KR100275287B1 - O-아세틸세린,l-시스테인및l-시스테인 유도생성물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피드백내성 세린 아세틸 전이효소를 사용하여 O-아세틸세린, L-시스테인 및 그 L-시스테인에서 유도된 유황함유 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
이들의 세린 아세틸 전이효소는 야생형효소와 비교하여 감소되는 억제제 L-시스테인의 감수성과, 그 야생형배열과 비교할 때 최소한 하나의 돌연변이 또는 결실을 나타내는 단백질 배열을 가지며, 그 돌연변이는 위치 97의 아미노산에서 위치 273의 아미노산까지의 배열영역에 있거나 도는 그 결실은 앞쪽 위치 227의 아미노산에서 카르복실말단 배열영역에 있고, 위치 1은 도 5의 출발 메티오닌(SEQ ID NO: 1)이고, 위치 256에서 Met∼Ile의 돌연변이는 제외시킨다.
Description
L-시스테인 및 그 유도체는 제약분야(기관지질환치료), 화장품분야 [헤어샴푸 및 퍼머웨이브로션(permanent wave lotions)의 성분으로] 및 식품분야(항산화제,풍미증진제 및 반죽연압시의 보조제로서)에 사용되었다.
종래에는 L-시스테인을 털(hair), 강모(bristles), 뿔(horns), 발굽(hooves), 깃털(feathers)등 케라틴함유재에서 추출에 의해, 또는 전구물질의 효소에 의한 형질전환에 의해 얻었다.
미생물에 의한 L-시스테인의 과잉생산은 대단히 바람직한 것이다.
그 이유는 L-시스테인이 경제적으로 관심있는 화합물이며, 또 도 1-3에서 명백한 바와같이 글루타티온, 메티오닌 및 바이오틴(biotin)의 합성에서 중요한 중간제를 구성한다.
모든 생물체에서, L-시스테인은 유황대사(sulfur metabolism)에서 중요한 위치를 차지하며, 단백질, 글루타티온,바이오틴,메티오닌 및 기타 유황함유대사산물(sulfur-containing metabolites)의 합성에서 사용되었다.
또, L-시스테인은 코엔자임(coenzyme)A의 생합성에서 전구물질로서 작용한다.
그 외에 L-시스테인은 시스틴으로 용이하게 산화될 수 있다.
L-시스테인의 생합성과, L-세린, 글리신 및 L-메티오닌 등 다른 아미노산의 생합성 사이에는 밀접한 관계가 있다.
L-시스테인의 합성(도4)는 원핵성물(prokaryotes), 특히 세균에서 구체적으로 조사되었다(Kredich, N.M. 및 G.M.Tomkins 1966, J. Biol. chem. 241:4955-4965; Kredich, N.M., 1987, Biosynthesis of cysteine, In: Neidhardt F.C. Ingraham, J.L., Magasanik, B., Low. K.B., Schaechter, M., Umbarger, H.E.(ends)Escherichia coli 및 salmonella typhimurium : cellular and molecular biology, vol. l. American society for Microbiology, Washington D.C., 419-428).
그 중요한 반응은 O- 아세틸세린 1)을 제조하기 위하여 세린으로 아세틸기를 전이시킨다음, SH 기에 의해 아세틸기를 치환시켜 L- 시스테인 2) 의 합성이 얻어진다.
1)L-세린 + 아세틸-코엔자임 A-〉 O-아세틸세린 + 코엔자임 A
2)O-아세틸세린 + H2S - 〉 L-시스테인 + 아세테이트
미생물 및 식물에서, 세린이 아니고 O-아세틸세린은 L-시스테인의 탄소골격의 중간체 전구물질로서 작용한다(Kredich, N.M. and G.M. Tomkins 1966, J. Biol. chem. 241 : 4955-4965).
그 아세틸기가 활성형의 L-세린을 제조하기 위하여 전이되는 반응은 cys E 유전자에 의해 엔코딩되고, 최종생성물 L-시스테인에 의해 엄격하게 조절시킨 세린 아세틸전이효소(EC 2,3.1.30)에 의해 촉진된다.
세린 아세틸 전이효소의 유전자는 이미 클로닝되었으며, 그 DNA 배열에서 감소된 아미노산배열은 공지되었다.(Denk, D. and Bock, A. 1987, J.Gen, Microbiol. 133;515-525).
L-시스테인의 그 자체의 생성은 2개의 O-아세틸세린 설프히드리라아제 동위효소(EC4.2.99.8)에 의해 촉진되고, 유전자 cysK(O-아세틸 세린 설프히드리라아제 A) 와 cysM (O-아세틸세린 설프히드리라아제 B)에 의해 엔코딩되며, 반응에서 O-아세틸세린은 β-알라닐 도너(alanyl donor)로서 작용하고 H2S 는 β-알라닐 악셉터(alany acceptor)로서 작용하고(Kredich, N.M. and G.m. Tomkins 1966, J.Biol. Chem. 241;4955-4965), O- 아세틸세린 설프 히드리라아제 A 는 시스테인합성에 주로 기여한다.
또 0-아세틸세린 설프히드리라아제 B(cys M)는 유황원으로 티오설페이트를 이용할 수 있다(Sirko, A. et al., 1987, J. Gen. Microbiol. 133:2719-2725).
그 0-아세틸세린 설프히드리라아제 B 는 0-아세틸세린과 티오설페이트 사이의 반응을 촉진시켜 S-설포시스테인을 생성하며, 이것은 그 다음으로 시스테인으로 변환시킬수 있다(Nakamuka, T.et al, 1983, J. Bacteriol. 156, 656-662).
세린 아세틸전이효소의 야생형형태의 L-시스테인에 의한 최종생성물억제는 시스테인 생합성의 동적조절(kinetic regulation)에서 생리적으로 중요한 요인이 된다(Kredich, N.M. 1971, J. Biol, chem. 246; 3474-3484;kredich, N.M. and G.M. Tomkins 1966, J. Biol. chem. 241, 4955-4965).
세린 아세틸렌 전이효소의 야생형형태에 대한 활성은 시스테인에 의해 억제된다.
이 억제는 동적으로 조사하여 경쟁특성을 갖는 것으로 확인되었다.
억제제 정수 Ki=1.1×10-6M 이 0.1mM 아세틸-코엔자임 A 및 1mML-세린의 존재하에서 측정되었다(Kredich, N.M. 1971 and Tomkins G.M. 1966, J. Biol. chem. 241, 4955-4965).
그 참고문헌에서 시스테인-원영양체복귀돌연변이체(Cysteine -prototrophic revestant)를 분리시킬수 있는 한 예가 공지되엇다.
그 복귀 돌연변이체의 세린 아세틸전이효소활성은 코딩영역에서 아미노산치환으로 인하여 다만 약하게 나타탠 L-시스테인에 의해, 시스테인-독립영양체균주(cysteine-auxotrophic strain)를 에틸 메탄설포네이트로 화학적 돌연변이시킴으로써 최종 생성물의 억제를 나타낸다
(Denk, D., Bock, A., 1987, J.Gen, Microbiol, 133;515-525).
위에서 설명한 참고문헌에 의해, 이 변이체의 피드내성(feedback resistance)은 10배 상승한다.
그 결과, 이 변이체의 Ki 는 그 야생형형태와 비교할 때 약 0.1mM이다.
본 발명은 O-아세틸세린, L-시스테인 및 그 L-시스테인 유도 유황함유 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
도 1 은 호모세린(homoserine)에서 출발하는 L-메티오닌의 생합성을 나타낸다.
도 2 는 글루타메이트(glutamate)에서 출발하는 글루타티온의 생합성을 나타낸다.
도 3 은 데티오바이오틴에서 출발하는 바이오틴의 생합성을 나타낸다.
도 4 는 글루코오스에서 출발하는 에.콜리(E.coli)에서의 L-시스테인의 생합성을 나타낸다.
도 5 는 에.콜리 세린 아세틸전이효소의 아미노산 배열을 나타낸다.
도 6 은 그 에.콜리 cysE 유전자의 DNA 배열과, 이 배열에서 감소되는 세린 아세틸 전이효소의 아미노산 배열을 나타낸다.
도 7 은 실시예 1에서 플라스미드 pP1의 제한지도를 나타내며, 그 플라스미드에는 2.25kb PvuII 프라그멘트로서 pUC19로 클로닝되는 피드백내성 cysE 대립유전자를 포함한다.
도 8 은 실시예 2에서 플라스미드 pPC43을 나타내며, 그 플라스미드에는 1.15kb-크기의 EcoRI/BamHI프라그멘트로서 pBluescript에서 cysE 야생형 유전자를 포함한다.
도 9 는 실시예 3에서 PACYC184-LH의 플라스미드지도를 나타내며, 그 플라스미드에는 카르복실말란결실을 가진 피드백내성 cysE 대립유전자를 포함하고, 또 실시예 4에서 PACYC184-LH의 플라스미드지도를 나타내며, 그 플라스미드에는 각종의 염기치환체를 포함하는 피드백 내성 cysE 대립유전자를 포함한다.
실시예
다음 실시예를 들어 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.
실시예 1
시스테인 무감수성 세린 아세틸 전이효소를 포함하는 에.콜리 돌연변이체의 분리
독립영양체 에.콜리 균주를 복귀돌연변이(reverting)시켜 조절 돌연변이체를 제조할 수 있다.
소정의 특성(시스테인에 대한 세린 아세틸 전이효소의 무감수성)을 가진 돌연변이체는 시스테인-독립영양체 cysE 에.콜리 균주의 복귀돌연변이체(revertants)사이에서 얻었다.
그 복귀돌연변이체를 분리시키기 위하여, 시스테인-독립영양체 에.콜리 균주 JM15(CGSC#5042:cysE50, tfr-8) 및 JM39(CGSC#5043:cysE51, tfr-8)를 사용하였다.
그 균주는 독일 DSM에 기탁되었다(기탁번호 DSM 10173).
시스테인-원영양체복귀 돌연변이체를 생산하기 위하여, 이들의 균주를 다음 문헌(Miller, J.H(1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press:125-129, Cold Spring Harbor Laboratory)에서 기재되어 있는 바와 같이 그 돌연변이 유발물질(mutagen) 니트로소 구아니딘으로 처리하였다.
시스테인-원영양체복귀 돌연변이체는 시스테인없는 최소배지상에서 얻었다.
얻어진 복귀 돌연변이체 약 1,000개를 크로스-피딩실험에서 시스테인 분비물로 초기에 테스트하였다.
테스트할 복귀 돌연변이체를 시스테인없는 최소배지에 이식하였다(그 배지:12g/ℓK2HPO4, 3g/ℓKH2PO4, 5g/ℓ(NH4)2SO4, 0.3g/ℓMgSO4×7H2O, 0.015g/ℓCaCl2×2H2O, 0.002g/ℓFeSO4×7H2O, 1g/ℓ 소듐시트레이트×2H2O, 0.1g/ℓNaCl, 15g/ℓ박토-아가(bacto-agar)및 0.15g/ℓNa2M0O4×2H2O, 2.5g/ℓH3BO3, 0.7g/ℓC0Cl2×6H2O, 0.25g/ℓCuSO4×5H2O, 1.6g/ℓMncl2×4H2O와 0.3g/ℓZnSO4×7H2O로 이루어지는 1㎖/ℓ 극미량의 구성요소용액).
여기에 1％ 글루코오스를 첨가시켜 ㎖당 시스테인-독립영양체 인디케이터 균주 JM39의 세포 5×106개를 접종하고 37℃에서 48시간 배양하였다.
그 테스트 콜로니(test colony)(할로:halo) 주위에서 있는 공급되는 광륜(aureole)의 반경은 그 테스트 균주에 의한 시스테인 분비물의 반정성 측정으로 하여 얻었다.
2mm보다 더 큰 생장영역을 나타낸 모든 복귀 돌연변이체는 양성(+)으로 분류시켜 분리하고, 정제하기 위하여 수회 선배열(streak out)시킨 후 저장하였다.
그 복귀 돌연변이체의 시스테인 분비물의 생화학적인 기초를 조사하기 위하여 세린 아세틸 전이효소의 활성을 실험관내에서 측정하였다.
그리고 그 효소를 억제하는 시스테인의 억제력을 측정하였다.
그 측정을 하기 위하여, 그 선택한 복귀 돌연변이체, 출발균주 및 대비 균주, 에.콜리 W31110(aTTC27325)의 S30 추출물(Extracts)(4℃, 20분간 30,000g을 원심분리시킨 세포 호모게네이트:cell homogenates)를 사용하였다.
다수의 복귀 돌연변이체는 그 세린 아세틸 전이효소가 아직도 서로다른 농도의 그 억제제, L-시스테인의 존재하에서 상당한 잔류활성(Ki값 5∼50㎛)을 나타냄을 확인하였다.
시스테인을 정성분석시켜 액상배지에서 시스테인을 분비하는 분비력을 측정하기 위하여, 50㎛의 선택 cysE복귀 돌연변이체를 30℃, 48시간 170rpm으로 표준 생산배지 20㎖에서 배양하였다.
그 표준 생산배지는 15g/ℓ글루코오스, 0.08g/ℓ박토트립톤, 0.04g/ℓ이스트추출물(yeast extract), 5mg/ℓ비타민 B1, 3g/ℓKH2PO4, 12g/ℓK2HPO4, 0.3g/ℓMgSo4×7H2O, 0.1g/ℓNaCl, 5g/ℓ(NH4)2SO4, 14.7mg/ℓCaCl2×2H2O, 2mg/ℓFeSo4×2H2O, 1g/ℓ소듐시트레이트×2H2O, 5g/ℓNa2S2O3×5H2O 및 1㎖/ℓ 극미량구성요소용액(상기 설명참조)로 구성되었다.
샘플(10㎕)을 각각의 경우 24시간 및 48시간후 제거시켜 적합할 경우, 희석하였다.
세포없는 상증액의 시스테인 농도를, 참고문헌(Gaitonde, M.K. 1967, Biochem. J.104:627-633)의 방법에 의해 칼로리미터로 측정하였다(Calorimetrically).
이들 돌연변이 유발물질에 의한 시스테인 분비물은 그 배양 상증액에서 시스테인 5-60mg/ℓ의 범위에서 변화되었다.
반면에 에.콜리 야생형 균주에서 대비해 볼 때 시스테인 분비물을 검출할 수 없었다.
시스테인 분비물이 40-60mg/ℓ인 8개의 복귀 돌연변이체는 이 스크리닝(screening)에서 선택하였다.
이들 8개의 돌연변이 유발물질의 세린 아세틸 전이효소의 최종 생성물 내성에 대한 유전자기초를 정밀분석하기 위하여, 이들의 cysE구조유전자를 클로닝하여, 이들의 유전자의 DNA배열을 측정하였다.
cysE 야생형 유전자의 DNA배열과, 또 에.콜리에서 그 cysE유전자를 플랭킹(flanking)하는 영역의 크로모솜 제한지도는 참고문헌(Denk and Bck, 1987, J.Gen.Microbiol. 133:515-525)에서 공고되었기 때문에, 그 cysE구조 유전자가 2.25kb-크기 PVUII DNA 프라그멘트상에 위치되어 있는 것은 공지된 사실이다.
시스테인-무감수성 세린 아세틸 전이효소를 엔코딩하는 cysE유전자를 클로닝하기 위하여, 그 선택 복귀 돌연변이체의 크로모솜 DNA는 PVUII로 완전 가수분해되어, 그 DNA가수분해 생성물을 준비한 아가로스겔 상에서 분리하였다.
그리고 2-3kb의 크기범위에 있는 그 DNA를 분리하였다.
그 분리시킨 PVUII 가수분해물은 T4DNA리가아제에 의해 SmaI-선형 및 알칼리 포스테이트-데포스포릴화 플라스미드벡터 PUC19(독일 Boehringes에서 취득할 수 있음)에 결찰시켰다.
시스테인-독립영양체 cysE 균주 JM15(CGSC#5042)를 각각의 결찰혼합물(ligation mixture)로 형질전환시켜, 시스테인없는 앰피실린 함유(50mg/ℓ)최소배지에서 선택하였다.
이들의 제한 패턴에서, 선택하여 숙주 균주의 시스테인 독립영양체를 상보시킨(complemented) 플라스미드(도 7 참조)는 cysE유전자를 필요로 하는 분리패턴을 나타내었다(Denk and Bck, 1987, J.Gen. Microbiol. 133:515-525).
그 선택한 형질전환체(transformants)는 또 그 크로스-피딩 테스트에서 인디케이터 균주 JM35(halo 〉 4mm)의 경렬한 생장상승을 나타내었다.
이들의 cysE 돌연변이 유발체의 세포 추출물에서 세린 아세틸 전이효소의 활성측정(여기서 그 추출물은 4℃, 20분간 30,000g을 원심분리시켜 얻었음)은 L-시스테인의 감수성 감소를 나타내었다.
각각의 cysE 대립유전자의 구조 유전자에서 최종 생성물의 내성에 대한 변화를 정확하게 확인하기 위하여, 이들의 대립유전자의 DNA는 cysE유전자의 소정의 올리고뉴클레오티드에 의해 배열시켜, 확인한 뉴클로에티드배열을 cysE 야생형 유전자의 것과 대비하였다.
이 뉴클레오티드배열에 대한 이 비교에서는 다음 표 2(도 5 및 6 참조)에서 요약한 야생형의 아미노산배열 및 DNA배열과 비교하여 차이를 나타내었다.
표 2 : 화학적 돌연변이 유발에 의해 얻어진 피드백-내성 cysE 대립유전자
| cysE돌연변이체 | 뉴클레오티드치환(No.) | 아미노산치환(No.) | Ki(㎛) |
| cysEII | GGC-〉AGC (934) | Gly238-〉Ser238 | 10 |
| cysEIII | GGT-〉GAT (716) | Gly165-〉Asp165 | 10 |
| cysEVII | GCT-〉GTT (932) | Ala237-〉Val237 | 10 |
| cysEX | ACG-〉GCG (721) | Thr167-〉Ala167 | 50 |
| cysEXI | GGT-〉AGT (955) | Gly245-〉Ser245 | 700 |
| ACG-〉GCG (721) | Thr167-〉Ala167 | ||
| cysEXII | AAA-〉CAA (511) | Lys97-〉Gln97 | 40 |
| GGC-〉AGC (934) | Gly238-〉Ser238 | ||
| TTT-〉TTG (1023) | Phe267-〉Leu267 | ||
| cysEXIII | GTT-〉GCT (713) | Val164-〉Ala164 | 30 |
| TTT-〉TTG (1023) | Phe267-〉Leu267 | ||
| cysEXVI | GAT-〉GGT (971) | Asp250-〉Gly250 | 50 |
| AAG-〉TAG (973) | Lys251-〉Stop251 |
실시예 2
cysE 구조유전자에서 소정의 염기치환에 의한 최종생성물 무감수성 세린 아세틸 전이효소의 발생
실시예 1 에서는 모두 서로 다른 8종의 cysE 대립유전자를 기재하였다.
그 대립유전자는 염기치환과 이에 따른 아미노산 변화로 인하여 L-시스테인 억제제에 대한 세린 아세틸 전이효소의 실질적인 수감감소(desensitization)를 나타낸다.
이들의 변질효소는 그 내성을 초래하는 아미노산치환의 위치만이 아니라, 일부 경우 L-시스테인 억제제에 대한 수감성 정도가 다르다.
새로운 특성을 가진 최종 생성물 내성 세린 아세틸 전이효모에서는 아미노산치환을 실시예 1에서 기재한 바 있으며, 이들의 효소는 서로 혼합하여 부위에 소정의 돌연변이 유발에 의해 구성시켰다.
이 목적에 필요한 돌연변이 유발은 인용참증(Kunkel등, 1987, Meth. Enzymol. 154:367-382)의 방법에 의해 실시하였다.
도 8 에 나타내었으며, 파지미드 벡터 pBluescriptII SK+(stratagene, 독일)의 EcoRI-BamHI부위에서 1.15kb-크기 cysE 야생형 유전자를 포함하는 cysE 플라스미드 pPC43(독일 DSM에 기탁, 기탁번호 DSM 10171)를 돌연변이 유발의 출발 플라스미드로 사용하였다.
이 cysE WT 유전자는 오리고뉴클레오티드 cysE-fwl(SEQ ID NO:3)(센스프라이머:senseprimer)와 cysE-revl(SEQ ID NO:4)(앤티센스프라이머:antisense primer)를 사용하여 폴리머효소 사슬반응(polymerase chain reaction:PCR)방법(Saiki등, 1988, science 239:487-491)에 의해 에.콜리 야생형 균주 W 3110(ATT C 27325)의 게놈 DNA에서 증폭(확대)시켰다.
이들의 후자 프라이머(primers)의 그 뉴클레오티드 배열은 다음과 같이 구성되었다:
cysE-fwl : (SEQ ID NO:3)
5'-GCCTGGATCCTGCAGTCGACCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3'
더 진한 글자로 나타낸 성분은 도 6에서 cysE DNA배열의 염기 9-30에 대응되고, 그 결합 BamHI부위는 밑줄친 것이다.
cysE-revl : (SEQ ID NO:4)
5'-GTAGGAGCTCTGCAGAATTCGGGTATCCGGHGAGCGGTATTG-3'
진한 글자로 나타낸 성분은 도 6에서 sysE DNA 배열의 염기 1106-1126에 대응되고; 그 결합 EcoRI부위는 밑줄친 것이다.
PCR실험은 200㎛데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)의 존재하에, 각각의 경우 그 대응되는 올리고뉴클레오티드 1㎛, W3110 DNA 100mg, 반응버퍼(10mM트리스-HCl pH8.3, 50mMKCl, 1.5mMMgCl2, 0.01％젤라틴) 및 열 안정성 Vent DNA 폴리머 효소와 다음 조건하에서(96℃, 1:5분; 62℃, 1분; 72℃, 3분) 서머시클러(thermocycler)(GeneATAG controller, Pharmacia)에서 30사이클로 실시하였다.
그 중복 생성물은 BamHI 및 EcoRI로 제한시켜, 아가로오스겔을 사용하여 정제하였으며, 1.15Kb-크기 DNA프라그멘트로서, BamHI와 EcoRI로 선형화시킨 파지미드벡터 BluescniptII SK+로 클로닝함으로서, cysE 플라스미드 pPC43(도 8)를 얻었다.
바람직한 중돌연변이체(multiple mutants)를 다음 처리공정을 사용하여 제조하였다.
1) cysE Ⅳ 대립유전자의 제조 : 중 돌연변이체 Val237+Ser238
cysE 야생형 플라스미드 pPC43으로 출발하고 부위상에 소정의 돌연변이유발을 사용하여, 세린을 돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-1(SEQ ID NO:5)에 의해 글리신 대신 위치 238에서 초기에 도입시켰으며, 발린을 돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-3(SEQ ID NO:6)(표 3)에 의해 알라닌 대신 위치 237에서 도입시켜 cysE Ⅳ 대립유전자를 얻었다.
2) cysE Ⅷ 대립유전자의 제조 : 중 돌연변이체 Val237+Ile256
cysE 야생형 플라스미드 pPC43으로 출발하고, 부위에서의 소정의 돌연변이 유발을 사용하여, 이소류신(isoleucine)을 메티오닌대신 위치 256에서 돌연변이(mutation)올리고뉴클레오티드 sysE-Mut-6(SEQ ID NO:7)(표 3)을 사용해 도입시켜 cysE Ⅰ대립유전자를 얻었다.
발린은 돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-3(SEQ ID NO:6)(표 3)을 사용하여 위치 237에서 알라닌대신 이후자 대립유전자에 도입시켰다.
그결과, cysE Ⅷ 대립유전자를 얻었다.
3) cysE Ⅵ 대립유전자의 제조 : 중 돌연변이체 Ser238+Ile256
돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-1(SEQ ID NO:5)(표 3)을 사용하여 세린을 글리신 대신 위치 238에서 cysE Ⅰ 대립유전자(돌연변이체 Ile256)에 도입시켜, cysE Ⅵ 대립유전자를 얻었다.
4) cysE Ⅴ 대립유전자의 제조 : 3중 돌연변이체 Val237+Ser238+Ile256
돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-6(SEQ ID NO:7)(표 3)을 사용하여 이소류신에 의해 cysE Ⅳ 대립유전자(중 돌연변이체 Val237+Ser238)의 위치 256에서 메티오닌을 대치시켜, cysE Ⅴ 대립유전자를 얻었다.
5) cysE ⅩⅣ 대립유전자의 제조 : 중 돌연변이체 Ala167+Stop251
cysE-De 1255 대립유전자(실시예 3 참조)에서 출발하고, 돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-10(SEQ ID NO:8)(표 3)을 사용하여 트레오닌(threonine)대신 위치 167에서 알라닌을 도입시켜 cysE ⅩⅣ 대립유전자를 얻었다.
6) cysE ⅩⅦ 대립유전자의 제조 : 중 돌연변이체 Asp165+Ala167
cysE Ⅲ 대립유전자(돌연변이체 Asp165, 실시예 1 참조)에서 출발하여 위치 167에서 아미노산 트레오닌을, 올리고 뉴클레오티드 cysE-Mut-10(SEQ ID NO:8)(표 3)의 사용으로 알라닌에 의해 대치하였다.
그결과, cysEXVII 대립유전자를 얻었다.
7) cysE XXIII 대립유전자의 제조 : 3중 돌연변이체 Ala167+Val237+Ser238
돌연변이 올리고뉴클레오티드 cysE-Mut-10(SEQ ID NO:8)(표 3)을 사용하여 알라닌을 트레오닌대신 위치 167에서 cysE IV 대립유전자(중 돌연변이체 Val237+Ser138)에 도입시켜, cysE XXIII 대립유전자를 얻었다.
그 소정의 돌연변이체의 전체구조유전자의 DNA배열분석을 사용하여 돌연변이의 정확한 도입을 첵크하였다.
cysE+다중 돌연변이체의 전체를 표 4 에 나타낸다.
효소 활성 및 억제제 정수 Ki등 생화학적 파라미터를 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 하여 측정하였다.
표 3 : 새로운 피드백 내성 cysE 대립유전자를 생성하는 부위상의 소정의 돌연변이에 사용한 올리고 뉴클레오티드
| SEQID NO: | 돌연변이올리고뉴클레오티드 | 뉴클레오티드 배열 | 도6의위치 | 아미노산치환 |
| 5 | cysE-Mut-1 | 5'-GCCGCTAGCGTTCCGGCT-3' | 928-945 | Gly238-〉Ser238 |
| 6 | cysE-MuT-3 | 5'-CCGCCGCATACCACCGCCGTT-3' | 913-933 | Ala237-〉VaL237 |
| 7 | cysE-Mut-6 | 5'-CCATCAATGGATATAGACCAGCAT-3 | 976-999 | Met256-〉Ile256 |
| 8 | cysE-Mut-10 | 5'-GTCGTTGGTGAAGCGGCGGTGATT-3' | 709-732 | Thr167-〉Ala167 |
표 4 : 목표로 한 부위상의 소정의 돌연변이 유발에 의해 생성한 피드백 내성 cysE 대립유전자
| cysE돌연변이체 | 뉴클레오티드치환(No.) | 아미노산치환(No.) | Ki(㎛) |
| cysEIV | GCT-〉CTT(932) | Ala237-〉Val237 | 40 |
| GGC-〉AGC(934) | Gly238-〉Ser238 | ||
| cysEV | GCT-〉GTT(932) | Ala237-〉Val237 | 10 |
| GGC-〉AGC(934) | Gly238-〉Ser238 | ||
| ATG-〉ATA(990) | Met256-〉Ile256 | ||
| cysEVI | GGC-〉AGC(934) | Gly238-〉Ser238 | 10 |
| ATG-〉ATA(990) | Met256-〉Ile256 | ||
| cysEVIII | GCT-〉GTT(932) | Ala237-〉Val237 | 30 |
| ATG-〉ATA(990) | Met256-〉Ile256 | ||
| cysEXIV | ACG-〉GCG(721) | Thr167-〉Ala167 | 〉1000 |
| ATG-〉TAG(988+989) | Met256-〉stop256 | ||
| cysEXVII | GGT-〉GAT(716) | Gly165-〉Asp165 | 100 |
| ACG-〉GCG(721) | Thr167-〉Ala167 | ||
| cysEXXIII | ACG-〉GCG(721) | Thr167-〉Ala167 | 2300 |
| GCT-〉GTT(932) | Ala237-〉Val237 | ||
| GGC-〉AGC(934) | Gly238-〉Ser238 |
실시예 3
PCR를 사용하여 조절할 수 있게 효소의 카르복실말란을 절단시킨 최종 생성물-무감수성 세린 아세틸 전이효소의 생성
단백질내 하나이상의 아미노산에 대한 소정의 변화는 종래의 기술에서 기술되어 있어 PCR기술에 의해 적합한 돌연변이 프라이머(primers)를 사용하여 DNA레벨에서 용이하게 실시할 수 있다(Saiki등, 1988, science 239:487-491).
그결과 얻어진 PCR생성물은 적합한 플라스미드/숙주계에 클로닝시켜 변질 단백질을 발현시킬 수 있다.
길이가 다른 카르복실말란결실을 가지며, 표 6 에 요약한 cysE 돌연변이체는 표 5 에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머(primers)를 사용하여 에.콜리 야생형 균주 W3110(ATTC 27325)의 게놈 DNA에서 제조하였다.
그 PCR실험은 200㎛ 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dSTP, dTTP)의 존재하에서, 각각의 경우 센스 프라이머(sense primer) cysE-LH fwl(SEQ ID NO:9) 및 그 대응하는 앤티센스 프라이머(antisense primer)(SEQ ID NO:10-23)(표 5), W 31110 DNA 100ng, 반응버퍼(10mM Tris-Hcl pH8.3, 50mM Kcl, 1.5mM Mgcl2, 0.01％젤라틴) 및 열 안정성 Vent DNA 폴리머효소 5단위와 다음 조건(96℃, 1.5분;62℃, 1분; 72℃, 3분)하에서 서머사이클러(thermocycler)(gene ATAQ concroller)에서 30사이클로 실시하였다.
cysE-LH fwl (SEQ ID NO:9)
5'-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3'
진한 글자로 나타낸 성분은 도 6에서 cysE 배열의 염기 9-30에 대응되고; 그 결합 Bst×I/SacI 부위는 밑줄 친것으로 나타낸다.
증폭후 얻어진 생성물은 효소 SacI와 NsiI로 제한시킨 다음 아가로오스로 정제시켰다.
각각의 경우 분리시킨 cysE DNA 프라그멘트는 SacI와 NsiI로 선형화시킨 벡터 pACYC184-LH(DSM10172)(도 9 참조)에 결찰시켰다(ligated).
각 결찰 혼합물을 시스테인-독립영양체 cysE 균주 JM15(CGSC#5042)에 형질전환시켰다.
시스테인없는 테트라시클린 함유(20mg/ℓ) 최소배지에서 선택하였다.
이 클로닝에서 얻은 플라스미드는 이들의 결실범위에 따라 pACYC184/CYSE-Del로 설정하였다(플라스미드 지도에 대한 도 9 참조).
효소활성과 억제제정수 Ki의 측정과 또 크로스-피딩테스트를 실시예 1 에서와 같이 실시하였다.
DNA배열 분석을 사용하여 그 결실의 정확한 도입을 확인하였다.
이 조사결과를 표 6 에 나타낸다.
표 5 : 카르복실말단결실을 가진 cysE 대립유전자를 제조하는 앤티 센스올리고뉴클오티드
| SEQIDNO. | 돌연변이올리고뉴클레오티드 | 뉴클레오티드배열 | 도6의 위치 |
| 10 | cysE-del270 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTACCCATACTCAAATCTATGGTTAATACC-3' | 1006-1032 |
| 11 | cysE-del268 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTACTCAAATGTATGGTTAATACCGTTGAA-3' | 1000-1026 |
| 12 | cysE-del263 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAAATACCGTTGAAATGCTGGTCCATATC-3' | 985-1011 |
| 13 | cysE-del259 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAATGCTGGTCCATATCCATTGATGGCTT-3' | 973-999 |
| 14 | cysE-del258 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTACTGGTCCATATCCATTGATGGCTTATC-3' | 970-996 |
| 15 | cysE-del257 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAGTCCATATCCATTGATGGCTTATCGCTG-3' | 966-993 |
| 16 | cysE-del256 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTACATATCCATTGATGGCTTATCGCTGTC-3' | 964-990 |
| 17 | cysE-del255 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAATCCATTGATGGCTTATCGCTGTCTGG-3' | 961-987 |
| 18 | cysE-del250 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAATCGCTGTCTGGTTTACCGACAATACG-3' | 946-972 |
| 19 | cysE-del249 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAGCTGTCTGGTTTACCGACAATACGAGC-3' | 943-969 |
| 20 | cysE-del248 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAGTCTGGTTTACCGACAATACGAGCCGG-3' | 940-966 |
| 21 | cysE-del245 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAACCGACAATACGAGCCGGAACGCCAGC-3' | 931-957 |
| 22 | cysE-del239 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTAAACGCCAGCGGCGGTGGTATCCGGCGG-3' | 913-939 |
| 23 | cysE-del227 | 5'-CTCGATGCATTACGTATTACAGCACCACGGAACCTGCGCCAATCTT-3' | 877-903 |
진한 글자로 나타낸 성분은 도 6 의 배열에서 각각의 염기에 대응되며, NsiI부위는 밑줄친 것이다.
표 6 : 카르복실말란결실에 의해 생성된 피드백내성 cysE 대립유전자
| cysE돌연변이체 | 결실아미노산의 수 | 말단아미노산 | Ki(㎛) |
| cysE-Del259 | 14 | His259 | 7.5 |
| cysE-Del258 | 15 | Gln258 | 5 |
| cysE-Del257 | 16 | Asp257 | 7.5 |
| cysE-Del256 | 17 | Met256 | 12.5 |
| cysE-Del255 | 18 | Asp255 | 30 |
| cysE-Del250 | 23 | Asp250 | 20 |
| cysE-Del249 | 24 | Ser249 | 15 |
| cysE-Del248 | 25 | Asp248 | 12.5 |
실시예 4
진탕플라스크에서 L-시스테인 또는 L-시스테인 유도생성물의 과잉생성을 목적으로 하는 변질세린 아세틸 전이효소에 의한 에.콜리 숙주 균주의 형질전환
복제수가 낮은 것이 특징인 PACYC184-LH를 그 제조에 사용하였다.
실시예 1 및 2 에서 플라스미드의 cysE 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다.
PCR실험은 200㎛ 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)의 존재하에, 각각의 경우 센스 프라이머(sense primer) cysE-LH fwl(SEQ ID NO:9) 및 그 대응하는 앤티센스 프라이머 cysE-LH revl(SEQ ID NO:24)의 올리고 뉴클레오티드 1㎛, 각각의 플라스미드 DNA 10mg, 반응버퍼(10㎛ 트리스-Hcl pH 8.3, 50mMKcl, 1.5mM Mgcl2, 0.01％젤라틴) 및 열안정성 Vent DNA 폴리머효소(Biolabs) 5단위 및 다음 조건(96℃, 1.5분; 62℃, 1분; 72℃, 3분)하에 서머시클러(thermocycler)(Gene ATAQ 콘트롤러)에서 30사이클로 실시하였다.
cysE-LH fwl (SEQ ID NO:9)
5'-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3'
위 밑줄친 염기는 결합한 BstXI 및 SacI 제한분리부위에 대응한다.
진한 글자로 나타낸 잔류염기는 도 6에서 cysE 배열의 위치 9-30에 대응한다.
cysE-LH revl(SEQ ID NO:24)
5'-CTCGATGCATTACGTAGGGGTATCCGGGGAGCGGTATTG-3'
밑줄친 염기는 그 결합된 NsiI 제한분리부위에 대응되고, 굵고 진하게 나타낸 나머지 염기는 도 6에서 cysE 배열의 위치 1106-1127에 대응된다.
증폭후 얻어진 생성물은 효소 SacI 및 NsiI로 제한시켜, 아가로스겔(agarose gel)에 의해 정제하였다.
그다음, 각각의 경우 분리시킨 cysE DNA 프라그멘트를 SacI 및 NsiI로 선형화시킨 벡터 PACYC184-LH(DSM10172)에 결찰(ligate)하였다.
각각의 리가아제 혼합물을 시스테인-독립영양체 cysE JM15(CGSC#5042)에 형질전환시켜, 시스테인없는 테트라시클린 함유(20mg/ℓ) 최소배지상에서 선택을 하였다.
이 클로닝에서 얻어진 일련의 피드백 내성 cysE 플라스미드는 PACYC184/cysE(도 9 참조)를 설정하였다.
각 클로닝은 그 대응되는 cysE 대립유전자수를 제공한다.
효소활성과 억제제 정수 Ki의 측정과 또 그 크로스-피딩테스트는 실시예 1 의 기재내용과 동일하게 실시하였다.
액상배지에서 생성용량을 측정하기 위하여, 기준생성배지 20㎖를 단콜로니(single colony)로 접종하여 48시간 30℃에서 170rpm으로 배양하였다.
그 생성배지는 15g/ℓ글루코오스, 0.08g/ℓ박토트립톤, 0.04g/ℓ이스소트추출물, 5 mg/ℓ비타민B1, 3g/ℓKH2PO4, 12g/ℓK2HPO4, 0.3g/ℓMgSo4×7H2O, 0.1g/ℓ소듐시트레이트×2H2O, 5g/ℓNa2S2O3×5H2O, 1㎖/ℓ극미량 구성요소액 및 0.025㎖/ℓ테트라마이신으로 구성시켰다.
샘플(10㎕)을 각각의 경우 24시간 및 48시간후에 제거시켜 희석하였다.
그다음 그 세포없는 상증액에서의 그 시스테인 농도를 참증자료(Gaitonde, M.K. 1967, Biochen. J.104, 627-633)의 방법에 의해 비색측정하였다.
여기서, ℓ당 시스테인 50∼300mg의 농도는 서로 다른 cysE 돌연변이체로 형질전환시킬 때 생성균주 JM15에 대하여 측정하였다.
실시예 5
재조합 λ 프로파지(prophage)를 사용하여 염색체 엔코딩을 한 피드백-내성 cysE 대립유전자 X의 구조 및 1ℓ 발효조(fermenter)내에서 L-시스테인에서 유도시킨 생성물 또는 L-시스테인의 생성
염색체 부착부위(attλ)에 결합시키기 위하여, cysE 대립유전자 cysEIV, cysEX 및 cysEXI를 플라스미드 pRS551(simons등, 1987, Gene 53:85-96)에 클로닝하였다.
이 때문에, 각 cysE 대립유전자는 그 대응되는 cysE 플라스미드에서 PCR에 의해 종폭시켰다.
사용한 올리고 뉴클레오티드, 즉 cysE-fwl 및 cysE-revl은 실시예 1에서 설명하였다.
그 증폭은 실시예 3 에서와 같이 실시하였다.
그 결과 얻어진 프라그멘트는 EcoRI/BamHI로 분리시켜 아가로오스겔(agarose gel)를 통하여 정제하여 EcoRI 및 BaamHI로 분리시키는 벡터 pRS551에 결찰(ligate)하였다.
이것에 의해 벡터 pRS551-기재 재조합 플라스미드 pRScysEIV, X 및 XI를 얻었다.
λRS45파지(phages)이외에 재조합 cysE 대립유전자 보유 λRS45 유도체를 포함한 이질람다 용해질(lambda lysate)은, λRS45파지(simons등, 1987, Gene 53:85-96)를 사용하여 pPRScysE-보유 recA+균주(즉, YMCP, ATCC 3397)에서 판상용해질의 제조에 의해 상동 재조합으로 생체내에서 제조하였다.
이질람다 용해질로 감염시킨 다음 카나마이신 함유(25mg/ℓ)(LB플레이트상에서 플레이팅(plating)시킨 cysE 균주 JM15를 사용하여, 재조합 RS45유도체로 선택하였다.
얻어진 용원성(lysogenic) 카나마이신 내성 클론을 시스테인없는 최소배지판상에 생장할 수 있는 생장력에 대하여 테스트하였다.
각각의 경우 시스테인-원 영양체인 클론을 선택하여 균질 cysEλ 용해질의 제조에 사용하였다(UV유도에 의해, simons등, 1987, Gene 53:85-96).
그 JM15균주는 각각의 경우 얻어진 이들의 균질 cysEλ 용해질로 감염시켰다.
그 얻어진 JM15attλ::cysE 균주를 실시예 6 에서와 같이 배양하였다.
테트라시클린 대신, 각각의 경우 각 배지에는 선택제로서 ℓ당 카나마이신 25mg이 포함되었다.
시스테인의 수율은 다음과 같다:
cysEIV의 경우 0.5g/ℓ, cysEX의 경우 1.8g/ℓ, cysEXI의 경우 2.1g/ℓ(표 7 참조).
실시예 6
숙주 균주 JM15를 사용하여 1ℓ발효조에서 L-시스테인에서 유도시킨 생성물 또는 L-시스테인의 제조에 대한 서로 다른 플라스미드-엔코딩 cysE 대립유전자의 영향
100㎖ 에렌메이어 플라스크에 포함된 20㎖의 LB배지(1％트립톤, 0.5％효모엑스, 0.5％NaCl)는 각각의 cysE플라스미드로 형질전환시킨 생성균주 JM15(CGSC#5042)의 단콜로니(single colony)로 접종시켰다.
7시간 세균 진탕기(30℃, 150rpm)에서 배양시킨 후 각각의 예비배양물을 100㎖의 SM1배지에 옮겼다.
그 SM1배지에는 5g/ℓ글루코오스, 5g/ℓNaCl, 0.3g/ℓMgSO4×7H2O, 15mg/ℓCaCl2×2H2O, 75mg/ℓFeSo4×7H2O, 1g/ℓ소듐시트레이트×2H2O, 1.5g/ℓKH2PO4, 극미량 구성요소액(상기 참조) 1㎖, 4mg/ℓ 비타민 B1, 2.5g/ℓ효모엑스(Difco), 2.5g/ℓ트립톤(Difco) 및 25mg/ℓ테트라시클린이 포함되어 있다.
그 발효조내의 글루코오스농도는 700g/ℓ(W/V)(살균)글루코오스용액으로 펌핑(pumping)시켜 값 15g/ℓ으로 초기에 조정하였고, 그 pH는 25％ NH4OH용액으로 펌핑시켜 7.0으로 조정하였다.
OD600이 10에 도달된 후 티오설페이트의 100g/ℓ(W/V) 살균원액으로 시간당 300mg을 공급하였다.
예비 배양액 100㎖를 접종용으로 발효조용기에 펌핑하였다.
그 출발용액은 약 1ℓ이었다.
그 배양액을 초기에 400rpm으로 교반시켜, 살균필터의 통과에 의해 살균시킨 압축공기 1.5VVm으로 폭기하였다(aeration).
그 발효는 30℃의 온도에서 실시하였다.
그 pH는 25％NH4OH로 자동적으로 교정되어 값 7.0으로 유지시켰다.
그 발효육즙(broth)에서의 산소포화는 발효시에 20％이하로 저하되는 일이 없었다.
교반속도를 사용하여 이것을 확실하게 유지하였다.
그 영양용액의 글루코오스 함량, 광밀도 및 시스테인 함량은 2-3시간 간격으로 측정하였다.
그 글루코오스함량을 글루코오스분석기(YSI제품)를 사용하여 효소측정을 하였다.
그 글루코오스의 농도는 이 화합물에 연속공급시킴으로써 10-20g/ℓ으로 조정하였다.
그 배지에서 시스테인의 농도는 참증자료(Gaitonde, M.K.(1967), Biochem. J. 627-633)의 방법을 사용하여 그 샘플의 세포없는 상증액으로부터 비색측정을 하였다.
그 발효는 44-50시간후에 완료하였다.
48시간후 생성된 시스테인의 양(g/ℓ)을 표 7 에 요약한다.
표 7 : 서로 다른 cysE 대립유전자(g/ℓ 발효조)로 형질전환시킨 생성 균주 JM15의 시스테인 수율
| cysE 대립유전자 | 시스테인 수율[g/L][48시간] |
| pACYC184/cysEIV | 1.6 |
| pACYC184/cysEV | 1.3 |
| pACYC184/cysEVI | 1.4 |
| pACYC184/cysEX | 3.4 |
| pACYC184/cysEXI | 3.4 |
| pACYC184/cysEXII | 1.2 |
| pACYC184/cysEXIV | 2.3 |
| pACYC184/cysEXV | 3.0 |
| pACYC184/cysEXVI | 2.2 |
| pACYC184/cysEXXIII | 2.7 |
| pACYC184/cysEDe1255 | 3.9 |
실시예 7
L-시스테인 또는 코린박테리아에 의해 L-시스테인에서 유도된 생성물의 제조
피드백 내성 cysE 대립유전자, cysEIV, cysEX, cysEXI 및 cysEXIV(실시예 1에서 표 2 참조)는 그 제한효소 BamHI 및 EcoRI에 의해 그 대응되는 플라스미드에서 분리시켜, 각각의 1.15Kb-크기 DNA 프라그멘트를 아가로오스겔에 의해 정제하고 분리하였다.
그 각각의 DNA프라그멘트는 에.콜리 DNA 폴리머효소 1 의 클레노우(klenow)프라그멘트에 의해 끝을 둥굴게 하였다.
그 벡터 pWST1은 제한효소 SmaI와 가수분해시켜, T4 DNA 리카아제에 의해 끝이 둥근 DNA 프라그멘트에 결찰하였다.
그 벡터 pWST1는 에.콜리/코린 박테리아 셔틀(shuttle)벡터이며, 에.콜리와 코린 박테리아에서 복제할 수 있다.
이 벡터의 코린 박테리아 레플리콘(replicon)은 코린 박테리아 글루타미컴(glutamicum) 균주 ATCC 19223에서 기원을 둔다(originate).
벡터 pWST1의 제조는 특허문헌 USP 4,965,197에서 기재되어 있다.
그 결찰 혼합물을 사용하여, 시스테인에 대하여 독립영양체인 돌연변이체 JM15를 형질전환하였다.
그 보충 플라스미드는 이들의 삽입 cysE 대립유전자에 의해 pWST1-cysEIV, pWST1-cysEX, pWST1-cysEXI 및 pWST1-cysEXIV으로 설정하였다.
그 pWST1-cysE 플라스미드를 사용하여 코린 박테리아 글루타미컴 ATCC21851를 형질전환시켰다.
그 형질전환은 참고문헌(Liebel, W.등, 1989, PEMS Microbiol, 65, 299-304)에서 구체적 기술한 기술을 사용하여 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 실시하였다.
그 재조합 클론은 25mg/ℓ카나마이신을 포함하는 한천플레이트상에서 카나마이신에 대한 플라스미드 엔코딩내성을 기초로 하여 선택하였다.
그 발효는 농도 50mg/ℓ의 카나마이신을 테트라시클린 대신 그 선택 항생물질로서 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6 의 조건과 동일하게 하여 실시하였다.
그 발효에서, 플라스미드에서 cysEXI 대립유전자를 가진 균주가 최대의 시스테인 수율을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다.
배열리스트
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인
(A) 성명 : 콘소티움 퓌르 에렉트로헤미쉬 인투스트리 게엠베하
(B) 번지 : 지엘쉬타트 20
(C) 도시명 : 뮨헨
(D) 연방주명 : 바바리아
(E) 국가명 : 독일연방공화국
(F) 우편번호 : 81379
(G) 전화 : 089/748440
(H) TELEFAX : 089/74844350
(I) TELEX : 5215553 cons d
(ⅱ) 발명의 명칭 : O-아세틸세린, L-시스테인 및 L-시스테인유도생성물의 제조방법
(ⅲ) 배열수 : 24
(ⅳ) 컴퓨터 판독형 :
(A)중간타입 : 플로피디스크(Folppy disk)
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 조작시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, 버전(Version)
(2) SEQ ID NO : 1의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 273개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS):
(D) 토폴로지(TOPOLOGY): 선형
(ⅱ) 분자타입 :단백질
(ⅵ) 기원(ORIGINAL SOURCE) :
(A) 생물체 : 에쉐리키아코리(Escherichia coli)
(B) 균주 : W3110
(Xi) 배열기재 : SEQ ID NO : 1
(2) SEQ ID NO : 2의 정보 :
(ⅰ) 배열특성
(A) 길이 : 1135개의 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 중복
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 :게놈 DNA
(ⅵ) 기원
(A) 생물체 : 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)
(B) 균주 : W3110
(ⅶ)인접원(INNEDIATE SOURCE) :
(B) 클론 : pPC43
(ⅹⅰ) 배열기재 : SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 2의 정보:
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 42개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴콜레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리꼬뉴콜레모티도"
(ⅶ) 적접원 :
(A)라이브러리(LIBRARY) : 합성
(B) 클론 : cysE-fwl
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 3 :
GCCTGGATCC TGCAGTCGAC CTGGCGCATC GCTTCGGCGT TG 42
(2) SEQ ID NO : 4의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 41개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 단일
(D) 톰폴로지(TOPOLOGY) : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴콜레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리(LIBRARY) : 합성
(B)클론 : cysE-revl
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 4
GTAGGAGCTC TGCAGAATTC GGGTATCCGG GAGCGGTATT G 41
(2) SEQ ID NO : 5의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 42개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ)직접원 :
(A) 라이브러리(LIBRARY) :합성
(B) 클론 : cysE-mUT-1
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 5 :
GCCGCTAGCG TTCCGGCT
(2) SEQ ID NO : 6의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 21개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 단일
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각국의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리(LIBRARY) : 합성
(B) 클론 : cysE-Mut-3
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 6 :
CCGCCGCATA CCACCGCCGT T
(2) SEQ ID NO : 7의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 단일
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리(LOBRARY) : 합성
(B) 클론 : cysE-Mut-6
(ⅹⅰ) 배열설명 ; SEQ ID NO : 7 :
CCATCAATGG ATATAGACCA GCAT
(2) SEQ ID NO : 8의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클로티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cysE-Mut-10
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 8 :
GTCGTTGGTG AAGCCGGCGGT GATT
(2) SEQ ID NO : 8의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개 염기쌍
(B) 타입 : 누클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클로티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cysE-Mut-10
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ IN NO : 8 :
GTCGTTGGTG AAGCGGCGGT GATT
(2) SEQ ID NO : 9의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 38개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴콜레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cysE-LHfwl
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 9 :
TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGCGTTG 38
(2) SEQ ID NO : 10의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 46개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 ; 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cysE-Dek270
(ⅹⅰ) 배열설명 : SEQ ID NO : 10 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC CCATACTCAA ATCTATGGTT AATACC 46
(2) SEQ ID NO : 11의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 46개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cysE-De1268
(ⅹⅰ) 배열기재설명 : SEQ ID NO : 11 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC TCAAATGTAT GGTTAATACC GTTGAA 46
(2) SEQ ID NO : 12의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 46개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C)스트렌디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /dese = "올리고뉴골레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cyE-De1263
(ⅹⅰ) 배열기재설명 : SEQ ID NO : 12 :
CTCGATGCAT TACGTATAAA ATACCGTTGA AATGCTGGTC CATATC 46
(2) SEQ ID NO : 13의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 46개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 :합성
(B) 클론 : cysE-De1258
(ⅹⅰ) 배열기재설명 : SEQ ID NO : 13 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TGCTGGTCCA TATCCATTGA TGGCTT 46
(2) SEQ ID NO : 14의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 46개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(ⅶ) 직접원 :
(A) 라이브러리 : 합성
(B) 클론 : cysE-De1258
(ⅹⅰ) 배열기재설명 : SEQ ID NO : 14 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC TGGTCCATAT CCATTGATGG CTTATC 46
(2) SEQ ID NO : 15의 정보 :
(ⅰ) 배열특성 :
(A) 길이 : 47개 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자타입 : 각종의 핵산
(A) 기재설명 : /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii) 직접원
(A) 라이브러리: 합성
(B) 클론: cysE-De1257
(xi) 배열기재설명: SEQ ID NO: 15:
CTCGATGCAT TACGTATTAG TCCATATCCA TTGATGGCTT ATCGCTG 47
(2) SEQ ID NO: 16의 정본:
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜드네스: 단일
(D)토폴로리: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-De1256
(xi)배열 기재 설명: SEQ ID NO: 16:
CTCCGATGCAT TACGTATTAC ATATCCATTG ATGGCTTATC GCTGTC 46
(2) SEQ ID NO: 17의 정본:
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토클로지: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /dasc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원:
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-Del1255
(xi)배열기재설명: SEQ ID NO: 17:
CTCGATGCAT TACGTATTAA TCCATTGATG GCTTATCGCT GTCTGG 46
(2) SEQ ID NO: 18의 정보:
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-De1250
(xi) 배열기재설명: SEQ ID NO: 18:
CTCGATGCAT TACGTATTAA TCGCTGTCTG GTTACCGAC AATACG 46
(2) SEQ ID NO: 19의 정보:
(i)배열특성:
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ii)문자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-De1249
(xi)배열기재설명: SEQ ID NO: 19:
CTCGATGCAT TACGTATTAG CTGTCTGGTT TACCGACAAT ACGAGC 46
(2) SEQ ID NO: 20의 정보:
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ii)문자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원:
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-De1248
(xi)배열기재설명: SEQ ID NO: 20:
CTCGATGCAT TACGTATTAG TCTGGTTTAC CGACAATACG AGCCGG 46
(2)SEQ ID NO: 21의 정보:
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원
(A)라이브러리: 합성
(B)클론:cysE-De1245
(xi)배열기재설명: SEQ ID NO: 21:
CTCGATGCAT TACGTATTAA CCGACAATAC GAGCCGGAAC GCCAGC 46
(2)SEQ ID NO: 22의 정보:
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원:
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-De1239
(xi)배열 기재설명: SEQ ID NO: 22:
CTCGATGCAT TACGTATTAA ACGCCAGCGG CGGTGGTATC CGGCGG 46
(2) SEQ ID NO: 23:의 정보
(i)배열특성
(A)길이: 46개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜디드네스: 단일
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리고뉴클레오티드"
(vii)직접원:
(A)라이브러리: 합성
(B)클론: cysE-De1227
(xi) 배열기재설명: SEQ ID NO: 23:
CTCGATGCAT TACGTATTAC AGCACCACGG AACCTGCGCC AATCTT 46
(2) SEQ ID NO: 24의 정본:
(i)배열특성
(A)길이: 38개 염기쌍
(B)타입: 뉴클레오티드
(C)스트랜드네스: 단일
(D)토폴로리: 선형
(ii)분자타입: 각종의 핵산
(A)기재설명: /desc = "올리로뉴클레오티드"
(vii)직접원
(A)라이브러리: 합성
(B)클론; cysE-LHrev1
(xi)배열기재설명: SEQ ID NO: 24:
CTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG CGGTATTG 38
본 발명은 야생형 효소와 비교하여 감소되는 억제제 L-시스테인에 의한 감수성을 나타내며, 그 단백질배열은 그 야생형 배열과 비교할 때 최소한 하나의 돌연변이 또는 결실을 나타내는 세린 아세틸전이효소에 관한 것으로, 그 돌연변이가 위치 97 의 아미노산에서 위치 273 의 아미노산까지의 배열영역에 있으며, 그 결실이 전방위치에서 아미노산의 카르복시말단배열영역에 있고, 위치 1 은 도 5 에서 출발메티오닌(SEQ ID NO:1)이며, 위치 256 에서 돌연변이체 Met~Ile 를 가진 단백질배열은 제외시킴을 특징으로 한다.
그 세린 아세틸전이효소의 카르복실말단의 새로운 아미노산 치환 및/또는 아미노산 결실(deletions)은 시스테인 감수성을 감소시킴과 동시에 적합한 효소활성을 보유하도록 한다.
그 새로운 세린 아세틸전이효소는 1mM L-세린과 0.1mM 아세틸-CoA 의 존재하에 0.005~2.3mM의 억제제 정수 Ki 를 가지며, 여기서 최소한 하나의 돌연변이를 가진 세린 아세틸 전이효소는 1mM L-세린과 0.1mM 아세틸-CoA 의 존재하에서 0.015~2.3mM 의 억제제 정수 Ki 를 갖는 것이 바람직하며, 최소한 하나의 카르복실말단 결실을 가진 세린 아세틸전이효소는 1mM L-세린 및 0.1mM 아세틸-CoA 의 존재하에 0.005~0.03mM 의 억제제 정수 Ki 를 나타내는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 효소 돌연변이체 L-시스테인에 대한 억제제정수(Ki)는 1mM L-세린과 0.1mM 아세틸-CoA 의 존재하에서 0.02~2.3mM 이다.
새로운 세린 아세틸 전이효소는 이들을 포함하는 미생물의 생장에 적합한 활성을 나타낸다.
새로운 세린 아세틸전이효소의 단백질 배열에는 표 1a 또는 1b 에 기재되어 있는 최소한 하나의 cys E 돌연변이체의 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직하다.
표1a : 코딩영역에서 단 또는 복(single or multiple)아미노산변화를 가진 피드백-내성 cye E 대립유전자
[표1a]
| cyseE돌연변이체 | 뉴클레레오티드치환(No.) | 아미노산치환(No.) | K1(μM) | 활성μmol/min×mg |
| cysEII | GGC-〉AGC(934) | Gly238-〉Ser238 | 10 | 0.068 |
| cysEIII | GGT-〉GAT(716) | Gly165-〉Asp165 | 10 | 0.030 |
| cysEIV | GCT-〉GTT(932)GGC-〉AGC(934) | Ala237-〉Val237Gly238-〉Ser238 | 40 | 0.170 |
| cysEV | GCT-〉GTT(932)GGC-〉AGC(934)ATG-〉ATA(990) | Ala237-〉Val237Gly238-〉Ser238Met256-〉Ile256 | 10 | 0.246 |
| cysEVI | GGC-〉AGC(934)ATG-〉ATA(990) | Gly238-〉Ser238Met256-Ile256 | 10 | 0.075 |
| cysEVII | GCT-〉GTT(932) | Ala237-〉Val237 | 10 | 0.253 |
| cysEVIII | ATG-〉ATA(990)GCT-〉GTT(932) | Met256-〉Ile256Ala237-〉Val237 | 30 | 0.160 |
| cysEX | ACG-〉GCG(721) | Thr167-〉Ala167 | 50 | 0.156 |
| cysEXI | ACG-〉GCG(721)GGT-〉AGT(955) | Thr167-〉Ala167Gy245-〉Ser245 | 700 | 0.117 |
| cysEXII | AAA-〉CAA(511)GGC-〉AGC(934)TTT-〉TTG(1023) | Lys97-〉Gln97Gly238-〉Ser238Phe267-〉Leu267 | 40 | 0.254 |
| cysEXIII | GTT-〉GCT(713)TTT-〉TTG(1023) | Val164-〉Ala164Phe267-〉Leu267 | 30 | 0.213 |
| cysEXIV | ACG-〉GCG(721)ATG-〉TAG(988+989) | Thr167-〉Gly250Met256-〉Stop256 | 〉1000 | 0.453 |
| cysEXIVI | GAT-〉GGT(971)AAG-〉TAG(973) | Asp250-〉Gly250Lys251-〉Stop251 | 50 | 0.554 |
| cysEXVII | GGT-〉GAT(716)AGC-〉GCG(721) | Gly165-〉Asp165Thr167-〉Ala167 | 100 | 0.052 |
| cysEXXIII | ACG-〉GCGGCT-〉GTTGGC-〉AGC | Thr167-〉Ala167Ala237-〉Val237Gly238-〉Ser238 | 2300 | 0.085 |
표 1b : 카르복실말단 결실을 가진 피드백-내성 cysE 대립유전자
| cyseE돌연변이체 | 결실아미노산 | 말단아미노산 | K1(μM) | 활성μmol/min×mg |
| cysE-Del259 | 14 | His259 | 7.5 | 0.328 |
| cysE-Del258 | 15 | Gln258 | 5 | 0.256 |
| cysE-Del257 | 16 | Asp257 | 7.5 | 0.394 |
| cysE-Del256 | 17 | Met256 | 12.5 | 0.366 |
| cysE-Del255 | 18 | Asp255 | 30 | 0.624 |
| cysE-Del250 | 23 | Asp250 | 20 | 0.405 |
| cysE-Del249 | 24 | Ser249 | 15 | 0.420 |
| cysE-Del248 | 25 | Asp248 | 12.5 | 0.270 |
새로운 시스테인-무감수성 세린 아세틸전이효소는 예로서 새로운 세린 아세틸 전이효소를 엔코딩하는 DNA 배열을 발현시켜 얻을수 있다.
이들의 DNA 배열에 의해 엔코딩시킨 효소변이형은 억제제 L-시스테인에 대한 서로 다른 감수성을 각각 나타낸다.
그러나, 그 세린아세틸 전이효소는 모든 경우 그 야생형과 비교하여 억제제 L-시스테인은 최소한 5배 이상 저항성이 있음을 확인하였다.
또, 본 발명은 새로운 세린 아세틸 전이효소를 엔코딩하는 DNA 배열에 관한 것이다.
이들의 DNA 배열은 bp 510~bp1040 에서 각각 cysE 유전자의 코딩한 DNA 배열영역에서 최소한 하나의 돌연변이를 나타내며, bp1 은 도 6 에서 제 1 염기(first base),(SEQ IO NO:2)이며 위치 990 에서 아데인에 대한 구아닌의 돌연변이를 제외시킴을 특징으로 한다.
그 새로운 DNA 배열은 또 피드백-내성 cysE 대립유전자를 말한다.
이들의 DNA 배열은 예로서 아래에서 설명하는 출발물질로부터 통상의 돌연변이 유발방법 또는 표적 돌연변이 유발방법에 의해 제조할 수 있다.
상기 DNA 영역 내에서의 통상의 돌연변이는 예로서 화학제품(chemical agents)(즉, 니트로소구아니딘, 에틸메탄설폰산 등)및/또는 물리적 방법(Miller, J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory , USA : (13-185) 및/또는 소정의 조건에 실시하는 PCR 반응(Gilbbs, R.A. 1990, Anal. Chem, 62:1202-1214)에 의해 제조할 수 있다.
DNA 프라그먼트내에서 소정의 위치에 돌연변이를 도입시키는 방법은 공지되어 있으며, 예로서 다음 간행물에 기재되어 있다.간행물(Sarkar, G., Sommer, S.S., 1990, Biotechniques 8:404-407)에서는 PCR 을 사용하는 특정부위 돌연변이유발(site-specific mutagenesis)에 대하여 기재되어 있고, 간행물(Ausubel, F.M. 등, 1987, PP. 8.01~8.36 current protocols in Molecular biology, Greene Publishing Associates)에서는 M13 파지(phages)를 사용하는 특정부위 돌연변이 유발방법에 대하여 기재되어 있다.
피드백 내성 CysE 대립유전자를 생성하는 또 다른 방법은 피드백 내성으로 되는 서로다른 돌연변이를 조합시켜 새로운 특성을 가진 복 돌연변이체(multiple mutants)의 증가를 나타낸다.
야생형(wild-type)CysE 유전자 또는 돌연변이에 의해 불활성화시킨 CysE 유전자, 또는 돌연변이시켜 피드백내성 세린 아세틸전이효소를 이미 엔코딩한 cysE 유전자의 DNA 은 그 돌연변이 유발 출발재료로서 사용하는 것이 바람직하다.
돌연변이를 시킨 cysE 유전자는 염색체 또는 염색체외에 엔코딩할 수 있다.
예로서 야생형 cysE 유전자를 포함하는 출발 DNA 프라그먼트는 재조합 DNA 를 생성하는 공지의 기존기술을 사용하여 벡터상에서 재조합시킨다.
앞서 설명한 돌연변이 유발방법을 사용하여, 그 DNA 배열에서 하나이상의 뉴클레오티드를 변화시킴으로써, 그 유전자에 의해 엔코딩한 아미노산배열은 위치 97 에서, 또 최소한 하나의 결실이 위치 227 에서의 아미산으로 출발하는 카르복실 말단배열에 존재하고, 여기서 위치 1 은 도 5 에서 개시하는 메티오닌(SEQ ID NO:1)이고, 위치 256 에서 Met~Ile 의 돌연변이는 제외된다.
위에서 설명한 기술을 사용하여, 엔코딩한 세린 아세틸전이효소가 시스테인의 무감수성(cysteine insensitivity)으로 되는 아미노산 배열을 갖도록 하는 하나이상의 돌연변이를 sysE 유전자의 상기 DNA 영역으로 도입시킬수 있다.
위에서 실시한 돌연변이유발을 한 다음, 예로서 바람직한 페노타입(phenotype)를 가진 돌연변이체는 예로서 시스테인이 없는 배지에 평판배양시켜(plating)선택한 다음 변연변이된 세린 아세틸 전이효소와 시스테인에 감수성이 있는 범위를 측정한다.
본 발명은 또 피드백 내성 cysE 대립유전자를 포함한 미생물에 관한 것이다.
이와같은 미생물의 균주는 최소한 하나의 피드백 내성 cysE 대립 유전자에 의해 조절해제시킨(deregulated)시스테인 대사를 가짐을 특징으로 한다.
원칙적으로, 시스테인 대사는 그 자체공지된 동일한 대사 과정에 의해 진행되고, 새로운 균주를 제조하는데 사용되는 기술이 예로서 종래의 표준참고서에 널리 공지되어 있어, 모든 미생물에 적용할 수 있기 때문에, 새로운 균주 역시 미생물에서 제조할 수 있다.
세균은 새로운 균주의 제조에 적합한 것이 바람직하다.
그램 음성균, 특히 에.코리(E.coli)가 바람직하다.
본 발명은 또 새로운 미생물을 배양시켜, L-시스테인 또는 L-시스테인에서 유도되는 유도생성물의 제조에 관한 것이다.
그 피드백 내성 cysE 대립유전자는 중요한 생합성 조절점에서 조절을 제거할 수 있으므로, 이 조절점의 하류에 위치한 다수의 화합물의 생성을 증폭시킬수 있다.
이들의 화합물에는 특히 0-아세틸세린, L-시스테인 및 L-시스테인 유도생성물이 있다.
L-시스테인 유도생성물은 L-시스테인에서 유도된 일체의 생성물이다.
즉, 이들 화합물의 제조에 L-시스테인을 필요로 하는 유황함유 화합물이다.
이와같은 생성물의 예로는 2(R,S)-메틸티아졸리딘-2(R,S), 4(R)-디 카르복실산, 호모시스테인, 메티오닌, 바이오틴 및 글루타티온이 있다.
변질(altered)세린 아세틸 전이효소를 나타내기 위하여, 피드백 내성 cysE 대립유전자를 통상의 방법에 의해 숙주 균주에서 형질전환시킨다.
예로서, 변질 세린 아세틸 전이효소 특성을 가진 균주의 선별은 예로서 아래에서 설명하는 방법에 의해 실시한다.
그 변질 효소에서의 시스테인 무감수성 정도(extent)를 측정하기 위하여, 그 균주에 의한 시스테인의 분비물(secretion)을 우선 반정성시험, 즉 크로스-피딩테스트(coss-feeding test)로 모두 측정한다.
테스트할 균주는 시스테인에 대하여 독립영양체가 있는 인디케이터 균주(indicator strains)를 첨가하는 시스테인이 없는 최소배지에 처리한다.
소정의 배양 스트릭(streak)(halo)주위에 있는 인디케이터 균주의 생장 영역은 그 시스테인 분비물의 반정성 측정 테스트로 사용한다.
그 크로스-피딩 테스트에서 반경 〉2mm 를 가진 할로(halo)가 있는 모든 균주를 "크로스-피딩테스트에서 양성(positive)"인 것으로 정한다.
효소 활성 테스트는 변질 세린 아세틸전이효소의 시스테인 내성(tolerance)범위를 측정하기 위하여 선택균주에서 실시한다.
시스테인의 존재하에서 그 세린 아세틸 전이효소의 활성을 측정할 수 있는 어떤 방법이라도 이 효소의 시스테인 감수성을 측정하는데 사용할 수 있다.
예로서, 그 세린 아세틸 전이효소 활성은 참고문헌(Kredich 및 Tomkins, J.Biol, Chem, 241:4955-4965, 1966)에 기재되어 있는 방법에 의해 측정할 수 있다.
이 테스트에서, 효소 테스트 혼합물에는 기질, L-세린 및 보조인자(cofactor), 아세틸-코엔자임 A 를 포함한다.
그 반응은 효소 첨가에 의해 개시되고 232nm 에서 흡수감소를 스펙트로포토미터(spectro photometer)로 측정함으로써 감시하며, 아세틸-코엔자임 A 에서 티오에스테르 결합의 분리에 의해 유도된다.
위에서 설명한 효소 테스트는 변질 카르복실 말단을 가진 효소를 포함하여 세린 아세틸 전이효소의 시스테인 활성을 측정하는데 적합한다.
세린 아세틸 전이효소 활성의 억제는 반응 혼합물 중에서 서로다른 농도의 시스테인 존재하에 테스트한다.
그 서로다른 세린 아세틸 전이효소의 촉매활성은 L-시스테인의 존재하에 그리고 L-시스테인없이 측정되며, 그 억제제 정수 Ki 는 참고문헌(Kredich 및 Tomkins, J.Biol. chem., 241, 4955-4965, 1966)에서 확인된다.
대부분의 경우 효소활성 세린 아세틸전이효소는 시스테인 감수성 감소를 갖는 것이 바람직하다.
최종생성물 감수성과 촉매 활성에서 동시 감소가 바람직하다.
일반적으로, 최종생성물의 내성 세린 아세틸전이효소는, 0-아세틸 세린 또는 L-시스테인 또는 너무 광범위하게 생성되는 유도 대사물질이 세포내에서 축적되어 독성을 발생하여 세린 아세틸 전이효소 활성을 감소시키는 돌연변이체의 선택을 유도할 수 있기 때문에 과도한 발현이 바람직하지 않다.
이 때문에, 그 피드백 내성 cysE 대립유전자는 통상의 방법에 의해 단복제로서 게놈에 결합시키는 것이 바람직하다.
적합한 벡터를 사용하여 염색체에서 단일 유전자를 결합하는 방법은 다음 문헌에 기재되어 있다.(즉 winans 등, 1985; J.Bacteriol. 161 : 1219-1221;Shevell 등, 1988; J.Bacteril. 1970; 3294-3296; kulakauskas 등, 1991, J. Bacteriol. 173:2633-2638).
동일하게, 그 피드백-내성 세린 아세틸 전이효소를 복제수가 낮은 플라스미드상에서 발현시키는 것이 바람직하다.
널리 공지되어 있는 바와같이, 그 발현 벡터는 그 피드백-내성 cysE 대립유전자 이외에 아래에서 설명되는 추가 구성요소를 갖는 것이 바람직하다.
그 벡터상에 존재하는 코딩배열은 바람직한 범위까지 그 코딩 배열을 발현하는데 필요로 하는 조절 구성요소에 연결되는 것이 바람직하다.
이들의 조절 구성요소의 예로는 촉진제(promoters), 리보솜 결합부위(ribosomal binding sites) 및 말단 배열이 있다.
대분의 경우, 그 새로운 돌연변이체를 발현하는데는 본래의 조절 cysE 배열을 사용한다.
그러나 다른 조절 배열도 사용할 수 있다.
선택성 마커(marker)및/또는 리포터(reporter)유전자를 엔코딩한 배열은 그 조절구성요소 이외에 발현 벡터상에 존재하는 것이 바람직하다.
이와같은 선택성 마커의 발현은 형질전환체의 확인을 용이하게 한다.
적합한 선택 마커는 예로서 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 기타 항생물질에 대한 내성을 엔코딩한 유전자이다.
그 새로운 돌연변이체가 염색체 이외에서 복제되도록 할 경우, 그 플라스미드 벡터에는 복제의 기시부(origin)를 포함하는 것이 바람직하다.
복제의 기시부를 제거한 벡터를 사용하여 유전자를 염색체에 결합시키는 방법은 다음문헌에 기재되어 있다.(Winans 등, 1988; J.Bacteriol. 161:1219-1221; shevell 등, 1988; J.Bacteriol. 170 : 3294-3296;Kulakauskas 등, 1991, J. Bacteriol. 173:2633-2638).
에.콜리(E.coli)에서 자율복제할 수 있는 벡터의 예는 참고문헌(pouwels, P.H., Enger-valk, BE., Brammer, W.J. 1985, cloning Vectors, ElSevier, Amsterdam)에 기재되어 있다.
이와같은 벡터의 예는 다음과 같다.
-pBR322 및 pUC18 등 복제수가 높은 플라스미드,
-pACYC184, pACYC177 및 pSC101 등 복제수가 낮은 플라스미드의 배지,
-M13 벡터등 파지벡터
적합한 벡터에는 복제수가 낮은 배지를 가진 벡터가 바람직하고,
PACYC184(ATCC37033)또는 pACYC177(ATCC370310)등 p15A 리플리콘(replicon)을 가진 벡터가 특히 바람직하다.
다수의 벡터에 대해서는 다른 세균에 대한 참고문헌(pouwels, P.H., Engervalk, B.E., Brammer, W.J. 1985, cloneing vectors, Elsevier, Amsterdam)에 기재되어 있다.
이들의 벡터가 사용될 때, 다른 세균에서 새로운 돌연변이체를 발현할 수 있다.
적합한 재조합 벡터는 재조합 DNA를 제조하는 일반기술에 의해 제조할 수 있다.
이들의 기술은 일반기술서적에서 구체적으로 기재되어 있다.
적합한 숙주 균주는 시스테인-무감수성 세린 아세틸전이효소를 엔코딩하는 전자단위(transcription unit)를 포함하는 발현벡터로 형질전화시킨다.
시스테인-감수성 단백질, 예로서 프로카리오트(prokaryotes)또는 이스트(yeastes)를 포함하는 균주는 숙주균주로서 사용된다.
에.콜리(E.coli)야생형 균주 또는 내인성(endogenous)cysE유전자가 불활성화되어 새로운 cysE 유전자에 의해 보충되는 균주의 사용이 바람직하다.
이와같은 세포시스템은 L-시스테인 및 그 시스테인에서 유도된 대사물질을 과잉 생산하는데 적합하다.
최소한 하나의 피드백 내성 cysE 대립유전자를 포함하는 균주를 배양할 때, 1mM L-시스테인과 0.1mM 아세틸-CoA 의 존재하에 Ki 값 0.015~2.3mM을 가진 피드백-내성 cysE 대립유전자가 있는 균주가 상당히 더 큰 량의 시스테인을 분비함을 확인하였다.
새로운 세린 아세틸 전이효소는 또 반감수성(antisense)RNA를 사용하여 제조할 수 있다.
반감수성 RNA을 사용하여 역유전(reverse genetics)에 의한 소정의 방법으로 유전자 활성을 볼록킹 또는 변성시키는 것은 종래의 기술로서 문헌에 기재되어 있다(Inouye, 1988, Gene 72:25-35).
반감수성 RNA 는 단백질을 엔코딩하는 스트랜드(strand)와 상보성이 있는 DNA 스트랜드의 전사생성물이다.
본래(native)또는 형질전환시키는 cysE 유전자의 3'코딩스트랜드의 소정영역과 상보성이 있는 반감수성 RNA를 발현 벡터로 제조함으로써 생체내 세린 아세틸전이효소의 시스테인 감수성을 감소시킬수 있다.
이 경우, 반감수성 RNA 는 cysE=mRNA 의 목표(표적)배열에 특히 어닐링(annealing)하여, 카르복실 말단에서 절단시켜, 실시예 3 의 결실 돌연변이체와 동일하게 억제제 L-시스테인에 대한 감수성 감소를 나타내는 새로운 세린 아세틸전이효소의 합성을 유도한다.
본 발명의 추가 목적은 새로운 미생물에 의해 시스테인의 최적의 광잉생산을 보장받는데 적합하다.
적합한 배지와 조합하여 새로운 세린 아세틸 전이효소 돌연변이체를 사용하여 과잉생산을 하는 O-아세틸 세린의 세포내 과잉생산은 시스테인의 세포외부농도의 현저한 증가를 초래하게 된다는 것을 기대이상으로 발견하였다.
따라서, 새로운 세린 아세틸 전이효소 돌연변이체는 시스테인의 과잉생산에 적합하다.
이와같은 과잉생산을 하기 위하여, 새로운 미생물은 생산배지에서 적합한 량의 유황도너(donors)를 제공해야할 필요가 있다.
모든 유기 유황화합물은 시스테인 과잉생산을 달성하는데 있어 유황도너로서 사용에 적합하다.
적합하고 바람직한 이들의 화합물에는 설페이트, 설피트, 설피드, 디티오니트 및 티오설페이트가 있다.
티오설페이트가 적합하고, 최적의 시스테인 생산을 얻는데 가장 바람직하다.
시스테인의 수율 증가는 설페이트 감소효소(유전자 cysD, C, H, G,I 및 J 에 의해 엔코딩함)와 유황수화(sulfhydrating)효소(유전자 cysK 및 cysM 에 의해 엔코딩함)를 추가로 과잉 발현시켜 얻을수 있다.
그 시스테인 수율의 또 다른 증가는 a) 연속발현(constitutive expression)을 달성하기 위하여 그 유전자 레벨에서 조절 단백질 cysB 의 조절해제에 의해 가능하다.
그 cysB 단백질은 에.콜리(E.coli)에서의 시스테인 생합성 조절에서 과잉조절을 가진 단백질로서 작용한다.(Kredich, N.M., 1987, Biosynthesis of cysteine, In : Neidhardt F.C., Ingraham, J.L., Magasanik, B., Low, K.B., schaechter, M., umbarger, H.E.,(eds)Escherichia coli and salmonella tyshimurium : (ellular and molecular biology, vol, 1. American socuety for Microbiology, washington DC., 419-428).
또 다른 증가는 b) Ser A 야생형 그룹에서 선택되는 Ser A 유전자와 세린에 대한 감수성이 감소된 포스포글리세레이트 탈수소효소를 엔코딩하는 SerA 유전자를 새로운 cysE 유전자의 조합에 의해 가능하다.
그 또 다른 증가는 c) 세린을 외부에서의 공급에 의해 가능하다.
그 본래의 시스테인-감수성 세린 아세틸 전이효소의 유전자는 숙주균주에서 불활성인 것이 바람직하므로, 이것은 형질전환에 의해 소정의 균주로 도입시켜 합성한 시스테인-불감수성 세린 아세틸 전이효소 단독인으로 확실히 보장받는다.
다수의 프로토콜(protocols)은 에.콜리(E.coli)에서 본래의 불활성 유전자로 존재한다(Hamilton 등, 1989, J.Bacteriol. 171:4617-4622; Russel 등, 1989, J.Bacteriol 171 : 2609-2613; shen and Huang, 1986, Genetics 112 : 441-457; Jasin and schimmel, 1984, J.Bacteriol. 159:783-786).
변질세린 아세틸 전이효소를 엔코딩하는 유전자의 단복제가 숙주게놈으로의 결합이 또 바람직하다.
이 기술의 구체적기재 및 참증문헌은 다음 간행물에서 예로서 예시할 수 있다:
shcvell 등, 1988, J.Bacteriol. 170 : 3294-3296 ; Kulakauskas 등, 1991, J.Bacteriol. 173 : 2633-2638:
Ki 정수가 서로 다른 cysE 대립 유전자는 복제수가 낮은 벡터에서 클로닝되고 적합한 생산균주로 형질전화되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해, 피드맥 내성 세린 아세틸 전이효소를 사용하여 O-아세틸세린, L-시스테인 및 그 L-시스테인에서 유도된 유황함유 화합물을 제조할 수 있다.
본 발명에 의한 세린 아세틸린이 효소는 돌연변이가 위치 97의 아미노산에서 위치 273의 아미노산까지의 배열영역내에 있거나, 또는 그 결실이 앞쪽위치 227에서 아미노산의 카르복실말단 배열에 있고, 그 위치 1은 도 5의 출발메티오닌(SEQ ID NO:1)이고, 위치 256에서 Met∼Ile의 돌연변이는 제외시키며, 억제제 정수 Ki는 1mM L- 세린과 0.1mM 아세틸-CoA의 존재하에서 0.02∼2.3mM인 특징을 가진다.
본 발명에 의한 세린 아세틸 전이효소 돌연변이체로 시스테인을 과잉생산할 수 있다.
Claims (8)
- 야생형효소와 비교하여 감소되는 억제제 L-시스테인의 감수성을 나타내며, 그 단백질 배열은 그 야생형 배열과 비교할 때 최소한 하나의 돌연변이 또는 결실을 나타내는 세린 아세틸 전이효소에 있어서,그 돌연변이는 위치 97에서의 아미노산에서 위치 273의 아미노산까지의 배열영역내에 있거나, 또는그 결실이 앞쪽 위치 227에서의 아미노산의 카르복실말단배열에 있으며,그 위치 1은 도 5의 출발메티오닌(SEQ ID NO: 1)이고, 위치 256에서 Met∼Ile의 돌연변이는 제외시키며,그 억제제 정수 Ki는 1mM L-세린과 0.1mM 아세틸-CoA의 존재하에서 0.02∼2.3mM임을 특징으로 하는 세린아세틸 전이효소.
- 야생형효소와 비교하여 감소되는 억제제 L-시스테인에 대한 감수성을 나타내고, 그 단백질배열은 그 야생형 배열과 비교할 때 최소한 하나의 돌연변이 또는 결실을 나타내는 세린 아세틸 전이효소에 있어서,그 단백질 배열에는 표 1a 또는 표 1b에 기재된 최소한 하나의 cysE 돌연변이체의 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는 세린 아세틸 전이효소.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 세린 아세틸전기효소를 엔코딩한 DNA 배열.
- 야생형효소와 비교할 때 감소되는 억제제 L-시스테인의 감수성을 나타내는 세린 아세틸 전이효소를 엔코딩하며, bp510∼bp1040에서 최소한 하나의 돌연변이를 가지며, bp1은 도 6에서 최소염기(SEQ ID NO: 2)이고, 위치 990에서 구아닌∼아데닌, 티미딘 또는 시토신의 돌연변이는 제외시킨 DNA 배열.
- 제3항 또는 제4항에서 최소한 하나의 DNA배열에 의해 조절해제시킨 시스테인 대사를 가진 미생물.
- O-아세틸세린, L-시스테인 또는 L-시스테인에서 유도되는 생성물의 제조방법에 있어서,제5항의 미생물을 영양배지에서 공지의 방법으로 배양시킴을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서,그 영양배지에는 적량의 유황도너(donor)가 포함됨을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서,유황도너로는 티오설페이트를 사용함을 특징으로 하는 방법.
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