CZ285915B6 - Materiály a metody pro biosyntézu serinu a produktů odvozených od serinu - Google Patents
Materiály a metody pro biosyntézu serinu a produktů odvozených od serinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285915B6 CZ285915B6 CZ941406A CZ140694A CZ285915B6 CZ 285915 B6 CZ285915 B6 CZ 285915B6 CZ 941406 A CZ941406 A CZ 941406A CZ 140694 A CZ140694 A CZ 140694A CZ 285915 B6 CZ285915 B6 CZ 285915B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- aeqg
- qtsa
- edvaekal
- aqyl
- iead
- Prior art date
Links
- 108010038555 Phosphoglycerate dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 17
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 8
- 241000772991 Aira Species 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 9
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- LFLUCDOSQPJJBE-UHFFFAOYSA-N 3-phosphonooxypyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)COP(O)(O)=O LFLUCDOSQPJJBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N (6R)-5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C1)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 1
- MJEQLGCFPLHMNV-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1-(hydroxymethyl)pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CN(CO)C(=O)N=1 MJEQLGCFPLHMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150058734 A gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010046914 Exodeoxyribonuclease V Proteins 0.000 description 1
- 102000019236 Exonuclease V Human genes 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010030161 Serine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 102100040516 Serine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150072344 argA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016693 dipotassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- -1 pKB1455 and pKB1512 Proteins 0.000 description 1
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L potassium L-tartrate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Tires In General (AREA)
- Epoxy Resins (AREA)
- Ceramic Products (AREA)
Abstract
DNA kodující 3-fosfoglycerát dehydrogenasu (PGD) se sníženou citlivostí k inhibici serinem ve srovnání s divokým typem PGD - tj. DNA, kodující PGD, která má alespoň nějakou enzymatickou aktivitu použitelnou pro biosyntézu a která si udržuje tuto aktivitu při vyšších hladinách serinu než (nemodifikovaná) PGD divokého typu. Jsou také popsány: a) PGD, mající aminokyselinovou sekvenci výše popsané zkonstruované DNA, b) expesní vektory, obsahující zkonstruovanou DNA a regulační DNA umístěnou a orientovanou pro expresi zkosntruované DNA v hostitelském expresním systému, c) buňky, obsahující takové expresní vektory a d) způsoby produkce serinu a produktů odvozených od serinu kultivací takových buněk.
ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká zkonstruované DNA, kódující 3-fosfoglycerát dehydrogenasu (PGD), se sníženou citlivostí k inhibici serinem ve srovnání s divokým typem PGD. Dále se týká 3fosfoglycerát dehydrogenasy, mající aminokyselinovou sekvenci kódovanou zkonstruovanou DNA, expresního vektoru, obsahujícího tuto zkonstruovanou DNA, buňky, obsahující tuto zkonstruovanou DNA a způsobu produkce požadovaného produktu, kterým je serin nebo cholin, glycin, cystein nebo tryptofan.
Dosavadní stav techniky
Serin je primární meziprodukt v biosyntéze velkého množství buněčných metabolitů, zahrnujících takové ekonomické důležité sloučeniny jako je cholin, glycin, cystein a tryptofan. Navíc serin figuruje jako jediný donor uhlíku a je odpovědný za 60 až 75 % buněčné celkové potřeby C] jednotek při produkci 5,10-methylentetrahydrofolátu z tetrahydrofolátu. Tyto Ci jednotky jsou užívány v mnoha různých biosyntetických cestách, zahrnujících syntézy methioninu, inosin monofosfátu, jiných purinů a některých pyrimidinů (např. thymidinu a hydroxymethyl-citidinu).
Cesta biosyntézy šeřinu uvedená na obr. 1 je obecně dostupná mnoha různými tkáněmi a mikroorganismy. Prvním provedeným stupněm v této cestě je konverze 3-fosfo-D-glycerové kyseliny (PGA) na 3-fosfohydroxypyrohroznovou kyselinu (PHA) působením enzymu 3fosfoglycerát dehydrogenasy CPGD). Byl klonován a sekvenován gen, kódující PGD a byla dedukována aminokyselinová sekvence PGD subjednotky. (Tobey a Grant, J. Biol. Chem. 261:12179-12183(1980)).
U prokaryot (zejména bakterií) a mikroorganismů, jako jsou kvasinky, ale ne u vyšších eukaryt, je aktivita divokého typu PGD inhibována buněčnými serinovými hladinami. Tato inhibice byla kineticky studována a byla zpracována v různých pracích Tobey a Grant; J. Biol. Chem., 261:121 79-12183 (1986), Dubrow a Pizer, J. Biol.Chem. 252:1527-1551 (1977), McKitrick a Pizer, J. Bacteriol, 141:235-245(1980).
Tosa a Pizer, J. Bacteriol. 106:972-982 (1971) studovali vliv normálně toxického serinového analogu, L-serinhydroxamátu, na kmen E. coli. Selekce na růstovém médiu, obsahujícím tento analog, poskytla mutanty rezistentní k šeřinu. U některých mutantů bylo zjištěno, že mají modifikaci v enzymu nevztaženému k PGD, seryl-tRNA syntetase. Surový extrakt jednoho mutantu vykazuje PGD aktivitu se sníženou citlivostí k šeřinu (viz. J. Bacteriol. 106:972-982 (1971), obr. 5, tabulka 6 a viz str. 973, spodek levého sloupce, str. 977, spodek levého sloupce).
Podstata vynálezu
Jeden aspekt vynálezu obecně poskytuje DNA kódující 3-fosfoglycerát dehydrogenasu (PGD) se sníženou citlivostí k inhibici serinem ve srovnání s divokým typem PGD - tj. DNA kódující PGD, která má alespoň nějakou hladinu enzymatické aktivity, použitelnou pro biosyntézu a která si takovou aktivitu udržuje při vyšších hladinách šeřinu, než je tomu u (nemodifikovaného) divokého typu PGD.
Předmětem předloženého vynálezu tedy je zkonstruovaná DNA, kódující 3-fosfoglycerát dehydrogenasu (PGD), se sníženou citlivostí k inhibici serin ve srovnání s divokým typem PGD,
-1 CZ 285915 B6 kde tato DNA kóduje PGD, obsahující alespoň inzerci mezi aminokyselinami 363 a 364, nebo inzerci mezi aminokyselinami 394 a 395, nebo inzerci mezi aminokyselinami 403 a 404, nebo deleci aminokyselin 364 až 402, nebo deleci aminokyselin 395 až 403, nebo deleci 46 Cterminálních aminokyselin, nebo deleci 45-C terminálních aminokyselin, nebo deleci kterékoliv 5 ze 7 C-terminálních aminokyselin, která kóduje PGD, obsahující následující sekvence aminokyselin
| AEQG | V--- -NIA | AQYL | QTSA | QMGY | WID | IEAD | EDVAEKAL | --QA | MKAI | PÁSL | D; | |
| AEQG | VLV; | |||||||||||
| AEQG | VL; | |||||||||||
| AEQG | VCSR ΑΝΙΑ | AQYL | QTSA | QMGY | WID | IEAD | EDVAEKAL | --QA | MKAI | PGT- | -IRA | RLLY |
| AEQG | V----NIA | AQYL | QTSA | QMGY | WID | IEAD | EDVAEKAL | SRQA | MKAI | PGT- | -IRA | RLLY |
| AEQG | V----NIA | AQYL | QTSA | QMGY | WID | IEAD | EDVAEKAL | L; | ||||
| AEQG | V--- -NIA | AQYL | QTSA | QMGY | WID | IEAD | EDVAEKAL | --QA | MKAI | PGT- | AIRA | RLLY. |
| AEQG | V----NIA | AQYL | QTSA | QMGY | WID | IEAD | EDVAEKAL | --QA | MKAI | PVL; |
AEQG V............... CSR AIRA RLLY;
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL----------SR AIRA, RLLY;
AEQG VCSR ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTIRARLL;
AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTIRARLL;
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTIRARL;
AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTIRAR;
AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTIRA;
AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTIR;
AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGTI;
AEQG V---, -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGT;
výhodně tato zkonstruovaná DNA, která kóduje PGD, obsahující alteraci v 50 C-terminálních aminokyselinách divokého typu PGD.
Dále je předmětem vynálezu zkonstruovaná DNA, která kóduje PGD, obsahující C-terminální deleci divokého typu PGD. Dále se vynález týká zkonstruované DNA, ve které C-terminální alterace zahrnuje inzerci do sekvence divokého typu PGD, obzvláště inzerci mezi VAL 363 a ASN 364 nebo mezi ALA 392 a GLN 394 divokého typu PGD.
Zkonstruovaná DNA podle vynálezu, kde tato DNA kóduje PGD, má výhodně jednu z následujících aminokyselinových sekvencí
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -- QA MKAI
PÁSL D,
AEQG VLV,
AEQG VL,
AEQG VCSR ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -- QA MKAI
PGT- -IRA RLLY,
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL SRQA MKAI
PGT- -IRA RLLY,
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL L,
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI
PGT- AIRA RLLY,
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PVL,
AEQG V---.... CSR
AIRA RLLY,
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL---------SR AIRA RLLY,
-2CZ 285915 B6 místo 52 C-terminálních aminokyselin divokého typu PGD.
Dále je předmětem předloženého vynálezu 3-fosfoglycerátdehydrogenasa, mající aminokyselinovou sekvenci kódovanou výše uvedenou zkonstruovanou DNA, expresní vektor, obsahující výše uvedenou zkonstruovanou DNA a regulační DNA, umístěnou a orientovanou pro expresi uvedené zkonstruované DNA v hostitelském expresním systému.
Také je předmětem předloženého vynálezu buňka, obsahující výše uvedenou zkonstruovanou DNA a regulační DNA, umístěnou a orientovanou pro expresi uvedené zkonstruované DNA v uvedené buňce, obzvláště buňka, která je deletována pro divoký typ ser-A.
Konečně je předmětem předloženého vynálezu způsob produkce požadovaného produktu, kterým je serin nebo cholin, glycin, cystein nebo tryptofan, který zahrnuje kultivaci buňky, obsahující uvedenou zkonstruovanou DNA a regulační DNA, umístěnou a orientovanou pro expresi uvedené zkonstruovaná DNA v uvedené buňce a získání požadovaného produktu. Výhodně je uvedeným produktem serin.
Vynález poskytuje odstranění kontroly důležitého biosyntetického kontrolního bodu, čímž zvyšuje produkci mnoha sloučenin ve směru od tohoto bodu, zahrnujících, zejména serin a produkty odvozené od šeřinu jako je tryptofan. Jiné buněčné metabolity odvozené od šeřinu (tj. serin je první meziprodukt v jejich biosyntéze) zahrnují cholin, glycin, cystein s C(-donorzávislé sloučeniny jako je methionin, inosinmonofosfát, puriny a některé pyrimidiny (například thymidin a hydroxymethylcytosin).
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 znázorňuje stupně biosyntézy L-serinu z glukózy.
Obr. 2 je sekvence E. coli ser - A genu uváděná Tobey-em a Grantem (viz citace dříve) a aminokyselinová sekvence vydedukovaná z genu.
Obr. 3 znázorňuje biokonverzi L-serinu a tetrahydrofolátu na glycin s N5, N10-methylentetrahydrofolátu.
Poskytnutí PGD necitlivého k šeřinu
1. Geneticky zpracované konstrukce.
Výhodná provedení vynálezu poskytují biosyntézu šeřinu a produktů odvozených od šeřinu, např. produktů popsaných výše, získaných biosyntézou ze šeřinu. První stupeň v biosyntéze těchto sloučenin podle vynálezu je poskytnutí PGD necitlivé k šeřinu, jak je to diskutováno dále.
Bylo stanoveno, že zde existuje specifická serinová zpětná vazba, ovlivňující domény PGD a že domény mohou být alterovány pro snížení citlivosti k šeřinu při udržení vhodných hladin PGD aktivity. Obr. 2 ukazuje jednu výhodnou PGD genetickou a aminokyselinovou sekvenci, která může být použita pro srovnání v následující diskusi. Sekvence na obr. 2 obsahuje 410 aminokyselin (včetně počátečního Met, který je ze zralého proteinu odštěpen. Doména PGD, která může snižovat serinovou citlivost, bez narušení PGD aktivity, je v C-terminálních 25 % molekuly, nejvýhodněji jí je 50 C-koncových zbytků.
Příklady PGD modifikací, které spadají do vynálezu jsou delece některých nebo všech Cterminálních 42 aminokyselin, nebo inzerce nebo substituce v takovém regionu, který redukuje citlivost k šeřinu při udržení použitelné PGD funkce. Například inzerce aminokyselinových
-3CZ 285915 B6 zbytků mezi Val 363 a Asn 364 bude zvyšovat K; PGD oproti divokému typu, při udržení PGD aktivity.
Dramatičtější zvýšení v K; se dosáhnou delecí některých nebo všech C-terminálních aminokyselinových zbytků. Například, delece C-terminálních zbytků GTIRARLLY a nahrazení ASLD zvyšuje K; o několik řadů, při udržení použitelné PGD aktivity. Jinými inzercemi v rozsahu vynálezu jsou inzerce mezi Ala392 a Gln394.
Jiné použitelné modifikace zahrnují delece od C-konce navíc k inzercím a modifikacím diskutovaným výše.
Geny, kódující k šeřinu necitlivou PGD popsanou výše, mohu být konstruovány technikami genetického inženýrství, které zahrnují alteraci 3' konce kódujícího regionu, kódujícího Cterminální aminokyseliny a pak transformaci hostitelského kmene svehikulem pro expresi alterovaného PGD enzymu.
Kandidáti alterovaných enzymů jsou screenováni (jak je popsáno dále) na serinovou afinitu (K) a PGD aktivitu způsoby, které jsou obecně popsány dále.
2. Screening geneticky zpracovaných konstrukcí.
Ve screeningu genetických konstrukcí vyrobených výše popsanými metodami, byly použity následující zkoušky PGD aktivity a serinové citlivosti.
I když není pro vynález kritická, je zkouška PGD aktivity obecně nezbytná za účelem zjištění stupně serinové citlivosti alterovaného enzymu. Jak je v oboru známo, je enzymová aktivita funkcí celkového počtu enzymových molekul a katalytické aktivity každé molekuly. Tak ve srovnání katalytické aktivity PGD zpětnovazebných variant, stupně musí být podniknuty kroky adekvátní kontroly relativního počtu PGD molekul u vzorků, se kterými je relativní katalytická aktivita porovnávána. Existuje řada způsobů, kterými to lze provést. Nicméně proto, že je obtížné adekvátně stanovit hladinu exprese genu v buňkách transformovaných zkrácenými ser A-geny (díky snížené viabilitě), nej vhodnější cestou pro porovnání PGD aktivity produkované z různých konstruktů a divokého typuje chromozomální integrace alterovaného ser A-genu, obsahujícího standardní regulační prvky v jediné kopii s následujícím shromážděním transformantů a stanovením relativní katalytické aktivity ve srovnání s PGD z divokého typu buněk.
Může být použita jakákoliv metoda vhodná pro měření PGD aktivity. PGD aktivita může být měřena detekcí buď přední, nebo reverzní reakce metodou popsanou McKitrickem Johnem C. a Lewisem I. Pizerem (1980) J. Bacteriol. 141 235-345.
Enzymatická zkouška popsaná výše je vhodná pro stanovení serinové citlivosti pro jakýkoliv PGD enzym, zahrnující ty, které mají chemicky modifikovaný C-konec. Zkouška se provádí za přítomnosti různých hladin šeřinu. Katalytická aktivita v přítomnosti šeřinu je srovnávána s katalytickou aktivitou za nepřítomnosti šeřinu a vypočte se KP
Ve většině případů bude výhodné snížit serinovou citlivost bez významné změny PGD katalytické aktivity. V ještě dalších provedeních může být žádoucí snížit jak zpětnovazebnou citlivost, tak katalytickou aktivitu. Dále je možno použít konstrukce, mající C-terminální aminokyselinovou sekvenci 3-fosfoglycerát dehydrogenas uvedené v tabulce 1.
-4CZ 285915 B6
Tabulka 1
C-terminální aminokyselinové sekvence 3-fosfoglycerát dehydrogenas
SerA sekvence ki/gm jednotky
WT 1455 1459
1507
1508
1509
1510
1511
1512
1530
1531 aeqg v— -nia aqyl qtsa qmgy wid iead edvaekal -qa mkai pgt- -irarlly AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PÁSL D AEQG VLV
AEQG VL
AEQG VCSR ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PGT- -IRA RLLY AEQG V— -NIA AQY“ QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL SRQA MKAI PGT- -IRA RLLY AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL L
AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PGT- AIRA RLLY
AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PVL
AEQG V— ---------------------------- -- -CSR AIRA RLLY
AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL----- -SR AIRA RLLY
| <o,l | 0,05 |
| >100 | <0,01 |
| >100 | N/A |
| >100 | N/A |
| 3,8 | 0,05 |
| >100 | N/A |
| >100 | N/A |
| >100 | N/A |
| >100 | N/A |
| >100 | N/A |
| >100 | N/A |
Jiné konstrukce s modifikovanými 3' konci také spadají do rozsahu předloženého vynálezu, protože je jednoduché připravit testované konstrukty a transformované buňky podle předloženého vynálezu a testovat na serinovou inhibici PGD aktivity.
Jakýkoliv vektor, který vede k expresi PGD proteinu postrádající citlivost k inhibici serinem se týká předloženého vynálezu. Obecně by však za nepřítomnosti citlivosti k šeřinu, mohlo být dosaženo vysokých hladin exprese zpětné vazby prosté PGD i když výsledné cytoplasmické hladiny šeřinu nebo od šeřinu odvozených metabolitů mohou být pro buňku toxické. Obecně u jakéhokoliv konstruktu, kódujícího zpětnovazebně inhibovanou PGD s normální katalytickou aktivitou a expresními hladinami podobnými hladinám nativního genu, by transformace měla vést k vysokým hladinám PGD exprese a zvýšené buněčné viabilitě. Toxicita vysokých hladin produkovaného šeřinu může ve skutečnosti selektovat mutanty se zvýšenou PGD expresí. Zatímco transformace za použití multi-kopiových plasmidů může být vhodná v počátečním screeningu konstruktů s určitými provedeními, je preferována chromosomální integrace ser-A konstruktů vjediných kopiích do genomu. Alternativně, chromosomální integrace jak je popsána dále, usnadňuje měření aktivity zpětné vazby deletované PGD. Ve většině provedení, kde je očekávána nebo požadována silná katalytická aktivita, je výhodné použít vektorů vhodných pro jednokopiovou chromosomální integraci. Mnoho takových vektorů a strategií pro jejich použití je v oboru známo. Viz např. Backman, U.S.S.N. 07/091837, podáno 1. září 1987 - citován jako odkaz. Vhodné vektory a konstrukty mohou být získány úspěšnou transformací a expresí enzymu ve vhodném hostiteli pro produkci požadovaného produktu. Prostředky pro dosažení tohoto jsou dobře známy odborníkům v oboru a nejsou podstatou předloženého vynálezu. Navíc k alterované PGD-kódující DNA, bude expresní vektor obsahovat různé jiné dále popsané prvky.
Za prvé, kódující sekvence přítomné ve vektoru budou spojeny s vhodnými regulačními prvky nezbytnými pro vhodnou hladinu exprese kódujících sekvencí, zahrnujícími promotory, ribosomová vazebná místa a koncové sekvence. Ve většině případů nativní ser-A regulační sekvence bude preferovaným zdrojem katalyticky aktivní části molekuly, i když je známo, že může být použito mnoho jiných regulačních sekvencí, které jsou známy v oboru nebo ještě mohou být objeveny.
Za druhé, je preferováno, že sekvence, kódující selektivní markéry a/nebo reportér geny, spolu se vhodnými regulačními prvky, budou také přítomny ve vektoru. Exprese takových selektivních markérů je použitelná při identifikaci transformantů. Vhodné selektivní markerové geny zahrnují geny kódující ampicilin, tetracyklin a chloramfenikol.
Za třetí, požadavek na počátek replikace na plasmidovém vektoru závisí velmi na požadavku udržení genů chromosomálně nebo extrachromosomálně. Odborníkům v oboru budou zřejmé
-5CZ 285915 B6 různé strategie, ve kterých může být využita ztráta počátku replikace pro promotování integrace do chromosomu, viz např. Backman a spol., US patent 4743546, uváděný zde jako odkaz.
Jakmile je zkonstruován expresní vektor, může být vhodná hostitelská buňka transformována 5 vektorem, obsahujícím transkripční jednotku, kódující k šeřinu necitlivý PGD protein. Ve většině případů je vhodné použít buňky, o kterých je známo, že endogenní PGD protein je inhibován serinem a ve kteiých je endogenní ser-A gen deletován a nahrazen alterovaným genem podle vynálezu. Takové buněčné systémy jsou vhodné pro nadprodukci od šeřinu odvozených metabolitů. Buňkami, známými, že obsahují k šeřinu citlivé proteiny jsou prokaryota io a kvasinky.
Pro všechny konstrukty jsou uvedeny počáteční vektor, použité restrikční místo a sekvence inzertovaného íinkeru. K; hodnoty pro serin jsou uvedeny v tabulce 1, jakož i relativní katalytické aktivity pro tři z těchto konstruktů po chromosomální integraci (popsána dále). N/A 15 znamená, že konstrukce nebyly chromosomálně integrovány a jejich hladina aktivity proto nebyla standardizována.
3. Chemické modifikace
Odborníkům v oboru bude zřejmé, že delece nebo modifikace C-konce divokého typu PGD mohou být provedeny enzymaticky nebo chemicky, např. různými karboxypeptidasami, včetně karboxypeptidaxy Y nebo laktoperoxidasou zprostředkovanou jodací.
4. Použití „antisence“ mRNA
Alternativně je možné snižovat serinovou citlivost in vivo generováním PGD-kódujících transkriptů zkrácených na 3' konci prostřednictvím produkce „antisense“ mPNA, které obsahují nukleotidové sekvence komplementární k částem 3' kódujícího regionu nativních nebo transformovaných PGD kódujících sekvencí.
5. Produkce požadovaných sloučenin
Jak je uvedeno na obr. 3, je serin meziproduktem v přípravě glycinu. Je také meziproduktem v produkci N5, N10-methylentetrahydrofolátu, který je generalizovaným Cl donorem podstatným 35 pro syntézu methioninu, purinů (včetně inosinu) a některých pyrimidinů. Nadprodukce šeřinu z fosfoglycerátu může být dosaženo ve velkém rozsahu bakteriálních produkčních systémů, zahrnujících produkční systémy pro cholin, glycin, cystein, methionin, tryptofan a všechny puriny včetně inosinmonofosfátu.
Následující specifické příklady ilustrují vynález.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce ser-A genových alel kódujících zpětnovazebně rezistentní 3-fosforylglycerát dehydrogenasy
E.coli K12 ser-A gen byl izolován na 6,4 Kb DNA fragmentu ze Seu3A parciálního štěpu klonovaného do Bell místa pTR264. Viz Backman a spol., U.S.S.N. 07(285128, podáno 16. prosince 1988 a Roberts a spol., Gene 12:123 (1980). Tento plasmid byl nazván pKB1302. 3
-6CZ 285915 B6
KbSalI až SpHI fragment pKB1302 DNA, obsahující Ser-A gen byi klonován do pUC19 pro přípravu pKB1321. pKB1370 byl generován klonováním 3 Kb HindlII až Sáli fragmentu, obsahujícího ser-A gen do pBR322.
Alely ser-A kódující zpětnovazebně rezistentní 3-fosfoglycerát dehydrogenasy byly generovány inzercí Xbal linkerů na restrikční místa v 3' regionu ser-A genu. Parciální štěpení plasmidu pKB1321 pomocí HindlI poskytuje tupé konce v poloze 1793, kde inzerce linkerů poskytla: a) pKB1459, kódující zkrácenou 3-fosfogIycerát dehydrogenasu, b) pKB1507, kódující zkrácenou 3-fosfoglycerát dehydrogenasu a c) pKB1508, který kóduje 3-fosfoglycerát dehydrogenasu s inzertem čtyř aminokyselinových zbytků.
Pst digesce pKB 1321 poskytuje 3' přesah v poloze 1888. Tupé konce byly generovány působením Klenowova fragmentu DNA polymerasy I. Linkery byly ligovány ke fragmentům s tupými konci a získanými plasmidy byly pKB1509, které kódují 3-fosfoglycerát dehydrogenasu s inzertem dvou aminokyselin a pKB1510, který kóduje zkrácenou 3-fosfoglycerát dehydrogenasu. KpnI digest pKB1370 byl upraven na tupé konce Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I a inzertované linkery poskytly plasmidy, kódující zkrácenou 3-fosfoglycerát dehydrogenasu, pKB1455 a pKB1512, nebo 3-fosfoglycerát dehydrogenasu se dvěma aminokyselinovými zbytky jako inzerty, pKB1511. Delece plasmidů pKB1530 a pKB1531 byly generovány inzercí 0,8 Kb BamHI kXbal fragmentu zpKB1508 nebo 0,9 Kb BamHI kXbal fragmentu z pKB1509, do 5,8 Kb BamHi k Xbal fragmentu pKB1511.
Následující tabulka 2 shrnuje různé připravené konstrukty.
Tabulka 2
| Ser A alela | plasmid | Restrikční místo | linker | výsledek |
| Ser A 1455 | pKB 1370 | KpnI | CTAGTCTAGACTAG | zkrácený |
| Ser A 1459 | pKB 1321 | Hind II | CTAGTCTAGACTAG | zkrácený |
| Ser A 1507 | pKB 1321 | HindlI | CTCTAGAG | zkrácený |
| Ser A 1508 | pKB 1321 | HindlI | TGCTCTAGAGCA | inzert |
| Ser A 1509 | pKB 1321 | Pstl | GCTCTAGAGC | inzert |
| Ser A 1510 | pKB 1321 | Pstl | TGCTCTAGAGCA | zkrácený |
| Ser A 1511 | pKB 1370 | KpnI | GCTCTAGAGCA | inzert |
| Ser A 1512 | pKB 1370 | KpnI | TGCTCTAGAGC | zkrácený |
| Ser A 1530 | pKB 1511 +pKB 1508 | Hind Π + Κρη I | deletovaný | |
| Ser A 1531 | pKB 1511 +pKB 1509 | Pst I + Κρη I | deletovaný |
Příklad 2
Příprava hostitelského kmene
Sekvence vlastní plasmidu nesoucímu ser-A gen byly nahrazeny genem rezistence ke kanamycinu. Tento plasmid pak byl použit k inaktivaci hostitelského kmene ser-A genu pomocí alelové výměny následujícím způsobem:
ser-A region YMC9 (ATCC33920) byl klonován ze chromosomální DNA, částečně štěpen pomocí Sau 3AI, komplementací PC1523 (arglól, argF58, serA27, purA54, thr-25, tonA49, relAl, spoTl), získaného z Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT. 3 kb fragment, nesoucí ser-A gen byl subklonován do pUC19 za zniku plasmidu nazvaného pKB1321. Z tohoto plasmidu byl 3 kb Sáli až HindlII fragment reklonován do pBR322 za poskytnutí plasmidu pKB1370. KpnI místo na 3'konci ser-A genu bylo konvertováno na BamHI linkerem a BamHI fragment vložený do výsledného ser-A byl nahrazen BamHI fragmentem zpUC-4-KSAC (Pharmacia), obsahujícím Tn903 gen kanamycinové rezistence. Tento nový plasmid byl označen pKB1429. Derivát pBR322 nazvaný pKB 701 (ATCC 39772) viz USSN 06/757019-citována jako reference- byl generován, ve kterém Mbol a TThlII 1 doprovázející počátek replikace, byly konvertovány na Κρη I místa. Sáli až EcoRI fragment, obsahující ser-A: KanR zpKB1429 byl klonován do pKB701 za vzniku pKB1438. pKB1438 byl štěpen pomocí KpnI pro odstranění ori regionu. Velký fragment, obsahující region, kódující ampicilinovou rezistenci jakož i ser-A: KanR, byl cirkularizován a použit v CaCl? transformaci YMC9. Po transformaci byly hostitelské YMC9 buňky umístěny do ampicilinové selekce. Za těchto podmínek se ampicilin rezistentní geny vyvinuly inkorporací cirkulámí DNA homologní rekombinací v ser-A gen doprovázejících regionech. Růst ampicilin rezistentního izolátu v nepřítomnosti ampicilinové selekce vede ke ztrátě genu ampicilinové rezistence homologní rekombinací opakujících se sekvencí ser-A gen doprovázejících regionů. Takové kmeny byly identifikovány ztrátou produkce β-laktamasy za použití AmpScreen (BRL) podle nároku výrobce. Dvojité očkování jednotlivých kolonií na médium za přítomnosti a nepřítomnosti šeřinu odhaluje ampicilin citlivé klony vyžadující serin pro růst na minimálním mediu a které jsou také rezistentní ke kanamycinu. Jeden z těchto izolátů byl nazván KB875.
Příklad 3
Chromosomální integrace alterovaných ser-A sekvencí alelovou výměnou ser-A 145 5 alela byla zavedena do chromosomu způsobem analogickým způsobu použitému pro zavedení ser-A: KanR jak je uvedeno v příkladu 2. Stručně, fragment (Sáli až HindlII) nesoucí ser-A1455 alelu byl klonován do pKB701. Plasmidový počátek byl odstraněn KpnI štěpením. Pro transformaci na ampicilinovou rezistenci byla použita cirkularizovaná DNA za poskytnutí kmene, který je požadován.
Po neselektivním růstu, za použití Ampscreenu a replikovaného plátování na kanamycin, byl izolován KB904 (ser-A1455) a zjištěno, že je citlivý kampicilinu a kanamycinu KB904. Výsledná ser-A1544 alela může být přenesena do produkčních kmenů PÍ transdukcí. Miller (1972) Experiments In Mol. Genetics Cold Spring Harbor Press, str. 201-205.
Příklad 4
Chromosomální integrace alterovaných ser-A sekvencí přemístěním recD závislého genu
Jiný přístup byl použit pro přemístění ser-A1508 alely na chromosomu. Kmen KB875 byl připraven recD PÍ transdukcí zV220 (recD, argA:Tnl0. Amundsen a spol., (1986)Proc. Acad.Sci., USA 82 5558-5562) (DSM 6823). Gen pro podstatnou třetí podjednotku exonukleasy V. za vzniku JGP101. Plasmid pKB1508 byl linearizován a použit pro transformaci JPG101 na serin prototrofní v podstatě jak je popsáno Shevellem a spol., (1988) J.Bacteriol. 170 32943296, za vzniku JGP103. ser-A1508 alela pak může být přemístěna do produkčních kmenů PÍ transdukcí. Miller a spol., Experiments in Mol. Genetics Cold Spring Harbor Lab., str. 201-205 (1972).
-8CZ 285915 B6
Získání nadprodukovaných metabolitů
Pro nadprodukci od šeřinu odvozených metabolitů mohou být připraveny buňky, které produkují PGD se sníženou citlivostí k šeřinu a kultivovány ve fermentorech za vhodných podmínek, ve většině případů ve stacionární fázi. Buňky pak budou sklizeny a lyžovány a požadovaný metabolit připraven podle standardních biochemických postupů. Podmínky, zásady a reference pro kultivaci mikrobů a získání specifických metabolitů jsou poskytnuty v práci autorů Cruegera a Cruegera (1982) (Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology) a Herrmanna a Somerville-a (1983) (Amino Acids: Biosynthesis and Genetics Regulation), které zde jsou zahrnuty jako citace.
Claims (12)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Zkonstruovaná DNA, kódující 3-fosfoglycerát dehydrogenasu (PGD), se sníženou citlivostí k inhibici serinem ve srovnání s divokým typem PGD, kde tato DNA kóduje PGD, obsahující alespoň inzerci mezi aminokyselinami 363 a 364, nebo inzerci mezi aminokyselinami 394 a 395, nebo inzerci mezi aminokyselinami 403 a 404, nebo deleci aminokyselin 364 až 402, nebo deleci aminokyselin 395 až 403, nebo deleci 46 C-terminálních aminokyselin, nebo deleci 45 Cterminálních aminokyselin, nebo deleci kterékoliv ze 7 C-terminálních aminokyselin, která kóduje PGD, obsahující následující sekvence aminokyselin
AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG VLV; AEQG VL; AEQG VCSP. ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG v--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V--- AEQG v--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG VCSR ΑΝΙΑ. AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG v--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V----NIA. AQYL QTSA QMGY WiD IEAD EDVAEKAL AEQG V----NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL AEQG V---( -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL--QA MKAI PÁSL D;--QA MKAI PGT- -IRA RLLY; SRQA MKAI PGT- -IRA RLLY; L; --QA MKAI PGT- AIRA RLLY; --QA MKAI PVL; -CSR AIRA RLLY; — — --SR AIRA RLLY; --QA MKAI PGTIRARLL; --QA MKAI PGTIRARLL; --QA MKAI PGTIRARL; - -QA MKAI PGTIRAR; --QA MKAI PGTIRA; --QA MKAI PGTIR; --QA MKAI PGTI; --QA MKAI PGT; - 2. Zkonstruovaná DNA podle nároku 1, která kóduje PGD, obsahující alteraci v 50 Cterminálních aminokyselinách divokého typu PGD.
- 3. Zkonstruovaná DNA podle nároku 1, která kóduje PGD, obsahující C-terminální deleci divokého typu PGD.
- 4. Zkonstruovaná DNA podle nároku 1, ve které C-terminální alterace zahrnuje inzerci do sekvence divokého typu PGD.
- 5. Zkonstruovaná DNA podle nároku 4, ve které je uvedená inzerce mezi VAL 363 a ASN 364 nebo mezi ALA 392 a GLn 394 divokého typu PGD.-9CZ 285915 B6
- 6. Zkonstruovaná DNA podle nároku 1, kde tato DNA kóduje PGD, mající jednu z následujících aminokyselinových sekvencíAEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -- QA MKAIPÁSL D,AEQG VLV,AEQG VL,
AEQG VCSR ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL - - QA MKAI PGT- -IRA RLLY, AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL SRQA MKAI PGT- -IRA RLLY, AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL L, AEQG v--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PGT- A1RA RLLY, AEQG V--- -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --QA MKAI PVL, AEQG V--- --CSR A1RA RLLY, AEQG V--- -NIA . AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL --SR AIRA RLLY, místo 52 C-terminálních aminokyselin divokého typu PGD. - 7. 3-Fosfoglycerátdehydrogenasa, mající aminokyselinovou sekvenci kódovanou zkonstruovanou DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
- 8. Expresní vektor, obsahující zkonstruovanou DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a regulační DNA, umístěnou a orientovanou pro expresi uvedené zkonstruované DNA v hostitelském expresním systému.
- 9. Buňka, obsahující zkonstruovanou DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a regulační DNA, umístěnou a orientovanou pro expresi uvedené zkonstruované DNA v uvedené buňce.
- 10. Buňka podle nároku 9, která je deletována pro divoký typ ser-A.
- 11. Způsob produkce požadovaného produktu, kterým je serin nebo cholin, glycin, cystein nebo tryptofan, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buňky, obsahující zkonstruovanou DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a regulační DNA umístěnou a orientovanou pro expresi uvedené zkonstruované DNA v uvedené buňce a získání požadovaného produktu.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedeným produktem je serin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91121385 | 1991-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ140694A3 CZ140694A3 (en) | 1995-01-18 |
| CZ285915B6 true CZ285915B6 (cs) | 1999-11-17 |
Family
ID=8207424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ941406A CZ285915B6 (cs) | 1991-12-12 | 1992-08-17 | Materiály a metody pro biosyntézu serinu a produktů odvozených od serinu |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5618716A (cs) |
| EP (1) | EP0620853B1 (cs) |
| JP (1) | JP2584409B2 (cs) |
| KR (1) | KR0132258B1 (cs) |
| CN (1) | CN1065914C (cs) |
| AU (1) | AU668359B2 (cs) |
| BR (1) | BR9206902A (cs) |
| CA (1) | CA2124214C (cs) |
| CZ (1) | CZ285915B6 (cs) |
| DE (1) | DE69208894T2 (cs) |
| ES (1) | ES2084373T3 (cs) |
| FI (1) | FI113665B (cs) |
| HU (1) | HU217795B (cs) |
| RU (1) | RU2154671C1 (cs) |
| SK (1) | SK279805B6 (cs) |
| TW (1) | TW313589B (cs) |
| UA (1) | UA39861C2 (cs) |
| WO (1) | WO1993012235A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA926405B (cs) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4232468A1 (de) * | 1992-09-28 | 1994-03-31 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JP4066543B2 (ja) * | 1998-01-12 | 2008-03-26 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−セリンの製造法 |
| JP3997631B2 (ja) * | 1998-01-12 | 2007-10-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−セリンの製造法 |
| US6431870B1 (en) | 1999-11-30 | 2002-08-13 | Ora Metrix, Inc. | Method and apparatus for generating a desired three-dimensional digital model of an orthodontic structure |
| US6250918B1 (en) | 1999-11-30 | 2001-06-26 | Orametrix, Inc. | Method and apparatus for simulating tooth movement for an orthodontic patient |
| US6350120B1 (en) | 1999-11-30 | 2002-02-26 | Orametrix, Inc. | Method and apparatus for designing an orthodontic apparatus to provide tooth movement |
| US6540512B1 (en) | 1999-11-30 | 2003-04-01 | Orametrix, Inc. | Method and apparatus for treating an orthodontic patient |
| US6471512B1 (en) | 1999-11-30 | 2002-10-29 | Ora Metrix, Inc. | Method and apparatus for determining and monitoring orthodontic treatment |
| US6509191B2 (en) * | 2000-05-02 | 2003-01-21 | Alex Liu | Identification and characterization of a PAGODA phenotype (PGD) in plants |
| DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| EP1871274B1 (en) | 2005-03-07 | 2019-05-08 | Align Technology, Inc. | Wrinkled dental aligner |
| US20060275731A1 (en) | 2005-04-29 | 2006-12-07 | Orthoclear Holdings, Inc. | Treatment of teeth by aligners |
| DE102005049527B4 (de) * | 2005-10-17 | 2013-05-08 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Serin, Gensequenz, Vektoren sowie Mikroorganismus |
| RU2006129690A (ru) | 2006-08-16 | 2008-02-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010017082A (ja) * | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010017081A (ja) * | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2192170B1 (en) | 2007-09-04 | 2017-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid |
| JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2138585B1 (en) * | 2008-03-06 | 2011-02-09 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| KR20110117131A (ko) | 2008-12-31 | 2011-10-26 | 메타볼릭 익스플로러 | 디올의 제조 방법 |
| EP2508594B1 (en) * | 2009-11-30 | 2017-08-16 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium, and process for production of l-cysteine |
| US8911978B2 (en) | 2010-07-02 | 2014-12-16 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of hydroxy acids |
| DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| WO2014049382A2 (en) | 2012-09-26 | 2014-04-03 | Metabolic Explorer | Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP7463388B2 (ja) | 2019-02-20 | 2024-04-08 | ブラスケム エス．エー． | ペントース糖およびヘキソース糖のための分解経路 |
| EP3908663A1 (en) | 2019-02-20 | 2021-11-17 | Braskem S.A. | Microorganisms and methods for the production of oxygenated compounds from hexoses |
| EP4172310A1 (de) | 2020-06-26 | 2023-05-03 | Wacker Chemie AG | Verbesserte cystein produzierende stämme |
| CN118742558A (zh) | 2022-03-01 | 2024-10-01 | 瓦克化学股份公司 | 改良的半胱氨酸生产菌株 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0190921A3 (en) * | 1985-02-04 | 1988-01-13 | Engenics, Inc. | Method for the overproduction of amino acids |
| US4743546A (en) * | 1985-02-13 | 1988-05-10 | Biotechnica International, Inc. | Controlled gene excision |
| US4753883A (en) * | 1986-05-07 | 1988-06-28 | Biotechnica International, Inc. | Enzyme deregulation |
| US4753833A (en) * | 1986-09-26 | 1988-06-28 | Fishgal Semyon I | Hollow article with zigzag projections |
| GB8828806D0 (en) * | 1988-12-09 | 1989-01-18 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
| JP2967996B2 (ja) * | 1989-06-06 | 1999-10-25 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―トリプトファンの製造法 |
| US5120837A (en) * | 1989-09-20 | 1992-06-09 | The Nutrasweet Company | Dna encoding phe a feedback inhibition resistant enzyme analogues |
-
1992
- 1992-03-24 TW TW081102201A patent/TW313589B/zh active
- 1992-08-17 EP EP92917826A patent/EP0620853B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 DE DE69208894T patent/DE69208894T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 BR BR9206902A patent/BR9206902A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-08-17 UA UA94005362A patent/UA39861C2/uk unknown
- 1992-08-17 WO PCT/EP1992/001873 patent/WO1993012235A1/en active IP Right Grant
- 1992-08-17 RU RU94030817/13A patent/RU2154671C1/ru active
- 1992-08-17 CZ CZ941406A patent/CZ285915B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-08-17 CA CA002124214A patent/CA2124214C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 HU HU9400796A patent/HU217795B/hu unknown
- 1992-08-17 JP JP5510540A patent/JP2584409B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 AU AU24268/92A patent/AU668359B2/en not_active Expired
- 1992-08-17 ES ES92917826T patent/ES2084373T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 SK SK700-94A patent/SK279805B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-08-17 KR KR1019940701948A patent/KR0132258B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 US US08/244,491 patent/US5618716A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-25 ZA ZA926405A patent/ZA926405B/xx unknown
- 1992-10-10 CN CN92112014A patent/CN1065914C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-09 FI FI942711A patent/FI113665B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK70094A3 (en) | 1995-03-08 |
| AU2426892A (en) | 1993-07-19 |
| CA2124214C (en) | 2002-04-02 |
| DE69208894T2 (de) | 1996-07-18 |
| ZA926405B (en) | 1993-04-28 |
| EP0620853A1 (en) | 1994-10-26 |
| WO1993012235A1 (en) | 1993-06-24 |
| BR9206902A (pt) | 1995-11-21 |
| TW313589B (cs) | 1997-08-21 |
| KR0132258B1 (ko) | 1998-04-11 |
| ES2084373T3 (es) | 1996-05-01 |
| AU668359B2 (en) | 1996-05-02 |
| JP2584409B2 (ja) | 1997-02-26 |
| CA2124214A1 (en) | 1993-06-24 |
| EP0620853B1 (en) | 1996-03-06 |
| DE69208894D1 (de) | 1996-04-11 |
| FI113665B (fi) | 2004-05-31 |
| CN1065914C (zh) | 2001-05-16 |
| JPH06510911A (ja) | 1994-12-08 |
| SK279805B6 (sk) | 1999-04-13 |
| HUT69802A (en) | 1995-09-28 |
| HU217795B (hu) | 2000-04-28 |
| FI942711A0 (fi) | 1994-06-09 |
| FI942711L (fi) | 1994-06-09 |
| US5618716A (en) | 1997-04-08 |
| CZ140694A3 (en) | 1995-01-18 |
| CN1073209A (zh) | 1993-06-16 |
| RU2154671C1 (ru) | 2000-08-20 |
| HU9400796D0 (en) | 1994-06-28 |
| UA39861C2 (uk) | 2001-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ285915B6 (cs) | Materiály a metody pro biosyntézu serinu a produktů odvozených od serinu | |
| JP3331472B2 (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 | |
| JP3783065B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| CA2214498C (en) | Process for producing l-amino acid through fermentation | |
| KR100275287B1 (ko) | O-아세틸세린,l-시스테인및l-시스테인 유도생성물의 제조방법 | |
| US7267967B1 (en) | Nucleic acid encoding pyruvate carboxylase from coryneform glutamicum | |
| JPH07155184A (ja) | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 | |
| US5856148A (en) | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products | |
| US7582460B2 (en) | 3-phosphoglycerate dehydrogenase variants whose inhibition by L-serine is reduced, and genes encoding them | |
| US20130210097A1 (en) | Glycolic acid fermentative production with a modified microorganism | |
| DK2430152T3 (en) | A microorganism with increased L-lysine productivity and method for producing L-lysine using the same | |
| CZ100596A3 (en) | Dna fragment, vector and micro-organism containing genes for metabolic transformation of butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine and process for preparing l-carnitine | |
| US20240060097A1 (en) | Bioconversion of ferulic acid to vanillin | |
| KR100319566B1 (ko) | 발효법에의한l-트레오닌의생산방법 | |
| MXPA97007921A (en) | Procedure for the production of l-aminoacidomediantefermentac |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120817 |