CN109517748A - 黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途，由AtD‑SAT转基因酵母菌株发酵所得蛋氨酸；所述的黑色食物小分子肽对由肝纤维化、酒精肝引起的受损肝细胞具有良好的抗炎和修复作用；利用黑色食物小分子肽制成的药物具有临床效果显著，毒副作用小的特点；本发明黑色食物小分子肽制备方法简单实用。

Description

黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途

技术领域

本发明提供一种黑色食物小分子肽及制备方法，同时进一步公开了该小分子肽在修复受损肝损伤中的医用用途，属于涉及药物技术领域。

背景技术

肝脏作为体内代谢过程中的关键器官，由体内代谢产生的各种有毒有害物质和外源性物质，长期接触可能会引起慢性肝损伤。肝病是危害人类健康的常见疾病之一，威胁着人们的生活和工作。目前对于肝病的防治也被全世界所关注，然而尚未阐明慢性肝损伤的发病机制。因此寻找药效持久、低毒、安全的保肝护肝药物是目前研究的重要方向。

花生中油酸的相对含量高达50%以上，油酸对人体心血管有益，对人体的高血脂、有害胆固醇有降低作用，而不影响或相对提高有益胆固醇。

目前，黑色食品的保健养生作用越来越受广大人们认可和喜爱，由于黑色食品包含黑芝麻、黑米、黑豆、黑枸杞、花生、黑木耳、黑桑葚等众多食物种类，并且各个具有不同功效和食用方法；本发明的任务是提供一种从黑色食品中提取的小分子肽，用于酒精肝、肝纤维化和代谢性疾病导致的肝损性的抗炎修复。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种黑色食物小分子肽，对酒精性肝损伤、肝纤维化和代谢性疾病导致的肝损有很好的抗炎修复功能。

本发明所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株，基因序列如SEQ No.1所示。

所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株的制备方法制备，包括以下步骤：

1） 总RNA 提取和反转录

以Total RNA 提取试剂RNAiso Plus 提取AtD-SAT酵母的总RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，利用核酸定量仪测定其浓度和纯度，取1 μ g 总RNA，以AOLP 为引物：5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACT16 （G/A/C）- 3' 反转录合成cDNA；

2） 基因克隆、重组表达载体的构建及电转化

根据酵母转录组序列信息，设计特异引物DBTN F：AGCAATGGTG GAAGAGTAAA，以cDNA 为模板进行扩增；根据酵母AtD-SAT基因编码成熟肽序列设计引物，在引物5' 端分别引入酶切位点Eco RI 和Xba I；

上游引物P1 ：5'- CGGGAATTCATGTCGTGTGAAGAACTG - 3'；

下游引物P2 ：5'- CTAGTCTGAGGATCCCATCCCCATACTC - 3' ；

以酵母的cDNA 为模板，以引物P1 和P2 进行目的片段的PCR 扩增，回收目的片段后用Eco RI 和Xba I 进行双酶切；将双酶切后的目的片段连接至经Eco RI 和Xba I双酶切后的pPICZ-DSAT载体，将其转化大肠杆菌感受态Trans- T- 1 中，筛选阳性克隆；将表达载体pPICZ-DSAT用Sac I 线性化后电转化入毕赤酵母感受态中，平行设置pPICZ-DSAT载体为对照；电转化后将转化子涂布在MD 平板上，所含物质的质量浓度分别为无氨基酸酵母氮源基础培养基YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，将平板置于30℃培养箱培养，直至出现单个菌落，此菌落即为目标酵母菌——AtD-SAT酵母菌株；

3） 遗传霉素筛选及PCR

鉴定转化子 利用无菌水重悬酵母重组子，将酵母重组子分别涂布于含有不同遗传霉素浓度（0、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）的YPD 平板上；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，于30℃培养；待不同遗传霉素条件下长出单克隆菌落后，在对应的遗传霉素条件下进行划线培养；挑取菌落为模板，以P1和P2，pPICZ-DSAT 载体上的5' AOX1（5'- GACTGGTTCCAATTGACAAGC- 3'）和P2 为引物，分别进行PCR 扩增鉴定各转化子插入情况；

4） 重组pPICZ-DSAT的诱导表达、蛋白检测及分离纯化

将阳性重组子置于BMGY 培养基中；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20g/L、磷酸钾缓冲液（pH 6.0）100mL/L、YNB13.4g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 mL/L；在30℃200 r/min 条件下培养，当OD 600 =0.4~0.8 时收集菌体并重悬于BMMY 培养基中：所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸钾缓冲液（pH6.0）100 mL/L、YNB13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L；于30℃下200 r/min 培养，每间隔24 h添加无水甲醇，使其终浓度为0.5%。诱导96 h 后收集发酵上清液进行Tricine- SDS- PAGE 分析，并以抗His 标签兔多克隆抗体为一抗，以山羊抗兔抗体为二抗对表达产物进行Western Blot检测；按照His 标签蛋白纯化试剂说明书对带有6×His 标签的小分子肽进行纯化，并用牛血清蛋白BSA 作为对照，Bradford 法测定蛋白的浓度。结果表明pPICZ-DSAT可以稳定表达，且可高效表达蛋氨酸。

所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株在制备黑色食物小分子肽中的用途。

所述的一种丝氨酸乙酰转移酶，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本发明所述的一种黑色食物小分子肽，其特征在于：是由上述的AtD-SAT转基因酵母菌株发酵所得，主要活性成分为含有权利要求4所述的一种丝氨酸乙酰转移酶。

本发明所述的一种黑色食物小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1）称量黑豆20-30份、黑花生20-30份、黑芝麻 10-15份、黑米10-15份、黑桑葚10-15份、黑木耳5-10份和黑枸杞1-5份以流动的水洗净，并破壁研磨，加入30-40份白糖后迅速倒入发酵罐中；

2）向发酵罐中加总物料体积3.5－4倍的无菌水，用消毒后搅拌均匀；

3） 25-30摄氏度条件下，加入权利要求1所述的AtD-SAT转基因酵母菌株0.02-0.03份密封3天进行发酵；

4）步骤3）中的发酵液温度升至55-65℃，加入木瓜蛋白酶0.02-0.03份， pH6.0－7.0，反应18－24h；

5）分别装入离心筒中离心，3000－5000r/min，20-30min，将上清和沉淀分别保存，取上清即得。

黑色食物小分子肽存在与黑色食物发酵液中谱图，参见图1。

本发明所述的黑色食物小分子肽及其有效成分在制备修复肝损伤药物中的应用。

所述的黑色食物小分子肽及其有效成分在制备肝纤维化、酒精肝药物中的应用。

【用法用量】口服；2次/日；50ml/次

本发明的药理药性如下：

黑花生是内含钙、钾、铜、锌、铁、硒、锰和8种维生素及19种人体所需的氨基酸等营养成分，还富含硒、铁、锌等微量元素和黑色素的新品种。与红花生相比，粗蛋白质含量高5%，精氨酸含量高 23.9%，钾含量高19%，锌含量高48%，硒含量高101%。黑花生含量较高的10种氨基酸效用分析：黑花生富含18种氨基酸，氨基酸总量为27.57%，仅次于黑大豆，必需氨基酸比例占22.90%。

黑豆为豆科植物大豆（学名：Glycinemax（L.）merr）的黑色种子。黑豆蛋白质含量36%，易于消化，对满足人体对蛋白质的需要具有重要意义; 脂肪含量16%，主要含不饱和脂肪酸，吸收率高达95%，除满足人体对脂肪的需要外，还有降低血液中胆固醇的作用; 黑豆含有丰富的维生素、蛋黄素、黑色素及卵磷脂等物质，其中B 族维生素和维生素E 含量很高，具有营养保健作用，黑豆中还含有丰富的微量元素，对保持机体功能完整，延缓机体衰老、降低血液粘度、满足大脑对微量物质需求都是必不可少的。但黑豆本身食用有一定弊端，比如

（1）黑豆入肾阴，冬天怕冷、肾阳虚的人最好不要过多食用。

（2）黑豆炒熟后食用会引起便秘。

所以本发明加入黑米。黑米营养丰富，食、药用价值高，同时黑米可以解决花生和黑豆在破壁后多油的现象，调和黑豆性阴少阳的特点，达到发挥各个成分的优点而消除各种缺点的目的。

对于黑豆易引起便秘的弊端，本发明加入黑芝麻，其含有大量的脂肪和蛋白质，可以达到润肠通便的功效，还含有糖类、维生素A、维生素E、卵磷脂、钙、铁、铬等营养成分。有健胃、保肝、促进红细胞生长的作用，同时可以增加体内黑色素，有利于头发生长。

除了上述四种黑色食物，本发明还加入了黑枸杞、黑木耳和黑桑葚。黑木耳为木耳科植物，其性平味甘，人胃、大肠经。具有滋补、润燥、养血益胃、活血止血、润肺、润肠的作用。黑枸杞含有大量花青素，具有延缓衰老、美容养颜、生津明目、提高皮肤吸收氧分的能力、保肝功能、补肾功能、提高免疫力、抗脂肪肝、防癌抗癌、抗疲劳等作用；黑桑葚性微寒，入心、肝、肾经，为滋补强壮、养心益智佳果。具有补血滋阴，生津止渴，润肠燥等功效，主治阴血不足而致的头晕目眩，耳鸣心悸，烦躁失眠，腰膝酸软，须发早白，消渴口干，大便干结等症。

本发明采用赤毕酵母电击转化方法，将 AtD-SAT 基因转入发酵所用的赤毕酵母中，获得高蛋氨酸转基因菌株。

蛋氨酸（Methionine，Met）是一种含硫氨基酸，是人和动物自身不能合成的必须氨基酸之一，参与很多重要的生命活动过程，在人类和动物营养中占有重要地位。本实验中的发酵液中蛋白质含量高，是具有生命活力的安全保健品，具有保肝护肾、调整免疫应答、抗癌、降血压、整肠、消除便秘、抵御痛风等作用。作为具有生命活力的独特保健品，黑色食物发酵液有着巨大的养生前景。但其中的氨基酸组分不均衡，含硫氨基酸尤其是蛋氨酸含量偏低，限制其利用价值的提高。

因此本发明在黑色食物发酵的过程中引入CAtD-SAT转基因酵母菌株，对黑豆、黑芝麻这样含油量高，且易致腹胀便秘的黑色食物在口感和功能上有着重要的调和作用，并且CAtD-SAT转基因酵母菌株高效表达的蛋氨酸与黑色食物发酵液中的小分子肽一样，同样有着修复受损肝脏的作用和易被人体吸收利用的优点。

本发明的积极效果在于：

提供了一种黑色食物小分子肽，由AtD-SAT转基因酵母菌株发酵所得蛋氨酸；所述的黑色食物小分子肽对由肝纤维化、酒精性肝损伤及代谢类疾病高尿酸血症引起的肝损伤具有良好的抗炎和修复作用；利用黑色食物小分子肽制成的药物具有临床效果显著，毒副作用小的特点；本发明黑色食物小分子肽制备方法简单实用。

附图说明

图1是本发明实施例1中转基因菌株稳定性PCR检测结果；

图2是本发明试验例1中健康组肝脏细胞图；

图3是本发明试验例1中模型组肝脏细胞图；

图4是本发明试验例1中阳性药组肝脏细胞图；

图5是本发明试验例1中实施例2肝脏细胞图；

图6是本发明试验例1中实施例3肝脏细胞图；

图7是本发明试验例1中实施例4肝脏细胞图；

图8是本发明试验例2中健康组肝脏细胞图；

图9是本发明试验例2中模型组肝脏细胞图；

图10是本发明试验例2中阳性药组肝脏细胞图；

图11是本发明试验例2中实施例2肝脏细胞图；

图12是本发明试验例2中实施例3肝脏细胞图；

图13是本发明试验例2中实施例4肝脏细胞图；

图14是本发明试验例3中健康组肝脏细胞图；

图15是本发明试验例3中模型组肝脏细胞图；

图16是本发明试验例3中阳性药组肝脏细胞图；

图17是本发明试验例3中实施例2肝脏细胞图；

图18是本发明试验例3中实施例3肝脏细胞图；

图19是本发明试验例3中实施例4肝脏细胞图；

图20是本发明试验例4中健康组肝脏细胞图；

图21是本发明试验例4中模型组肝脏细胞图；

图22是本发明试验例4中阳性药组肝脏细胞图；

图23是本发明试验例4中实施例2肝脏细胞图；

图24是本发明试验例4中实施例3肝脏细胞图；

图25是本发明试验例4中实施例4肝脏细胞图；

图26是本发明试验例5中健康组肝脏细胞图；

图27是本发明试验例5中模型组肝脏细胞图；

图28是本发明试验例5中阳性药组肝脏细胞图；

图29是本发明试验例5中实施例2肝脏细胞图；

图30是本发明试验例5中实施例3肝脏细胞图；

图31是本发明试验例5中实施例4肝脏细胞图；

图32是本发明试验例6中健康组肝脏细胞图；

图33是本发明试验例6中模型组肝脏细胞图；

图34是本发明试验例6中阳性药组肝脏细胞图；

图35是本发明试验例6中实施例2肝脏细胞图；

图36是本发明试验例6中实施例3肝脏细胞图；

图37是本发明试验例6中实施例4肝脏细胞图；

图38是本发明试验例6中健康组肝脏细胞图；

图39是本发明试验例6中模型组肝脏细胞图；

图40是本发明试验例6中阳性药组肝脏细胞图；

图41是本发明试验例6中实施例2肝脏细胞图；

图42是本发明试验例6中实施例3肝脏细胞图；

图43是本发明试验例6中实施例4肝脏细胞图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1） 总RNA 提取和反转录

以Total RNA 提取试剂RNAiso Plus 提取AtD-SAT酵母的总RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，利用核酸定量仪测定其浓度和纯度，取1 μ g 总RNA，以AOLP 为引物：5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACT16 （G/A/C）- 3' 反转录合成cDNA；

2） 基因克隆、重组表达载体的构建及电转化

根据酵母转录组序列信息，设计特异引物DBTN F：AGCAATGGTG GAAGAGTAAA，以cDNA 为模板进行扩增；根据酵母AtD-SAT基因编码成熟肽序列设计引物，在引物5' 端分别引入酶切位点Eco RI 和Xba I；

上游引物P1 ：5'- CGGGAATTCATGTCGTGTGAAGAACTG - 3'；

下游引物P2 ：5'- CTAGTCTGAGGATCCCATCCCCATACTC - 3' ；

以酵母的cDNA 为模板，以引物P1 和P2 进行目的片段的PCR 扩增，回收目的片段后用Eco RI 和Xba I 进行双酶切；将双酶切后的目的片段连接至经Eco RI 和Xba I双酶切后的pPICZ-DSAT载体，将其转化大肠杆菌感受态Trans- T- 1 中，筛选阳性克隆；将表达载体pPICZ-DSAT用Sac I 线性化后电转化入毕赤酵母感受态中，平行设置pPICZ-DSAT载体为对照；电转化后将转化子涂布在MD 平板上，所含物质的质量浓度分别为无氨基酸酵母氮源基础培养基YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，将平板置于30℃培养箱培养，直至出现单个菌落，此菌落即为目标酵母菌——AtD-SAT酵母菌株；

3） 遗传霉素筛选及PCR

鉴定转化子 利用无菌水重悬酵母重组子，将酵母重组子分别涂布于含有不同遗传霉素浓度（0、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）的YPD 平板上；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，于30℃培养；待不同遗传霉素条件下长出单克隆菌落后，在对应的遗传霉素条件下进行划线培养；挑取菌落为模板，以P1和P2，pPICZ-DSAT 载体上的5' AOX1（5'- GACTGGTTCCAATTGACAAGC- 3'）和P2 为引物，分别进行PCR 扩增鉴定各转化子插入情况；

4） 重组pPICZ-DSAT的诱导表达、蛋白检测及分离纯化

将阳性重组子置于BMGY 培养基中；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20g/L、磷酸钾缓冲液（pH 6.0）100mL/L、YNB13.4g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 mL/L；在30℃200 r/min 条件下培养，当OD 600 =0.4~0.8 时收集菌体并重悬于BMMY 培养基中：所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸钾缓冲液（pH6.0）100 mL/L、YNB13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L；于30℃下200 r/min 培养，每间隔24 h添加无水甲醇，使其终浓度为0.5%。诱导96 h 后收集发酵上清液进行Tricine- SDS- PAGE 分析，并以抗His 标签兔多克隆抗体为一抗，以山羊抗兔抗体为二抗对表达产物进行Western Blot检测；按照His 标签蛋白纯化试剂说明书对带有6×His 标签的小分子肽进行纯化，并用牛血清蛋白BSA 作为对照，Bradford 法测定蛋白的浓度。结果表明pPICZ-DSAT可以稳定表达，且可高效表达蛋氨酸。

5）PCR检测结果

结果如图1，我们可以看到转基因酵母菌住中表达出一段822bp的DNA片段，且空白对照没有，证明目的基因可以在菌株中稳定存在。

实施例2

1）称量黑豆3kg、黑花生3kg、黑芝麻 1kg、黑米1kg、黑桑葚1kg、、黑木耳500g和黑枸杞100g以流动的水洗净，并破壁研磨，加入3.4-3.5kg白糖后迅速倒入发酵罐中；

2）将1）中的物料121摄氏度，20min灭菌后，向发酵罐中加总物料体积3.5－4倍的无菌水后搅拌均匀；

3）25－30摄氏度，加入实施例1所述的AtD-SAT转基因酵母菌株2.3-2.8g，密封3天进行发酵；

4）将步骤3）中的发酵液温度升至50-55℃，加入木瓜素酶2.3-2.8g，反应pH6.0－7.0，反应18—24h；

5）分别装入离心筒中离心，3000－5000r/min，20-30min，将上清和沉淀分别保存，取上清即得。

实施例3

1）称量黑豆2kg、黑花生2kg、黑芝麻 1kg、黑米1kg、黑桑葚1kg、、黑木耳500g和黑枸杞100g以流动的水洗净，并破壁研磨，加入3.4-3.5kg白糖后迅速倒入发酵罐中；

2）将1）中的物料121摄氏度 20min灭菌后，向发酵罐中加总物料体积3.5－4倍的无菌水，用消毒后搅拌均匀；

3） 25-28摄氏度条件下，加入实施例1所述的AtD-SAT转基因酵母菌株2.3-2.8g，密封3天进行发酵；

4）将步骤3）中的发酵液温度升至50-55℃，加入木瓜素酶2.3-2.8g，反应pH6.0－7.0，反应18—24h；

5）分别装入离心筒中离心，6000－7000r/min，20-30min，将上清和沉淀分别保存，取上清即得。

实施例4

1）称量黑豆2kg、黑花生2kg、黑芝麻 1.5kg、黑米1kg、黑桑葚1kg、、黑木耳500g和黑枸杞100g以流动的水洗净，并破壁研磨，加入3.4-3.5kg白糖后迅速倒入发酵罐中；

2）将1）中的物料121摄氏度 20min灭菌后，向发酵罐中加总物料体积3.5－4倍的无菌水，用消毒后搅拌均匀；

3） 25-28摄氏度条件下，加入实施例1所述的AtD-SAT转基因酵母菌株2.3-2.8g，密封3天进行发酵；

4）将步骤3）中的发酵液温度升至50-55℃，加入木瓜素酶2.3-2.8g，反应pH6.0－7.0，反应18—24h；

5）分别装入离心筒中离心，6000－7000r/min，20-30min，将上清和沉淀分别保存，取上清即得。

实施例5

1） 黑色食物发酵液中的小分子肽的乙醇分级提取

将 200 mL 黑色食物小分子肽（实施例2、实施例3、实施例4制备的产物采用凝胶色谱法测定肽分子量分布，检测证明多肽分子量在1～5KDa）浓缩至 100 mL，然后加入 67 mL食用级无水乙醇后常温搅拌 30 min，离心（8000 r/min，15 min）得沉淀物 1 和上清液 1，取沉淀物 1 冻干，命名为 E-1；将上一步中离心后所得上清液继续与 80 mL 酒精混合配成 60%酒精含量的溶液，常温搅拌 30 min 并离心（8000 r/min，15 min）得沉淀物 2 和上清液 2，取沉淀物2 冻干，命名为 E-2；同理，将上清液 2 加入 200 mL 酒精使得乙醇最终浓度为 80%，以同等条件搅拌、离心得到沉淀物 3 冻干，命名为 E-3，并将最后剩余的上清液 3 冻干后命名为 E-4。

2） 多肽含量测定

采用福林酚-比色法进行肽含量的测定。标准曲线的测定，配置浓度为 1 mg/mL BSA（牛血清蛋白）母液，然后分别移取 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 以及 1 mL 的 BSA 母液于试管中，以纯水稀释至 1 mL，振荡均匀后加入 5 mL 福林酚试剂甲，之后迅速振荡混合均匀，并在室温（25 °C）下放置 10 min，之后往每根管中依次加入 0.5 mL 的福林酚试剂乙，迅速震荡混合均匀并在 25°C 下静置 30 min，以未加蛋白溶液的样品为空白对照在 500 nm处测定其吸光度值，并绘制标准曲线。样品的测定，参照标准曲线的绘制方法，将从浓缩后的 100 mL 黑色食物发酵液在1）中分离出的上清液和沉淀部分冻干，称重，测定样品中的多肽总含量。结果如表1所示，取未转入AtD-SAT基因的酵母菌株，作为对照，发现AtD-SAT酵母菌株中的小肽含量是为转入AtD-SAT基因的酵母菌株的两倍之多：

表1 黑色食物发酵液中多肽含量测定

3） 肽分子量测定

采用凝胶色谱法测定肽分子量分布：

表2 黑色食物发酵液中肽分子量分布测定

一、黑色食物及其有效成分修复四氯化碳引起的肝纤维化肝损伤试验

试验例1

（1） 材料

小分子肽：实施例2、实施例3、实施例4制备的产物；

四氯化碳，国药集团。

肝爽颗粒，保定天浩制药有限公司。

GOT试剂盒，南京建成生物工程公司。

GPT试剂盒，南京建成生物工程公司。

SOD试剂盒，南京建成生物工程公司。

MDA试剂盒，南京建成生物工程公司。

BCA试剂盒，南京建成生物工程公司。

SPF级KM小鼠：雄性，体质量（22～25）g，由吉林大学第一医院实验动物中心提供。

（2）造模给药

给予正常饮食，饲养6周。正常组注射与模型组相同比例的花生油；CCl4模型组采用腹腔注射法注射0.5％的CCl4－花生油注射液（0.75ml CCl4原液加入149.25ml花生油配成0.5％的慢性CCl4注射液），10μL／g，1次／3d，每天选择固定的时间注射，连续注射6周。灌胃和注射同时进行，先灌胃再腹腔注射。每周称量小鼠体重，严格按照体重注射CCl4注射液，及时更换垫料以保证小鼠健康。每天观察动物特征、行为活动等。

末次灌胃后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，用于GOT、GPT试剂盒测定。脱颈处死后快速取出小鼠肝脏，一部分肝脏用福尔马林固定，用于HE观察；余下肝脏精确称重0.1g，按照1:9加入生理盐水研磨后离心，取上清进行BCA、MDA、SOD试剂盒的测定。

（3）HE染色实验检验药物对肝脏影响

①组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

②准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

③迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

④待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

⑤蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切。

⑥取出切片，采用免疫组化试剂盒染色，显微镜观察检验切片组织细胞状态并拍照。

实验结果见图1-4，血清中GOT、GPT是肝损伤的重要指标。如表1所示，与正常组相比，小鼠在腹腔注射CCl4后，模型组血清中GOT、GPT活性水平显著升高，显示模型组肝组织损伤严重，而阳性药物组的GOT、GPT活性水平与模型组比较有显著差异（P﹤0.01），黑色食物发酵液上清液组的GOT、GPT活性水平与模型组相比有显著性差异（P﹤0.05）。

SOD是机体内的抗氧化酶之一，其活性的大小可以在一定范围内反映机体损伤的程度。如图3所示，与正常组比较，模型组SOD活性显著降低，表明模型组肝组织损伤严重，而阳性药物组、黑色食物发酵液上清液组的SOD活性较模型组均有明显的增加，其可使肝脏内的抗氧化能力增强。

MDA是脂质化氧化的最终产物，若机体肝损伤越严重，肝脏内MDA含量越高。如图4模型组与正常组相比，MDA含量显著升高，且具有显著性差异。黑色食物发酵液上清液组MDA含量较模型组有着明显降低，说明黑色食物发酵液上清液组可以抑制MDA产生，从而减少了MDA分解所引起的肝细胞损伤，这也说明黑色食物发酵液上清液有助于增强肝脏的抗氧化能力：

表3 黑色食物小分子肽对四氯化碳致肝纤维化小鼠肝脏SOD、MDA的影响

注：与模型组相比，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。

表4 黑色食物发酵液对四氯化碳致肝纤维化小鼠血清生化指标的影响

注：与模型组相比，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01

试验结果表明，本发明黑色食物小分子肽可以有效改善肝损伤小鼠的脂质过氧化程度， 对小鼠的慢性肝损伤有着治疗和保护作用。

二、黑色食物及其有效成分修复酒精性肝损伤引起的肝损伤试验

试验例2

（1）材料

小分子肽：实施例2、3、4制备的黑色食物小分子肽；

四氯化碳，国药集团。

肝爽颗粒，保定天浩制药有限公司。

GOT试剂盒，南京建成生物工程公司。

GPT试剂盒，南京建成生物工程公司。

SOD试剂盒，南京建成生物工程公司。

MDA试剂盒，南京建成生物工程公司。

BCA试剂盒，南京建成生物工程公司。

SPF级KM小鼠：雄性，体质量（22～25）g，由吉林大学第一医院实验动物中心提供。

（2）造模给药

除黑色食物发酵液沉淀组外，其他组给予正常饮食。按照体重将SD大鼠随机分为6组,每组10只:分为正常组、模型组、对照组、黑色食物小分子肽。黑色食物发酵液上清液组按1000ml·kg-1·d-1灌胃;对照组以熊去氧胆酸10 mg·kg-1·d-1灌胃;其余2组灌胃等剂量0.9%Nacl 2.0 m L·d-1,连续给药15 d。一次性灌胃ANIT橄榄油溶液建立肝损伤模型,48 h后取处死。及时更换垫料以保证小鼠健康。每天观察动物特征、行为活动等。

末次灌胃后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，用于GOT、GPT试剂盒测定。脱颈处死后快速取出小鼠肝脏，一部分肝脏用福尔马林固定，用于HE观察。

（3）HE染色实验检验药物对肝脏影响

①组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

②准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

③迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

④待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

⑤蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切。

⑥取出切片，采用免疫组化试剂盒染色，显微镜观察检验切片组织细胞状态并拍照。

实验结果见图2-19，健康组中肝小叶内肝细胞及肝细胞索清晰，肝细胞胞质饱满。模型组部分肝小叶内肝细胞及肝细胞索不清晰，肝细胞萎缩可见肝细胞浊肿、气球样变，炎细胞浸润。阳性药组、黑色食物发酵液上清液组及固体沉淀组偶见肝细胞浊肿、气球样变，炎细胞浸润。显微结构提示黑色食物发酵液中的小分子肽及其有效成分对受损的肝细胞具有一定的抗炎和修复作用。

试验例3

（1）酒精诱导小鼠急性肝损伤模型的建立

小鼠正常饲养 5d后，常规照射日光，随机分成正常对照组，酒精模型组，葵花盘粉提取物低浓度给药组(100mg/kg)、高浓度给药组(200mg/kg)，每组分小鼠10 只。其中正常对照组和酒精模型组小鼠每天灌胃生理盐水，实验组小鼠每天灌胃等剂量的黑色食物发酵液，连续灌胃给药20d。在末次给药2h后，除正常对照组灌胃等量生理盐水外，各组灌胃 56°红星二锅头 15m L/kg 1次。各组均于末次给药后禁食不禁水。

（2）生化指标检测

各组小鼠禁食 16h 后，摘除眼球取血，分离血清备测；同时，颈椎脱臼处死小鼠，立即破腹取肝脏，用4℃生理盐水洗尽残血、除去结缔组织、滤纸拭干，称质量，计算肝脏指数（肝指数=肝脏质量/体质量）；称取0.5g肝脏，加入一定量的生理盐水，匀浆后，按试剂盒说明书方法测定肝组织中 MDA、蛋白质含量和活力，血清中 SOD 酶、A L T 、A S T活力。

与正常组比较，模型组小鼠肝脏中 SOD 活性降低，而MDA含量明显升高，有极显著的统计学差异(P＜0.01)，说明酒精致小鼠急性肝损伤模型建立成功。结果显示，与模型组比较，实施例2、3、4组能显著提高小鼠酒精肝损伤的肝脏 SOD 活性，；实施例2、3、4组中MDA的含量与模型组相比下降较明显(P＜0.05或P＜0.01)，且随着给药浓度的提高MDA 的含量也降低，具有剂量依赖性。

与正常组相比，酒精致急性肝损伤模型组小鼠血清中的AST和ALT水平显著升高(P＜0.01)。与模型组相比，实施例2、3、4组中小鼠血清中的AST和ALT水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，AST活力分别下降到129.42和107.82（U/L），ALT活力分别下降到148.54和127.42（U/L）。碱性磷酸酶（ALP）是肝脏炎症反应的重要指标，与模型组相比，实施例2、3、4组中小鼠血清中的ALP水平明显降低(P＜0.01)，随着给药剂量的增加，实施例2、3、4组呈现出 ALP 水平逐渐下降的趋势，具有剂量依赖性。

表5 黑色食物发酵液对酒精致急性肝损伤小鼠血清生化指标的影响

注：与模型组相比，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。

表6 黑色食物发酵液对酒精致急性肝损伤小鼠肝脏 SOD、MDA的影响

注：与模型组相比，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。

（3）肝组织病理切片

取不同组的小鼠肝组织，用 4℃生理盐水冲尽残血，滤纸拭干，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，苏木素 - 伊红(HE)染色后，显微镜下观察肝组织切片的病理形态学变化。

黑色食物发酵液对酒精致急性肝损伤小鼠肝脏病理改变的影响正常对照组肝脏组织结构正常，肝细胞圆润、饱满、完整，排列整齐，中央静脉正常完整，没有严重的炎症细胞浸润现象，肝细胞胞浆均匀，肝细胞核仁清晰。模型组小鼠的肝脏切片中肝组织破坏严重，具有肝细胞肿大现象，胞浆疏松，肝细胞排列紊乱，汇管区炎症细胞浸润等现象；实施例2、3、4组小鼠肝组织细胞破坏现象有所缓解，细胞浸润现象得到很大程度减轻，高浓度给药组小鼠肝细胞排列较整齐，除少量炎症细胞之外，与正常组相差不多，说明黑色食物发酵液对酒精导致的急性肝损伤有一定的保护作用。

二、黑色食物及其有效成分修复代谢性疾病引起的肝损伤试验

试验例5

（1）材料

小分子肽：实施例2、实施例3、实施例4制备的产物；

四氯化碳，国药集团。

肝爽颗粒，保定天浩制药有限公司。

GOT试剂盒，南京建成生物工程公司。

GPT试剂盒，南京建成生物工程公司。

SOD试剂盒，南京建成生物工程公司。

MDA试剂盒，南京建成生物工程公司。

BCA试剂盒，南京建成生物工程公司。

SPF级KM小鼠：雄性，体质量（22～25）g，由吉林大学第一医院实验动物中心提供。

（2）造模给药

给予正常饮食，饲养7天。连续灌胃7天，第7天正常组注射与模型组相同比例的花生油；CCl4模型组采用腹腔注射法注射0.5％的CCl4－花生油注射液（0.75ml CCl4原液加入149.25ml花生油配成0.5％的慢性CCl4注射液），10μL／g。每周称量小鼠体重，严格按照体重注射CCl4注射液，及时更换垫料以保证小鼠健康。每天观察动物特征、行为活动等。

末次灌胃后禁食不禁水18 h，摘眼球取血，用于GOT、GPT试剂盒测定。脱颈处死后快速取出小鼠肝脏，一部分肝脏用福尔马林固定，用于HE观察；余下肝脏精确称重0.1g，按照1:9加入生理盐水研磨后离心，取上清进行BCA、MDA、SOD试剂盒的测定。

（3）HE染色实验检验药物对肝脏影响

①组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

②准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

③迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

④待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

⑤蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切。

⑥取出切片，采用免疫组化试剂盒染色，显微镜观察检验切片组织细胞状态并拍照。

实验结果见图1-4，血清中GOT、GPT是肝损伤的重要指标。如表1所示，与正常组相比，小鼠在腹腔注射CCl4后，模型组血清中GOT、GPT活性水平显著升高，显示模型组肝组织损伤严重，而阳性药物组的GOT、GPT活性水平与模型组比较有显著差异（P﹤0.01），黑色食物发酵液上清液组的GOT、GPT活性水平与模型组相比有显著性差异（P﹤0.05）。

SOD是机体内的抗氧化酶之一，其活性的大小可以在一定范围内反映机体损伤的程度。如图3所示，与正常组比较，模型组SOD活性显著降低，表明模型组肝组织损伤严重，而阳性药物组、黑色食物发酵液上清液组的SOD活性较模型组均有明显的增加，其可使肝脏内的抗氧化能力增强。

MDA是脂质化氧化的最终产物，若机体肝损伤越严重，肝脏内MDA含量越高。如图4模型组与正常组相比，MDA含量显著升高，且具有显著性差异。黑色食物发酵液上清液组MDA含量较模型组有着明显降低，说明黑色食物发酵液上清液组可以抑制MDA产生，从而减少了MDA分解所引起的肝细胞损伤，这也说明黑色食物发酵液上清液有助于增强肝脏的抗氧化能力。

表7 黑色食物小分子肽对四氯化碳致肝纤维化小鼠肝脏SOD、MDA的影响：

注：与模型组相比，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。

表8 黑色食物发酵液对四氯化碳致肝纤维化小鼠血清生化指标的影响：

注：与模型组相比，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01

试验结果表明，本发明黑色食物小分子肽可以有效改善肝损伤小鼠的脂质过氧化程度， 对小鼠的慢性肝损伤有着治疗和保护作用：

实验结果见图38-43，健康组中肝小叶内肝细胞及肝细胞索清晰，肝细胞胞质饱满。模型组部分肝小叶内肝细胞及肝细胞索不清晰，肝细胞萎缩可见肝细胞浊肿、气球样变，炎细胞浸润。阳性药组、黑色食物发酵液上清液组及固体沉淀组偶见肝细胞浊肿、气球样变，炎细胞浸润。显微结构提示黑色食物发酵液中的小分子肽及其有效成分对受损的肝细胞具有一定的抗炎和修复作用。

本发明黑色食物小分子肽及其有效成分在制备修复肝损伤药物中的应用，黑色食物小分子肽及其有效成分可以起到抗炎，消肿作用，同时对不同原因引起的肝脏受损细胞有良好的修复效果。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林大学

吉林省碧泉健康食品开发有限责任公司

<120> 黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 822

<212> DNA

<213> AtD-SAT转基因酵母菌(酵母菌)

<400> 1

atgtcgtgtg aagaactgga aattgtctgg aacaatatta aagccgaagc cagaacgctg 60

gcggactgtg agccaatgct ggccagtttt taccacgcga cgctactcaa gcacgaaaac 120

cttggcagtg cactgagcta catgctggcg aacaagctgt catcgccaat tatgcctgct 180

attgctatcc gtgaagtggt ggaagaagcc tacgccgctg acccggaaat gatcgcctct 240

gcggcctgtg atattcaggc ggtgcgtacc cgcgacccgg cagtcgataa atactcaacc 300

ccgttgttat acctgaaggg ttttcatgcc ttgcaggcct atcgcatcgg tcactggttg 360

tggaatcagg ggcgtcgcgc actggcaatc tttctgcaaa accaggtttc tgtgacgttc 420

caggtcgata ttcacccggc agcaaaaatt ggtcgcggta tcatgcttga ccacgcgaca 480

ggcatcgtcg ttggtgaaac ggcggtgatt gaaaacgacg tatcgattct gcaatctgtg 540

acgcttggcg gtacgggtaa atctggtggt gaccgtcacc cgaaaattcg tgaaggtgtg 600

atgattggcg cgggcgcgaa aatcctcggc aatattgaag ttgggcgcgg cgcgaagatt 660

ggcgcaggtt ccgtggtgct gcaaccggtg ccgccgcata ccaccgccgc tggcgttccg 720

gctcgtattg tcggtaaacc agacagcgat aagccatcaa tggatatgga ccagcatttc 780

aacggtatta accatacatt tgagtatggg gatgggatct aa 822

<210> 2

<211> 273

<212> PRT

<213> AtD-SAT转基因酵母菌(酵母菌)

<400> 2

Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Ser Asn Ile Lys Ala Glu

1 5 10 15

Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His

20 25 30

Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met

35 40 45

Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg

50 55 60

Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser

65 70 75 80

Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp

85 90 95

Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln

100 105 110

Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu

115 120 125

Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile

130 135 140

His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr

145 150 155 160

Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile

165 170 175

Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg

180 185 190

His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile

195 200 205

Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser

210 215 220

Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro

225 230 235 240

Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met

245 250 255

Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly

260 265 270

Ile

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 上游引物(人工序列)

<400> 3

cgggaattca tgtcgtgtga agaactg 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 下游引物(人工序列)

<400> 4

ctagtctgag gatcccatcc ccatactc 28

Claims (6)

1. 一种AtD-SAT转基因酵母菌株，基因序列如SEQ No.1所示。

2. 如权利要求1所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株的制备方法制备，包括以下步骤：

1） 总RNA 提取和反转录

以Total RNA 提取试剂RNAiso Plus 提取AtD-SAT酵母的总RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，利用核酸定量仪测定其浓度和纯度，取1 μ g 总RNA，以AOLP 为引物：5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACT16 （G/A/C）- 3' 反转录合成cDNA；

2） 基因克隆、重组表达载体的构建及电转化

根据酵母转录组序列信息，设计特异引物DBTN F：AGCAATGGTG GAAGAGTAAA，以cDNA 为模板进行扩增；根据酵母AtD-SAT基因编码成熟肽序列设计引物，在引物5' 端分别引入酶切位点Eco RI 和Xba I；

上游引物P1 ：5'- CGGGAATTCATGTCGTGTGAAGAACTG - 3'；

下游引物P2 ：5'- CTAGTCTGAGGATCCCATCCCCATACTC - 3' ；

以酵母的cDNA 为模板，以引物P1 和P2 进行目的片段的PCR 扩增，回收目的片段后用Eco RI 和Xba I 进行双酶切；将双酶切后的目的片段连接至经Eco RI 和Xba I双酶切后的pPICZ-DSAT载体，将其转化大肠杆菌感受态Trans- T- 1 中，筛选阳性克隆；将表达载体pPICZ-DSAT用Sac I 线性化后电转化入毕赤酵母感受态中，平行设置pPICZ-DSAT载体为对照；电转化后将转化子涂布在MD 平板上，所含物质的质量浓度分别为无氨基酸酵母氮源基础培养基YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，将平板置于30℃培养箱培养，直至出现单个菌落，此菌落即为目标酵母菌——AtD-SAT酵母菌株；

3） 遗传霉素筛选及PCR

鉴定转化子 利用无菌水重悬酵母重组子，将酵母重组子分别涂布于含有不同遗传霉素浓度（0、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）的YPD 平板上；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，于30℃培养；待不同遗传霉素条件下长出单克隆菌落后，在对应的遗传霉素条件下进行划线培养；挑取菌落为模板，以P1和P2，pPICZ-DSAT 载体上的5' AOX1（5'- GACTGGTTCCAATTGACAAGC- 3'）和P2 为引物，分别进行PCR 扩增鉴定各转化子插入情况；

4） 重组pPICZ-DSAT的诱导表达、蛋白检测及分离纯化

将阳性重组子置于BMGY 培养基中；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20g/L、磷酸钾缓冲液（pH 6.0）100mL/L、YNB13.4g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 mL/L；在30℃200 r/min 条件下培养，当OD 600 =0.4~0.8 时收集菌体并重悬于BMMY 培养基中：所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸钾缓冲液（pH6.0）100 mL/L、YNB13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L；于30℃下200 r/min 培养，每间隔24 h添加无水甲醇，使其终浓度为0.5%；

诱导96 h 后收集发酵上清液进行Tricine- SDS- PAGE 分析，并以抗His 标签兔多克隆抗体为一抗，以山羊抗兔抗体为二抗对表达产物进行Western Blot 检测；按照His 标签蛋白纯化试剂说明书对带有6×His 标签的小分子肽进行纯化，并用牛血清蛋白BSA 作为对照，Bradford 法测定蛋白的浓度。

3.如权利要求1所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株在制备黑色食物小分子肽中的用途。

4. 一种丝氨酸乙酰转移酶，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

5.一种黑色食物小分子肽，其特征在于：是由上述的AtD-SAT转基因酵母菌株发酵所得，主要活性成分为含有权利要求4所述的一种丝氨酸乙酰转移酶。

6.一种黑色食物小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1）称量黑芝麻 10-15份、黑米10-15份、黑豆20-30份、黑枸杞1-5份、花生20-30份、黑木耳5-10份和黑桑葚10-15份以流动的水洗净，并破壁研磨，加入30-40份白糖后迅速倒入发酵罐中；

2）向发酵罐中加总物料体积3.5－4倍的无菌水，用消毒后搅拌均匀；

3）25-30摄氏度条件下，加入权利要求1所述的AtD-SAT转基因酵母菌株0.02-0.03份密封3天进行发酵；

4）步骤3）中的发酵液温度升至55-65℃，加入木瓜蛋白酶0.02-0.03份， pH6.0－7.0，反应18－24h；

5）分别装入离心筒中离心，3000－5000r/min，20-30min，将上清和沉淀分别保存，取上清即得。