JP3329825B2 - Ｏ−アセチルセリン、ｌ−システイン及びｌ−システイン−関連生成物の製法 - Google Patents
Ｏ−アセチルセリン、ｌ−システイン及びｌ−システイン−関連生成物の製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はＯ−アセチルセリン、Ｌ−システイン及びこ
れから誘導された硫黄含有化合物の製法に関する。
れから誘導された硫黄含有化合物の製法に関する。
Ｌ−システイン及びその誘導体は医薬品の分野（気管
支疾患の治療）、化粧品分野（毛髪シャンプー及びパー
マネントローション中の成分として）及び食品分野（抗
酸化剤及び味強化剤として、ねり粉の加工におけるアジ
ュバントとして）使用される。Ｌ−システインは従来ケ
ラチン含有材料、例えば毛髪、剛毛、角、蹄及び羽から
の抽出により、又は前駆物質の酵素的変換により得られ
る。Ｌ−システインが経済的に興味深い化合物であるだ
けでなく、更に図１〜図３から明らかなように、グルタ
チオン、メチオニン及びビオチンの合成のための重要な
中間体であるので、微生物によるＬ−システインの過剰
生産は非常に望まれている。
支疾患の治療）、化粧品分野（毛髪シャンプー及びパー
マネントローション中の成分として）及び食品分野（抗
酸化剤及び味強化剤として、ねり粉の加工におけるアジ
ュバントとして）使用される。Ｌ−システインは従来ケ
ラチン含有材料、例えば毛髪、剛毛、角、蹄及び羽から
の抽出により、又は前駆物質の酵素的変換により得られ
る。Ｌ−システインが経済的に興味深い化合物であるだ
けでなく、更に図１〜図３から明らかなように、グルタ
チオン、メチオニン及びビオチンの合成のための重要な
中間体であるので、微生物によるＬ−システインの過剰
生産は非常に望まれている。
Ｌ−システインは全ての有機体中で硫黄代謝において
重要な位置を占めており、かつ蛋白質、グルタチオン、
ビオチン、メチオニン及び他の硫黄含有代謝物質の合成
に使用される。更に、Ｌ−システインは補酵素Ａの生合
成のための前駆物質として用いられ、その上Ｌ−システ
インは容易に酸化されてシステインとなる。Ｌ−システ
インの生合成と他のアミノ酸、例えばＬ−セリン、グリ
シン及びＬ−メチオニンの生合成との間には非常に緊密
な関連がある。
重要な位置を占めており、かつ蛋白質、グルタチオン、
ビオチン、メチオニン及び他の硫黄含有代謝物質の合成
に使用される。更に、Ｌ−システインは補酵素Ａの生合
成のための前駆物質として用いられ、その上Ｌ−システ
インは容易に酸化されてシステインとなる。Ｌ−システ
インの生合成と他のアミノ酸、例えばＬ−セリン、グリ
シン及びＬ−メチオニンの生合成との間には非常に緊密
な関連がある。
Ｌ−システインの合成（図４）は、原核細胞、特に細
菌中で十分に研究されている（Kredich,N.M.及びG.M.To
mkins 1966,J.Biol.Chem.241:4955−4965;Kredich,N.
M.,1987,Biosynthesis of Cysteine.In:Neidhardt F.
C.,Ingraham,J.L.,Magasanik,B.,Low.K.B.,Schaether,
M.,Umbarger,H.E.（eds）Escherichia coli and Salmon
ella typhimurium:Cellular and molecular biology, V
ol.1.American society for Microbiology,Washington
D.C.,419−428）。キー反応はＯ−アセチルセリンの形
成のためにセリン上にアセチル基を移し１）、引き続き
アセチル基をSH−基に対して交換し、これによりＬ−シ
ステインを合成する２）、ということにある。
菌中で十分に研究されている（Kredich,N.M.及びG.M.To
mkins 1966,J.Biol.Chem.241:4955−4965;Kredich,N.
M.,1987,Biosynthesis of Cysteine.In:Neidhardt F.
C.,Ingraham,J.L.,Magasanik,B.,Low.K.B.,Schaether,
M.,Umbarger,H.E.（eds）Escherichia coli and Salmon
ella typhimurium:Cellular and molecular biology, V
ol.1.American society for Microbiology,Washington
D.C.,419−428）。キー反応はＯ−アセチルセリンの形
成のためにセリン上にアセチル基を移し１）、引き続き
アセチル基をSH−基に対して交換し、これによりＬ−シ
ステインを合成する２）、ということにある。
１）Ｌ−システイン＋アセチル−補酵素Ａ →Ｏ−アセチルセリン＋補酵素Ａ ２）Ｏ−アセチルセリン＋H2S →Ｌ−システイン＋アセテート 微生物中及び植物中でＯ−アセチルセリンはＬ−シス
テインのための炭素骨格の直接の前駆物質であり、セリ
ンではない（Kredich,N.M.及びG.M.Tomkins 1966,J.Bio
l.Chem.241:4955−4965）。Ｌ−セリンの活性型の形成
のためのアセチル基移動の反応はcysE−遺伝子によりコ
ードされたセリン−アセチルトランスフェラーゼ（EC
2.3.1.30）により触媒され、かつ最終生成物Ｌ−システ
インによる厳密な制御下にある。セリン−アセチルトラ
ンスフェラーゼに関する遺伝子はすでにクローン化さ
れ、かつこのDNA−配列から誘導されたアミノ酸配列は
公知である（Denk,D.及びBoeck,A.1987,J.Gen.Microbio
l.133:515−525.）。
テインのための炭素骨格の直接の前駆物質であり、セリ
ンではない（Kredich,N.M.及びG.M.Tomkins 1966,J.Bio
l.Chem.241:4955−4965）。Ｌ−セリンの活性型の形成
のためのアセチル基移動の反応はcysE−遺伝子によりコ
ードされたセリン−アセチルトランスフェラーゼ（EC
2.3.1.30）により触媒され、かつ最終生成物Ｌ−システ
インによる厳密な制御下にある。セリン−アセチルトラ
ンスフェラーゼに関する遺伝子はすでにクローン化さ
れ、かつこのDNA−配列から誘導されたアミノ酸配列は
公知である（Denk,D.及びBoeck,A.1987,J.Gen.Microbio
l.133:515−525.）。
Ｌ−システインの形成自体は、遺伝子cysK（Ｏ−アセ
チルセリン−スルフヒドリラーゼ−Ａ）及びcysM（Ｏ−
アセチルセリン−スルフヒドリラーゼ−Ｂ）によりコー
ドされた、２つのＯ−アセチルセリン・スルフヒドリラ
ーゼ・アイソザイム（EC 4.2.99.8）により１つの反応
が触媒され、この反応においてＯ−アセチルセリンはβ
−アラニル−ドナーとしてかつH2Sはβ−アラニル−ア
クセプターとして機能し（Kredich,N.M.及びG.M.Tomkin
s 1966,J.Biol.Chem.241:4955−4965）、この際Ｏ−ア
セチルセリン−スルフヒドリラーゼ−Ａはシステイン合
成に主要な関与を有する。更に、Ｏ−アセチルセリン−
スルフヒドリラーゼ−Ｂ（cysM）はチオスルフェートを
硫黄源として利用することができる（Sirko,A.等,1987,
J.Gen.Microbiol.133:2719−2725）。Ｏ−アセチルセリ
ン−スルフヒドリラーゼ−ＢはＯ−アセチルセリンとチ
オスルフェートとの、Ｓ−スルホシステインへの反応を
触媒し、次いでこのＳ−スルホシステインはシステイン
に変換されうる（Nakamura,T.等,1983,J.Bacteriol.15
6,656−662）。
チルセリン−スルフヒドリラーゼ−Ａ）及びcysM（Ｏ−
アセチルセリン−スルフヒドリラーゼ−Ｂ）によりコー
ドされた、２つのＯ−アセチルセリン・スルフヒドリラ
ーゼ・アイソザイム（EC 4.2.99.8）により１つの反応
が触媒され、この反応においてＯ−アセチルセリンはβ
−アラニル−ドナーとしてかつH2Sはβ−アラニル−ア
クセプターとして機能し（Kredich,N.M.及びG.M.Tomkin
s 1966,J.Biol.Chem.241:4955−4965）、この際Ｏ−ア
セチルセリン−スルフヒドリラーゼ−Ａはシステイン合
成に主要な関与を有する。更に、Ｏ−アセチルセリン−
スルフヒドリラーゼ−Ｂ（cysM）はチオスルフェートを
硫黄源として利用することができる（Sirko,A.等,1987,
J.Gen.Microbiol.133:2719−2725）。Ｏ−アセチルセリ
ン−スルフヒドリラーゼ−ＢはＯ−アセチルセリンとチ
オスルフェートとの、Ｓ−スルホシステインへの反応を
触媒し、次いでこのＳ−スルホシステインはシステイン
に変換されうる（Nakamura,T.等,1983,J.Bacteriol.15
6,656−662）。
Ｌ−システインによるセリン−アセチルトランスフェ
ラーゼの野生型の最終生成物阻害はシステイン生合成の
運動力学的制御において生理学的に重要なファクターで
ある（Kredich,N.M.1971,J.Biol.Chem.246,3474−3484;
Kredich,N.M.及びG.M.Tomkins 1966,J.Biol.Chem.241:4
955−4965）。セリン−アセチルトランスフェラーゼの
野生型の活性はシステインにより阻害される。この阻害
は運動力学的に研究され、かつ競合的な特徴を示した。
アセチル補酵素A0.1mM及びＬ−セリン1mMの存在におい
て、阻害定数Ki＝1.1×10-6Mが測定された（Kredich,N.
M.1971及びTomkins G.M.1966,J.Biol.Chem.241:4955−4
965）。
ラーゼの野生型の最終生成物阻害はシステイン生合成の
運動力学的制御において生理学的に重要なファクターで
ある（Kredich,N.M.1971,J.Biol.Chem.246,3474−3484;
Kredich,N.M.及びG.M.Tomkins 1966,J.Biol.Chem.241:4
955−4965）。セリン−アセチルトランスフェラーゼの
野生型の活性はシステインにより阻害される。この阻害
は運動力学的に研究され、かつ競合的な特徴を示した。
アセチル補酵素A0.1mM及びＬ−セリン1mMの存在におい
て、阻害定数Ki＝1.1×10-6Mが測定された（Kredich,N.
M.1971及びTomkins G.M.1966,J.Biol.Chem.241:4955−4
965）。
システイン−要求株のメタンスルホン酸エチルエステ
ルでの化学的突然変異誘発により、システイン原栄養復
帰突然変異細胞を単離することができ、かつそのセリン
−アセチルトランスフェラーゼ活性はコード領域中での
アミノ酸交換によりＬ−システインによる弱い最終生成
物阻害を示す、ということは文献公知の例である（Den
k,D.,Boeck,A.,1987,J.Gen.Microbiol.133:515−52
5）。こうして、この突然変異体のKiは野生型に対し
て、約0.01mMである。
ルでの化学的突然変異誘発により、システイン原栄養復
帰突然変異細胞を単離することができ、かつそのセリン
−アセチルトランスフェラーゼ活性はコード領域中での
アミノ酸交換によりＬ−システインによる弱い最終生成
物阻害を示す、ということは文献公知の例である（Den
k,D.,Boeck,A.,1987,J.Gen.Microbiol.133:515−52
5）。こうして、この突然変異体のKiは野生型に対し
て、約0.01mMである。
本発明は野生型酵素に比較して、阻害剤Ｌ−システイ
ンに対して減少した感受性を有し、かつその蛋白質配列
が野生型配列に比較して少なくとも１つの突然変異又は
欠失を示す、セリン−アセチルトランスフェラーゼに関
し、この突然変異が97位のアミノ酸から、273位のアミ
ノ酸を含めてこの273位のアミノ酸までの配列領域中に
あるか、又はこの欠失が227位のアミノ酸からのカルボ
キシ末端配列領域中にあり、この際１位は図５（SEQ ID
NO:1）からの開始メチオニンであり、かつこの際256位
でのMetからIleへの突然変異は除外される。
ンに対して減少した感受性を有し、かつその蛋白質配列
が野生型配列に比較して少なくとも１つの突然変異又は
欠失を示す、セリン−アセチルトランスフェラーゼに関
し、この突然変異が97位のアミノ酸から、273位のアミ
ノ酸を含めてこの273位のアミノ酸までの配列領域中に
あるか、又はこの欠失が227位のアミノ酸からのカルボ
キシ末端配列領域中にあり、この際１位は図５（SEQ ID
NO:1）からの開始メチオニンであり、かつこの際256位
でのMetからIleへの突然変異は除外される。
本発明によるセリン−アセチルトランスフェラーゼの
アミノ酸交換及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸欠失
は、十分な酵素活性を保持しつつ、システインの感受性
低下に導く、ということが意外にも見いだされた。
アミノ酸交換及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸欠失
は、十分な酵素活性を保持しつつ、システインの感受性
低下に導く、ということが意外にも見いだされた。
本発明によるセリン−アセチルトランスフェラーゼ
は、Ｌ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1mMの存在下
に、有利に0.005〜2.3mMの阻害定数Kiを有し、この際セ
リン−アセチルトランスフェラーゼはＬ−セリン1mM及
びアセチル−CoA0.1mMの存在下に、有利に0.015〜2.3mM
の阻害定数Kiを有し、一方少なくとも１つのカルボキシ
末端欠失を有する、セリン−アセチルトランスフェラー
ゼはＬ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1mMの存在下
に、有利に0.005〜0.03mMの阻害定数Kiを有する。
は、Ｌ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1mMの存在下
に、有利に0.005〜2.3mMの阻害定数Kiを有し、この際セ
リン−アセチルトランスフェラーゼはＬ−セリン1mM及
びアセチル−CoA0.1mMの存在下に、有利に0.015〜2.3mM
の阻害定数Kiを有し、一方少なくとも１つのカルボキシ
末端欠失を有する、セリン−アセチルトランスフェラー
ゼはＬ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1mMの存在下
に、有利に0.005〜0.03mMの阻害定数Kiを有する。
Ｌ−システインに対する特に有利な酵素突然変異体の
阻害定数（Ki）はＬ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1m
Mの存在下に0.02及び2.3mMの間にある。
阻害定数（Ki）はＬ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1m
Mの存在下に0.02及び2.3mMの間にある。
本発明によるセリン−アセチルトランスフェラーゼ
は、これを包含する微生物の成長に十分な活性を示す。
は、これを包含する微生物の成長に十分な活性を示す。
有利に、本発明によるセリン−アセチルトランスフェ
ラーゼの蛋白質配列は表1a又は表1b中に挙げたcysE−突
然変異体少なくとも１つのアミノ酸交換を包含する。
ラーゼの蛋白質配列は表1a又は表1b中に挙げたcysE−突
然変異体少なくとも１つのアミノ酸交換を包含する。
表1a:コード領域中に単数又は複数のアミノ酸変化を有
する、フィードバック耐性cysE−対立遺伝子 本発明によるシステイン−不感受性セリン−アセチルト
ランスフェラーゼは例えば、本発明によるセリン−アセ
チルトランスフェラーゼをコードするDNA−配列を発現
することにより得ることができる。
する、フィードバック耐性cysE−対立遺伝子 本発明によるシステイン−不感受性セリン−アセチルト
ランスフェラーゼは例えば、本発明によるセリン−アセ
チルトランスフェラーゼをコードするDNA−配列を発現
することにより得ることができる。
これらのDNA−配列によりコードされた酵素変異体は
阻害剤Ｌ−システインに対してそれぞれ異なる感受性を
示し、しかしながらこの際全ての場合において、野生型
に比べて少なくとも５倍に高められた阻害剤Ｌ−システ
インに対するセリン−アセチルトランスフェラーゼの耐
性が見いだされた。
阻害剤Ｌ−システインに対してそれぞれ異なる感受性を
示し、しかしながらこの際全ての場合において、野生型
に比べて少なくとも５倍に高められた阻害剤Ｌ−システ
インに対するセリン−アセチルトランスフェラーゼの耐
性が見いだされた。
更に、本発明は本発明によるセリン−アセチルトラン
スフェラーゼをコードするDNA−配列に関する。
スフェラーゼをコードするDNA−配列に関する。
これらのDNA−配列は、それぞれcysE−遺伝子のコー
ドするDNA配列領域bp510〜bp1040中に少なくとも１つの
突然変異を有し、この際bp1は図６（SEQ ID NO:2）から
の最初の塩基であり、この際990位でのグアニンのアデ
ニンへの突然変異は含まれない。
ドするDNA配列領域bp510〜bp1040中に少なくとも１つの
突然変異を有し、この際bp1は図６（SEQ ID NO:2）から
の最初の塩基であり、この際990位でのグアニンのアデ
ニンへの突然変異は含まれない。
以降、本発明によるDNA−配列をフィードバック耐性c
ysE−対立遺伝子とも呼ぶ。
ysE−対立遺伝子とも呼ぶ。
これらのDNA配列は、例えば非特異的な突然変異誘発
法又は目的に合わせた突然変異誘発法により、次に記載
した出発材料から製造することができる。
法又は目的に合わせた突然変異誘発法により、次に記載
した出発材料から製造することができる。
前記DNA−領域内での非特異的な突然変異は例えば化
学的薬剤（例えば、ニトロソグアニジン、エチルメタン
スルホン酸等）により、及び／又は物理的方法により
（Miller,J.H.,1972,Experiments in Molecular Geneti
cs,Cold Spring Harbor Laboratory,USA:113−185）、
及び／又は一定の条件下で実施するPCR−反応により形
成することができる（Gibbs,R.A.1990,Anal.Chem.62:12
02−1214）。
学的薬剤（例えば、ニトロソグアニジン、エチルメタン
スルホン酸等）により、及び／又は物理的方法により
（Miller,J.H.,1972,Experiments in Molecular Geneti
cs,Cold Spring Harbor Laboratory,USA:113−185）、
及び／又は一定の条件下で実施するPCR−反応により形
成することができる（Gibbs,R.A.1990,Anal.Chem.62:12
02−1214）。
DNA−フラグメントの中の特異的な位置への突然変異
の導入法は公知であり、かつ例えば次の文献中に記載さ
れている:Sarkar,G及びSommer,S.S.（1990,BioTechniqu
es 8:404−407）はPCRによる位置特異的突然変異誘発を
記載している;Ausubel,F.M.等（1987,s.8.01−8.3.6 Cu
rrent Protocols in Molecular biology,Greene Publis
hing Associates）はM13ファージによる位置特異的突然
変異誘発法を記載している。フィードバック耐性cysE−
対立遺伝子を形成するための他の方法は、新規特性を有
する多重突然変異体への、フィードバック耐性に導く種
々異なる点突然変異の組合せである。
の導入法は公知であり、かつ例えば次の文献中に記載さ
れている:Sarkar,G及びSommer,S.S.（1990,BioTechniqu
es 8:404−407）はPCRによる位置特異的突然変異誘発を
記載している;Ausubel,F.M.等（1987,s.8.01−8.3.6 Cu
rrent Protocols in Molecular biology,Greene Publis
hing Associates）はM13ファージによる位置特異的突然
変異誘発法を記載している。フィードバック耐性cysE−
対立遺伝子を形成するための他の方法は、新規特性を有
する多重突然変異体への、フィードバック耐性に導く種
々異なる点突然変異の組合せである。
突然変異誘発のための出発物質として、有利に野生型
−cysE−遺伝子のDNA、又は突然変異により不活性化さ
れたcysE−遺伝子、又は突然変異し、かつすでにフィー
ドバック耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコ
ードするcysE−遺伝子を使用する。
−cysE−遺伝子のDNA、又は突然変異により不活性化さ
れたcysE−遺伝子、又は突然変異し、かつすでにフィー
ドバック耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコ
ードするcysE−遺伝子を使用する。
突然変異されるべきcysE−遺伝子は染色体に又は染色
体外にコードされていてよい。
体外にコードされていてよい。
例えば、野生型−cysE−遺伝子を包含する、出発−DN
A−フラグメントを組み換えDNA−の製造のための公知標
準技術でベクター上で組み換えを行なう。前記突然変異
誘発法の適用により、DNA−配列の１つ又は複数のヌク
レオチドを、この遺伝子によりコードされたアミノ酸配
列が、97位から、273位のアミノ酸を含めてこの273位の
アミノ酸までの配列領域中に少なくとも１つの突然変異
を有するか、又は227位のアミノ酸からのカルボキシ末
端配列領域中に少なくとも１つの欠失が存在するよう
に、変化させるが、この際１位は図５（SEQ ID NO:1）
からの開始メチオニンであり、かつ256位でのMetからIl
eへの突然変異は包含されない。
A−フラグメントを組み換えDNA−の製造のための公知標
準技術でベクター上で組み換えを行なう。前記突然変異
誘発法の適用により、DNA−配列の１つ又は複数のヌク
レオチドを、この遺伝子によりコードされたアミノ酸配
列が、97位から、273位のアミノ酸を含めてこの273位の
アミノ酸までの配列領域中に少なくとも１つの突然変異
を有するか、又は227位のアミノ酸からのカルボキシ末
端配列領域中に少なくとも１つの欠失が存在するよう
に、変化させるが、この際１位は図５（SEQ ID NO:1）
からの開始メチオニンであり、かつ256位でのMetからIl
eへの突然変異は包含されない。
前記方法により任意のcysE−遺伝子において、前記DN
A−範囲中に、１つ又は複数の突然変異を導入すること
ができ、この突然変異は、コードされたセリン−アセチ
ルトランスフェラーゼがシステイン不感受性に導くアミ
ノ酸配列を有する様に作用する。
A−範囲中に、１つ又は複数の突然変異を導入すること
ができ、この突然変異は、コードされたセリン−アセチ
ルトランスフェラーゼがシステイン不感受性に導くアミ
ノ酸配列を有する様に作用する。
例えば記載したように実施した突然変異誘発に続い
て、所望の表現型を有する突然変異体の選択を、例えば
システイン不含培地上に塗布し、かつ引き続き突−変異
セリン−アセチルトランスフェラーゼのシステイン−感
受性の低度の測定により実施した。
て、所望の表現型を有する突然変異体の選択を、例えば
システイン不含培地上に塗布し、かつ引き続き突−変異
セリン−アセチルトランスフェラーゼのシステイン−感
受性の低度の測定により実施した。
本発明の更なる課題はフィードバック耐性cysE−対立
遺伝子を有する微生物である。
遺伝子を有する微生物である。
微生物のそのような菌株は、これがフィードバック耐
性cysE−対立遺伝子により少なくとも脱制御されたシス
テイン物質代謝を有することを特徴とする。
性cysE−対立遺伝子により少なくとも脱制御されたシス
テイン物質代謝を有することを特徴とする。
全ての微生物においてシステイン物質代謝は原則的
に、自体公知の同一の物質代謝経路を経過し、かつ本発
明による菌株の製造のために使用すべき方法は、例えば
標準的な手引書から公知であり、かつ全ての微生物に適
用可能であるので、本発明による菌株は任意の微生物か
ら製造することができる。
に、自体公知の同一の物質代謝経路を経過し、かつ本発
明による菌株の製造のために使用すべき方法は、例えば
標準的な手引書から公知であり、かつ全ての微生物に適
用可能であるので、本発明による菌株は任意の微生物か
ら製造することができる。
本発明による菌株を製造するために有利に好適である
のは細菌である。
のは細菌である。
特に有利に好適であるのはグラム陰性菌、特にE.コリ
である。
である。
本発明の更なる課題は本発明による微生物を培養する
ことによる、Ｌ−システイン又はＬ−システイン誘導生
成物の製造である。
ことによる、Ｌ−システイン又はＬ−システイン誘導生
成物の製造である。
フィードバック耐性cys−Ｅ対立遺伝子は、重要な生
合成制御点の解消を可能とし、これによりこの制御点の
下流に存在する多くの化合物の生産は強化される。これ
には特にＯ−アセチルセリン、Ｌ−システイン及びＬ−
システイン−関連生成物を挙げることができる。Ｌ−シ
ステイン関連生成物はＬ−システインから誘導される全
ての生成物である、即ちその製造のためにＬ−システイ
ンが必要である硫黄含有化合物である。そのような生成
物の例は、２（R,S）−メチル−チアゾリジン−２（R,
S）,4−（Ｒ）−ジカルボン酸、ホモシステイン、メチ
オニン、ビオチン及びグルタチオンである。
合成制御点の解消を可能とし、これによりこの制御点の
下流に存在する多くの化合物の生産は強化される。これ
には特にＯ−アセチルセリン、Ｌ−システイン及びＬ−
システイン−関連生成物を挙げることができる。Ｌ−シ
ステイン関連生成物はＬ−システインから誘導される全
ての生成物である、即ちその製造のためにＬ−システイ
ンが必要である硫黄含有化合物である。そのような生成
物の例は、２（R,S）−メチル−チアゾリジン−２（R,
S）,4−（Ｒ）−ジカルボン酸、ホモシステイン、メチ
オニン、ビオチン及びグルタチオンである。
このフィードバック耐性cys−Ｅ対立遺伝子は、変化
したセリン−アセチルトランスフェラーゼ−酵素を発現
するために宿主菌株中で常法により形質転換される。変
化したセリン−アセチルトランスフェラーゼ−特性を有
する菌株に関する“スクリーニング”は例えば次に記載
した方法により実施される。
したセリン−アセチルトランスフェラーゼ−酵素を発現
するために宿主菌株中で常法により形質転換される。変
化したセリン−アセチルトランスフェラーゼ−特性を有
する菌株に関する“スクリーニング”は例えば次に記載
した方法により実施される。
変化した酵素のシステイン−不感受性の程度の測定の
ためには、まず半定量的、いわゆる交叉栄養供給テスト
で、菌株のシステイン分泌を測定する。このためにはテ
ストすべき菌株を、システイン要求性インジケータ菌株
を添加したシステイン不含最少培地上に塗沫する。その
つどの接種線を囲むインジケータ菌株の成長帯域（ハ
ロ）をシステイン分泌の半定量的尺度として使用する。
交叉栄養供給テストで2mmを越える半径を有するハロを
示す全ての菌株は“交叉栄養供給テストにおけるプラ
ス”とする。選択された菌株で変化したセリン−アセチ
ルトランスフェラーゼのシステイン許容の程度の測定の
ために酵素活性テストを実施する。
ためには、まず半定量的、いわゆる交叉栄養供給テスト
で、菌株のシステイン分泌を測定する。このためにはテ
ストすべき菌株を、システイン要求性インジケータ菌株
を添加したシステイン不含最少培地上に塗沫する。その
つどの接種線を囲むインジケータ菌株の成長帯域（ハ
ロ）をシステイン分泌の半定量的尺度として使用する。
交叉栄養供給テストで2mmを越える半径を有するハロを
示す全ての菌株は“交叉栄養供給テストにおけるプラ
ス”とする。選択された菌株で変化したセリン−アセチ
ルトランスフェラーゼのシステイン許容の程度の測定の
ために酵素活性テストを実施する。
セリン−アセチルトランスフェラーゼのシステイン−
感受性の測定のために、これらの酵素の活性をシステイ
ンの存在下に測定することを可能にする、全ての方法を
使用することができる。例えば、セリン−アセチルトラ
ンスフェラーゼ−活性の測定はKredich及びTomkinsによ
り記載された方法（J.Biol.Chem.241:4955−4965（196
6））により実施することができる。このテストにおい
て、酵素−テスト混合物は基質Ｌ−セリン及び補因子ア
セチル−補酵素Ａを含有する。この反応は酵素添加によ
り開始し、アセチル−補酵素Ａ中のチオエステル結合の
切断により生じる、232nmにおける吸収の減少を介し
て、分光測定機により追跡される。
感受性の測定のために、これらの酵素の活性をシステイ
ンの存在下に測定することを可能にする、全ての方法を
使用することができる。例えば、セリン−アセチルトラ
ンスフェラーゼ−活性の測定はKredich及びTomkinsによ
り記載された方法（J.Biol.Chem.241:4955−4965（196
6））により実施することができる。このテストにおい
て、酵素−テスト混合物は基質Ｌ−セリン及び補因子ア
セチル−補酵素Ａを含有する。この反応は酵素添加によ
り開始し、アセチル−補酵素Ａ中のチオエステル結合の
切断により生じる、232nmにおける吸収の減少を介し
て、分光測定機により追跡される。
記載した酵素テストは、変性カルボキシ末端を有する
酵素をも含めて、全てのセリン−アセチルトランスフェ
ラーゼ−酵素のシステイン−感受性を測定するために好
適である。セリン−アセチルトランスフェラーゼ−活性
の阻害を反応配合物中のＬ−システインの異なる濃度で
の存在において試験した。種々異なるセリン−アセチル
トランスフェラーゼ−酵素の触媒活性をＬ−システイン
の存在及び不存在下で測定し、かつそこから阻害定数Ki
を調べた（Kredich及びTomkinsJ.Biol.Chem.241:4955−
4965（1966））。
酵素をも含めて、全てのセリン−アセチルトランスフェ
ラーゼ−酵素のシステイン−感受性を測定するために好
適である。セリン−アセチルトランスフェラーゼ−活性
の阻害を反応配合物中のＬ−システインの異なる濃度で
の存在において試験した。種々異なるセリン−アセチル
トランスフェラーゼ−酵素の触媒活性をＬ−システイン
の存在及び不存在下で測定し、かつそこから阻害定数Ki
を調べた（Kredich及びTomkinsJ.Biol.Chem.241:4955−
4965（1966））。
多くの場合、減少したシステイン−感受性を有する酵
素活性セリン−アセチルトランスフェラーゼが有利であ
る。他の計画によっては、最終生成物−感受性及び触媒
活性の同時の減少が追求されていることがある。
素活性セリン−アセチルトランスフェラーゼが有利であ
る。他の計画によっては、最終生成物−感受性及び触媒
活性の同時の減少が追求されていることがある。
一般には、最終生成物耐性セリン−アセチルトランス
フェラーゼの強い過剰発現は所望されない、それという
のもその際に過剰に形成されたＯ−アセチルセリン、Ｌ
−システイン又はそれから誘導された代謝物質は細胞中
に蓄積され、この細胞は毒性化し、減少したセリン−ア
セチルトランスフェラーゼ−活性を有する突然変異体の
選択が惹起されるであろう。従って、フィードバック耐
性cysE−対立遺伝子は有利に単コピーとして常用の方法
でゲノム中に組み込まれる。
フェラーゼの強い過剰発現は所望されない、それという
のもその際に過剰に形成されたＯ−アセチルセリン、Ｌ
−システイン又はそれから誘導された代謝物質は細胞中
に蓄積され、この細胞は毒性化し、減少したセリン−ア
セチルトランスフェラーゼ−活性を有する突然変異体の
選択が惹起されるであろう。従って、フィードバック耐
性cysE−対立遺伝子は有利に単コピーとして常用の方法
でゲノム中に組み込まれる。
好適なベクターにより染色体中に単遺伝子を組み込む
ための方法は公知技術である（例えば、Winans等,1985;
J.Bacteriol.161:1219−1221;shevell等,1988;J.Bacter
iol.170:3294−3296;Kulakauskas等,1991,J.Bacteriol.
173:2633−2638）。
ための方法は公知技術である（例えば、Winans等,1985;
J.Bacteriol.161:1219−1221;shevell等,1988;J.Bacter
iol.170:3294−3296;Kulakauskas等,1991,J.Bacteriol.
173:2633−2638）。
フィードバック耐性セリン−アセチルトランスフェラ
ーゼを低いコピー数でプラスミド上で発現させること
も、同様に有利である。
ーゼを低いコピー数でプラスミド上で発現させること
も、同様に有利である。
公知のように、発現ベクターはフィードバック耐性cy
s−Ｅ対立遺伝子の他に、有利に更に次に記載する付加
的な要素を示す。
s−Ｅ対立遺伝子の他に、有利に更に次に記載する付加
的な要素を示す。
ベクター上に存在する、コードする配列はコードする
配列の所望な程度での発現のために必要である制御要素
と結合している。
配列の所望な程度での発現のために必要である制御要素
と結合している。
この制御要素の例はプロモーター、リボソーム結合位
及び末端配列である。多くの場合、天然の、制御cysE−
配列を本発明による突然変異体の発現のために使用す
る。しかしながら、任意の他の制御配列を使用すること
もできる。
及び末端配列である。多くの場合、天然の、制御cysE−
配列を本発明による突然変異体の発現のために使用す
る。しかしながら、任意の他の制御配列を使用すること
もできる。
制御要素の他に、選択マーカー及び／又はレポーター
遺伝子をコードする配列も発現ベクター上に存在する。
この種の選択マーカーの発現は形質転換体の同定を容易
にする。選択マーカーとして好適であるのは、例えばア
ンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラ
ムフェニコール又は他の抗生物質に対する耐性をコード
する遺伝子である。
遺伝子をコードする配列も発現ベクター上に存在する。
この種の選択マーカーの発現は形質転換体の同定を容易
にする。選択マーカーとして好適であるのは、例えばア
ンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラ
ムフェニコール又は他の抗生物質に対する耐性をコード
する遺伝子である。
本発明による突然変異体が染色体外に複製されるべき
である場合、プラスミドベクターは有利に複製の開始点
を含有すべきである。複製開始点が除去されている、ベ
クターを用いて染色体中に遺伝子を組み込むための戦略
は公知技術である（Winans等,1985;J.Bacteriol.161:12
19−1221;Shevell等,1988;J.Bacteriol.170:3294−329
6;Kulakauskas等,1991;J.Bacteriol.173:2633−263
8）。
である場合、プラスミドベクターは有利に複製の開始点
を含有すべきである。複製開始点が除去されている、ベ
クターを用いて染色体中に遺伝子を組み込むための戦略
は公知技術である（Winans等,1985;J.Bacteriol.161:12
19−1221;Shevell等,1988;J.Bacteriol.170:3294−329
6;Kulakauskas等,1991;J.Bacteriol.173:2633−263
8）。
E.コリ中で自己複製可能なベクターの例は、Pouwels,
P.H.、Enger−Valk,B.E.、Brammer,W.J.（1985,Cloning
Vectors,Elisevier,Amsterdam）により記載されてい
る。
P.H.、Enger−Valk,B.E.、Brammer,W.J.（1985,Cloning
Vectors,Elisevier,Amsterdam）により記載されてい
る。
そのようなベクターは例えば次のものである： − 高いコピー数を有するプラスミド、例えばpBR322、
pUC18 − 中程度から低いコピー数を有するプラスミド、例え
ばpACYC184、pACYC177及びpSC101 − ファージベクター、例えばM13−ベクター。
pUC18 − 中程度から低いコピー数を有するプラスミド、例え
ばpACYC184、pACYC177及びpSC101 − ファージベクター、例えばM13−ベクター。
有利に好適であるのは、中程度から低いコピー数を有
するベクターであり；特に有利にはp15A−レプリコンを
有するベクターである、例えばpACYC184（ATCC37033）
又はpACYC177（ATCC37031）が好適である。
するベクターであり；特に有利にはp15A−レプリコンを
有するベクターである、例えばpACYC184（ATCC37033）
又はpACYC177（ATCC37031）が好適である。
他の細菌のための多くのベクターは同様に文献中に記
載されている（Pouwels,P.H.,Enger−Valk,B.E.,Bramme
r,W.J.,1985,Cloning Vectors,Elisevier,Amsterda
m）。本発明による突然変異体の他の細菌中での発現は
これらのベクターにより可能である。
載されている（Pouwels,P.H.,Enger−Valk,B.E.,Bramme
r,W.J.,1985,Cloning Vectors,Elisevier,Amsterda
m）。本発明による突然変異体の他の細菌中での発現は
これらのベクターにより可能である。
好適な組み換えベクターは組み換えDNAを製造するた
めの標準技術で形成することができる。この技術は標準
的教科書中に詳細に記載されている。
めの標準技術で形成することができる。この技術は標準
的教科書中に詳細に記載されている。
好適な宿主菌株は、システイン不感受性セリン−アセ
チルトランスフェラーゼをコードする転写単位を有する
発現ベクターで形質転換される。
チルトランスフェラーゼをコードする転写単位を有する
発現ベクターで形質転換される。
宿主菌株としては、システイン感受性蛋白質を含有す
る菌株、例えば原核細胞又は酵母を使用する。
る菌株、例えば原核細胞又は酵母を使用する。
有利にはE.コリ野生型菌株又は内生cysE−遺伝子が不
活性化され、かつ本発明によるcysE−遺伝子により補足
される、菌株を使用する。この種の細胞システムはＬ−
システイン及びこれから誘導された代謝物質の過剰生産
に好適である。
活性化され、かつ本発明によるcysE−遺伝子により補足
される、菌株を使用する。この種の細胞システムはＬ−
システイン及びこれから誘導された代謝物質の過剰生産
に好適である。
少なくとも１つのフィードバック耐性cysE−対立遺伝
子を含有する菌株の発酵において、Ｌ−セリン1mM及び
アセチルCoA0.1mMの存在において0.015及び2.3mMの間の
Ki−値を有するフィードバック耐性cysE−対立遺伝子を
包含する菌株が、著しく多量のシステインを分泌すると
いうことを示した。
子を含有する菌株の発酵において、Ｌ−セリン1mM及び
アセチルCoA0.1mMの存在において0.015及び2.3mMの間の
Ki−値を有するフィードバック耐性cysE−対立遺伝子を
包含する菌株が、著しく多量のシステインを分泌すると
いうことを示した。
本発明によるセリン−アセチルトランスフェラーゼは
アンチセンス−RNAの使用によっても形成することがで
きる。アンチセンス−RNAの使用下に、いわゆる逆遺伝
学（Reverse Genetik）により所定の遺伝子活性を遮断
又は改変することは、公知技術である（Inouye,1988,Ge
ne 72:25−34）。アンチセンス−RNAは、その蛋白質を
コードする鎖に相補的であるDNA−鎖の転写生成物であ
る。天然又は形質転換cysE−遺伝子の３′−コード鎖の
所定領域に相補性である、アンチセンス−RNAを発現ベ
クターを介して生産することにより、生体内でのセリン
−アセチルトランスフェラーゼのシステイン感受性を減
少させることは可能である。この際、アンチセンス−RN
Aは特異的にcysE−mRNAの所定配列に付加し、かつこれ
によりカルボキシ末端で短縮しており、かつ阻害剤Ｌ−
システインに対して実施例３の欠失突然変異体に類似し
て、減少した感受性を示す、本発明によるセリンアセチ
ルトランスフェラーゼ−酵素の合成を引き起こす。
アンチセンス−RNAの使用によっても形成することがで
きる。アンチセンス−RNAの使用下に、いわゆる逆遺伝
学（Reverse Genetik）により所定の遺伝子活性を遮断
又は改変することは、公知技術である（Inouye,1988,Ge
ne 72:25−34）。アンチセンス−RNAは、その蛋白質を
コードする鎖に相補的であるDNA−鎖の転写生成物であ
る。天然又は形質転換cysE−遺伝子の３′−コード鎖の
所定領域に相補性である、アンチセンス−RNAを発現ベ
クターを介して生産することにより、生体内でのセリン
−アセチルトランスフェラーゼのシステイン感受性を減
少させることは可能である。この際、アンチセンス−RN
Aは特異的にcysE−mRNAの所定配列に付加し、かつこれ
によりカルボキシ末端で短縮しており、かつ阻害剤Ｌ−
システインに対して実施例３の欠失突然変異体に類似し
て、減少した感受性を示す、本発明によるセリンアセチ
ルトランスフェラーゼ−酵素の合成を引き起こす。
付加的な課題は、本発明による微生物による最適なシ
ステイン過剰生産に好適な硫黄源を製造することであ
る。
ステイン過剰生産に好適な硫黄源を製造することであ
る。
意外にも、本発明によるセリン−アセチルトランスフ
ェラーゼ−突然変異体の使用により引き起こされるＯ−
アセチルセリンの細胞内過剰生産は、好適な栄養培地と
関連して、細胞外システイン濃度の明らかな上昇に導く
ことが見いだされた。従って、本発明によるセリン−ア
セチルトランスフェラーゼ−突然変異体はシステイン過
剰生産に好適である。
ェラーゼ−突然変異体の使用により引き起こされるＯ−
アセチルセリンの細胞内過剰生産は、好適な栄養培地と
関連して、細胞外システイン濃度の明らかな上昇に導く
ことが見いだされた。従って、本発明によるセリン−ア
セチルトランスフェラーゼ−突然変異体はシステイン過
剰生産に好適である。
このためには、生産培地中の本発明による微生物に十
分量の硫黄供給源を用意しなければならない。
分量の硫黄供給源を用意しなければならない。
システイン過剰生産のために好適な硫黄供給源は全て
無機硫黄化合物である。有利であるのはスルフェート、
サルファイト、スルフィド、ジチオネート、及びチオス
ルフェートである。特に有利にチオスルフェートが最適
なシステイン生産に好適である。
無機硫黄化合物である。有利であるのはスルフェート、
サルファイト、スルフィド、ジチオネート、及びチオス
ルフェートである。特に有利にチオスルフェートが最適
なシステイン生産に好適である。
システイン収率の更なる上昇はスルフェート還元性酵
素（遺伝子cysD、Ｃ、Ｈ、Ｇ、Ｉ、Ｊによりコード）及
びスルフヒドリル化酵素（遺伝子cysK及びcysMによりコ
ード）の付加的な過剰発現により達せられる。
素（遺伝子cysD、Ｃ、Ｈ、Ｇ、Ｉ、Ｊによりコード）及
びスルフヒドリル化酵素（遺伝子cysK及びcysMによりコ
ード）の付加的な過剰発現により達せられる。
更なるシステイン収率の上昇は次の処置により可能で
ある； ａ）構成的発現の意味において、遺伝子レベルでの制御
蛋白質cysBの脱制御により。cysB−蛋白質はE.コリ中の
システイン−生合成の上位制御蛋白質として作用する
（Kredich,N.M.,1987,Biosynthesis of Cysteine.In:Ne
idhardt F.C.,Ingraham,J.L.,Magasanik,B.,Low.K.B.,S
chaechter,M.,Umbarger,H.E.（eds）Escherichia coli
and Salmonella typhimurium:cellular and molecular
biology,Vol.1.American society for Microbiology, W
ashington D.C.,419−428）。
ある； ａ）構成的発現の意味において、遺伝子レベルでの制御
蛋白質cysBの脱制御により。cysB−蛋白質はE.コリ中の
システイン−生合成の上位制御蛋白質として作用する
（Kredich,N.M.,1987,Biosynthesis of Cysteine.In:Ne
idhardt F.C.,Ingraham,J.L.,Magasanik,B.,Low.K.B.,S
chaechter,M.,Umbarger,H.E.（eds）Escherichia coli
and Salmonella typhimurium:cellular and molecular
biology,Vol.1.American society for Microbiology, W
ashington D.C.,419−428）。
ｂ）serA−野生型及び減少したセリン感受性を有するホ
スホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserA−
遺伝子から選択されたserA遺伝子と本発明によるcys−
Ｅ遺伝子との組合せにより。
スホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserA−
遺伝子から選択されたserA遺伝子と本発明によるcys−
Ｅ遺伝子との組合せにより。
ｃ）セリンの外からの供給により。
宿主菌株中で、天然のシステイン感受性セリン−アセ
チルトランスフェラーゼの遺伝子が有利に不活性化さ
れ、こうして形質転換を介してそれぞれの菌株中に導入
されるシステイン不感受性セリン−アセチルトランスフ
ェラーゼの唯一の合成が達成された。E.コリ中での天然
遺伝子の不活性化に関する多数の文献が存在する（Hami
lton等,1989,J.Bacteriol.171:4617−4622;Russel等,19
89,J.Bacteriol.171:2609−2613;Shen及びHuang,1986,G
enetics 112:441−457;Jasin及びSchimmel,1984,J.Bact
eriol.159:783−786）。
チルトランスフェラーゼの遺伝子が有利に不活性化さ
れ、こうして形質転換を介してそれぞれの菌株中に導入
されるシステイン不感受性セリン−アセチルトランスフ
ェラーゼの唯一の合成が達成された。E.コリ中での天然
遺伝子の不活性化に関する多数の文献が存在する（Hami
lton等,1989,J.Bacteriol.171:4617−4622;Russel等,19
89,J.Bacteriol.171:2609−2613;Shen及びHuang,1986,G
enetics 112:441−457;Jasin及びSchimmel,1984,J.Bact
eriol.159:783−786）。
同様に、変化したセリン−アセチルトランスフェラー
ゼをコードするそれぞれの遺伝子の単コピーの、宿主ゲ
ノム中への組み込みが有利である。
ゼをコードするそれぞれの遺伝子の単コピーの、宿主ゲ
ノム中への組み込みが有利である。
これらの技術に関する記載及び参考文献は文献（Shev
ell等,1988,J.Bacteriol.170:3294−3296;Kulakauskas
等,1991,J.Bacteriol.173:2633−2638）中に見いだすこ
とができる。
ell等,1988,J.Bacteriol.170:3294−3296;Kulakauskas
等,1991,J.Bacteriol.173:2633−2638）中に見いだすこ
とができる。
異なるKiのcysE−対立遺伝子を低いコピー数のベクタ
ー上でクローン化し、かつ相応する生産菌株中に形質転
換することが有利である。
ー上でクローン化し、かつ相応する生産菌株中に形質転
換することが有利である。
図１は、ホモセリンから出発するＬ−メチオニンの生
合成を示す。
合成を示す。
図２はグルタミン酸から出発するグルタチオンの生合
成を示す。
成を示す。
図３はデチオビオチンから出発するビオチンの生合成
を示す。
を示す。
図４はグルコースから出発するE.コリでのＬ−システ
インの生合成を示す。
インの生合成を示す。
図５はE.コリからのセリン−アセチルトランスフェラ
ーゼのアミノ酸順序を示す。
ーゼのアミノ酸順序を示す。
図６はE.コリcysE−遺伝子のDNA−配列及びこの配列
から誘導されたセリン−アセチルトランスフェラーゼの
アミノ酸配列。
から誘導されたセリン−アセチルトランスフェラーゼの
アミノ酸配列。
図７はフィードバック耐性cysE−対立遺伝子を含有す
る実施例１からのプラスミドpP1の制限酵素地図を示
し、これは2.25kbのPvu II−フラグメントとしてpUC19
中でクローン化される。
る実施例１からのプラスミドpP1の制限酵素地図を示
し、これは2.25kbのPvu II−フラグメントとしてpUC19
中でクローン化される。
図８は実施例２からのプラスミドpPC43を示し、これ
はcysE−野生型−遺伝子を1.15kbの大きさのEcoR I/Bam
H I−フラグメントとしてpBluescript中に含有する。
はcysE−野生型−遺伝子を1.15kbの大きさのEcoR I/Bam
H I−フラグメントとしてpBluescript中に含有する。
図９は実施例３からのカルボキシ末端欠失を有するフ
ィードバック耐性cysE−対立遺伝子を含有する及び実施
例４からの種々異なる塩基交換を有するフィードバック
耐性cysE−対立遺伝子を含有する、pACYC184−LHのプラ
スミド地図を示す。
ィードバック耐性cysE−対立遺伝子を含有する及び実施
例４からの種々異なる塩基交換を有するフィードバック
耐性cysE−対立遺伝子を含有する、pACYC184−LHのプラ
スミド地図を示す。
次に実施例につき本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ システイン−不感受性−セリン−アセチルトランスフェ
ラーゼ−酵素を有するE.コリ−突然変異体の単離 栄養要求性のE.コリ−菌株の復帰により制御突然変異
体を製造することは可能である。所望の特性（セリン−
アセチルトランスフェラーゼのシステイン−不感受性）
を有する突然変異体を復帰突然変異体システイン要求性
cysE−E.コリ−菌株下に探す。
ラーゼ−酵素を有するE.コリ−突然変異体の単離 栄養要求性のE.コリ−菌株の復帰により制御突然変異
体を製造することは可能である。所望の特性（セリン−
アセチルトランスフェラーゼのシステイン−不感受性）
を有する突然変異体を復帰突然変異体システイン要求性
cysE−E.コリ−菌株下に探す。
復帰突然変異体の単離のためにはシステイン要求性E.
コリ−菌株JM15（CGSC＃5042:cysE50、tfr−８）、及び
JM39（CGSC＃5043:cysE51、tfr−８）、寄託番号DSM101
73としてドイツ微生物保存機関（Deutschen Sammlung f
uer Mikroorganismen in Braunschweig）に寄託、を使
用した。システイン−原栄養復帰突然変異体の形成のた
めに突然変異誘発物質ニトロソグアニジンでMiller,J.
H.により処理した（1972,Experiments in Molecular Ge
netics.Cold Spring Harbor Press:125−129,Cold Spri
ng Harbor Laboratory）。システイン不含最少培地上
で、システイン−原栄養復帰突然変異体を探した。得ら
れた復帰突然変異体の約1000個を最初に交叉栄養供給実
験においてシステイン分泌をテストした。このためには
テストすべき復帰突然変異体を、１％グルコースで補充
されており、かつ1mあたりシステイン要求性インジケ
ーター菌株JM39の細胞５×106個で接種した、システイ
ン不含最少培地（K2HPO4 12g/、KH2PO4 3g/、（N
H4）2SO4 5g/、MgSO4×7H2O 0.3g/、CaCl2×2H2O
0.015g/、FeSO4×7H2O 0.002g/、クエン酸Na3×2H2
O 1g/、NaCl 0.1g/、寒天（Bacto−Agar）15g/、
微量元素溶液（Na2MoO4×2H2O 0.15g/、H3BO3 2.5g/
、CoCl2×6H2O 0.7g/、CuSO4×5H2O 0.25g/、MnC
l2×4H2O 1.6g/、ZnSO4×7H2O 0.3g/からなる、）1
m／、）上に塗布し、かつ37℃で48時間インキュベ
ーションする。テストコロニーの周りの栄養環（ハロ）
の半径は試験菌株によるシステイン分泌に関する半定量
的尺度と見なされた。2mmより大きな成長ゾーンを示
す、全ての復帰突然変異体はプラスとして位置づけら
れ、かつ多くの精製塗布により単離し、かつ保存した。
コリ−菌株JM15（CGSC＃5042:cysE50、tfr−８）、及び
JM39（CGSC＃5043:cysE51、tfr−８）、寄託番号DSM101
73としてドイツ微生物保存機関（Deutschen Sammlung f
uer Mikroorganismen in Braunschweig）に寄託、を使
用した。システイン−原栄養復帰突然変異体の形成のた
めに突然変異誘発物質ニトロソグアニジンでMiller,J.
H.により処理した（1972,Experiments in Molecular Ge
netics.Cold Spring Harbor Press:125−129,Cold Spri
ng Harbor Laboratory）。システイン不含最少培地上
で、システイン−原栄養復帰突然変異体を探した。得ら
れた復帰突然変異体の約1000個を最初に交叉栄養供給実
験においてシステイン分泌をテストした。このためには
テストすべき復帰突然変異体を、１％グルコースで補充
されており、かつ1mあたりシステイン要求性インジケ
ーター菌株JM39の細胞５×106個で接種した、システイ
ン不含最少培地（K2HPO4 12g/、KH2PO4 3g/、（N
H4）2SO4 5g/、MgSO4×7H2O 0.3g/、CaCl2×2H2O
0.015g/、FeSO4×7H2O 0.002g/、クエン酸Na3×2H2
O 1g/、NaCl 0.1g/、寒天（Bacto−Agar）15g/、
微量元素溶液（Na2MoO4×2H2O 0.15g/、H3BO3 2.5g/
、CoCl2×6H2O 0.7g/、CuSO4×5H2O 0.25g/、MnC
l2×4H2O 1.6g/、ZnSO4×7H2O 0.3g/からなる、）1
m／、）上に塗布し、かつ37℃で48時間インキュベ
ーションする。テストコロニーの周りの栄養環（ハロ）
の半径は試験菌株によるシステイン分泌に関する半定量
的尺度と見なされた。2mmより大きな成長ゾーンを示
す、全ての復帰突然変異体はプラスとして位置づけら
れ、かつ多くの精製塗布により単離し、かつ保存した。
復帰突然変異体のシステイン分泌に関する生化学的根
拠を調べるためにセリン−アセチルトランスフェラーゼ
の活性を試験管内で測定し、そのシステインによる阻害
性を測定した。測定のためには、選択した復帰突然変異
体、出発菌株ならびに比較菌株E.コリW3110（ATTC2732
5）のS30−抽出物（30000g及び４℃で20分間遠心分離し
た細胞砕壊物）を使用した。種々異なる濃度の阻害剤Ｌ
−システインの存在下にセリン−アセチルトランスフェ
ラーゼ−活性がなお明らかな残留活性を示す（Ki−値:5
〜50μＭ）一連の復帰突然変異体が見いだされた。
拠を調べるためにセリン−アセチルトランスフェラーゼ
の活性を試験管内で測定し、そのシステインによる阻害
性を測定した。測定のためには、選択した復帰突然変異
体、出発菌株ならびに比較菌株E.コリW3110（ATTC2732
5）のS30−抽出物（30000g及び４℃で20分間遠心分離し
た細胞砕壊物）を使用した。種々異なる濃度の阻害剤Ｌ
−システインの存在下にセリン−アセチルトランスフェ
ラーゼ−活性がなお明らかな残留活性を示す（Ki−値:5
〜50μＭ）一連の復帰突然変異体が見いだされた。
システイン定量測定により液体培地中のシステイン分
泌の能力を測定するために、選択された50個のcysE−復
帰突然変異体を標準生産培地20m中で、30℃及び170rp
mで48時間にわたってインキュベーションした。この標
準生産培地はグルコース15g/、バクトトリプトン0.08
g/、酵母抽出物0.04g/、ビタミンB15mg/、KH2PO4
3g/、K2HPO4 12g/、MgSO4×7H2O 0.3g/、NaCl
0.1g/、（NH4）2SO4 5g/、CaCl2×2H2O 14.7mg/
、FeSO4×3H2O 2mg/、クエン酸Na3×2H2O 1g/、N
a2S2O3×5H2O 5g/及び微量元素溶液（前記）1m／
からなる。24時間及び48時間後にそれぞれ試料（10μ
）を採取し、かつ場合により希釈し、細胞不含上澄み
中でシステイン濃度をGaitonde,M.K.（（1967）,Bioche
m.J.104:627−633）により、熱量測定で測定した。この
突然変異体のシステイン分泌の程度は培養上澄み中シス
テイン５〜60mg/の間で変化した。これに対して、E.
コリ−野生型菌株においては、決してシステイン分泌は
検出することはできなかった。このスクリーニングから
そのシステイン分泌が40〜60mg/にある復帰突然変異
体８個を選択した。
泌の能力を測定するために、選択された50個のcysE−復
帰突然変異体を標準生産培地20m中で、30℃及び170rp
mで48時間にわたってインキュベーションした。この標
準生産培地はグルコース15g/、バクトトリプトン0.08
g/、酵母抽出物0.04g/、ビタミンB15mg/、KH2PO4
3g/、K2HPO4 12g/、MgSO4×7H2O 0.3g/、NaCl
0.1g/、（NH4）2SO4 5g/、CaCl2×2H2O 14.7mg/
、FeSO4×3H2O 2mg/、クエン酸Na3×2H2O 1g/、N
a2S2O3×5H2O 5g/及び微量元素溶液（前記）1m／
からなる。24時間及び48時間後にそれぞれ試料（10μ
）を採取し、かつ場合により希釈し、細胞不含上澄み
中でシステイン濃度をGaitonde,M.K.（（1967）,Bioche
m.J.104:627−633）により、熱量測定で測定した。この
突然変異体のシステイン分泌の程度は培養上澄み中シス
テイン５〜60mg/の間で変化した。これに対して、E.
コリ−野生型菌株においては、決してシステイン分泌は
検出することはできなかった。このスクリーニングから
そのシステイン分泌が40〜60mg/にある復帰突然変異
体８個を選択した。
これら８個のセリン−アセチルトランスフェラーゼの
最終生成物耐性の遺伝学的根拠の正確な分析のために、
そのcysE−構造遺伝子をクローン化し、かつそのDNA配
列を決定した。
最終生成物耐性の遺伝学的根拠の正確な分析のために、
そのcysE−構造遺伝子をクローン化し、かつそのDNA配
列を決定した。
cysE−野生型−遺伝子のDNA−配列ならびにE.コリのc
ysE−遺伝子に隣接する領域の染色体制限酵素地図は公
知であるので（Denk及びBoeck,1987,J.Gen.Microbiol.1
33:515−525）、cysE−構造遺伝子が大きさ2.25kbのPvu
II−DNA−フラグメント上にあることは公知である。
ysE−遺伝子に隣接する領域の染色体制限酵素地図は公
知であるので（Denk及びBoeck,1987,J.Gen.Microbiol.1
33:515−525）、cysE−構造遺伝子が大きさ2.25kbのPvu
II−DNA−フラグメント上にあることは公知である。
システイン−不感受性セリンアセチルトランスフェラ
ーゼをコードするcysE−遺伝子のクローン化のために
は、選択された復帰突然変異体の染色体DNAを完全にPvu
IIで加水分解し、DNA−加水分解物を分取アガロースゲ
ルにより分離し、かつ２〜3kbの大きさのDNAを単離し
た。単離したPvu II−加水分解物をSma Iで線状化し、
かつアルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化したプ
ラスミド−ベクターpUC19（Fa.Boehringer Mannheimか
ら入手可能）とT4DNA−リガーゼにより結合する。
ーゼをコードするcysE−遺伝子のクローン化のために
は、選択された復帰突然変異体の染色体DNAを完全にPvu
IIで加水分解し、DNA−加水分解物を分取アガロースゲ
ルにより分離し、かつ２〜3kbの大きさのDNAを単離し
た。単離したPvu II−加水分解物をSma Iで線状化し、
かつアルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化したプ
ラスミド−ベクターpUC19（Fa.Boehringer Mannheimか
ら入手可能）とT4DNA−リガーゼにより結合する。
システイン要求性cysE−菌株JM15（CGSC＃5042）をそ
れぞれの連結反応混合物で形質転換し、システイン不
含、アンピシリン含有（50mg/）最少培地上で選択を
実施した。選択され、かつ宿主菌株のシステイン要求性
を補足するプラスミド（図７参照）は制限サンプルパタ
ーン中にcysE−遺伝子に必要な切断パターンを示す（De
nk及びBoeck,1987,J.Gen.Microbiol.133:515−525）。
交叉栄養素供給テスト中でも、選択された形質転換体は
インジケーター菌株JM35の強力な成長を引き起こす（ハ
ロ＞4mm）。30000g及び４℃で20分間遠心分離すること
により得られた、これらのcysE−突然変異体の細胞抽出
液中のセリン−アセチルトランスフェラーゼの活性測定
は、Ｌ−システインに対する減少した感受性を示した。
個々のcysE＊−対立遺伝子の構造遺伝子中の、最終生成
物耐性に導く変化の完全な同定のために、cysE−遺伝子
特異的オリゴヌクレオチドの使用下にそのDNAを配列決
定し、かつこの調べたヌクレオチド配列をcysE−野生型
遺伝子のヌクレオチド配列と比較した。ヌクレオチド配
列のこの比較は次の表２中にまとめたDNA配列及びアミ
ノ酸配列に対する差異を示す（図５及び図６参照）。
れぞれの連結反応混合物で形質転換し、システイン不
含、アンピシリン含有（50mg/）最少培地上で選択を
実施した。選択され、かつ宿主菌株のシステイン要求性
を補足するプラスミド（図７参照）は制限サンプルパタ
ーン中にcysE−遺伝子に必要な切断パターンを示す（De
nk及びBoeck,1987,J.Gen.Microbiol.133:515−525）。
交叉栄養素供給テスト中でも、選択された形質転換体は
インジケーター菌株JM35の強力な成長を引き起こす（ハ
ロ＞4mm）。30000g及び４℃で20分間遠心分離すること
により得られた、これらのcysE−突然変異体の細胞抽出
液中のセリン−アセチルトランスフェラーゼの活性測定
は、Ｌ−システインに対する減少した感受性を示した。
個々のcysE＊−対立遺伝子の構造遺伝子中の、最終生成
物耐性に導く変化の完全な同定のために、cysE−遺伝子
特異的オリゴヌクレオチドの使用下にそのDNAを配列決
定し、かつこの調べたヌクレオチド配列をcysE−野生型
遺伝子のヌクレオチド配列と比較した。ヌクレオチド配
列のこの比較は次の表２中にまとめたDNA配列及びアミ
ノ酸配列に対する差異を示す（図５及び図６参照）。
実施例２ cysE−構造遺伝子中の所定の塩基交換による最終生成物
−不感受性セリン−アセチルトランスフェラーゼの製造 実施例１中で全部で８個の異なるcysE−対立遺伝子を
記載しており、この対立遺伝子は塩基交換により及びそ
れにより生じたアミノ酸変化により阻害剤Ｌ−システイ
ンに対して明らかなセリン−アセチルトランスフェラー
ゼの不感受性を示す。これらの変化した酵素は耐性に導
くアミノ酸交換の位置だけでなく、部分的には阻害剤Ｌ
−システインに対する感受性の程度においても異なる。
位置特異的な突然変異誘発は新規特性を有する最終生成
物耐性セリン−アセチルトランスフェラーゼ−酵素を構
成し、この突然変異誘発においては実施例１中に記載さ
れたアミノ酸交換を相互に組み合わせた。このために必
要な突然変異誘発はKunkel等（（1987）,Meth.Enzymol.
154:367−382）により記載された方法で実施された。
−不感受性セリン−アセチルトランスフェラーゼの製造 実施例１中で全部で８個の異なるcysE−対立遺伝子を
記載しており、この対立遺伝子は塩基交換により及びそ
れにより生じたアミノ酸変化により阻害剤Ｌ−システイ
ンに対して明らかなセリン−アセチルトランスフェラー
ゼの不感受性を示す。これらの変化した酵素は耐性に導
くアミノ酸交換の位置だけでなく、部分的には阻害剤Ｌ
−システインに対する感受性の程度においても異なる。
位置特異的な突然変異誘発は新規特性を有する最終生成
物耐性セリン−アセチルトランスフェラーゼ−酵素を構
成し、この突然変異誘発においては実施例１中に記載さ
れたアミノ酸交換を相互に組み合わせた。このために必
要な突然変異誘発はKunkel等（（1987）,Meth.Enzymol.
154:367−382）により記載された方法で実施された。
この突然変異誘発のための出発プラスミドとしては図
８に示したcysE−プラスミドpPC43（ドイツ微生物保存
機関にDSM10171として寄託）を使用した。このプラスミ
ドはプラスミドベクターpBluescript II SK＋（Fa.Stra
tagene,Heidelberg）のEcoR I−BamH I−位中に1.15kb
の大きさのcysE−野生型遺伝子を含有する。このcysE−
WT（野生型）−遺伝子をE.コリ野生型菌株W3110（ATTC2
7325）のゲノムDNAから複製連鎖反応（PCR）（Saiki等,
1988,Science 239:487−491）の方法により増幅した。
オリゴヌクレオチドcysE−fw1（SEQ ID NO:3）（“セン
ス−プライマー”）及びcysE−rev1（SEQ ID NO:4）
（“アンチセンス−プライマー”）を使用した。このプ
ライマーのヌクレオチド配列を次のようにまとめる： cysE−fw1:（SEQ ID NO:3） 太字でマークした部分は図６のcysE−DNA−配列から
の塩基９〜30に相当し、下線は組み込まれたBamH I−位
である。
８に示したcysE−プラスミドpPC43（ドイツ微生物保存
機関にDSM10171として寄託）を使用した。このプラスミ
ドはプラスミドベクターpBluescript II SK＋（Fa.Stra
tagene,Heidelberg）のEcoR I−BamH I−位中に1.15kb
の大きさのcysE−野生型遺伝子を含有する。このcysE−
WT（野生型）−遺伝子をE.コリ野生型菌株W3110（ATTC2
7325）のゲノムDNAから複製連鎖反応（PCR）（Saiki等,
1988,Science 239:487−491）の方法により増幅した。
オリゴヌクレオチドcysE−fw1（SEQ ID NO:3）（“セン
ス−プライマー”）及びcysE−rev1（SEQ ID NO:4）
（“アンチセンス−プライマー”）を使用した。このプ
ライマーのヌクレオチド配列を次のようにまとめる： cysE−fw1:（SEQ ID NO:3） 太字でマークした部分は図６のcysE−DNA−配列から
の塩基９〜30に相当し、下線は組み込まれたBamH I−位
である。
cysE−rev1:（SEQ ID NO:4） 太字でマークした部分は図６のcysE−DNA−配列から
の塩基1106〜1126に相当し、下線は組み込まれたEcoR I
−位である。
の塩基1106〜1126に相当し、下線は組み込まれたEcoR I
−位である。
PCR−実験をデオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、d
CTP、dGTP、dTTP）200μＭ、相当するオリゴヌクレオチ
ド１μＭ、W3110−DNA100ng、反応緩衝液（トリス−HCl
pH8.3 10mM、KCl 50mM、MgCl2 1.5mM、ゼラチン0.01
％）及び熱安定性Vent−DNA−ポリメラーゼ（Fa.Biolab
s）５単位の存在下に熱循環装置（Gene−ATAQ−Control
er,Fa.Pharmacia）中で次の条件下に30サイクル実施し
た:96℃、1.5分間;62℃、１分間;72℃、３分間。増幅生
成物をBamH I及びEcoR Iで加水分解し、アガロースゲル
上で精製し、かつ1.15kbより大きなDNA−フラグメント
をBamH I及びEcoR Iで線状にされたファージミド（Phag
emid）−ベクターBluescript II SK＋中でクローン化
し、この際cysE−プラスミドpPC43が生じた（図８）。
CTP、dGTP、dTTP）200μＭ、相当するオリゴヌクレオチ
ド１μＭ、W3110−DNA100ng、反応緩衝液（トリス−HCl
pH8.3 10mM、KCl 50mM、MgCl2 1.5mM、ゼラチン0.01
％）及び熱安定性Vent−DNA−ポリメラーゼ（Fa.Biolab
s）５単位の存在下に熱循環装置（Gene−ATAQ−Control
er,Fa.Pharmacia）中で次の条件下に30サイクル実施し
た:96℃、1.5分間;62℃、１分間;72℃、３分間。増幅生
成物をBamH I及びEcoR Iで加水分解し、アガロースゲル
上で精製し、かつ1.15kbより大きなDNA−フラグメント
をBamH I及びEcoR Iで線状にされたファージミド（Phag
emid）−ベクターBluescript II SK＋中でクローン化
し、この際cysE−プラスミドpPC43が生じた（図８）。
所望の多重突然変異体は次に記載するように製造され
た： １）cysE−IV−対立遺伝子の製造：二重突然変異体Val
237＋Ser238 cysE−野生型プラスミドpPC43から出発し、突然変異
オリゴヌクレオチドcysE−Mut−１（SEQ ID NO:5）（表
３）の使用下に、位置特異的突然変異誘発により最初に
238位でグリシンの代わりにセリンを導入し、及びその
際生じたcysE−突然変異体pPC34中で突然変異オリゴヌ
クレオチドcysE−Mut−３（SEQ ID NO:6）（表３）を使
用下に237位でアラニンの代わりにバリンを導入し、こ
の際cysE−IV−対立遺伝子が生じた。
た： １）cysE−IV−対立遺伝子の製造：二重突然変異体Val
237＋Ser238 cysE−野生型プラスミドpPC43から出発し、突然変異
オリゴヌクレオチドcysE−Mut−１（SEQ ID NO:5）（表
３）の使用下に、位置特異的突然変異誘発により最初に
238位でグリシンの代わりにセリンを導入し、及びその
際生じたcysE−突然変異体pPC34中で突然変異オリゴヌ
クレオチドcysE−Mut−３（SEQ ID NO:6）（表３）を使
用下に237位でアラニンの代わりにバリンを導入し、こ
の際cysE−IV−対立遺伝子が生じた。
２）cysE−VIII−対立遺伝子の製造：二重突然変異体Va
l237＋Ile256 cysE−野生型プラスミドpPC43から出発し、突然変異
オリゴヌクレオチドcysE−Mut−６（SEQ ID NO:7）（表
３）の使用下に、位置特異的突然変異誘発により、256
位でメチオニンの代わりにイソロイシンを導入し、その
際cysE I−対立遺伝子が生じた。この中で突然変異オリ
ゴヌクレオチドcysE−Mut−３（SEQ ID NO:6）（表３）
により、237位のアラニンの代わりにバリンを導入し
た。この際対立遺伝子cysE−VIIIが生じた。
l237＋Ile256 cysE−野生型プラスミドpPC43から出発し、突然変異
オリゴヌクレオチドcysE−Mut−６（SEQ ID NO:7）（表
３）の使用下に、位置特異的突然変異誘発により、256
位でメチオニンの代わりにイソロイシンを導入し、その
際cysE I−対立遺伝子が生じた。この中で突然変異オリ
ゴヌクレオチドcysE−Mut−３（SEQ ID NO:6）（表３）
により、237位のアラニンの代わりにバリンを導入し
た。この際対立遺伝子cysE−VIIIが生じた。
３）cysE−VI−対立遺伝子の製造：二重突然変異体Ser
238＋Ile256 cysE−Ｉ−対立遺伝子（突然変異体Ile256）中で、突
然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut−１（SEQ ID NO:
5）（表３）の使用下に、238位でグリシンの代わりにセ
リンを導入し、その際cysE−VI−対立遺伝子が生じた。
238＋Ile256 cysE−Ｉ−対立遺伝子（突然変異体Ile256）中で、突
然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut−１（SEQ ID NO:
5）（表３）の使用下に、238位でグリシンの代わりにセ
リンを導入し、その際cysE−VI−対立遺伝子が生じた。
４）cysE−Ｖ−対立遺伝子の製造：三重突然変異体Val
237＋Ser238＋Ile256 cysE−IV−対立遺伝子（二重突然変異突然体Val237＋
Ser238）中で、突然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut
−６（SEQ ID NO:7）（表３）の使用下に、256位でメチ
オニンをイソロイシンに代えた。その際cysE−Ｖ−対立
遺伝子が生じた。
237＋Ser238＋Ile256 cysE−IV−対立遺伝子（二重突然変異突然体Val237＋
Ser238）中で、突然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut
−６（SEQ ID NO:7）（表３）の使用下に、256位でメチ
オニンをイソロイシンに代えた。その際cysE−Ｖ−対立
遺伝子が生じた。
５）cysE−XIV−対立遺伝子の製造：二重突然変異体Ala
167＋終止251 対立遺伝子cysE−Del 255（実施例３参照）から出発
し、突然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut−10（SEQ I
D NO:8）（表３）の使用下に、167位でトレオニンの代
わりにアラニンを導入し、その際cysE−XIV−対立遺伝
子が生じた。
167＋終止251 対立遺伝子cysE−Del 255（実施例３参照）から出発
し、突然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut−10（SEQ I
D NO:8）（表３）の使用下に、167位でトレオニンの代
わりにアラニンを導入し、その際cysE−XIV−対立遺伝
子が生じた。
６）cysE−XVII−対立遺伝子の製造：二重突然変異体As
p165＋Ala167 cysE−III−対立遺伝子（突然変異体Asp165、実施例
１参照）から出発し、オリゴヌクレオチドcysE−Mut−1
0（SEQ ID NO:8）（表３）の使用下に、167位でアミノ
酸トレオニンをアラニンに代えた。その際対立遺伝子cy
sE−XVII−対立遺伝子が生じた。
p165＋Ala167 cysE−III−対立遺伝子（突然変異体Asp165、実施例
１参照）から出発し、オリゴヌクレオチドcysE−Mut−1
0（SEQ ID NO:8）（表３）の使用下に、167位でアミノ
酸トレオニンをアラニンに代えた。その際対立遺伝子cy
sE−XVII−対立遺伝子が生じた。
７）cysE−XXIII−対立遺伝子の製造：三重突然変異体A
la167＋Val237＋Ser238 cysE−IV−対立遺伝子（二重突然体Val237＋Ser238）
中で、突然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut−10（SEQ
ID NO:8）（表３）の使用下に、167位でトレオニンの
代わりにアラニンを導入し、その際cysE−XXIII−対立
遺伝子が生じた。
la167＋Val237＋Ser238 cysE−IV−対立遺伝子（二重突然体Val237＋Ser238）
中で、突然変異オリゴヌクレオチドcysE−Mut−10（SEQ
ID NO:8）（表３）の使用下に、167位でトレオニンの
代わりにアラニンを導入し、その際cysE−XXIII−対立
遺伝子が生じた。
導入した突然変異体の正確性をその都度の突然変異体
の全構成遺伝子のDNA−配列分析により試験した。cysE
＊−多重突然変異体は表４中に見いだされる。
の全構成遺伝子のDNA−配列分析により試験した。cysE
＊−多重突然変異体は表４中に見いだされる。
生化学的パラメーター、例えば酵素活性及び阻害定数
Kiの決定のために実施例１中の記載と同様に実施した。
Kiの決定のために実施例１中の記載と同様に実施した。
実施例３ PCRにより酵素のカルボキシ末端の調節された短縮によ
る最終生成物不感受性セリン−アセチルトランスフェラ
ーゼの製造 蛋白質の中の１つ又は複数のアミノ酸の所定の変更は
公知技術であり、かつ好適な突然変異プライマーの使用
下にDNAレベルで、PCR−技術により（Saiki等,1988,Sci
ence 239:487−491）良好に実施される。変化した蛋白
質の発現のためには得られたPCR−生成物を好適なプラ
スミド／宿主細胞系中でクローン化する。
る最終生成物不感受性セリン−アセチルトランスフェラ
ーゼの製造 蛋白質の中の１つ又は複数のアミノ酸の所定の変更は
公知技術であり、かつ好適な突然変異プライマーの使用
下にDNAレベルで、PCR−技術により（Saiki等,1988,Sci
ence 239:487−491）良好に実施される。変化した蛋白
質の発現のためには得られたPCR−生成物を好適なプラ
スミド／宿主細胞系中でクローン化する。
表５中に示したオリゴヌクレオチドプライマーの使用
下に、E.コリ野生型菌株W3110（ATTC27325）のゲノムDN
Aから異なる長さのカルボキシ末端欠失を有するcysE−
突然変異体が製造された。これを表６中にまとめた。
下に、E.コリ野生型菌株W3110（ATTC27325）のゲノムDN
Aから異なる長さのカルボキシ末端欠失を有するcysE−
突然変異体が製造された。これを表６中にまとめた。
PCR−実験をデオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、d
CTP、dGTP、dTTP）200μＭ、“センス−プライマー"cys
E−LHfw1（SEQ ID NO:9）のオリゴヌクレオチド及び相
当する“アンチセンス−プライマー”（SEQ ID NO:10−
23）（表５）それぞれ１μＭ、W3110−DNA100ng、反応
緩衝液（トリス−HCl pH8.3 10mM、KCl 50mM、MgCl21.
5mM、ゼラチン0.01％）及び熱安定性Vent−DNA−ポリメ
ラーゼ（Fa.Biolabs）５単位の存在下に熱循環装置（Ge
ne−ATAQ−Controler,Fa.Pharmacia）中で次の条件下に
30サイクル実施した:96℃、1.5分間;62℃、１分間;72
℃、３分間。
CTP、dGTP、dTTP）200μＭ、“センス−プライマー"cys
E−LHfw1（SEQ ID NO:9）のオリゴヌクレオチド及び相
当する“アンチセンス−プライマー”（SEQ ID NO:10−
23）（表５）それぞれ１μＭ、W3110−DNA100ng、反応
緩衝液（トリス−HCl pH8.3 10mM、KCl 50mM、MgCl21.
5mM、ゼラチン0.01％）及び熱安定性Vent−DNA−ポリメ
ラーゼ（Fa.Biolabs）５単位の存在下に熱循環装置（Ge
ne−ATAQ−Controler,Fa.Pharmacia）中で次の条件下に
30サイクル実施した:96℃、1.5分間;62℃、１分間;72
℃、３分間。
cysE−LHfw1（SEQ ID NO:9） 太字でマークした部分は図６のcysE−配列の塩基９〜
30に相当し、下線は組み込まれたBst XI/Sac I−位であ
る。
30に相当し、下線は組み込まれたBst XI/Sac I−位であ
る。
増幅により生じた生成物を酵素Sac I及びNsi Iで加水
分解し、引き続きアガロースゲル上で精製し、かつその
都度単離されたcysE−DNA−フラグメントをSac I及びNs
i Iで線状にされたベクターpACYC184−LH（DMS10172）
（図９参照）中に連結する。その都度の連結配合物をシ
ステイン要求性cysE−菌株JM15（CGSC＃5042）において
形質転換し、かつシステイン不含、テトラサイクリン−
含有（20mg/）最少培地上での選択を実施した。
分解し、引き続きアガロースゲル上で精製し、かつその
都度単離されたcysE−DNA−フラグメントをSac I及びNs
i Iで線状にされたベクターpACYC184−LH（DMS10172）
（図９参照）中に連結する。その都度の連結配合物をシ
ステイン要求性cysE−菌株JM15（CGSC＃5042）において
形質転換し、かつシステイン不含、テトラサイクリン−
含有（20mg/）最少培地上での選択を実施した。
このクローニングから由来するプラスミドはその欠失
程度に相応して、pACYC184/cysE−Delと命名された（プ
ラスミド地図に関する図９を参照）。酵素活性及び阻害
定数Kiの測定ならびに交叉栄養供給テストを実施例１の
記載と同様に実施した。実施した欠失の正確性をDNA−
配列分析により証明した。
程度に相応して、pACYC184/cysE−Delと命名された（プ
ラスミド地図に関する図９を参照）。酵素活性及び阻害
定数Kiの測定ならびに交叉栄養供給テストを実施例１の
記載と同様に実施した。実施した欠失の正確性をDNA−
配列分析により証明した。
この実験の結果を表６にまとめた。
太字でマークした部分は図６の配列中のその都度の塩
基に相当し、下線は組み込まれたNsi I−位である。
基に相当し、下線は組み込まれたNsi I−位である。
実施例４ 振盪フラスコ中でのＬ−システインもしくはＬ−システ
イン−関連生成物の過剰生産のための変化したセリン−
アセチルトランスフェラーゼを有するE.コリ−宿主菌株
の形質転換 この生産のために低いコピー数で際だっているベクタ
ーpACYC184−LHを使用した。このためにはPCRにより実
施例１及び２からのプラスミド上のcysE−遺伝子を増幅
した。
イン−関連生成物の過剰生産のための変化したセリン−
アセチルトランスフェラーゼを有するE.コリ−宿主菌株
の形質転換 この生産のために低いコピー数で際だっているベクタ
ーpACYC184−LHを使用した。このためにはPCRにより実
施例１及び２からのプラスミド上のcysE−遺伝子を増幅
した。
このPCR−実験をデオキシヌクレオチド三リン酸（dAT
P、dCTP、dGTP、dTTP）200μＭ、“センス−プライマ
ー"cysE−LHfw1（SEQ ID NO:9）及び相当する“アンチ
センス−プライマー"cysE−LHrev（SEQ ID NO:24）のオ
リゴヌクレオチドそれぞれ１μＭ、その都度のプラスミ
ド−DNA10ng、反応緩衝液（トリス−HCl pH8.3 10mM、K
Cl 50mM、MgCl2 1.5mM、ゼラチン0.01％）及び熱安定性
Vent−DNA−ポリメラーゼ（Fa.Biolabs）５単位の存在
下に熱循環装置（Gene−ATAQ−Controler,Fa.Pharmaci
a）中で次の条件下に30サイクル実施した:96℃、1.5分
間;62℃、１分間;72℃、３分間。
P、dCTP、dGTP、dTTP）200μＭ、“センス−プライマ
ー"cysE−LHfw1（SEQ ID NO:9）及び相当する“アンチ
センス−プライマー"cysE−LHrev（SEQ ID NO:24）のオ
リゴヌクレオチドそれぞれ１μＭ、その都度のプラスミ
ド−DNA10ng、反応緩衝液（トリス−HCl pH8.3 10mM、K
Cl 50mM、MgCl2 1.5mM、ゼラチン0.01％）及び熱安定性
Vent−DNA−ポリメラーゼ（Fa.Biolabs）５単位の存在
下に熱循環装置（Gene−ATAQ−Controler,Fa.Pharmaci
a）中で次の条件下に30サイクル実施した:96℃、1.5分
間;62℃、１分間;72℃、３分間。
cysE−LHfw1（SEQ ID NO:9） 下線を引いた塩基は組み込まれた制限切断位Bst XI及
びSac Iに相当し、残りの太字でマークした塩基は図６
のcysE−配列の位置９〜30に相当する。
びSac Iに相当し、残りの太字でマークした塩基は図６
のcysE−配列の位置９〜30に相当する。
cysE−LHrev1（SEQ ID NO:24） 下線を引いた塩基は組み込まれた制限切断位Nsi Iに
相当し、残りの太字でマークした塩基は図６のcysE−配
列の1106−1127位に相当する。
相当し、残りの太字でマークした塩基は図６のcysE−配
列の1106−1127位に相当する。
増幅により生じた生産物を酵素Sac I及びNsi Iで加水
分解し、引き続きアガロースゲル上で精製し、かつその
都度単離されたcysE−DNA−フラグメントをSac I及びNs
i Iで線状にしたベクターpACYC184−LH（DMS10172）中
に連結した。
分解し、引き続きアガロースゲル上で精製し、かつその
都度単離されたcysE−DNA−フラグメントをSac I及びNs
i Iで線状にしたベクターpACYC184−LH（DMS10172）中
に連結した。
その都度の連結配合物をシステイン要求性cysE−菌株
JM15（CGSC＃5042）において形質転換し、かつシステイ
ン不含、テトラサイクリン−含有（20mg/）最少培地
上での選択を実施した。このクローニングから由来する
フィードバック耐性cysE−プラスミドの列をpACYC184/c
ysE（図９参照）と命名し、この際各クローンに相応す
るcysE−対立遺伝子番号を付与した。
JM15（CGSC＃5042）において形質転換し、かつシステイ
ン不含、テトラサイクリン−含有（20mg/）最少培地
上での選択を実施した。このクローニングから由来する
フィードバック耐性cysE−プラスミドの列をpACYC184/c
ysE（図９参照）と命名し、この際各クローンに相応す
るcysE−対立遺伝子番号を付与した。
酵素活性、阻害定数Kiの測定ならびに交叉栄養供給テ
ストを実施例１の記載と同様に実施した。
ストを実施例１の記載と同様に実施した。
液体培地中の生産能力を測定するために、標準生産培
地20mを単コロニーで接種し、30℃及び170r.p.m.で48
時間にわたってインキュベーションした。この生産培地
はグルコース15g/、バクトトリプトン0.08g/、酵母
抽出物0.04g/、ビタミンB15mg/、KH2PO4 3g/、K2
HPO4 12g/、MgSO4×7H2O 0.3g/、NaCl 0.1g/、
（NH4）2SO4 5g/、CaCl2×2H2O 14.7mg/、FeSO4×2
H2O 2mg/、クエン酸Na3×2H2O 1g/、Na2S2O3×5H2O
5g/及び微量元素溶液1m／、テトラサイクリン0.
025mg/からなる。24時間及び48時間後にそれぞれ試料
（10μ）を採取し、相応して希釈し、かつ細胞不含上
澄み中で生産物濃度をGaitonde,M.K.（（1967）,Bioche
m.J.104:627−633）により、熱量測定で測定した。異な
るcysE−突然変異体で形質転換した生産菌株JM15に関し
て、システイン50〜300mg/の間の濃度が測定された。
地20mを単コロニーで接種し、30℃及び170r.p.m.で48
時間にわたってインキュベーションした。この生産培地
はグルコース15g/、バクトトリプトン0.08g/、酵母
抽出物0.04g/、ビタミンB15mg/、KH2PO4 3g/、K2
HPO4 12g/、MgSO4×7H2O 0.3g/、NaCl 0.1g/、
（NH4）2SO4 5g/、CaCl2×2H2O 14.7mg/、FeSO4×2
H2O 2mg/、クエン酸Na3×2H2O 1g/、Na2S2O3×5H2O
5g/及び微量元素溶液1m／、テトラサイクリン0.
025mg/からなる。24時間及び48時間後にそれぞれ試料
（10μ）を採取し、相応して希釈し、かつ細胞不含上
澄み中で生産物濃度をGaitonde,M.K.（（1967）,Bioche
m.J.104:627−633）により、熱量測定で測定した。異な
るcysE−突然変異体で形質転換した生産菌株JM15に関し
て、システイン50〜300mg/の間の濃度が測定された。
実施例５ 組み換えλ−プロファージを用いる、染色体にコードさ
れ、フィードバック耐性のcysE−対立遺伝子の作成、及
び１−培養器中でのＬ−システイン又はＬ−システイ
ン誘導生成物の生産 染色体“付着部位”（attλ）中への組み込みのため
に、cysE−対立遺伝子、cysE IV、cysE X及びcysE XIを
プラスミドpRS551中でクローン化した（Simons等、198
7、Gene 53:85−96）。このためには、その都度のcysE
−対立遺伝子を、相応するcysE−プラスミドからのPCR
により増幅した。使用したオリゴヌクレオチドcysE−fw
l及びcysE−rev1は実施例１中に記載されている。増幅
は実施例３に記載されているように実施した。得られた
フラグメントをEcoR I/BamH Iで切断し、アガロースゲ
ル上で精製し、かつEcoR I/BamH I切断ベクターpRS551
中に連結した。この際、ベクターpRS551を基礎とする組
み換えプラスミドpRScysE IV、Ｘ及びXIが生じた。
れ、フィードバック耐性のcysE−対立遺伝子の作成、及
び１−培養器中でのＬ−システイン又はＬ−システイ
ン誘導生成物の生産 染色体“付着部位”（attλ）中への組み込みのため
に、cysE−対立遺伝子、cysE IV、cysE X及びcysE XIを
プラスミドpRS551中でクローン化した（Simons等、198
7、Gene 53:85−96）。このためには、その都度のcysE
−対立遺伝子を、相応するcysE−プラスミドからのPCR
により増幅した。使用したオリゴヌクレオチドcysE−fw
l及びcysE−rev1は実施例１中に記載されている。増幅
は実施例３に記載されているように実施した。得られた
フラグメントをEcoR I/BamH Iで切断し、アガロースゲ
ル上で精製し、かつEcoR I/BamH I切断ベクターpRS551
中に連結した。この際、ベクターpRS551を基礎とする組
み換えプラスミドpRScysE IV、Ｘ及びXIが生じた。
λRS45−ファージを有するpRScysE−担持recA+−菌株
（例えばYMC9、ATCC3397）上のプレートリザート（Plat
tenlysat）の製造により、生体内で相同組み換えにより
不均一ラムダ−リザートが生じた、これはλRS45−ファ
ージの他に組み換えcysE−対立遺伝子−担持λRS45−誘
導体も含有する（Simons等、1987、Gene 53:85−96）。
（例えばYMC9、ATCC3397）上のプレートリザート（Plat
tenlysat）の製造により、生体内で相同組み換えにより
不均一ラムダ−リザートが生じた、これはλRS45−ファ
ージの他に組み換えcysE−対立遺伝子−担持λRS45−誘
導体も含有する（Simons等、1987、Gene 53:85−96）。
組み換えRS45−誘導体に関する選択のためには、cysE
−菌株JM15を使用し、これを不均一ラムダ−リザートで
感染し、かつ引き続きカナマイシン含有（25mg/）LB
−プレート上に塗布した。次いで、得られた溶原性、カ
ナマイシン−耐性クローンをシステインを含有しない最
少培地上で成長する能力に関してテストした。それぞれ
のシステイン−原栄養クローンを選択し、かつ均一cysE
−リザートの製造のために（UV−誘発による、Simons
等、1987、Gene 53:85−96）使用した。
−菌株JM15を使用し、これを不均一ラムダ−リザートで
感染し、かつ引き続きカナマイシン含有（25mg/）LB
−プレート上に塗布した。次いで、得られた溶原性、カ
ナマイシン−耐性クローンをシステインを含有しない最
少培地上で成長する能力に関してテストした。それぞれ
のシステイン−原栄養クローンを選択し、かつ均一cysE
−リザートの製造のために（UV−誘発による、Simons
等、1987、Gene 53:85−96）使用した。
それぞれ得られた均一cysE−λ−リザートで、菌株JM
15を感染させた。これから由来する菌株JM15attλ::cys
Eを実施例６に記載したように発酵させた。それぞれの
培地はテトラサイクリンの代わりに選択剤としてそれぞ
れカナマイシン25mg/を含有する。
15を感染させた。これから由来する菌株JM15attλ::cys
Eを実施例６に記載したように発酵させた。それぞれの
培地はテトラサイクリンの代わりに選択剤としてそれぞ
れカナマイシン25mg/を含有する。
システインの収率はcysE IVで0.5、cysE Xで1.8及びc
ysE XIで2.1g/である（表７参照）。
ysE XIで2.1g/である（表７参照）。
実施例６ 宿主菌株JM15の使用下に１−培養器中でのＬ−システ
イン又はＬ−システイン誘導生成物の生産に対する種々
異なる、プラスミドコードcysE−対立遺伝子の影響 エルレンマイヤーフラスコ100m中のLB−培地（トリ
プトファン１％、酵母抽出物0.5％、NaCl0.5％）20m
をそれぞれcysE−プラスミドで形質転換した生産菌株JM
15（CGSC＃5042）の単コロニーで接種した。
イン又はＬ−システイン誘導生成物の生産に対する種々
異なる、プラスミドコードcysE−対立遺伝子の影響 エルレンマイヤーフラスコ100m中のLB−培地（トリ
プトファン１％、酵母抽出物0.5％、NaCl0.5％）20m
をそれぞれcysE−プラスミドで形質転換した生産菌株JM
15（CGSC＃5042）の単コロニーで接種した。
細菌振盪機中で（150rpm、30℃）７時間インキュベー
ションした後、SM1培地100m中でそれぞれ予培養を実
施した。このSM1−培地はグルコース5g/、ビタミンB1
5mg/、KH2PO43g/、K2HPO4 12g/、MgSO4×7H2O 0.
3g/、NaCl 0.1g/、（NH4）2SO4 5g/、CaCl2×2H2
O 14.7mg/、FeSO4×2H2O 2mg/、クエン酸Na3×2H2O
1g/、微量元素溶液1m／、テトラサイクリン25mg
/を含有した。微量元素溶液はNa2MoO4×2H2O 0.15g/
、H3BO3 2.5g/、CoCl2×6H2O 0.7g/、CuSO4×5H2
O 0.25g/、MnCl2×4H2O 1.6g/及びZnSO4×7H2O 0.3
g/からなる。この培地を１−−エルレンマイヤーフ
ラスコ中で、30℃で、150rpmで17時間振盪した。このイ
ンキュベーションの後OD600は４及び５の間であった。
更なる発酵を研究用発酵器（BIOSTAT M、Firma Braun−
Melsungen）中で実施した。全用量２を有する培養器
を使用した。
ションした後、SM1培地100m中でそれぞれ予培養を実
施した。このSM1−培地はグルコース5g/、ビタミンB1
5mg/、KH2PO43g/、K2HPO4 12g/、MgSO4×7H2O 0.
3g/、NaCl 0.1g/、（NH4）2SO4 5g/、CaCl2×2H2
O 14.7mg/、FeSO4×2H2O 2mg/、クエン酸Na3×2H2O
1g/、微量元素溶液1m／、テトラサイクリン25mg
/を含有した。微量元素溶液はNa2MoO4×2H2O 0.15g/
、H3BO3 2.5g/、CoCl2×6H2O 0.7g/、CuSO4×5H2
O 0.25g/、MnCl2×4H2O 1.6g/及びZnSO4×7H2O 0.3
g/からなる。この培地を１−−エルレンマイヤーフ
ラスコ中で、30℃で、150rpmで17時間振盪した。このイ
ンキュベーションの後OD600は４及び５の間であった。
更なる発酵を研究用発酵器（BIOSTAT M、Firma Braun−
Melsungen）中で実施した。全用量２を有する培養器
を使用した。
発酵培地はグルコース15g/、NaCl 5g/、MgSO4×7
H2O 0.3g/、CaCl2×2H2O 15mg/、FeSO4×2H2O 75mg
/、クエン酸Na3×2H2O 1g/、KH2PO4 1.5g/、微量
元素溶液1m／（前記）、ビタミンB1 5mg/、酵母
抽出物（Difco）2.5g/、トリプトン（Difco）2.5g/
及びテトラサイクリン25mg/を含有する。
H2O 0.3g/、CaCl2×2H2O 15mg/、FeSO4×2H2O 75mg
/、クエン酸Na3×2H2O 1g/、KH2PO4 1.5g/、微量
元素溶液1m／（前記）、ビタミンB1 5mg/、酵母
抽出物（Difco）2.5g/、トリプトン（Difco）2.5g/
及びテトラサイクリン25mg/を含有する。
発酵器中のグルコース濃度を、開始時に、グルコース
溶液（滅菌）700g/（w/v）をポンプにより供給するこ
とにより15g/の値にし、かつ25％NH4OH−溶液の供給
によりpH値を7.0に調節する。OD600 10が達せられた
後、滅菌チオスルフェート基本溶液100g/（w/v）から
１時間あたり300mgを供給した。接種するために、予培
地100mを発酵容器中にポンプで供給した。開始容量は
約１であった。この培養体を最初に400rpmで撹拌し、
かつ滅菌フィルターを介して除菌した圧縮空気1.5vvmで
通気した。発酵は温度30℃で実施した。
溶液（滅菌）700g/（w/v）をポンプにより供給するこ
とにより15g/の値にし、かつ25％NH4OH−溶液の供給
によりpH値を7.0に調節する。OD600 10が達せられた
後、滅菌チオスルフェート基本溶液100g/（w/v）から
１時間あたり300mgを供給した。接種するために、予培
地100mを発酵容器中にポンプで供給した。開始容量は
約１であった。この培養体を最初に400rpmで撹拌し、
かつ滅菌フィルターを介して除菌した圧縮空気1.5vvmで
通気した。発酵は温度30℃で実施した。
pH−値を25％NH4OHで、自動調節機により7.0に保持し
た。発酵ブイヨン中の酸素飽和は発酵の間20％より下回
るべきではなく、このことは撹拌速度を介して調節し
た。２〜３時間の間隔で、培養液のグルコース含量、光
学密度及びシステイン含量を調べた。グルコース含量の
測定はYSI社のグルコース分析機を用いて、酵素的に実
施した。グルコース濃度を連続的な供給で10〜20g/に
調節した。
た。発酵ブイヨン中の酸素飽和は発酵の間20％より下回
るべきではなく、このことは撹拌速度を介して調節し
た。２〜３時間の間隔で、培養液のグルコース含量、光
学密度及びシステイン含量を調べた。グルコース含量の
測定はYSI社のグルコース分析機を用いて、酵素的に実
施した。グルコース濃度を連続的な供給で10〜20g/に
調節した。
培地の生産物含量を試料の細胞不含上澄みから熱量測
定（Gaitonde,M.K.（1967）,Biochem.J.104:627−633）
により決定した。
定（Gaitonde,M.K.（1967）,Biochem.J.104:627−633）
により決定した。
44〜50時間後に発酵を中断した。48時間後に生産した
システイン量をg/で表７中にまとめた。
システイン量をg/で表７中にまとめた。
表7:異なるcysE−対立遺伝子で形質転換した、生産菌株
JM15のシステイン収量（１培養器） 実施例７ コリネバクテリウムでのＬ−システイン又はＬ−システ
イン誘導生成物の生産 フィードバック耐性cysE−対立遺伝子cysE IV、cysE
X、cysE XI及びcysE XIV（実施例１中の表２参照）を制
限酵素BamH I及びEcoR I（Fa.Boehringer Mannheim）で
その相当するプラスミドから切断し、かつそれぞれ1.15
kbの大きさのDNA−フラグメントをアガロースゲルを介
して精製し、かつ単離した。それぞれのDNA−フラグメ
ントを、E.コリからのDNA−ポリメラーゼＩのクレノウ
−フラグメント（Fa.Boehringer Mannheim）の作用によ
り平滑末端とした。ベクターpWST1を制限酵素Sma I（F
a.Boehringer Mannheim）で加水分解し、かつ平滑末端D
NA−フラグメントとT4DNA−リガーゼにより連結した。
このベクターpWST1はE.コリ／コリネバクテリア−シャ
トルベクターであり、かつE.コリ中にもコリネバクテリ
ア中にも複製することができる。このベクターのコリネ
バクテリアレプリコンはコリネバクテリウム・グルタミ
クム（Corynebacterium glutamicum）ATCC19223から由
来する。ベクターpWST1の製造はUS−A4965197中に記載
されている。システイン要求性突然変異体JM15を形質転
換するために連結配合物を使用した。相補するプラスミ
ドはその挿入されたcysE−対立遺伝子に相応して、pWST
1−cysE IV、pWST1−cysE X、pWST1−cysE XI及びpWST1
−cysE XIVと命名した。
JM15のシステイン収量（１培養器） 実施例７ コリネバクテリウムでのＬ−システイン又はＬ−システ
イン誘導生成物の生産 フィードバック耐性cysE−対立遺伝子cysE IV、cysE
X、cysE XI及びcysE XIV（実施例１中の表２参照）を制
限酵素BamH I及びEcoR I（Fa.Boehringer Mannheim）で
その相当するプラスミドから切断し、かつそれぞれ1.15
kbの大きさのDNA−フラグメントをアガロースゲルを介
して精製し、かつ単離した。それぞれのDNA−フラグメ
ントを、E.コリからのDNA−ポリメラーゼＩのクレノウ
−フラグメント（Fa.Boehringer Mannheim）の作用によ
り平滑末端とした。ベクターpWST1を制限酵素Sma I（F
a.Boehringer Mannheim）で加水分解し、かつ平滑末端D
NA−フラグメントとT4DNA−リガーゼにより連結した。
このベクターpWST1はE.コリ／コリネバクテリア−シャ
トルベクターであり、かつE.コリ中にもコリネバクテリ
ア中にも複製することができる。このベクターのコリネ
バクテリアレプリコンはコリネバクテリウム・グルタミ
クム（Corynebacterium glutamicum）ATCC19223から由
来する。ベクターpWST1の製造はUS−A4965197中に記載
されている。システイン要求性突然変異体JM15を形質転
換するために連結配合物を使用した。相補するプラスミ
ドはその挿入されたcysE−対立遺伝子に相応して、pWST
1−cysE IV、pWST1−cysE X、pWST1−cysE XI及びpWST1
−cysE XIVと命名した。
pWST1−cysE−プラスミドを、コリネバクテリウム・
グルタミクムATCC21851を形質転換するために使用し
た。この形質転換は、Liebl,W.等により詳細に記載され
た技術（1989,FEMS Microbiol.Letters,65,299−304）
により、エレクトロポレーションで実施した。組み換え
クローンはプラスミドにコードされたカナマイシン耐性
を介してカナマイシン25mg/を有するアガロースプレ
ート上で実施した。
グルタミクムATCC21851を形質転換するために使用し
た。この形質転換は、Liebl,W.等により詳細に記載され
た技術（1989,FEMS Microbiol.Letters,65,299−304）
により、エレクトロポレーションで実施した。組み換え
クローンはプラスミドにコードされたカナマイシン耐性
を介してカナマイシン25mg/を有するアガロースプレ
ート上で実施した。
発酵は実施例６に記載された条件下に実施したが、選
択抗生物質として、テトラサイクリンの代わりにカナマ
イシンを50mg/の濃度で使用した。
択抗生物質として、テトラサイクリンの代わりにカナマ
イシンを50mg/の濃度で使用した。
発酵において、cysE XI−対立遺伝子をプラスミド上
に有する菌株が最高のシステイン収率を達成することを
示した。
に有する菌株が最高のシステイン収率を達成することを
示した。
配列表 （１） 一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：コンゾルテイウム フユール エレクトロ
ケミツシエ インヅストリー ゲゼルシャフト ミット
ベシュレンクテル ハフツング （Ｂ）町：ツイールシユタツト ストラーセ 20 （Ｃ）市：ミュンヘン （Ｄ）州：バイエルン （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便コード:81379 （Ｇ）電話:089/748440 （Ｈ）テレファックス:089/74844350 （Ｉ）テレックス:5215553 cons d （ii）発明の名称:O−アセチルセリン、Ｌ−システイ
ン及びＬ−システイン−関連生成物の製法 （iii）配列の数:24 （iv）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパチブル （Ｃ）オペレーティング システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ＃1.
0,バージョン＃1.30（EPA） （２） SEQ ID NO:1に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:273アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名:W3110 （xi）配列:SEQ ID NO:1: （２） SEQ ID NO:2に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:1135塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:2本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:Genomic DNA （vi）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名:W3110 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pPC43 （xi）配列:SEQ ID NO:2: （２） SEQ ID NO:3に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:42塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−fw1 （xi）配列:SEQ ID NO:3: （２） SEQ ID NO:4に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:41塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−rev1 （xi）配列:SEQ ID NO:4: （２） SEQ ID NO:5に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−１ （xi）配列:SEQ ID NO:5: （２） SEQ ID NO:6に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−３ （xi）配列:SEQ ID NO:6: （２） SEQ ID NO:7に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−６ （xi）配列:SEQ ID NO:7: （２） SEQ ID NO:8に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−10 （xi）配列:SEQ ID NO:8: （２） SEQ ID NO:9に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:38塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−LHfw1 （xi）配列:SEQ ID NO:9: （２） SEQ ID NO:10に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del270 （xi）配列:SEQ ID NO:10: （２） SEQ ID NO:11に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del268 （xi）配列:SEQ ID NO:11: （２） SEQ ID NO:12に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del263 （xi）配列:SEQ ID NO:12: （２） SEQ ID NO:13に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del259 （xi）配列:SEQ ID NO:13: （２） SEQ ID NO:14に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del258 （xi）配列:SEQ ID NO:14: （２） SEQ ID NO:15に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:47塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del257 （xi）配列:SEQ ID NO:15: （２） SEQ ID NO:16に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del256 （xi）配列:SEQ ID NO:16: （２） SEQ ID NO:17に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del255 （xi）配列:SEQ ID NO:17: （２） SEQ ID NO:18に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del250 （xi）配列:SEQ ID NO:18: （２） SEQ ID NO:19に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del249 （xi）配列:SEQ ID NO:19: （２） SEQ ID NO:20に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del248 （xi）配列:SEQ ID NO:20: （２） SEQ ID NO:21に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del245 （xi）配列:SEQ ID NO:21: （２） SEQ ID NO:22に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del239 （xi）配列:SEQ ID NO:22: （２） SEQ ID NO:23に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del227 （xi）配列:SEQ ID NO:23: （２） SEQ ID NO:24に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:38塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−LHrev1 （xi）配列:SEQ ID NO:24:
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ン及びＬ−システイン−関連生成物の製法 （iii）配列の数:24 （iv）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパチブル （Ｃ）オペレーティング システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ＃1.
0,バージョン＃1.30（EPA） （２） SEQ ID NO:1に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:273アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （vi）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名:W3110 （xi）配列:SEQ ID NO:1: （２） SEQ ID NO:2に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:1135塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:2本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:Genomic DNA （vi）起源： （Ａ）生物名：大腸菌 （Ｂ）株名:W3110 （vii）直接の起源： （Ｂ）クローン名:pPC43 （xi）配列:SEQ ID NO:2: （２） SEQ ID NO:3に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:42塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−fw1 （xi）配列:SEQ ID NO:3: （２） SEQ ID NO:4に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:41塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−rev1 （xi）配列:SEQ ID NO:4: （２） SEQ ID NO:5に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:18塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−１ （xi）配列:SEQ ID NO:5: （２） SEQ ID NO:6に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−３ （xi）配列:SEQ ID NO:6: （２） SEQ ID NO:7に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−６ （xi）配列:SEQ ID NO:7: （２） SEQ ID NO:8に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Mut−10 （xi）配列:SEQ ID NO:8: （２） SEQ ID NO:9に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:38塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−LHfw1 （xi）配列:SEQ ID NO:9: （２） SEQ ID NO:10に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del270 （xi）配列:SEQ ID NO:10: （２） SEQ ID NO:11に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del268 （xi）配列:SEQ ID NO:11: （２） SEQ ID NO:12に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del263 （xi）配列:SEQ ID NO:12: （２） SEQ ID NO:13に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del259 （xi）配列:SEQ ID NO:13: （２） SEQ ID NO:14に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del258 （xi）配列:SEQ ID NO:14: （２） SEQ ID NO:15に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:47塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del257 （xi）配列:SEQ ID NO:15: （２） SEQ ID NO:16に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del256 （xi）配列:SEQ ID NO:16: （２） SEQ ID NO:17に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del255 （xi）配列:SEQ ID NO:17: （２） SEQ ID NO:18に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del250 （xi）配列:SEQ ID NO:18: （２） SEQ ID NO:19に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del249 （xi）配列:SEQ ID NO:19: （２） SEQ ID NO:20に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del248 （xi）配列:SEQ ID NO:20: （２） SEQ ID NO:21に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del245 （xi）配列:SEQ ID NO:21: （２） SEQ ID NO:22に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del239 （xi）配列:SEQ ID NO:22: （２） SEQ ID NO:23に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:46塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−Del227 （xi）配列:SEQ ID NO:23: （２） SEQ ID NO:24に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:38塩基対 （Ｂ）型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）配列の種類:/desc＝“オリゴヌクレオチド” （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名：合成 （Ｂ）クローン名:cysE−LHrev1 （xi）配列:SEQ ID NO:24:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｂ Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19 13/12 1:15 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ペーター ハインリヒ ドイツ連邦共和国 Ｄ−86447 トーテ ンヴァイス カペレンシュトラーセ 11 審査官 本間 夏子 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａ ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（1987) Ｖｏｌ．133，ｐ．515 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 9/10 C12P 13/06 C12P 13/12 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】阻害剤Ｌ−システインに対して野生型酵素
に比較して減少した感受性を有し、かつその蛋白質配列
が野生型配列に比較して突然変異を示す、セリン−アセ
チルトランスフェラーゼにおいて、この突然変異が 237位のAlaのValへのおよび238位のGlyのSerへの突然変
異であるか、 167位のThrのAlaへの突然変異であるか、 167位のThrのAlaへのおよび245位のGlyのSerへの突然変
異であるか、 97位のLysのGlnへの、238位のGlyのSerへのおよび267位
のPheのLeuへの突然変異であるか、 164位のValのAlaへのおよび267位のPheのLeuへの突然変
異であるか、 250位のAspのGlyへのおよび251位のLysのStopへの突然
変異であるか、 165位のGlyのAspへのおよび167位のThrのAlaへの突然変
異であるか、または 167位のThrのAlaへの、237位のAlaのValへのおよび238
位のGlyのSerへの突然変異であり、この際１位は図５
（SEQ ID NO:1）からの開始メチオニンであり、かつこ
のセリン−アセチルトランスフェラーゼがＬ−セリン1m
M及びアセチル−CoA0.1mMの存在下に、0.02〜2.3mMの阻
害定数Kiを有するか、またはこの突然変異が 167位のThrのAlaへのおよび256位のMetのStopへの突然
変異であり、この際１位は図５（SEQ ID NO:1）からの
開始メチオニンであり、かつこのセリン−アセチルトラ
ンスフェラーゼがＬ−セリン1mM及びアセチル−CoA0.1m
Mの存在下に、＞1000μＭの阻害定数Kiを有する、 ことを特徴とする、セリン−アセチルトランスフェラー
ゼ。 - 【請求項２】請求項１記載のセリン−アセチルトランス
フェラーゼをコードするDNA。 - 【請求項３】DNAが、 bp932位でＣがＴへのおよびbp934位でＧがＡへの突然変
異を有するか、 bp721位でＡがＧへの突然変異を有するか、 bp721位でＡがＧへのおよびbp955位でＧがＡへの突然変
異を有するか、 bp511位でＡがＣへの、bp934位でＧがＡへのおよびbp10
23位でＴがＧへの突然変異を有するか、 bp713位でＴがＣへのおよびbp1023位でＴがＧへの突然
変異を有するか、 bp721位でＡがＧへの、bp988位でＡがＴへのおよびbp98
9位でＴがＡへの突然変異を有するか、 bp971位でＡがＧへのおよびbp973位でＡがＴへの突然変
異を有するか、 bp716位でＧがＡへのおよびbp721位でＡがＧへの突然変
異を有するか、または bp721位でＡがＧへの、bp932位でＣがＴへのおよびbp93
4位でＧがＡへの突然変異を有し、 その際bp1は図６（SEQ ID NO:2）の最初の塩基である、
請求項２記載のDNA。 - 【請求項４】請求項２又は３記載のDNA少なくとも１つ
により脱制御されたシステイン物質代謝を有することを
特徴とする微生物。 - 【請求項５】請求項４に記載の微生物を公知法で培地中
で培養することを特徴とする、Ｏ−アセチルセリン、Ｌ
−システイン又はＬ−システインから誘導された生成物
の製法。 - 【請求項６】培地が十分量の硫黄供給源を含有する請求
項５記載の製法。 - 【請求項７】硫黄供給源としてチオスルフェートを使用
する請求項６記載の製法。
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