TW313589B

TW313589B -

Info

Publication number: TW313589B
Application number: TW081102201A
Authority: TW
Original assignee: Wacker Chemie Gmbh
Priority date: 1991-12-12
Filing date: 1992-03-24
Publication date: 1997-08-21
Also published as: FI113665B; HUT69802A; RU2154671C1; DE69208894T2; HU217795B; AU2426892A; CA2124214A1; HU9400796D0; CN1073209A; WO1993012235A1; SK279805B6; AU668359B2; DE69208894D1; BR9206902A; UA39861C2; CZ140694A3; FI942711A0; ES2084373T3; SK70094A3; JP2584409B2

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印11 ^13589 A7 _ B7 I 押 Π - 年1^日、」，、五、發明説明（1) #】无本發明相關於絲胺酸及其相鬭産物（特別是色胺酸〉之一般生物合成，以及該生物合成使用之方法與原料。絲胺酸僳許多細胞代謝物（包括：膽鹸、甘胺酸、半胱胺酸及色胺酸等極具經濟價值之化合物）生物合成中之主要中間産物。此外，絲胺酸僳一單磺供體，且佔經由四氫葉酸製備5,10 -亞甲基四氫葉酸時細胞對碩一單元總需求量之60至75¾。該等磺一單元僳用於許多不同生物合成途徑，包含··甲硫胺酸、肌苷一磷酸、其他嘌昤及若干嘧啶（例如：胸腺核苷及羥甲基胞核苷）等之合成。圖1所示之絲胺酸生物合成途徑，一般可適用於許多不同之組綣及徹生物。該途徑中之第一値步驟，像藉3 -磷酸甘油酸脱氫酶（PGD),將3-β酸-右旋-甘油酸（PGA)變成 3-磷酸羥基丙酮酸（ΡΗΑ)。「生化學報j 261:12179-12183 ( 1 9 8 0 )内，Tobey及Grant兩位曽合著一論文，將编碼PGD 之基因予以選殖化並定其序列，對於PGD次單元之胺基酸序列，亦有深入探討。在原核生物（特別是細菌）及微生物（例如：酵母）中，但並非在較高等之真核生物中，野生型PGD之活性像由細胞絲胺酸濃度抑制。該抑制作用曽經被作過動力學上之研究，且在變構物内進行過。Tobey及Grant,「生化學報j 261: 12179-12183 (1986); Dubrow 及 Pizer, 「生化學報」252: 1527-1551 (1977); McKitrick 及 Pizer，「細學報」141: 235-245 (1980)。在「細 _學報」106:972-982(1971)中，Tosa及Pizer 本紙張尺度逍用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央揉準局員工消費合作社印裝 °^3589 A7 _B7__ 五、發明説明（2 ) 曾就毒性絲胺酸類似物（左旋絲胺酸異羥胯酸）對大腸桿菌鐘株之影轡作過研究。選擇含有該類似物之生長培養基不同，可産生抗絲胺酸之變種。若干變種顯示：在一舆 PGD 無關之酵母（絲胺醯-轉移RNA合成酶）内，具有一種修飾作用。從某一變種内獲得之粗萃取物，其活性對絲胺酸之敏感度甚低（請參閲：「细®學報」106: 972-982 (1971); 圖5 ;表6 ;及第973頁左下欄，第977頁左下欐）。發明提要：本發明重點之一像具有一項特徽：编碼3 -磷酸甘油酸脱氫酶（PGD)之DNA,其對絲胺酸抑制作用之敏感度，較野生型者為低。亦即該DHA编碼之PGD,至少具有某濃度之酶活性對生物合成有用，而且將該活性保持在較野生型（未經修飾）PGD更高之絲胺酸濃度。在合意之具體實例中，野生型PGD僳黴生物PGD或酵母 PGD。更合意的是：重組DNA所编碼之PGD,在野生PGD之C-端25¾處構成一痼改變，最好在C-端50値胺基酸内。舉例言之，重组DNA可能编碼一種PGD,在部分或全部C-端構成短缺。更合意的是：除上述短缺外，重組DHA所编碼之PGD ，在 C -端（例如：V A L 3 6 3 舆 A S N 3 6 4 之間或 A L A 3 9 2 與 G L N3 9 4 之間）有一値插入，或形成另一改變。本發明之其他特戡是：a)具有上述重組DNA胺基酸序列之PGD; b)表現載體，該載體包括重組DNA及諝節DNA, 經適當定位及定向，可在宿主表現条统内表現該重组DNA; c)包括有該等表現載體之細胞；及d)藉培養該等細胞，以本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210XZ97公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __ _B7_ 五、發明説明（3 ) 年月日修正，掷，6.17補充着該等细胞，Μ製備絲胺酸或绦胺酸衍生物之方法。上述 c)中，該细胞最好經短缺成野生型SerA。另一具發實例，其一般特徵是：以工程設計之细胞（例如：該工程設計细胞包含一個重组基因建構），製備一種PGD-趲錄之傅訊RNA轉錄（該轉錄具有一個改變之3'端）， '該轉錄經該细胞之轉譯而產生PGD,該PGD對絲胺酸抑制作用之敏感度較野生型PGD者為低。本發明可使一涸重要的生物合成控制點失去控制作用，因此，位於該點下游之許多化合物（特別是含有絲胺酸及絲胺酸衍生物者，例如：色胺酸），其產量得K大增。其他由躲胺酸衍生而來之细胞代謝物（亦即，絲胺酸係該等代謝物生物合成過程中之主要中間產物），包括：膽鹼、甘胺酸、半胱胺酸及與碳一供艚有闞連之化合物，例如：甲硫胺酸、肌苷一磷酸、喋呤及若干嘧啶（例如：胸腺核苷及羥甲基胞核苷）。合意具體實例之說明： A .圄式：函一顯示由葡萄糖生物合成左旋-絲胺酸之步驟。圖二係Tobey與GranUM上述及）所提大腸菌絲胺酸基因之序列及由該基因演鏵而來之胺基酸序列。圖三顯示左旋絲胺酸及四氫綦酸經生物轉化而成甘胺酸及N5 , N 10 -亞甲基四氫葉酸。麗四顯示色胺酸之生物合成步骤。函五為如實驗例1所述自野生型SerA等位基因分別承本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 訂 3*3539 A7 A7 B7

五、發明説明（3-1 ) 載突變SerA等位基因SerA1459、 SerA1507及SerA1508之質嫌ρ〇1459、P1CB 1 50 7及PKB 1 508之質邇構築圓。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 躕六為如實驗例1所逑承載SerA1459之pKB1459限制画。画七為如實驗例1所述承《Se「A1507之pKB1507限制匾画八為如實驗例1所逑承®SerA15082pKB1508限制豳圏0 國九為如實驗例1所述自野生型SerA^位基因分別承載突變SerA等位基因SerA1509及SerA1510之質體PKB1509 及PKB1510之》艘構築画。鼷十為如實驗例1所述承載Ser*A1509之PKB1509限制圓。釀Η--為如實驗例1所述承載SerA1510之ΡΚΒ1510限制鼷。圓十二為如實驗例1所述自野生型Ser A等位基因分別承載突變SerA等位基因SerA1455、Ser*A1512及SerA1511之質β PKB1455、PKB1512及PKB1511之質臁構第國。經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝鼷十三為如實酴例1所述承載SerA1455之質《ΡΚΒ1455 限制画。圆十四為如實驗例1所述承戟SerA1512之質《ΡΚΒ1512 限制圓。画十五為如實驗例1所述承載SerA1511之質HPKB1511 限制画。 5 - 1 ~ 本紙張尺度適用中國國家橾隼（CNS ) A4规格（210X297公釐）五、發明説明（3-2 A7 _R7 年月~~日修正紙6· 1 7補充醑十六為如實驗例1所述分別承載突變SerA等位基因 Ser*A1530 及 SerA1531之質體 PKB1530 及 PKB1531之質體構築 _ ,係將質髁PKB1509及PKB1508之BaiHI/Xbal片段分別插入 PKB1511 之大 BastHI/Xbal片段。圄十七為如實驗例1所述承載Ser A1 5 3 0之PKB 1 5 3 0限制圖。匯十八為如實驗例1所逑承載SerA1531之PKB1531限制圓。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

T -V5 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 5-2 本紙朵尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 313589 經濟部中夬揉準局員工消費合作社印裝 A7 B7 _五、發明説明（4 ) 1 .基因重組之建構本發明合意具體實例之特徼是：絲胺酸及其衍生物之生物合成，亦即，藉生物合成，由絲胺酸衍生出上述之産物。依照本發明，該等化合物生物合成之第一値步驟，m 絲胺酸-非敏性PGD之製備，茲詳述如下：吾人曽確定：在PGD中有一特定之絲胺酸回饋調節區，且該區可經改變以降低絲胺酸敏感度，而PGD之活性則仍保持在有用之濃度。圖2顯示一待殊之PGD基因與胺基酸序列，該序列可供下列討論之參考。圖2之序列含有410 個胺基酸（包括第一痼胺基酸甲硫胺酸Met，僳自成熟蛋白質切割下來者）。無需破壞PGD活性而能減低絲胺酸敏感度之PGD區域，僳在分子C -端之25¾以内，但以50値C -端殘基較佳。屬於本發明範圍内PGD修飾之實例係：若干或全部C-端42個胺基酸之短缺，或該區内之插入或代替，該等修飾可減低絲胺酸之敏感度，但PGD之有用功能仍可保持不變。舉例言之，於Val 3 6 3及Asn 3 6 4之間，插入胺基酸殘基，將可使PGD之絲胺酸親和力Ki增加而超過野生型者，但 PGD之活性仍保持不變。短缺若干或全部C -端胺基酸殘基，亦可達成Ki之戯刺性增加。例如，將C-端殘基GTIRARLLY短缺，代之以ASLD, 可使Ki增加數痼量级，但PGD活性之有用濃度仍保持不變。本發明範赙内之其他插入，僳介於Ala 3 9 2及GU 3 9 4之間者 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -—•户 V ml .-¾ “ 訂本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A7 B7 五、發明説明（5 ) 除上述插入及修飾外，其他有用之修飾包含C-端之短缺。编碼上述絲胺酸-非敏性PGD之基因，可經由基因工程技術建造，其中包括：（1)编碼區3’端之改變，（2)C-端胺基酸之编碼，（3)藉載髏將宿主菌株轉形以表現改變之PGD 酶。經改變之酶，其具有候補資格者，傜藉下述方法，就其絲胺酸親和力（Ki)及PGD活性加以篩選（如以下所述）。 2.篩選基因重组之建構篩選由上述方法製得之基因建構，葆採用下列PGD活性及絲胺酸敏感度之測定法。對本發明而言雖非苛求，但為建立改變後酶之絲胺酸敏感度，一般仍需要PGD活性之測定法。如基因工程技術方面所週知者，酶活性隨酶分子總數之大小及毎個分子之催化活性而不同。所以，在比較PGD回饋變種之催化活性時，若要比較試樣間之相對催化活性，必須採取步驟，以適當控制該等試樣内PGD分子之相對數量。可完成此項工作之方法有很多種。因為在由截形絲胺酸基因轉形而成之細胞内建立基因表現濃度極為困難（由於生存能力減低），比較不同建構及野生型産生之PGD活性，應探用之最適當方法，像將改變之絲胺酸基因（含有標準調節要素）整合在一値單拷貝内，再收穫轉形劑，最後決定與野生型細胞之 P G D比較之相對催化活性。任何適於PGD活性测定之方法均可採用。藉McKitrick ，John C.及 Lewis I. Pizer 於 1 9 8 0 年，細菌學報 141 期，本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7B7 經濟部中央梂準局貝工消費合作社印裝五、發明説明（6 ) 第235至245頁，提供之方法，偵澍前反應或逆反應，亦可測定PGD活性。上述酶测定法適於澍定任何PGDSS (包含具有化學修飾 C-端者）之絲胺酸敏慼度。實施測定工作時，有絲胺酸之不同濃度存在。將有絲胺酸存在時之催化活性與無絲胺酸存在時之催化活性比較，可算出Ki。在絶大多數情況下，最好減低絲胺酸敏感度而PGD催化活性無太多改變。在其他合意之具醱實例中，亦可能期望回饋敏感度及催化活性均滅低。表.1所列具有3-磷酸甘油酸脱氫酶C -端胺基酸序列之建構（如下所述）亦可使用。表

SerA 序列 ’ Ki/“· Units w Α0Χ V——HIA AQYL OKA QHGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PGT- -IRA RLLY <0.1 .05 1455 ΜΕ V——NIA «YL CTTSA QM3Y WID IEAD EDVAEKAL -OA MKAI PASL D > 100 <0.1 1459 AEQG VIV > 100 H/A 1507 AEQG VL > 100 H/A 1508 AECK VCSR AKIA m ΟΚΑ CMIY WID IEAD EDVAEKAL -Ok MKAI PGT- -IRA RLLY 3.8 .05 1509 AEQG V——NIA AQYL OKA QMDY WID IEAD EDVAEKAL SRQA MKAI PGT- -IRA RLLY > 100 K/A 1510 AEQG V——HIA m QTSA QHGY WID M) EDVAEKAL L > 100 H/A 1511 AEQG V——KIA AQYL QfESA QHGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PGT- AIAR .RLLY > 100 H/A 1512 AEQG V——HIA AQYL OKA »CY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PVL > 100 N/A 1530 AEQG V ------—,........ - ~CSR A1RA RLLY > 100 N/A 1531 AEQG V--NIA /1QYL OISA QHGY WID IEAD EDVAEKAL---SR AIRA RLLY > 100 N/A 本紙張尺度逍用中國國家檩準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央梂準局員工消費合作社印裝 313539 at B7 五、發明説明（7 ) 因為製備测試建構、依據本發明使細胞轉形及测試絲胺酸對PGD活性之抑制作用等，均甚簡單，所以，具有修飾3’端之其他建構亦屬本發明之範醻。任何載體，凡能達成某一 PGD蛋白（該PGD蛋白對絲胺酸之抑制作用不夠敏感）之表現者，均與本發明有關。一般而言，若無容纳絲胺酸之空間存在，無回饋PGD之高階表現應予避免，蓋因絲胺酸或由絲胺酸衍生之代謝物中所形成之高細胞質濃度，可能對細胞産生毒寄。對任何可编錄回饋抑制PGD (該PGD具有正常催化活性及類似於天然基因之表現濃度）之建構而言，轉形作用將可能導致PGD表現之高濃度及細胞生存能力之減低。實際上，製得之絲胺酸，其高濃度之毒性，可選用於具有低PGD表現之變種。所以，雖然若干具體之實例中，利用多重拷貝質體之轉形作用，在建構之初始篩選方面有用，最好以單拷貝型態將Se「 A建構物染色體式地整合在基因组内。.此外，下述之染色體整合，將有助於回饋短缺PGD之活性測定。所以，在絶大多數之具體實例中，需要強催化活性之場合，最好利用適於單拷貝染色體整合之載髏。該等載體及其使用策略，均傷本專業技術界所熟知者。請參閲Backaan於1987年9 月1日所申請之專利申請案（U.S.S.N. 07/091,837)。有用之載體及建構物均可製得，用作酶在適當宿主内實施成功的轉形及表現，以産製預期之産物。達成該等目標之方法 ,偽技術專家所熟知者，而且，不受本發明所限。除改變之PGD-编碼DNA之外，表現載體含有其他不同要素，如下本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 經濟部中央揉準局負工消費合作社印袈五、發明说明（8 ) I 1 | 所述 0 1 1 | 第 — » 載體上出現之编碼序列 9 將伴有邇當之諝節要素 ( I 1 該等要素葆該等编碼序列之適當表現濃度所需要者 ) 9 其請先 1 1 中包含啓動子核插醱 Λ 結合部位及終止序列〇在絶大閱讀 1 背 1 多數情況下 9 天然綠胺酸調節序列將是分子催化活性部分之 1 之較佳來源 > 雖然 9 許多其他為業界所熟知或有待發現之注意 * 1 1 調節序列也可採用 0 項再 1 1 第二 f 编碼選擇性 Trrrt 標誌及 / 或通訊基因之序列 > 以及適當 § 寫 r Λ 之調節要素 1 最好亦出現在載釀上 0 該等選擇性檫誌之表頁、/ 1 現 > 在轉形爾之鑑定方面有用〇適當之 m 擇性標誌基因包 1 J I 含编碼安匹西林、四環 mb 僦素及氯徽素之基因 0 1 1 第三 > 質體 4«卜載體上複製起點之慶點 > 主要有賴於供應基因 1 訂以染色體之優點〇精於此技術之學者專家 9 均讚賞若干不 1 同之策略 9 藉該等策略 > 可利用複製起點之欠缺 » 以支援 1 I 染色體之整合 0 請參閲 B a c k 1 a η 等人在美國專利 4 , 7 43 , 1 5 46號内之專論。 i 1 一旦表現載體建造兀成 9 則可用一値含有轉錄單元 ( '線 i 编碼一個對絲胺酸不敏感之 P G D蛋白質）之載體 * 使適當之 1 1 宿主細胞轉形〇在大多數之情況下 9 若細胞内之内源性 1 i PGD蛋白質將被絲胺酸抑制，内源性S e r A基因被短缺而代 1 I 之以本發明之改變基因 9 則採用該等細胞將極為有用 0 該 1 1 等細胞糸統對絲胺酸相雜關之代謝物超量生産極為有用 0 公 1 | 認含有對絲胺酸敏感之蛋白質有原核生物及酵母 0 1 1 下列實驗例足以説明 * 但並不限制本發明 0 1 1 I - 10 - 1 1 1 1 本紙張尺度逍用中國國家#準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 313589 A7 B7 五、發明説明（9 ) 實驗例1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 编碼抗回餓3-磷酸甘油酸脱氳酶之Ser A基因等位基因之建造，大膜菌K12 SerA基因僳從一 Sau3A部分切割（選殖化至 PTR264之Bell部位内）分離在一6.4Kb DNA片段上。請參閲 :Backaan 等人之專利申請案（IKS.S.N. 07/285,128, 12/ 16/88)及Roberts等人，基因 1 2: 1 23 ( 1 9 8 0 )上之專論。該質體僳命名為PKB 1302。一値3Kb Sail至SphI之Η段（屬於ΡΚΒ1 3 02 DNA,其中含有SerA基因），經選殖化至 PUC19 内以産生PKB1321。將一傾3Kb Hindlll至Sail片段（含有 SerA基因）選殖化至PBR322内，則産生PKB1370。於SerA基因3’區内之限制部位，插人Xbal連接蘼，可製得编碼抗回饋3-磷酸甘油酸脱氬酶之Ser A等位基因。質醱PJCB1321至HincII之部分切割，在1793處産生鈍端，若在該處插入連接醱，則可産生：a ) p K B 1 4 5 9 ,編碼一個截形3 -磷酸甘油酸脱氫酶；b) PKB1507,编碼一偁截形3 -磷酸甘油酸脫氫酶；c) PKB1508,编碼一個含有四個胺基酸殘基插入之3 -磷酸甘油酸脱氫酶。 PKB1321之PstI消化，在1888處産生一個3’突出物。經濟部中央橾準局貝工消費合作社印裝由DNA聚合酶I内Kleno#片段之作用，可産生若干鈍端。連接艨像舆鈍端片段相連，而衍生來之質體有：⑴PKB1509 ，编碼一傾含有兩餹胺基酸插入之3-磷酸甘油酸脱氢酶， ©PO1510,编碼一值截形3-磷酸甘油酸脱氳酶。將pKB 1370之一嫡ΚρηΙ切割變成具有DHA聚合海I Klenow片段之 -1 1 -本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（1〇) 鈍端，並插入連結體産生之質體，以编碼截形3 -磷酸甘油酸脱氫酶，PKB 1 45 5及PKB1512,或具有兩値胺基酸殘基插入之3-磷酸甘油酸脱氫酶，pKB1511。將來自pKB 1 5 0 8之0.8 K b B a a Η I 至 X b a I 片段或來自 p K B 1 5 0 9 之 0 . 9 K b B a Β Η I 至 X b a I 片段，分別插人PKB1511之5.8 Kb BanHI至Xbal片段，可産生短缺質體PKB1530及PKB1531。製得之各種建構物，如表2所示：表 2 ' 等位基因質體限制部位連接體結果 Ser A 1455 pKB 1370 Kpn I CTAGTCTAGACTAG Truncated Ser A 1459 pKB 1321 Hind II CTAGTCTAGACTAG Truncated Ser A 1507 pKB 1321 Hind II CTCTAGAG Truncated Ser A 1508 pKB 1321 Hind II TGCTCTAGAGCA Insert Ser A 1509 pKB 1321 'Pst I GCTCTAGAGC Insert Ser A 1510 pKB 1321 Pst I TGCTCTAGAGCA Truncated Ser A 1511 pKB 1370 Kpn I GCTCTAGAQCA Insert Ser A 1512 pKB 1370 Kpn I TGCTCTAGAGC Truncated Ser A 1530 pKB 1511 + pKB 150« Hind II + Κρη I Deleted Ser A 1531 pKB 1511 + pKB 1509 Pst I + Kpn I Deleted -12- 本紙張尺度逍用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央揉準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明说明（11) 對所有之建構物，起始載體、所用之限制部位，及插入連結體之序列，均加以標示。絲胺酸之Ki值，如表1所示。另外，其中三痼建構物在染色體整合後之相對催化活性（如下所述）亦一併列出。N/A表示該建構並非染色體整合者，所以，活性濃度尚未標準化。3 .化學修飾精於此項技術者將了解：野生型PGD之C-端短缺及修钸，可用酶的方法或化學方法來達成，例如··不同之羧肽酶，包含羧肽酶Y或乳過氣化钧酶調節之碘化作用。4 .反意傳訊RNA之使用孩轉絲碼低编 t-f I - 滅 D I G 内 P 髏生種産一由，另經斷，僳截外法端此該 CO I 於能而訊傳中其含包可屬亦法方之度感敏，碼 A N 编 R D 訊FG 傳形意轉反或造然製天藉舆

成逹而 \J/ 列序酸糖核之 i 補互備分製部之區® 碼合编化 3 期之預列. 序 C 胺，絲5N ，造示製所是 3 亦圖酸如胺絲物 α 産物間産中間之中中之程中過程酸過葉酸氫胺四甘基備甲製亞 fto- 0 自昤，嘌以、所酸。按1 硫供甲一成磷合性乃般 ί甘肌含包之，需酸必胺所絲啶産嘧生干量若超及酸丨由 -.71 甘含昤包嘌中部其全，及用酸有胺均色统、条酸産胺生硫。菌甲統細、集多酸産許胺生對胱之酸胺3 .，圖色以5 特結 I 達之之示 0 胺甘半 ί甘肌含包哚能嘲可與者酸兩胺於絲在括，包難中困其之 -成例合為物成生合該物。生丨 (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 313589 A7 B7 能期物胺 ’合後絲縱表tr之可預生絲酸最：操 D 之明，對由入纟胺該現}PG當# 度或若加 Ϊ色對發ΓΡ性適本泡濃 \，須藉能人(t敏一: 及及外必 έ 僳可吾酸非及如率亡此内驟度，胺酸體例速死。基 Ϊ 步濃種色胺。載。成胞力養後胞變現絲用現佳合細 Ε 培)«最細 D 表以有表較之致性，ΓΡ之之PG上所別ΓΑ則酸導擇當(t成酸之成。待se，胺，選適。酸合胺明组度内之主色衡的不f)胺酸絲發在濃統過宿加平利度i色胺，本低¾¾.飾櫥增不不濃S1現色哚用減吲産修一圖之生酸 2 表因吲使可之生述形 } 試物産胺上。入經，現酸上轉 2)若謝胞絲 Η 成哚加。現發胺用以 (1。代細之Bac組吲酸制表上色若，月毒種主成目以胞胺限量株在，源说有兩宿形si可細絲所超菌能此來明胞該之所-S在有將有之細可因子發细成形成(-積酶驟酸之，縱 _'對形轉合酸累成步胺子現操五 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印袈結構可舆tr*p操縱子結構相結合（如安德森之美國專利4,371 614號所掲示者）。請參閲：例如：A GX15(PGx44), NRRL B -12262。總之，宿主應經重組以生産回饋非敏性PGD及（此處絲胺酸並非産物）促進絲胺酸轉化成預期之産物。此外，在許多情況下，希望使宿主菌株内可编碼回饋敏感性PGD之天然基因失去活性。如此則容許僅表現絲胺酸非敏性PGD蛋白質。可使天然基因失活之方法很多，包含：基因取代、短缺及失活。有關許多該等方法之説明及參考資料，詳載於Davis等人所著：高等細菌遣傳學（冷泉 -14 -本紙張尺度逍用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐）經濟部中央梯準局員工消費合作社印榘 A7 B7 五、發明説明（13 ) 港實驗室發行，1980年販）及以下所列參考資料，請參閲。在許多情況下，能將编碼序列之改變PGD之罩拷貝整合入宿主細胞基因組，則較佳。許多整合技術像眾所週知者。許多該等技術之説明及參考資料，均可在下列諸參考資料中發現，請參閲：闌木大基整合：Balakrishnan及 Backman (1988)基因 67: 97-103; recD 關連基因取代： Shevell等人（1988)於細®學報141: 235至245所著專文；其他：Shihavy等人所著（1984):基因融合實驗，冷泉港實驗室發行。若擬使天然基因失活，整合工作可在使天然基因失活之前、同時或之後實施。茲藉下列待定實驗例，對本發明作一説明。實驗例2 宿主菌株之製備：質體所生之SerA基因内之序列由一抗卡那徽素基因所取代。藉等位基因交換，可用該質體使宿主菌株Ser A基因失去活性，其詳細過程如下：

藉 P C 1 5 2 3 ( a r g I 6 1 , a r g F 5 8，S e r A 2 7，p u r* A 5 4 , t h r - 2 5 ，tonA49, relAl, SpoTI)(得自康州紐海文耶魯大學柯立基因儲備中心）之互補，從染色髏DNA (經舆Sau3Al部分消化），將YMC9UTCC 3 3 9 2 0 )之SerA區予以選殖化。將攜有Ser A基因之3 kb片段次選殖化成pUC19,則可産生一個稱作p〇 1321之質謾。自該質體，可將一 3kb Sail至Hind I'll片段再選殖化成PBR322，産生質體PKB1370。用一連接體將SerA -15 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央揲準局負工消费合作社印t A 7 B7 五、發明説明（1 4 ) 基因3'端之ΚρηΙ部位轉化成BanHI。所得SerA内之段則代之以來自pUC-4-KSAC(Pharnacia)(含有Tn903卡那徽素抗基因）之BaaHI片段。該新質體稱之為ΡΚΒ 1 42 9。一個 PBR322 衍生物，稱作 pKB701(ATCC39 7 7 2)(請參閲 USSN 0 6 / 7 5 7 , 0 1 9 )得以産生，其中，位於複製起點侧翼之Mbol 及TThlll 1則轉化成ΚρηΙ部位。來自PKB1429之Sail至Eco RI片段（含有SerA::KanR)，經遘殖化入PKB701，得以生成 PKB1438。PKB1438與ΚρηΙ消化則除去起點（Ori) B。將含有抗安匹西林编碼區及SerA::KanR之大片段予以環狀化，並用作YMC9之CaCl2轉形。轉形後，宿主YMC9細胞將置於安匹西林上。在此情況下，經由對應（同源）重组將圓形DNA 納入，抗安匹西林選殖得以在Ser A基因倒翼區内發展。在無安匹西林選擇存在之情浣下，藉Se「A基因倒冀區重複序列之對應（同源）重组，抗安匹西林分_物之生長，可造成抗安匹西林基因之損失。該等菌株像依照製造者之指示，利用A»pScreen (生化實驗室），由；8 -内醛胺酶之減産而鑑定者。在有及無絲胺酸存在之情況下，單菌落在培餐基上之重複劃線培養顯示出安匹西林敏感性選殖，該等選殖在棰少培養基上生長，需要絲胺酸，而且具有抗卡那徽素之性能。該一分離物經命名為KB875。實驗例3 藉等位基因交換實施改變SerA序列之染色體整合將S e r A 1 4 5 5等位基因傳入染色體所用之方法，舆實驗例2中用以傅入 SerA::KanR所用者相似。簡言之，攜有 -16 - 本紙張尺度逍用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁)

-C 訂 A7 _B7__— . 五、發明説明（I5 )

Ser>A1455等位基因之片段（Sail至^以^^經蘧殖化至？!^ 7 01。質髅之起點經K p η I消化而除去。經環狀化之D Μ A ,僳用以轉形為抗安匹西林，導致1株得以標定。於非選擇性生長後，使用 AmpScreen並褀製卡那徽素，0904 (SerA 1455)經予以分離，並顯示對安匹西林及卡那徽素KB904敏感。形成之SerA1544等位基因，可藉P1轉導而轉移成生産菌株。請參閲：Miller(1972)所著：分子遣傅學實驗，冷泉港出販公司發行，第201至205頁。實驗4 藉recD鼷連基因取代實施改變SerA序列之染色體整合將SerA1508等位基因移至染色醱可利用另外一種方法，藉自V2 2 0之P1轉導作用，將菌株0875變成recD(r*ecD, argA ： TnlO. A重undsen等人（1986) Proc. Acad. Sci.， U . S . A . 8 2 5 5 5 8 - 5 5 δ 2 ) ( D S Μ δ 8 2 3 )。用於核酸外切 _ V 之必需第三次單元之基因可産生JGP101。將質體PKB1508線狀化並用以轉形JGP101成絲胺酸原營養型微生物，産生JPG <· 經济部中央梂準局員工消费合作社印製 (请先閲讀背面之注意^項再填寫本頁) 103(如 Shevell等人，（1988)，細 _ 學報 1 70 3294至 3296) 。藉P1轉導作用，Ser*Al_5 08等位*因可移至生産菌株。 Miller等人，分子逋傳學實驗，冷泉港實驗室，第201至 205頁（1972)。超量生産代謝物之收獲為了絲胺酸相鼷代謝物之超量生産，細胞可用以生産絲胺酸敏感度低之PGD ，亦可在適當情況下，於發酵器内生長至靜止相。然後，細菌將可予以收獲及溶解，預期之 -17 _ 本紙法尺度逍用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐）經濟部中央榣準局員工消費合作杜印«- A7 B7 五、發明説明（U ) 代謝物亦將可依照標準生化程序製得。徹生物生長之條件、原理、參考資料及特定代謝物之收獲等，Crueger及 Crueger箸有專論述及（1982)(生物技術：工業微生物學教科書）及Herrmann及Somerville之專著：（1983)(胺基酸：生物合成及遣傳調節），一併供作參考。 18 本紙張尺度逍用中國國家梯準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

-1丄 3

8888 ABCD 504408 I 二 1 I 1 186382 oooool 二二二 654211 888888

iIE正六、申請專利範圍公告本經濟部中央揉準局I工消费合作社印聱 1 . 一種磷酸甘油較絲胺濉 1 X 61 21 121 41 181 61 241 81 3Q1 X01 361 121 421 141 481 161 541 181 601 201 661 221 721 241 781 261 841 281 901 301 961 321 1021 341 1081 3 61 1141 381 1201 401 重組D N A，該"ΊΠΓΓ稱編媽經修飾之徹生物或酵母3-酸脫氫®(PGD)，其對絲胺酸抑制作用之敏感度 -敏感野生型PGD者（其胺基酸序列如下所示）為低 ATGGCAAAGGTATCGCTtSGAGAAAGACAAGATTAAGTTTCTGCTGGTAGAAGGCGTGCAC MetAlaJ^ysValSerLauGluLysAspJiysIleLysPheLeilLeTaValGluGlyValHis caaaaggcgctggaaagccttcgtgcagctggttacaccaacktcgaatttcacaaaggc GlnLysAlaI*etiGluSe2：LeuArgAlaAlaGlyTyxthrAsiiIleGluPheHi3LysGly GCGCTGGATGATGAACAATTAAAAGAAXCCATCCGCGATGCCCACTTCATCGGCCTGCGA AlaLeuAspAspGluGlnLeuIiysGluSerlieArgAspAlaHisPhelleGlyLeuArg TCCCGTACCCAXCTGACTGAAGACGTGATCAACGCCGCaGAAAAACTGGTCGCTATTGGC 5βχΑτ9τΤίιτΗΐβΧ)βϊΐΤίιχ61ιιΑ3ρν3·1Ιΐ€Α3ηΑΐ3ΐΑ1&01αΙ(γ3ΐ(«ιν3·ΐΑ3^Ι1β〇1γ TGTTTCTGTATCGGAACAAACCAGGTTGS.TCTGGATGCGGCGGCAAAGCGCGGGATCCCG 工 lfcGlyThrAsnGlnValAspLeiiAspAlaAlaAlaLysArgGlyllePr。 GTATTTAACGCACCGTTCrCAAATACGCGCTCTGTTGCGGAGCTGGTGATTGGCGAACTG ValPhftAsnAlaProPheSerA3:a!ThrArgSerValAlaGluLeuValIleGly<31uX*eii CTGCTGCTATTGCGCGGCGTGCCGGAAGCCAATGCrAAAGCl Leu!<eTlLeuLeiiAi：9rGlyVaXP：r5>GiuAlaA3nAXaLysAlaHii LysIienAl2L2U.aGlySerPhe' 'GAAGO ：GluAl- GCACCGTGGC aHi&AxgGly· GTGTGGAAC yValTrpAan aArgGlyLysIiysIieuGlyllelleGlyTyrGly CATATTGGTACGCAATTGGGCArTCTGGCTGAiVTCGCTGGGAATGTATGrTTACTTTTAT Hi s 11 eGlyThxGlnLeaGly II eLeiiAX aGluS erXeuGlyMe t TyrValTyrPlieTy r GAXAXTC^VAAAtAAACTGCCGCTGGGCAACGCCACTCAGGiaCAGavrCTTTCTGACCrG AspIleGluAsnLysLeuProLeiaGlyAsnAlaiThrGlaValGlnHiaLeuSezAapLeu CTGAATATGAGCffi^TGGTGAG!ICTGCATGTACC^GaGaATCCGTCCACCAAAAATATG I««uAanMetSerAspValValSerIignfiri 3Valgr〇GlttA3aProSer^hrI.y aAanMet AXGGGCGCGAAAGAAATTTCACEAATGAAGCCCGGCTCOTGCTGATTaATGCTTCGCGC Met：glyAlaX<y，GluIla3erLepMetiL;y，gi:oGlySe3cLegTfeuIleA3DAlaSerArg· GGTaCTGTGGTGGArA!TTCCGGCGCTGTGTGaTGC^CrGGCGAGCaAACa.TCTGGCGGGG GlyThrValValAspIleProAlaJ^euCysAsplU.aLlieuXlaSerLysB-isLe'aAlaGly GO Al, GGCAATO aAlalleJ IGACGTATtCCCGACGGAACCGGCGAeCMlAGCGAICCATTTACCTCTCCG eAapValPheProThrGluProAlaTixrAsnSerAapPraPheTlirSerPro CTGTGTGAAnrrCGACAACGTCCTTCTGACGCCACACATTGGCGGTTCGACTCa^iftAGCG Ιίβυ^;/，<Ξ1υΡΙιβΑ3ρΑΒην4ΐΧ(βτ1ΕιβτιΤ1ιι:Ρ2：οΗ·1·，Ι1β<ϊ1γΘ1γ5βτΤΐιζ<；1：α。丄 uAla CAGGAGAAXATCGGCCTGGAAGTXGCGGGTAAArrGATCAAGTATTCTGACAATGGCTCA GlnGluAsnlleGlyLeuGluValAlaGlyLysLeuIleLysTyrSerAspAsnGlySex· ACGCTCTCTGCGGTGAACTTCCCGGAAGTCTCGCTGCCACXGCACGGTGGGCGTCGTCTG ^lrLeuSezAlaVaXAsnPheProGXuValSerLeuFroL^ufilsGlyGlyArgArgLe'u .CGAAAAf .sGluAsi .CCQTCCGGGCGTGCTAACTGCGCTGAACAAAATCTTCGCCGAG inAxgProGlyValLeuTlirAlaLeuAaziLy s II ePheAlaGlu CAGGGCGTCAACATCGCCGCGCAATATCTGCAAACTTCCGCCCAGATGGGTTATGTGGTT GlnGlyValAsnlleAlaAlaGlnTyrLeuGlnThrSerAiaGlnMetGlyTyrValVal attgatattgaagccgacgaagacgttgccgaaaaagcgctgcaggcaatgaaagctatt XXeAspIleGluAlaA^pGluA^pVaiAlaGluLysAlaljeuGlnAlaMetLyeAlaXle CCGGGTACCATTCGCGCCCGTCTGCTGTACTAA 1233 ProGlyThrlleAxgAlaArgLeuLeuTyrEnd 411 19 - 本紙張尺度逍用中國國家操準（CNS ) A4規格（：2Ι〇Χ297公釐） 60 20 120 4Q 180 60 240 80 300 100 360 120 420 140 480 16Q 540iao 600 200 660 220 720 240 780 260 840 280 900 300 960 320 1020 340 1080 360 1140 380 1200 400 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) i km m· —m mt -f 'f n^l----1vm* nm mi 訂 A 313589 A8 B8 C8 D8 Γ、申請專利範園g經修飾之PGD包括野生型C -端42個胺基酸殘基1及42間之2. 二種重組DNA ,該DNA像编碼經修飾之徹生物或酵母3-磷酸甘油酸脫氫酶（PGD),其對絲臃酸抑制作用之敏感度較緖胺酸-敏感野生型PGD者（其胺基酸序列如下所示）為低經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1 1 61 21 121 41 1SX 61 241 ax 301 101 361 121 421 141 481 161 541 181 601 201 66X .221 721 241 781 261 841 281 901 301 961 321 1021 341 1081 36X 1141 381 1201 401 ATGGCAAAGGTATCGeTGGAGAAAGACAAGArTAAGTTTCTGCTGGTAGAAGGCGTGCAC MetAlaLyaValSerLeuGluLysAspLysIleLysPheLeuLeuValGluGlyValHis CAAAAGGCGCTGGAAAGCC'TTCGiGCAGCTGGttACACCAACATCGAArTTCACAAAGGC GCGCTGGATGATGAACAATTAAAAGAATCCATCCGCGATGCCCACTTCATCGGCCTGCGA AlaLeuAapAspGluGlaLeuLysGluSerlleArgA.spAlaHisPhe 工 leGlyLenArg XCCCGTACCCATCTGACTGAAGACGTGATCAACGCCGCAGAAAAACTGGTCGCTATTGGC SerArgThrHislieurhxGluAspVal 工 leAanAlaAlaGluIiysIieuValAlalleGly TGTTTCTGTATCGGAACAAACCaGGTTGATCT'GGATGCGGCGGCAAAGCGCGGGATCCCG CyaPheCysIleGlyTtudAsnGlnValAspLeuAapAlaAX.aAi.aljysArgGly 工 lePro GTATTTAACGCACCGTTCTCAAATACGCGCTCTGrrGCGGAGCTGGTGATTGGCGAACTG ValPheAsnAXaProPheSerAsnThrArgSerValAlaGluLeuVallleGlyGluXe'u (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)> 60 20 120 4Q 180 60 240 80 300 100 360 120 420 140 480 160 540 180 600 200 6S0 220 720 240 780 260 840 280 900 300 960 320 1020 340 1080 360 1140 380 1200 400 A GGAA.C 'rpA-sn CTGCTGCTATTGCGCGGCGTGCCGi^VAGCCaATGCTAAAGCGCACCGTGGCGTGTG LeuLeuLeuLe _ _ jcgcgcggcaaaaagctgggtatcatcggctacggt euArgGlyValBroGluAlaAsnA-laXyaAlaHisArgGlyValT; AAACTGGCGGCGGGT'TCTTTTGAAGC LySerPheGluAl， Ly sLeuAi aAl aGl^ aArgGlyLysLysLeuGlylle 工 leGlyTyrGly CATAXTGGTACGCAATTGGGCArrCTGGCXGAAXCGCTGGGAAXGTATGXTXACTTTTAT HisXleGlyXIirGinLeTiGlylleL.euAl.aGluSerLe'aGXyMet.TyrValTyrPheTyr GATATTGaAAATAAACTGCCGCTGGGCAACGCCACTCAGGTACAGCAT' AspIleGluAsnLysLeuProIieiiGiyAsnAlaThrGlnValGlnflis: 'CTTTCTGACCTG I»euSerAspX*eu 、1T AGAATCCG InAsnPrc roGlnAsriProSexTSirLysAsnitet VTGCTTCG snAlaSex MatGlyAIaLysGluIleSerLeuMecLysProGlySeriteuLeuIleAsr erArg GGTACTGTGGTGGATATTCCGGCGCTGTGTGATGCGCTGGCGAGCAAACATCTGGCGGGG GlyTtixValValAspIleProAlaLeuCysAspAlai^xiAlaSerLysSisI^uAlaGly GCGGCAATCGACGTATTCCCGACGGaACCGGCGACCAAIAGCGATCCATTTACCTCTCCG AlaAlalleAapValPheProThrGluProAlaKirAsnSerAspPiroPheTlirSezPrO CTGTGTGAATTCGACAACGTCCTTCXGACGCCACACATTGGCGGTTCGACTCAGGAAGC' LeuCysGluPheAspAanValLeuLeuThrfroHialleGlyGlySerfThrGlnGluAli CAGGAGAATATCGGCCTGGAAi GinGluAanXleGlyLeuGluV; ‘GTTGO ValAl; ：GGGTAAAtTGATCAAGTATTCTGACAATGGCXCA aGlyLysLeuIleliysTyrSerAapAanGlySer ACGCTCTCTGCGGTGAACTTCCCGGAAGTCTCGCTGCCACTGCACGGTGGGCGTCGTCTG ThrLeuS*rAlaValAsnPheProGluValS©rLe\iProLeuHi.3GlyGlyArgArgLen ATGi Met: ；CACATCCACSAAAft.CCGTCCGGGCGTGCTAACTGCGCTGAACAAAATCTTCGCCQAG ‘HisIleHisGluAanArgProGlyValLeuThrAlaLeuAanLysIlePheAlaGlu CAGGGCGTCAACATCGCCGCGCAATATCTGCAAACTTCCGCCCAGATGGGTTATGXGGTT GlnGlyValAsxi 工 leAlaAlaGlnTyrlieuGlrLThxSeiiAlaGlnMetGlyTyarValVal ATTGATATTGAAGCCGACGAAGyVCGTTGCCGAAAAAGCGCTGCAGGCAATGAAAGCTATT IleAspIleGluAlaAspGluAspValAlaGluLysAlaLLeuGlnAlaMetliysAlalle CCGGGTACCATTCGCGCCCGTC'TGCTGTACTAA 1233 ProGlyThrlleArgAlaArgLeuLeuTyrEnd 411 -20 - 本纸铢尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） A8 B8 C8 ____ D8 六、申請專利範圍該經修飾之PGD,在野生型C，»42齒胺基酸殘基1及42間之位置上包括一值胺基酸插入。 3. 如申請專利範園第2項之重組DNA,其中該插入僳介於野生型PGD内VAL363及△5〇6 4之間或介於其&1^3 92及01^394 之間。 4. 如申讅專利範園第1或第2項之重組DNA,其中該重组 DNA像编碼遘自具有下述胺基酸序列之PGD I AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVAEKAL· ~QA MKAI PASL D I I AEQG VLV I I AEQG VL· I I AEQG VCSR ΑΝΙΑ AQYL QTSA QHGY WID IEAD EDVAEKAL —QA MKAI PGT- -IRA RLLY I I AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVAEKAL SRQA MKAI PGT- -IRA RLLY 1 I AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVAEKAL L I I AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVAEKAL —QA MKAI PGT- AIRA RLLY I I AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL· —QA MKAI PVL -1 I AEQG V--------------------------------------------CSR AIRA RLLY I I AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL----------SR AIRA RLLY I ..二 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印11 本纸張尺度遗用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）