动子

Gam：λ噬菌体Gam重组基因

Bet：λ噬菌体Bet重组基因

外显子：λ噬菌体外显子重组基因

ORI101：温度敏感的复制起点

RepA：质粒复制蛋白A的基因

sacB：左旋蔗糖酶基因

pr-f：引物的结合位点f(正向)

pr-r：引物(反向)的结合位点r

OriC：复制起点C

IHF：DNA结合蛋白IHF的结合位点(“整合宿主因子”)

CamR：赋予氯霉素抗性的基因

TetR：赋予四环素抗性的基因

P15A ORI：复制起点。

序列表

<110> 瓦克化学股份公司

<120> 改进的产生半胱氨酸的菌株

<130> xxx

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3000

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

tttgttcttc ccgtgatgca gacataattc tatgaaagca taaattaaaa acgcacagaa 60

gcgtagaacg ttatgtctgg tttataaaat gaaccttcaa ttttattttt tatgaaaaca 120

gcatttcatt tttatggttt cgtttatacc gatggtttat gtggaaattg tcgaagagag 180

cagatttgcg caacgctggg atcagtctta aaaagtaaaa aaatatattt gcttgaacga 240

ttcaccgttt ttttcatccg gttaaatatg caaagataaa tgcgcagaaa tgtgtttctc 300

aaaccgttca tttatcacaa aaggattgtt cgatgtccaa caatggctcg tcaccgctgg 360

tgctttggta taaccaactc ggcatgaatg atgtagacag ggttgggggc aaaaatgcct 420

ccctgggtga aatgattact aatctttccg gaatgggtgt ttccgttccg aatggtttcg 480

ccacaaccgc cgacgcgttt aaccagtttc tggaccaaag cggcgtaaac cagcgcattt 540

atgaactgct ggataaaacg gatattgacg atgttactca gcttgcgaaa gcgggcgcgc 600

aaatccgcca gtggattatc gacactccct tccagcctga gctggaaaac gccatccgcg 660

aagcctatgc acagctttcc gccgatgacg aaaacgcctc ttttgcggtg cgctcctccg 720

ccaccgcaga agatatgccg gacgcttctt ttgccggtca gcaggaaacc ttcctcaacg 780

ttcagggttt tgacgccgtt ctcgtggcag tgaaacatgt atttgcttct ctgtttaacg 840

atcgcgccat ctcttatcgt gtgcaccagg gttacgatca ccgtggtgtg gcgctctccg 900

ccggtgttca acggatggtg cgctctgacc tcgcatcatc tggcgtgatg ttctccattg 960

ataccgaatc cggctttgac caggtggtgt ttatcacttc cgcatggggc cttggtgaga 1020

tggtcgtgca gggtgcggtt aacccggatg agttttacgt gcataaaccg acactggcgg 1080

cgaatcgccc ggctatcgtg cgccgcacca tggggtcgaa aaaaatccgc atggtttacg 1140

cgccgaccca ggagcacggc aagcaggtta aaatcgaaga cgtaccgcag gaacagcgtg 1200

acatcttctc gctgaccaac gaagaagtgc aggaactggc aaaacaggcc gtacaaattg 1260

agaaacacta cggtcgcccg atggatattg agtgggcgaa agatggccac accggtaaac 1320

tgttcattgt gcaggcgcgt ccggaaaccg tgcgctcacg cggtcaggtc atggagcgtt 1380

atacgctgca ttcacagggt aagattatcg ccgaaggccg tgctatcggt catcgcatcg 1440

gtgcgggtcc ggtgaaagtc atccatgaca tcagcgaaat gaaccgcatc gaacctggcg 1500

acgtgctggt tactgacatg accgacccgg actgggaacc gatcatgaag aaagcatctg 1560

ccatcgtcac caaccgtggc ggtcgtacct gtcacgcggc gatcatcgct cgtgaactgg 1620

gcattccggc ggtagtgggc tgtggagatg caacagaacg gatgaaagac ggtgagaacg 1680

tcactgtttc ttgtgccgaa ggtgataccg gttacgtcta tgcggagttg ctggaattta 1740

gcgtgaaaag ctccagcgta gaaacgatgc cggatctgcc gttgaaagtg atgatgaacg 1800

tcggtaaccc ggaccgtgct ttcgacttcg cctgcctacc gaacgaaggc gtgggccttg 1860

cgcgtctgga atttatcatc aaccgtatga ttggcgtcca cccacgcgca ctgcttgagt 1920

ttgacgatca ggaaccgcag ttgcaaaacg aaatccgcga gatgatgaaa ggttttgatt 1980

ctccgcgtga attttacgtt ggtcgtctga ctgaagggat cgcgacgctg ggtgccgcgt 2040

tttatccgaa gcgcgtcatt gtccgtctct ctgattttaa atcgaacgaa tatgccaacc 2100

tggtcggtgg tgagcgttac gagccagatg aagagaaccc gatgctcggc ttccgtggcg 2160

cgggccgcta tgtttccgac agcttccgcg actgtttcgc gctggagtgt gaagcagtga 2220

aacgtgtgcg caacgacatg ggactgacca acgttgagat catgatcccg ttcgtgcgta 2280

ccgtagatca ggcgaaagcg gtggttgaag aactggcgcg tcaggggctg aaacgtggcg 2340

agaacgggct gaaaatcatc atgatgtgtg aaatcccgtc caacgccttg ctggccgagc 2400

agttcctcga atatttcgac ggcttctcaa ttggctcaaa cgatatgacg cagctggcgc 2460

tcggtctgga ccgtgactcc ggcgtggtgt ctgaattgtt cgatgagcgc aacgatgcgg 2520

tgaaagcact gctgtcgatg gctatccgtg ccgcgaagaa acagggcaaa tatgtcggga 2580

tttgcggtca gggtccgtcc gaccacgaag actttgccgc atggttgatg gaagagggga 2640

tcgatagcct gtctctgaac ccggacaccg tggtgcaaac ctggttaagc ctggctgaac 2700

tgaagaaata aaataaatcc ccggcggcgt ttagtcgccg gggttatgtg atccccgaag 2760

atgaaactta ttcaatctct tcacagacat cctgcgttaa acgccgcata atatcttttc 2820

ttaacaaaaa cttttgtatt ttacctgagg tagttcgcgg tagtttttcg attaccacga 2880

tatgttcagg atatttatat tttgcgaccc gtttacggct aaaaaaagcc actacctctt 2940

ccagcgataa tgaatgatgc ggcgctttca gcacgacata agcgcatgat cgttcaccta 3000

<210> 2

<211> 792

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Ser Asn Asn Gly Ser Ser Pro Leu Val Leu Trp Tyr Asn Gln Leu

1 5 10 15

Gly Met Asn Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Val Pro Asn Gly

35 40 45

Phe Ala Thr Thr Ala Asp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Asp Gln Ser Gly

50 55 60

Val Asn Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Thr Asp Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Thr Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Ile Arg Gln Trp Ile Ile

85 90 95

Asp Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Asn Ala Ile Arg Glu Ala Tyr

100 105 110

Ala Gln Leu Ser Ala Asp Asp Glu Asn Ala Ser Phe Ala Val Arg Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Ala Glu Asp Met Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln

130 135 140

Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Ala Val

145 150 155 160

Lys His Val Phe Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg

165 170 175

Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Val

180 185 190

Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Ser

195 200 205

Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ser Ala

210 215 220

Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ile Val

245 250 255

Arg Arg Thr Met Gly Ser Lys Lys Ile Arg Met Val Tyr Ala Pro Thr

260 265 270

Gln Glu His Gly Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp Val Pro Gln Glu Gln

275 280 285

Arg Asp Ile Phe Ser Leu Thr Asn Glu Glu Val Gln Glu Leu Ala Lys

290 295 300

Gln Ala Val Gln Ile Glu Lys His Tyr Gly Arg Pro Met Asp Ile Glu

305 310 315 320

Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg

325 330 335

Pro Glu Thr Val Arg Ser Arg Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Thr Leu

340 345 350

His Ser Gln Gly Lys Ile Ile Ala Glu Gly Arg Ala Ile Gly His Arg

355 360 365

Ile Gly Ala Gly Pro Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn

370 375 380

Arg Ile Glu Pro Gly Asp Val Leu Val Thr Asp Met Thr Asp Pro Asp

385 390 395 400

Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly

405 410 415

Gly Arg Thr Cys His Ala Ala Ile Ile Ala Arg Glu Leu Gly Ile Pro

420 425 430

Ala Val Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Met Lys Asp Gly Glu

435 440 445

Asn Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Ala

450 455 460

Glu Leu Leu Glu Phe Ser Val Lys Ser Ser Ser Val Glu Thr Met Pro

465 470 475 480

Asp Leu Pro Leu Lys Val Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu

500 505 510

Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Arg Ala Leu Leu

515 520 525

Glu Phe Asp Asp Gln Glu Pro Gln Leu Gln Asn Glu Ile Arg Glu Met

530 535 540

Met Lys Gly Phe Asp Ser Pro Arg Glu Phe Tyr Val Gly Arg Leu Thr

545 550 555 560

Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Pro Lys Arg Val Ile

565 570 575

Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Ser Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly

580 585 590

Gly Glu Arg Tyr Glu Pro Asp Glu Glu Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg

595 600 605

Gly Ala Gly Arg Tyr Val Ser Asp Ser Phe Arg Asp Cys Phe Ala Leu

610 615 620

Glu Cys Glu Ala Val Lys Arg Val Arg Asn Asp Met Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Val Glu Ile Met Ile Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala

645 650 655

Val Val Glu Glu Leu Ala Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly

660 665 670

Leu Lys Ile Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala

675 680 685

Glu Gln Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp

690 695 700

Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser

705 710 715 720

Glu Leu Phe Asp Glu Arg Asn Asp Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met

725 730 735

Ala Ile Arg Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly

740 745 750

Gln Gly Pro Ser Asp His Glu Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Glu

755 760 765

Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Gln Thr Trp

770 775 780

Leu Ser Leu Ala Glu Leu Lys Lys

785 790

<210> 3

<211> 3062

<212> DNA

<213> 菠萝泛菌

<400> 3

aagtcgtgcc tcgggcaggg aagtcgtaaa aacaagtgag ataatataag catgccttca 60

ggggcaagtg tagtctgggg catcgtttcc ctctcgcttt tgcatcatga cgtcacctgt 120

tcactctttt ttgcgccatt aaaaccgcct caggtgacag acaacgcctg tgtttgttgc 180

gcaacaaaaa cgccgcataa caggcagtaa aaaaaataat gagctaatta tcagcgtatt 240

agcaaaaaat aagggccttg cgcaacgctg aaaaaaacca ggcgcaattc tgaaactgtg 300

tctgagaatc tgctttaacg attcaacaga tcgtgtttaa tcagacgtta tgccaggctg 360

gatttgttaa tagcaggatt ttccatgtgc ccattcatta ataaaggatc agttcaatgt 420

ccaataaagg cgaacagccg ttagtacttt ggtacaacca gcttggcatg catgatgttg 480

atcgggtggg aggcaaaaat gcttctctgg gtgagatgat taccaatttg tcatctctgg 540

gcgtgtccgt tcccaacggt tttgcgacca cctcctgggc ctttaatcag tttcttgagc 600

agagcggtct gaaccagcgt atttatgctt tgctggatga caccaatatt gatgatgtgg 660

atcaactggc gaaggcgggt aagcagatac gccagtgggt agtcgaaacc ccgttccagc 720

ctgaactgga agccgcgatt ctttcggcct atgagcagct ctctgccgac gatgctgagg 780

catccttcgc cgtgcgctca tccgccaccg ccgaagatat gcctgacgcg tcctttgccg 840

gccagcagga aactttcctg aacgtgcagg gcatcgagtc agtcatggtg gcagtgaaac 900

acgtttatgc ctcactgttt aacgatcgcg ccatctccta tcgcgtccat cagggttacg 960

accatcgcgg cgtggcgctg tcggcgggga ttcagcgcat ggtgcgatcc gatctggcgt 1020

cctcaggggt catgttcacc attgataccg aatcgggctt tgatcaggtg gtgttcatta 1080

ccgccgcgtt gggcctgggt gaaatggtgg tacagggcgc ggtgaacccg gacgagtttt 1140

atgtgcacaa gccgacgctg gccgcgaaac gtcccgctat cgttcgccgc aacatgggct 1200

cgaaaaaggt gcggatggtt tacgccgact cgcgtgaaca tggcgagcag gtgcgcatcg 1260

aagatgtggc ggaagccgag cgcgatcgtt tctgtctgag cgatgccgaa gtggaggcgt 1320

tggcccatca ggcggtactg attgagcaac actacaagcg cccgatggat attgagtggg 1380

ccaaagacgg ccacaccggg aagttattta ttgtccaggc gcgccctgaa accgtgcgat 1440

ccaacggtca ggtcatggag cgttacagcc tgcagggaca gggcaaggtg gtgattgaag 1500

gccgtgcgat tggtcaccgc atcggcgccg gtaccgtcaa ggtcattcac gatatcagcg 1560

aaatgaaccg catcgaaaaa ggtgacgtgc tggtgaccga tatgaccgat cccgactggg 1620

aaccgatcat gaaaaaagcc tccgccattg tgacgaaccg cggcggccgt acctgccatg 1680

ccgcgattat cgcgcgtgag ctgggcatcc cggcggtggt tggctgtggc gatgccaccg 1740

agcggctgaa agagggacat accgttaccg tatcctgtgc tgagggcgat accggctatg 1800

tctacgatga actgctcgac ttcgacgtca ccagttcgca ggttgatacc atgccggacc 1860

tgccgcttaa aatcatgatg aacgtgggca acccggatcg cgcgttcgat ttcgcctgtt 1920

tgccaaacga aggggttggt ctggcgcggc tggaatttat tatcaaccgc atgatcggcg 1980

tgcatccaaa agcgttgctg gagttcgatc agcaaacccc tgaactgcag aagcagattc 2040

gtcagatgat gaaaggtttt gacgatccgg ttgagtttta catcgcccgt ctgaccgaag 2100

ggatcgcgac gctgggcgcg gcgttcgcgc cgaagcgcgt tattgtccgc ctgtcggatt 2160

ttaaaacgaa cgaatatgcc aatctggtgg gtggagaacg ttacgaaccc gaagaggaaa 2220

acccgatgct ggggttccgt ggcgcaggcc gctatgtctc cgagagtttc cgcgactgtt 2280

tcgcgctgga gtgcgaagcg gtgaagcgcg tacgcaacga gatggggctg accaacgtgg 2340

aaatcatggt gccctttgtg cgtacggtcg atcaggctca ggcggtggta gaggaattgg 2400

gtcgccaggg actgaagcgc ggcgagaacg ggctcaaggt cattatgatg tgtgaaatcc 2460

cctcgaatgc cctgctggcc gagcagtttt tacaacactt tgacggtttc tccatcggct 2520

ctaatgatat gactcagctg gcgctggggc tggatcgcga ctccggcgtg gtatctgcct 2580

tgtttgatga gcgtaatgag gcggtcaaag cgctgctgtc catggcgatt caggcggcga 2640

aaaaacaggg caaatacgta ggaatatgcg gtcaggggcc gtcagatcat caggatttcg 2700

cggcctggtt gatggagcag ggcatcgaca gtctgtctct gaatccggac accgtggtgg 2760

aaacctggtt aagcctggcg gcgctaaaca aacccgcctg aggtgatgga taacctccga 2820

tgccagaagg ccagcgcaag ctggcttttt tttttgtctt tttgacaggc aaaaaaaagc 2880

ccatcacagg ggatgggcaa agactacaca cagcaattct ttacgctact caggggaaat 2940

tagggcgttt agaaatcagt aacttgattt ccaacatagg aaacatggta ttcacacggc 3000

tcgctggcgt ctttaagaat cctcttatta gtttaaagga aataatattt tgacggctag 3060

gg 3062

<210> 4

<211> 794

<212> PRT

<213> 菠萝泛菌

<400> 4

Met Ser Asn Lys Gly Glu Gln Pro Leu Val Leu Trp Tyr Asn Gln Leu

1 5 10 15

Gly Met His Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Pro Asn Gly

35 40 45

Phe Ala Thr Thr Ser Trp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Glu Gln Ser Gly

50 55 60

Leu Asn Gln Arg Ile Tyr Ala Leu Leu Asp Asp Thr Asn Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Asp Gln Leu Ala Lys Ala Gly Lys Gln Ile Arg Gln Trp Val Val

85 90 95

Glu Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Ala Ala Ile Leu Ser Ala Tyr

100 105 110

Glu Gln Leu Ser Ala Asp Asp Ala Glu Ala Ser Phe Ala Val Arg Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Ala Glu Asp Met Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln

130 135 140

Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Ile Glu Ser Val Met Val Ala Val

145 150 155 160

Lys His Val Tyr Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg

165 170 175

Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Ile

180 185 190

Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Thr

195 200 205

Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ala Ala

210 215 220

Leu Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Lys Arg Pro Ala Ile Val

245 250 255

Arg Arg Asn Met Gly Ser Lys Lys Val Arg Met Val Tyr Ala Asp Ser

260 265 270

Arg Glu His Gly Glu Gln Val Arg Ile Glu Asp Val Ala Glu Ala Glu

275 280 285

Arg Asp Arg Phe Cys Leu Ser Asp Ala Glu Val Glu Ala Leu Ala His

290 295 300

Gln Ala Val Leu Ile Glu Gln His Tyr Lys Arg Pro Met Asp Ile Glu

305 310 315 320

Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg

325 330 335

Pro Glu Thr Val Arg Ser Asn Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Ser Leu

340 345 350

Gln Gly Gln Gly Lys Val Val Ile Glu Gly Arg Ala Ile Gly His Arg

355 360 365

Ile Gly Ala Gly Thr Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn

370 375 380

Arg Ile Glu Lys Gly Asp Val Leu Val Thr Asp Met Thr Asp Pro Asp

385 390 395 400

Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly

405 410 415

Gly Arg Thr Cys His Ala Ala Ile Ile Ala Arg Glu Leu Gly Ile Pro

420 425 430

Ala Val Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Leu Lys Glu Gly His

435 440 445

Thr Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Asp

450 455 460

Glu Leu Leu Asp Phe Asp Val Thr Ser Ser Gln Val Asp Thr Met Pro

465 470 475 480

Asp Leu Pro Leu Lys Ile Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu

500 505 510

Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Lys Ala Leu Leu

515 520 525

Glu Phe Asp Gln Gln Thr Pro Glu Leu Gln Lys Gln Ile Arg Gln Met

530 535 540

Met Lys Gly Phe Asp Asp Pro Val Glu Phe Tyr Ile Ala Arg Leu Thr

545 550 555 560

Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Lys Arg Val Ile

565 570 575

Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Thr Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly

580 585 590

Gly Glu Arg Tyr Glu Pro Glu Glu Glu Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg

595 600 605

Gly Ala Gly Arg Tyr Val Ser Glu Ser Phe Arg Asp Cys Phe Ala Leu

610 615 620

Glu Cys Glu Ala Val Lys Arg Val Arg Asn Glu Met Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Val Glu Ile Met Val Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Gln Ala

645 650 655

Val Val Glu Glu Leu Gly Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly

660 665 670

Leu Lys Val Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala

675 680 685

Glu Gln Phe Leu Gln His Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp

690 695 700

Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser

705 710 715 720

Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn Glu Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met

725 730 735

Ala Ile Gln Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly

740 745 750

Gln Gly Pro Ser Asp His Gln Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Gln

755 760 765

Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Glu Thr Trp

770 775 780

Leu Ser Leu Ala Ala Leu Asn Lys Pro Ala

785 790

<210> 5

<211> 2379

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg ctttggtata accaactcgg catgaatgat 60

gtagacaggg ttgggggcaa aaatgcctcc ctgggtgaaa tgattactaa tctttccgga 120

atgggtgttt ccgttccgaa tggtttcgcc acaaccgccg acgcgtttaa ccagtttctg 180

gaccaaagcg gcgtaaacca gcgcatttat gaactgctgg ataaaacgga tattgacgat 240

gttactcagc ttgcgaaagc gggcgcgcaa atccgccagt ggattatcga cactcccttc 300

cagcctgagc tggaaaacgc catccgcgaa gcctatgcac agctttccgc cgatgacgaa 360

aacgcctctt ttgcgatgcg ctcctccgcc accgcagaag atatgccgga cgcttctttt 420

gccggtcagc aggaaacctt cctcaacgtt cagggttttg acgccgttct cgtggcagtg 480

aaacatgtat ttgcttctct gtttaacgat cgcgccatct cttatcgtgt gcaccagggt 540

tacgatcacc gtggtgtggc gctctccgcc ggtgttcaac ggatggtgcg ctctgacctc 600

gcatcatctg gcgtgatgtt ctccattgat accgaatccg gctttgacca ggtggtgttt 660

atcacttccg catggggcct tggtgagatg gtcgtgcagg gtgcggttaa cccggatgag 720

ttttacgtgc ataaaccgac actggcggcg aatcgcccgg ctatcgtgcg ccgcaccatg 780

gggtcgaaaa aaatccgcat ggtttacgcg ccgacccagg agcacggcaa gcaggttaaa 840

atcgaagacg taccgcagga acagcgtgac atcttctcgc tgaccaacga agaagtgcag 900

gaactggcaa aacaggccgt acaaattgag aaacactacg gtcgcccgat ggatattgag 960

tgggcgaaag atggccacac cggtaaactg ttcattgtgc aggcgcgtcc ggaaaccgtg 1020

cgctcacgcg gtcaggtcat ggagcgttat acgctgcatt cacagggtaa gattatcgcc 1080

gaaggccgtg ctatcggtca tcgcatcggt gcgggtccgg tgaaagtcat ccatgacatc 1140

agcgaaatga accgcatcga acctggcgac gtgctggtta ctgacatgac cgacccggac 1200

tgggaaccga tcatgaagaa agcatctgcc atcgtcacca accgtggcgg tcgtacctgt 1260

cacgcggcga tcatcgctca tgaactgggc attccggcga tagtgggctg tggagatgca 1320

acagaacgga tgaaagacgg tgagaacgtc actgtttctt gtgccgaagg tgataccggt 1380

tacgtctatg cggagttgct ggaatttagc gtgaaaagct ccagcgtaga aacgatgccg 1440

gatctgccgt tgaaagtgat gatgaacgtc ggtaacccgg accgtgcttt cgacttcgcc 1500

tgcctaccga acgaaggcgt gggccttgcg cgtctggaat ttatcatcaa ccgtatgatt 1560

ggcgtccacc cacgcgcact gcttgagttt gacgatcagg aaccgcagtt gcaaaacgaa 1620

atccgcgaga tgatgaaagg ttttgattct ccgcgtgaat tttacgttgg tcgtctgact 1680

gaagggatcg cgacgctggg tgccgcgttt tatccgaagc gcgtcattgt ccgtctctct 1740

gattttaaat cgaacgaata tgccaacctg gtcggtggtg agcgttacga gccagatgaa 1800

gagaacccga tgctcggctt ccgtggcgcg ggccgctatg tttccgacag cttccgcgac 1860

tgtttcgcgc tggagtgtga agcagtgaaa cgtgtgcgca acgacatggg actgaccaac 1920

gttgagatca tgatcccgtt cgtgcgtacc gtagatcagg cgaaagcggt ggttgaagaa 1980

ctggcgcgtc aggggctgaa acgtggcgag aacgggctga aaatcatcat gatgtgtgaa 2040

atcccgtcca acgccttgct ggccgagcag ttcctcgaat atttcgacgg cttctcaatt 2100

ggctcaaacg atatgacgca gctggcgctc ggtctggacc gtgactccgg cgtggtgtct 2160

gaattgttcg atgagcgcaa cgatgcggtg aaagcactgc tgtcgatggc tatccgtgcc 2220

gcgaagaaac agggcaaata tgtcgggatt tgcggtcagg gtccgtccga ccacgaagac 2280

tttgccgcat ggttgatgga agaggggatc gatagcctgt ctctgaaccc ggacaccgtg 2340

gtgcaaacct ggttaagcct ggctgaactg aagaaataa 2379

<210> 6

<211> 792

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Ser Asn Asn Gly Ser Ser Pro Leu Val Leu Trp Tyr Asn Gln Leu

1 5 10 15

Gly Met Asn Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Val Pro Asn Gly

35 40 45

Phe Ala Thr Thr Ala Asp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Asp Gln Ser Gly

50 55 60

Val Asn Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Thr Asp Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Thr Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Ile Arg Gln Trp Ile Ile

85 90 95

Asp Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Asn Ala Ile Arg Glu Ala Tyr

100 105 110

Ala Gln Leu Ser Ala Asp Asp Glu Asn Ala Ser Phe Ala Met Arg Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Ala Glu Asp Met Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln

130 135 140

Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Ala Val

145 150 155 160

Lys His Val Phe Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg

165 170 175

Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Val

180 185 190

Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Ser

195 200 205

Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ser Ala

210 215 220

Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ile Val

245 250 255

Arg Arg Thr Met Gly Ser Lys Lys Ile Arg Met Val Tyr Ala Pro Thr

260 265 270

Gln Glu His Gly Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp Val Pro Gln Glu Gln

275 280 285

Arg Asp Ile Phe Ser Leu Thr Asn Glu Glu Val Gln Glu Leu Ala Lys

290 295 300

Gln Ala Val Gln Ile Glu Lys His Tyr Gly Arg Pro Met Asp Ile Glu

305 310 315 320

Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg

325 330 335

Pro Glu Thr Val Arg Ser Arg Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Thr Leu

340 345 350

His Ser Gln Gly Lys Ile Ile Ala Glu Gly Arg Ala Ile Gly His Arg

355 360 365

Ile Gly Ala Gly Pro Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn

370 375 380

Arg Ile Glu Pro Gly Asp Val Leu Val Thr Asp Met Thr Asp Pro Asp

385 390 395 400

Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly

405 410 415

Gly Arg Thr Cys His Ala Ala Ile Ile Ala His Glu Leu Gly Ile Pro

420 425 430

Ala Ile Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Met Lys Asp Gly Glu

435 440 445

Asn Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Ala

450 455 460

Glu Leu Leu Glu Phe Ser Val Lys Ser Ser Ser Val Glu Thr Met Pro

465 470 475 480

Asp Leu Pro Leu Lys Val Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu

500 505 510

Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Arg Ala Leu Leu

515 520 525

Glu Phe Asp Asp Gln Glu Pro Gln Leu Gln Asn Glu Ile Arg Glu Met

530 535 540

Met Lys Gly Phe Asp Ser Pro Arg Glu Phe Tyr Val Gly Arg Leu Thr

545 550 555 560

Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Pro Lys Arg Val Ile

565 570 575

Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Ser Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly

580 585 590

Gly Glu Arg Tyr Glu Pro Asp Glu Glu Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg

595 600 605

Gly Ala Gly Arg Tyr Val Ser Asp Ser Phe Arg Asp Cys Phe Ala Leu

610 615 620

Glu Cys Glu Ala Val Lys Arg Val Arg Asn Asp Met Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Val Glu Ile Met Ile Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala

645 650 655

Val Val Glu Glu Leu Ala Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly

660 665 670

Leu Lys Ile Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala

675 680 685

Glu Gln Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp

690 695 700

Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser

705 710 715 720

Glu Leu Phe Asp Glu Arg Asn Asp Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met

725 730 735

Ala Ile Arg Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly

740 745 750

Gln Gly Pro Ser Asp His Glu Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Glu

755 760 765

Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Gln Thr Trp

770 775 780

Leu Ser Leu Ala Glu Leu Lys Lys

785 790

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg gtgtaggctg gagctgcttc 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ttatttcttc agttcagcca ggcttaacca ctgtcaaaca tgagaattaa 50

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

attgtcgaag agagcagatt tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ttaacgcagg atgtctgtga ag 22

<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

atgtccaata aaggcgaaca gccgttagta ctttggtaca accagcttgg tgtaggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

tcaggcgggt ttgtttagcg ccgccaggct taaccaggtt tccaccacgc tgtcaaacat 60

gagaattaa 69

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ggcgcaattc tgaaactgtg tc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

aaagaattgc tgtgtgtagt ct 22

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg cctcacgctg ccgcaagcac 50

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ttatttcttc agttcagcca ggcttaacca agaacaactg ttcaccgtta g 51

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

caaaccgttc atttatcaca 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

catcttcggg gatcacataa c 21

Claims

1.一种适于发酵生产L-半胱氨酸的微生物菌株，其特征在于，

-由KEGG数据库中的编号EC 2.7.9.2标识的酶类的相对酶活性是失活的或相对于野生型酶的比活性是降低的，并且

-与具有由KEGG数据库中的编号EC 2.7.9.2标识的酶类的野生型酶活性的微生物菌株相比，所述适于发酵生产L-半胱氨酸的微生物菌株形成增加量的L-半胱氨酸

其中编码所述酶活性的基因由ppsA标识。

2.根据权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株是来自肠杆菌科或棒状杆菌科的菌株。

3.根据权利要求1或2所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株选自由大肠杆菌(Escherichia coli)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)组成的组。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株选自由大肠杆菌和菠萝泛菌组成的组。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株是大肠杆菌种的菌株。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株在ppsA基因中包含至少一个突变。

7.根据权利要求6所述的微生物菌株，其特征在于，突变的基因选自由来自大肠杆菌的ppsA基因、来自菠萝泛菌的ppsA基因和与这些基因同源的基因组成的组。

8.根据权利要求6和7中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，所述ppsA基因的编码DNA序列是SEQ ID NO：5。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，在所述菌株中，由KEGG数据库中的编号EC 2.7.9.2标识的酶类的相对酶活性相对于所述野生型酶的比活性降低至少25％。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，在所述菌株中，由KEGG数据库中的编号EC 2.7.9.2标识的酶类的相对酶活性相对于所述野生型酶的比活性降低至少70％。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株不具有由KEGG数据库中的编号EC 2.7.9.2标识的酶类的酶活性。

12.一种用于生产L-半胱氨酸的发酵方法，其特征在于，使用权利要求1至11中任一项所述的微生物菌株。