CZ126998A3 - Způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu - Google Patents
Způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ126998A3 CZ126998A3 CZ981269A CZ126998A CZ126998A3 CZ 126998 A3 CZ126998 A3 CZ 126998A3 CZ 981269 A CZ981269 A CZ 981269A CZ 126998 A CZ126998 A CZ 126998A CZ 126998 A3 CZ126998 A3 CZ 126998A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cysteine
- cyse
- serine
- seq
- sequence
- Prior art date
Links
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 166
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 27
- VZXPDPZARILFQX-SCSAIBSYSA-N o-acetylserine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](N)C(O)=O VZXPDPZARILFQX-SCSAIBSYSA-N 0.000 title 1
- 108091022908 Serine O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims abstract description 53
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 53
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 17
- VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N O-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 60
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 claims description 42
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 39
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 31
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 17
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 11
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 10
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical group [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical group NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims 1
- ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N levomefolic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N 0.000 claims 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 239000007858 starting material Substances 0.000 abstract description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 40
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 8
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 8
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 8
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 8
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 8
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 7
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000595586 Coryne Species 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 101150029709 cysM gene Proteins 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 3
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 3
- -1 β-alanyl Chemical group 0.000 description 3
- ZNAIHAPCDVUWRX-DUCUPYJCSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;4-amino-n-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-t Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O ZNAIHAPCDVUWRX-DUCUPYJCSA-N 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 101150058227 cysB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MFMJRYHVLLEMQM-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N MFMJRYHVLLEMQM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 235000007575 Calluna vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N Cys-Asp Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102100037579 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N His-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N 0.000 description 1
- NBWATNYAUVSAEQ-ZEILLAHLSA-N His-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O NBWATNYAUVSAEQ-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N L-cysteine sulfonic acid Natural products OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WRXOPYNEKGZWAZ-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Cys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WRXOPYNEKGZWAZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010038555 Phosphoglycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- NOKPBJYHPHHWAN-REOHCLBHSA-N S-sulfo-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSS(O)(=O)=O NOKPBJYHPHHWAN-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- KJKQUQXDEKMPDK-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KJKQUQXDEKMPDK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 101150094831 cysK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112941 cysK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 210000003284 horn Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003464 sulfur compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000004764 thiosulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká způsobu výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a od něj odvozených sloučenin obsahujících síru.
Dosavadní stav techniky
L-cystein a jeho deriváty se používají ve farmacii (ošetřování bronchiálních onemocnění), v kosmetice (jako součást vlasových šamponů a přípravků pro trvalou ondulaci) a v potravinářství (jako antioxidans, zesilovač chutě a jako adjuvans při zpracování těsta). L-cystein se dosud získává extrakcí z materiálů obsahujících keratin, jako vlasy, štětiny, rohy, kopyta a pera nebo enzymatickou přeměnou prekurzorů. Nadprodukce L-cysteinu mikroorganismy je velmi žádoucí, protože hospodářsky zajímavou sloučeninou je nejenom L-cystein, ale protože navíc představuje, jak vyplývá z obrázků 1-3, důležitou mezisloučeninou pro syntézu glutathionu, methioninu a biotinu.
L-cystein zaujímá ve všech organismech klíčovou pozici při metabolismu síry a používá se při syntéze proteinů, glutathionu, biotinu, methioninu a dalších metabolitů obsahujících síru. Navíc slouží L-cystein jako prekurzor pro biosyntézu koenzymu A, navíc se může L-cystein snadno oxidovat na cystin. Mezi biosyntézou L-cysteinu a dalších
1« ·
-2.4 4 β β 4 4 *
ί .!
j
* aminokyselin jako L-serin, glycin a L-methionin existuje úzká souvislost.
Syntéza L-cysteinu (obrázek 4) v prokaryontech, obzvláště bakteriích, je podrobně prozkoumána (Kredich,
N.M. a G.M.Tomkins 1966, J.Bio.Chem. 241, 4955-4965;
Kredich, N.M., 1987, Biosynthesis of Cysteine. V : Neidhardt F.C., Ingraham, J.L., Magasanik Β. , Low. K.B., Schaechter Μ., Umbarger H.E. (eds) Escherichia Coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, Vol. 1 American Society for Microbiology, Washington D.C. , 419-428). Klíčová reakce spočívá v přenosu acetylové skupiny na serin k přípravě O-acetylserinu 1), následovaná výměnou acetylové skupiny za skupinu -SH, čímž se syntetizuje L-cystein 2).
1) L-serin + acetyl-koenzym A -> O-acetylserin + koenzym A
2) O-acetylserin + H2S -> L-cystein + acetát
V mikroorganismech a v rostlinách slouží O-acetylserin a nikoliv serin jako přestupeň uhlíkové struktury pro L-cystein (Kredich, N.M. a G.M.Tomkins 1966, J.Biol.Chem. 241, 4955-4965). Reakce přenosu acetylové skupiny ke tvorbě aktivované formy L-serinu se katalyzuje serin-acetyltransferázou kodovanou genem cysE (EC 2.3.1.30) a podléhá striktní kontrole konečným produktem, L-cysteinem. Gen pro serin-acetyltransferázu byl již klonován a sekvence aminokyselin odvozená od sekvence DNA je známá (Denk, D. a Bóck, A; 1987, J.Gen.Microbiol. 133, 515-525).
Tvorba L-cysteinu samotného je katalyzována dvěma isoenzymy O-acetylserin-sulfohydrolázy (EC 4.2.99.8), kódovanými geny cysK (O-acetylserin-sulfhydroláza-A) a cysM
000··· · · · · 0 ·· — 3 — · · · · · · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 · ···· 9 ··· 9 9
0 · · · · 0 · ···· 9 99 9 99 99 (O-acetylserin-sulfhydroláza-B) , reakce, ve které funguje O-acetylserin jako donor β-alanylu a H2S jako akceptor β-alanylu (Kredich, N.M. a G.M.Tomkins 1966, J.Biol.Chem, 241, 4955-4965), přičemž O-acetylserin-sulfhydroláza-A má hlavní podíl na syntéze cysteinu. Navíc je O-acetylserinsulfhydroláza-B (cysM) schopná využít thiosulfát jako zdroj síry (Sirko, A. a spol, J.Gen.Microbiol. 133, 2719-2725). O-acetylserin-sulfhydroláza-B katalyzuje reakci mezi O-acetylserinem a thiosulfátem za vzniku S-sulfocysteinu, který se pak může konvertovat na cystein (Nakamura, T. a spol. 1983, J.Bacteriol. 156, 656- 662).
Potlačení konečného produktu formy divokého typu serin-acetyltransferázy L-cysteinem je fyziologicky významným faktorem při kinetické regulaci biosyntézy cysteinu (Kredich, N.M. 1971, J.Biol.Chem. 246, 3474-3484; Kredich, N.M. a G.M.Tomkins 1966, J.Biol.Chem. 241, 4955-4965). Aktivita divokého typu serin-acetyltransferázy je potlačena cysteinem. Toto potlačeni bylo kineticky vyšetřováno a vykazuje kompetitivní charakteristiku. Byla stanovena inhibiční konstanta K^ = 1,1 x ÍO-^ jj v přítomnosti 0,1 mM acetyl-koenzymu A a 1 mM L-serinu (Kredich, N.M. a G.M. Tomkins 1966, J.Biol.Chem. 241, 4955-4965).
Z literatury je znám příklad, že se chemickou mutagenezí cystein-auxotrofního kmene ethylesterem kyseliny methansulfonové může izolovat cystein-prototrofní revertant, jehož serin-acetyltransferázová aktivita na základě výměny aminokyselin v kódované oblasti vykazuje mírné potlačení inhibiční aktivity konečným produktem L-cysteinem (Denk, D., Bóck, A., 1987, J.Gen.Microbiol. 133, 515-525). Feedbackrezistence těchto mutantů je podle známých literárních pramenů desetinásobně zvýšena. K^ těchto mutantů tak činí asi
-4• · · .9 9'
0,01 mM oproti formě divokého typu.
Předložený vynález se týká serin-acetyltransferáz, které ve srovnáni s divokým typem enzymu vykazuj i sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a jejichž proteinová sekvence ve srovnání se sekvenci divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, vyznačující se tím, že se mutace nachází v sekvenční oblasti aminokyseliny v pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 nebo delece v oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 227, přičemž pozice jedna je iniciační methionin z obrázku 5 (SEQ ID č.·: 1) a přičemž je vyloučena proteinová sekvence s mutací Met na Ile v pozici 256.
Podstata vynálezu
Překvapivě bylo objeveno, že výměny aminokyselin podle vynálezu a/nebo delece aminokyselin karboxylovém konci serin-acetyltransferázy vedou ke snížení citlivosti vůči cysteinu za zachování dostatečné enzymatické aktivity.
Serin-acetyltransferázy podle vynálezu mají s výhodou inhibiční konstantu 0,005 až 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA, přičemž serin-acetyltransferázy s nejméně jednou mutací mají s výhodou inhibiční konstantu 0,015 až 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA, zatímco serin-acetyltransferázy s nejméně jednou delecí na karboxylovém konci, vykazují s výhodou inhibiční konstantu 0,005 až 0,03 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA.
Inhibiční konstanty (K^) obzvláště výhodných mutantů fl fl flflfl· • ·
-5enzymu oproti L-cysteinu leží mezi 0,02 a 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetýl-CoA.
Serin-acetyltransferázy podle vynálezu vykazují dostatečnou aktivitu pro růst mikroorganismů, které ji obsahuj i.
S výhodou obsahuje proteinová sekvence serin-acety1transferázy podle vynálezu výměnu aminokyselin nejméně j ednoho cysE mutantu uvedeného v tabulce la nebo lb.
Ji
-6······ · · · · · ·· • · · 4 * · 4 4 4 4
4 4 4 44 4 4 4 4
4 44 444444 4444 4
4 444 444
6 0 0 0' 49 « 44 44
Tabulka la : Feedback-rezistentní cysE-alely s jednotlivými nebo násobnými výměnami aminokyselin v kódované oblasti
| Mutanty cysE | Výměna nukleotidu^ .) | Výměna aminokyseliny (č.) | Κ±(μΜ) | spec. akt pmol/min x mg |
| cysEII | GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 | 10 | 0,068 |
| cysEIII | GGT->GAT (176) | Glyl65->Aspll65 | 10 | 0,030 |
| cysEIV | GCT->GTT (932) GGC->AGC (934) | Ala237->Val237 Gly238->Ser238 | 40 | 0,170 |
| cysEV | GCT->GTT (932) | Ala237->Val237 | ||
| GGC->AGC (934) ATG->ATA (990) | Gly238->Ser238 Met256->Ile256 | 10 | 0,246 | |
| cysEVI | GGC->AGC (934) ATG->ATA (990) | Gly238->Ser238 Met256->Ile256 | 10 | 0,075 |
| cysEVII | GCT->GTT (932) | Ala237->Val237 | 10 | 0,253 |
| cysEVIII | ATG->ATA (990) GCT->GTT (932) | Met256->Ile256 Ala237->Val237 | 30 | 0,160 |
-Ί-
ee · ·
Tabulka la : Feedback-rezistentní cysE-alely s jednotlivými nebo násobnými výměnami aminokyselin v kódované oblasti (dokončeni)
| Mutanty | Výměna nukleo- | Výměna amino- | Ki(pM) | spec. akt |
| cysE | tidu(č.) | kyseliny (č.) | gmol/min x mg | |
| cysEX | ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | 50 | 0,156 |
| cysEXI | ACG->GCG (721) GGT->AGT (955) | Thrl67->Alal67 Gly245->Ser245 | 700 | 0,117 |
| cysEXII | AAA->CAA (511) GGC->AGC (934) TTT->TTG (1023) | Lys97->Gln97 Gly238->Ser238 Phe267->Leu267 | 40 | 0,254 |
| cysEXIII | GTT->GTT (713) TTT->TTG (1023) | Vall64->Alal64 Phe267->Leu267 | 30 | 0,213 |
| cysEXIV | ACG->GCG (721) ATG->TAG (988+989) | Thrl67->Alal67 Met256->Stop256 | >1000 | 0,453 |
| cysEXVI | GAT->GGT (971) AAG->TAG (973) | Asp250->Gly250 Lys251->Stop251 | 50 | 0,554 |
| cysEXVII | GGT->GAT (716) ACG->GCG (721) | Glyl65- Aspll65 Thrl67- Alal67 | 100 | 0,052 |
| cysEXXIII | ACG->GCG GCT->GTT GGC->AGC | Thrl67- Alal67 Ala237- Val237 Gly238- Ser238 | 2300 | 0,085 |
-8• · • · · · · · · » · · « · · 4 • · · · · · ·4» • ······ · · · · 4 • · · · · 4 •» β β β -e β
Tabulka lb : Feedback-rezistentni cysE-alely s delecemi na karboxylovém konci
| Mutant cysE | Deletované aminokyseliny | Terminální aminokyseliny | Κ±(μΜ) | spec. akt gmol/min x mg |
| cysE-Del259 | 14 | His259 | 7,5 | 0,328 |
| cysE-Del258 | 15 | Gln258 | 5 | 0,256 |
| cysE-Del257 | 16 | Asp257 | 7,5 | 0,394 |
| cysE-Del256 | 17 | Met256 | 12,5 | 0,366 |
| cysE-Del255 | 18 | Asp255 | 30 | 0,624 |
| cysE-Del250 | 23 | Asp250 | 20 | 0,405 |
| cysE-Del249 | 24 | Ser249 | 15 | 0,420 |
| cysE-Del248 | 25 | Asp248 | 12,5 | 0,270 |
Serin-acetyltransferázy insenzitivní vůči cysteinu podle vynálezu se mohou získat příkladně expresí sekvencí DNA, které kódují pro serin-acetyltransferázy podle vynálezu.
Těmito sekvencemi DNA kódované varianty enzymů vykazují vždy rozdílnou citlivost oproti inhibitoru L-cysteinu, přičemž ve všech případech však byla ve srovnání s divokým typem nalezena nejméně pětkrát zvýšená rezistence serinacetyltransf erázy oproti inhibitoru L-cysteinu.
Předložený vynález se dále týká sekvencí DNA, které kódují pro serin-acetyltransferázy podle vynálezu.
Tyto sekvence DNA se vyznačují tím, že v kódované
-9······ ··· ·· • fe ♦ · · β ♦ · · • · · · · · · · · · • · · · · ···· fe ··· · · • β · · · ···
CSC e · fe fe ·· ·· sekvenční oblasti DNA daného genu cysE od bp 510 do bp 1040 vykazují nejméně jednu mutaci, přičemž bp 1 je první báze z obrázku 6 (SEQ ID NQ : 2), přičemž je vyloučena mutace guaninu následujícího po adeninu v pozici 990.
Dále budou sekvence DNA podle vynálezu označovány také jako feedback-rezistentní cysE-alely.
Tyto sekvence DNA je možné vyrobit příkladně nespecifickými nebo cílenými mutagenezními metodami z výchozích materiálů popsaných dále.
Nespecifické mutace v rámci uvedené oblasti DNA se mohou provádět příkladně chemickými agenciemi (příkladně nitrosoguanidin, kyselina ethylmethansulfonová) a/nebo fyzikálními metodami (Miller, J.H., 1972, Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 113-185) a/nebo reakcemi PCR, prováděnými za určitých podmínek (Gibbs, R.A. 1990, Anal.Chem. 62, 1202-1214).
Metody k zavedení mutací ve specifických pozicích v rámci jednoho fragmentu DNA jsou známy a jsou popsány příkladně v následujících pramenech : Sarkar, G., Sommer, S.S., 1990, BioTechniques 8, 404-407 popisují ortospecifické mutageneze podle PCR; Ausubel, F.M. a spol., 1987, s. 8.018.3.6 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, popsány metody k ortospecifické mutagenezi pomocí fágů Ml3 .
Další metodou k výrobě feedback-rezistentní cysEalely spočívá v kombinaci různých bodových mutací, vedoucích k feedback-resistenci k multiplenovým mutantům s novými
0 · 0 · · • 0
-10vlastnostmi .
Jako výchozí materiál pro mutagenese slouží s výhodou
DNA divokého typu genu cysE nebo mutací inaktivovaný gen cysE nebo mutovaný cysE gen j iž kódovaný pro feedbackrezistentni serinacetyltransferázu.
Mutovaný gen cysE může být chromosomálně nebo extrachromosomálně kódovaný.
Výchozí DNA-fragment, příkladně obsahující divoký typ genu cysE, se může rekombinovat známými standardními technikami za vzniku rekombinantní DNA na jednom vektoru. Použitím výše uvedených mutagenezních metod se jeden nebo několik nukleotidů sekvence DNA změní tak, že nyní genem kódovaná sekvence aminokyselin vykazuje nejméně jednu mutaci v sekvenční pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 a nejméně jednu deleci v sekvenční oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 227, přičemž pozice jedna je startovacím methioninem podle obrázku 5 (SEQ ID č.: 1) a přičemž mutace z Met na lle v pozici 256 je vyloučena.
Popsanými technikami je možné zavést do libovolného genu cysE jednu nebo několik mutací v uvedené oblasti DNA, které způsobí, že kódovaná serin-acetyltransferáza má sekvenci aminokyselin vedoucí k insenzitivitě vůči cysteinu.
V návaznosti na provedenou mutagenezí, jak je popsáno výše, se provádí selekce mutantů s požadovaným fenotypem příkladně plátováním na mediu neobsahuj ícím cystein a následným stanovením rozsahu citlivosti mutované serinacetyltransf erázy vůči cysteinu .
• · • · · · • · • 9
-119 · 99 999··· ···· · • · ··· ··· ····· ·· · ·· ··
Dalším předmětem vynálezu jsou mikroorganismy, které obsahují feedback-rezistentní cysE-alely.
Takové kmeny mikroorganismů se vyznačují tím, že obsahuji nejméně jednu cysteinovou výměnu, deregulovanou pomocí feedback-rezistentní cysE-Alle.
Protože látková výměna cysteinu probíhá u všech mikroorganismů principiálně stejným, obecně známým způsobem látkové výměny a techniky použité k výrobě kmenů podle vynálezu j sou obecně známé příkladně ze standardních učebnic a použitelné na všechny mikroorganismy, je možné vyrábět kmeny podle vynálezu z libovolných mikroorganismů.
S výhodou j sou k výrobě kmenů podle vynálezu vhodné bakterie.
Obzvláště výhodné jsou gramnegativní bakterie, obzvláště E. coli.
Dalším předmětem vynálezu je výroba L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu kultivací mikroorganismů podle vynálezu.
Feedback-rezistentní cysE-alely umožňují vyloučení kontroly důležitého biosyntetického kontrolního bodu, přičemž se produkce četných sloučenin ležících ve směru tohoto kontrolního bodu zesiluje. K tomu patří zejména O-acetylserin, L-cystein a produkty příbuzné L-cysteinu. Produkty příbuzné L-cysteinu jsou všechny odvozené od L-cysteinu, to znamená sloučeniny obsahující síru, k jejichž výrobě je L-cystein nezbytný. Příklady takových produktů jsou kyselina 2(R,S)-methyl-thiazolidin-2(R,S),4(R)-dikar·« · • · ·· ··«·
-12boxylová, homocystein, methionin, biotin a glutathion.
Feedback-rezistentní cysE-alely se transformují k expresi se změněným serin-acetyltransferázovým enzymem pomocí obvyklých způsobů na hostitelském kmenu. Screening kmenů se změněnými serin-acetyltransferázovými vlastnostmi se provádí příkladně podle metod popsaných dále.
Ke stanovení míry insenzitivity vůči cysteinu změněného enzymu se nejprve měří vylučování cysteinu kmenů v semikvantitativním tak zvaném křížovém vyživovacím testu.
K tomu se pěstuj í testované kmeny na minimálním mediu neobsahujícím cystein, ale obsahujícím cystein-auxotrofní indikátorový kmen. Růstová zóna indikátorového kmenu okolo dané očkovací linie (halo) slouží jako semikvantitativní míra vylučování cysteinu. Všechny kmeny, které v křížovém vyživovacím testu vykazují odezvu s průměrem > 2 mm, se v křížovém vyživovacím testu označují jako positivní.
S vybranými kmeny se provádí test enzymové aktivity ke stanovení míry cysteinové tolerance změněné serin-acetyltransferázy.
Ke stanovení senzitivity serin-acetyltransferázy vůči cysteinu se může použít každá metoda, která umožňuje stanovit aktivitu tohoto enzymu v přítomnosti cysteinu. Příkladně se může stanovení serin-acetyltrnsferázové aktivity provádět metodou, kterou popsal Kredich a Tomkins v J.Biol.Chem. 241, 4955-4965 (1966). V případě tohoto testu obsahuje enzymová testovací směs substrát L-serin a kofaktor acetyl-koenzym A. Reakce se nastartuje přídavkem enzymu a sleduje na základě poklesu absorpce při 232 nm, který je vyvolán štěpením thioesterové sloučeniny v-acetyl-13• ·· ·
9 9 9 9 9 · « 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9999 9 999 9 ·
9 9 9 9 9 9 9
99999 ·· · ·· ·· koenzymu A pomocí spektrálního fotometru.
Popsaný enzymový test je vhodný ke stanovení senzitivity každého serin-acetyltransferázového enzymu vůči cysteinu, včetně enzymů s modifikovaným karboxylovým koncem. Potlačení serin-acetyltransferázové aktivity se testuje v přítomnosti různých koncentrací L-cysteinu, Katalytická aktivita různých serin-acetyltransferázových enzymů se stanovuje jednak v přítomnosti a jednak v nepřítomnosti L-cysteinu a z výsledků se stanovuje inhibiční konstanta (Kredich, N.M. a G.M.Tomkins 1966, J.Biol.
Chem. 241, 4955-4965).
Ve většině případů je výhodná enzymaticky aktivní serin-acetyltransferáza se sníženou cysteinovou aktivitou. Pro j iné účely může být požadováno současně snížení senzitivity konečného produktu a katalytické aktivity.
Zpravidla není žádoucí silná nadprodukce rezistentní serin-acetyltransferázy jako konečného produktu, protože se přitom ve zvýšené míře tvořený O-acetylserin, L-cystein nebo od něj odvozené metabolity hromadí v buňce, toxifikují ji a mohly by vyvolat selekci mutantů s s redukovanou serinacetyltransf erázovou aktivitou. Proto se s výhodou integrují do genomu cysE-alely feedback-rezistentní s výhodou jako jednotlivá kopie pomocí obvyklých způsobů.
Metody pro integraci jednotlivých genů do chromosomu s pomocí vhodných vektorů odpovídají stavu techniky (příkladně Vinans a spol., 1985, J.Bacteriol. 161, 1219-1221; Shevell a spol., 1988, J.Bacteriol. 170, 3294-3296; Kulakauskas a spol., 1991, J.Bacteriol. 173, 2633-2638).
AA • A «
A · A
-14AA AAAA
AA A • · A · A A • A · A A A
A A AA A AAAA
A A AAA
AAAA A AA A
Rovněž je výhodné exprimovat feedback-rezistentní serin-acetyltransferázy na plasmidech s nízkým počtem kopií.
Jak je známo, vykazuje expresní vektor vedle feedbackrezistentní cysE-alely s výhodou ještě další dodatečné elementy, popsané dále.
Kódované sekvence, nacházející se na vektoru jsou s výhodou spojeny s regulačními elementy, které jsou nutné pro expresi kódovaných sekvencí v požadované míře.
Příklady těchto regulačních elementů jsou promotory, ribosomální spojovací místa a terminální sekvence. Ve většině případů se použijí pro expresi mutantů podle vynálezu přirozené regulační sekvence cysE. Mohou se však použít libovolné jiné regulační sekvence.
Vedle regulačních elementů se s výhodou nacházej i na expresním vektoru také sekvence, které kódují pro selektivní markér a/nebo reporterový gen. Exprese selekčních markérů tohoto druhu usnadňují identifikaci transformantů. Jako selekční markéry jsou vhodné geny, které kódují resistenci vůči příkladně ampicilinu, tetracyklinu, kanamycinu, chloramfenikolu nebo dalším antibiotikiům.
Pokud se mají mutanty podle vynálezu extrachromosomálně replikovat, měl by plasmidový vektor s výhodou obsahovat původní bod replikace. Strategie k integraci genů do chromosomů s pomocí vektorů, z nichž byl· odstraněn původní bod replikace, jsou podle stavu techniky známé (Vinans a spol., 1985, J.Bacteriol. 161, 1219-1221; Shevell a spol.,
1988, J.Bacteriol. 170, 3294-3296; Kulakauskas a spol.,
·· ··«·
-15• · · • ···* ·
·· • · · ·· ··
1991, J.Bacteriol. 173, 2633-2638).
Příklady vektorů, které jsou autonomně replikovatelné na E.coli uvádí příkladně Pouwels, P.H. , Enger-Valk, B.E., Brammer, V.J. 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam.
Takovými vektory jsou příkladně :
plasmidy s vysokým počtem kopií jako příkladně pBR322, pUC18 plasmidy se středním až nízkým počtem kopií jako příkladně pACYC184, pACYC177 a pSCIOl fagové vektory jako příkladně vektory M13.
S výhodou j sou vhodné vektory se středním až nízkým počtem kopií; obzvláště výhodné jsou vektory s replikonem pl5A, jako pACYC184 (ATCC37033) nebo pACYC177 (ATCC37031).
Pro jiné bakterie je rovněž v literatuře popsán velký počet vektorů (Pouwels, P.H., Enger-Valk, B.E., Brammer, V.J. 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam). S těmito vektory j e možná exprese mutantů podle vynálezu na j iné bakterie.
Vhodné rekombinantní vektory se mohou vyrábět standardními technikami pro výrobu rekombinantní DNA. Tyto techniky jsou podrobně uvedeny ve standardních učebnicích.
Vhodný hostitelský kmen se transformuje expresním 'vektorem, který obsahuje transkripční jednotku kódující pro cystein-insenzitivní serin-acetyltransferázu.
Jako hostitelské kmeny se používají kmeny, které
-16obsahuji proteiny senzitivní vůči cysteinu, jako příkladně prokaryonty nebo kvasinky.
S výhodou se použij i kmeny divokého typu nebo kmeny E.coli, ve kterých kterých je endogenní gen cvsE inaktivován a komplementován cvsE genem podle vynálezu. Takové buněčné systémy jsou vhodné pro nadprodukci L-cysteinu a z něj odvozených metabolitů.
Při fermentaci kmenů, obsahujících nejméně jednu feedback-rezistentní cysE-alelu se ukazuje, že kmeny, které přijmou feedback-rezistentní cysE-alelu s hodnotou mezi 0,015 a 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetylCoA vylučují výrazně větší množství cysteinu.
Serin-acetylt-ransf erázy podle vynálezu je možné získávat také použitím antisense-RNA. Blokovat nebo modifikovat cíleně genovou aktivitu tak zvanou reverzní genetikou (Reverse Genetik) odpovídá stavu techniky (Inouye, 1988,
Gene 72, 25-34). Antisense-RNA je transkripční produkt toho řetězce DNA, který je komplementární k řetězci kódujícímu protein. Je možné redukovat senzitivitu serin-acetyltransferázy vůči cysteinu in vivo tím, že se z expresního vektoru produkuje antisense-RNA, která je komplementární k definované oblasti 3 -kódovaného řetězce přirozeného nebo transformovaného genu cvsE. Přitom se antisense-RNA specificky váže na cílové sekvence cvsE-mRNA a umožňuje tím syntézu serin-ačetyltransferázových enzymů podle vynálezu, které jsou na karboxylovém konci zkráceny a-analogicky jako * u deletovaných nutantů z příkladu 3 vykazují sníženou senzitivitu vůči inhibitoru L-cysteinu.
Dalším úkolem bylo dát k dispozici vhodné zdroje síry
-17• · • · » • · · · · ·
pro optimální nadprodukci cysteinu pomocí mikroorganismů podle vynálezu.
Překvapivě bylo objeveno, že intracelulární nadprodukce O-acetylserinu, vyvolaná použitím serin-acetyltransferásových mutantů podle vynálezu ve sloučeninách s vhodným vyživovacím mediem vede k výraznému vzestupu extracelulární koncentrace cysteinu. Na základě toho jsou serin-acetyltransferázové mutanty vhodné k nadprodukci cysteinu.
K tomu musí být pro mikroorganismy podle vynálezu být v produkčním mediu k dispozici dostatečné množství donoru siry.
Vhodnými donory síry pro nadprodukci cysteinu jsou všechny anorganické sloučeniny síry. Váhodné jsou sírany, siřičitany, sulfidy, dithionit a thiosulfáty. Obzvláště výhodný k optimální nadprodukci cysteinu je thiosulfát.
Dalšího zvýšení výtěžku cysteinu se může dosáhnout dodatečnou nadprodukci enzymů redukuj ících sulfáty (kódované pomoci genů cvsD. C, H, G, 1, J) a sulfohydrogenačních enzymů (kódované geny cvsK a cysM).
Další zvýšení výtěžku cysteinu je možné :
a) deregulací regulačního proteinu cysB na genové úrovni ve smyslu konstitutivní exprese. Protein cysB vystupuje ve funkci nadřazeného regulačního proteinu bisyntézy cysteinu v E.coli (Kredich,N.M, 1987, Biosynthesis of Cysteine. V : Neidhardt F.C., Ingraham, J.L., Magasanik, B., Low. K.B., Schaechter, Μ., Umbarger, H.E. (eds) Escherichia
-18«· · · · r ♦ · · ··
coli a Salmonella typhimurium : cellular and molekular biology, Vol.1 American Society for Microbiology, Vashington D.C., 419-428).
b) kombinací genů ser-A, vybraných ze skupiny divokého typu serA a genů serA kódujících pro fosfoglycerátdehydrogenásu se sníženou senzitivitou vůči šeřinu s geny cys-E podle vynálezu.
c) externím dodáváním šeřinu.
S výhodou se gen přirozené serin-acetyltransferázy senzitivní vůči cysteinu v hostitelském kmenu inaktivuje, takže je zaručna pouze syntéza cystein-insezitivní serinacetyltransf erázy zavedené do daného kmenu před transformací. K inaktivaci přirozených genů v E.coli existují četné předpisy (Hamilton a spol, 1989, J.Bacteriol. 171, 46174622; Russel a spol., 1989, J.Bacteriol. 171, 2609-2613;
Shen a Huang, 1986, Genetics 112, 441-457; Jasin a Schimmel, 1984, J.Bacteriol. 159, 783-786).
Rovněž tak výhodná je integrace jedné kopie stejného genu, který kóduje pro změněnou serin-acetyltransferázu do hostitelského genomu.
Popisy a odkazy na tyto techniky lze nalézt v následujících publikacích : Shevell a spol, 1988, J.Bacteriol. 170, 3294-3296; Kulakauskas a spol., 1991, J.Bacteriol. 173, 2633-2638.
S výhodou se klonují cysE-alely o rozdílných na vektor s nižším počtem kopii a transformuje se do odpovídajícího produkčního kmenu.
-19• · · »9 • · ·’ « 9 9 · • · · · « 9 99 • ♦ · tf 99999» · · * * 9 * 9 4 · · · · · ··»· « ·> i »· «·
Vysvětlení obrázků na výkresech
Obrázek 1 zobrazuje biosyntézu glutathionu, vycházející z homoserinu.
Obrázek 2 zobrazuje biosyntézu glutathionu, vycházející z glutamátu.
Obrázek 3 zobrazuje biosyntézu glutathionu, vycházející z dethiobioninu.
Obrázek 4 zobrazuje biosyntézu L-cysteinu v E.coli, vycházející z glukosy.
Obrázek 5 zobrazuje pořadí aminokyselin serin-acetyltransferázy ζΈτοοΙΐ:------------------------------------------------------------Obrázek 6 zobrazuje sekvenci DNA E.coli cysE-genu a od této sekvence odvozenou sekvenci aminokyselin serin-acetyltransferázy.
Obrázek 7 zobrazuje restrikční mapu plasmidu pPl z příkladu 1 obsahující feedback-rezistentní cysE-alely, klonovaný jako 2,25 kb PvuII-fragment v pUC219.
Obrázek 8 zobrazuje plasmid pPC43 z příkladu 2, obsahující divoký typ genu cysE jako 1,15 kb velký fragment EcoRI/BamHI v pBluescript.
• 9 · · • ·
-20• Υ '9
0«
0 •
0 0 0
Obrázek 9 zobrazuje mapu plasmidu pACYC184-LH z příkladu 3 obsahu-, jící feedback-rezistentní cysE-alely s deleci v karboxylovém konci, a z příkladu 4 obsahující feedback-rezistentní cysE-alely s rozdílnými výměnami bází.
Příklady provedení vynálezu
Následuj ící příklady provedení slouží k bližšímu vysvětlení vynálezu :
Přikladl
Isolace mutantů E.coli se serin-acetyltransferázovými enzymy insenzitivními vůči cysteinu
Reversí auxotrofních kmenů E.coli je možné připravit regulativní mutanty. Mutanty s požadovanými vlastnostmi (insenzitivita serin-acetyltransferázy vůči cysteinu) se vyhledají mezi revertantními cystein-auxotrofnimi kmeny cysE-E.coli.
Pro isolaci revertantů se používají cystein-auxotrofnimi kmeny E.coli JM15 (CGSC # 5042: cysE50. tfr-8) a JM39 (CGSC # 5043 cvsE51. tfr-8), založené v Deutschen Sammlung fůr Mikroorganismen v Braunschweigu pod zakládacím číslem DSM 10173. K výrobě cystein-protrofních revertantů byly tyto kmeny zpracovány mutagenem nitrosoguanidinu podle Miller, J,H. (1972) Experimente in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Na minimálním mediu neobsahujícím cystein byly hledány cystein protrofní revertanty. Nejprve bylo asi 1000 získaných revertantů testováno křížovým e β β e • β
-21• ee • · · · · • · · · · · • · ·* ····*· ···· « • · rt · · · « * *··· 4 ·· · fl· vyživovacím experimentem z hlediska vylučování cysteinu. K tomu byly testované revertanty očkovány na minimální medium neobsahující cystein (12 g/1 K2HPO4, 3 g/1 KH2P04, 5 g/1 (NH4)2S04, 0,3 g/1 MgS04 x 7 H20, 0,015 g/1 CaCl2 x 2 H20,
0,002 g/1 FeSO4 χ Ί H20, 1 g/1 Na^-citrátu x 2 H20, 0,1 g/1 NaCl, 15 g/1 bactoagaru, 1 ml/1 roztoku se stopovými prvky, sestávajícího z 0,15 g/1 Na2Mo04 x 2 H2O, 2,5 g/1 H3BO3,
0,7 g/1 CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/1 CuS04 x 5 ři20, 1,6 g/1 MnCl2 x 4 H20, 0,3 g/1 ZnS04 x 7 H20, který byl suplementován 1 % glukosy. Bylo očkováno 5 x 10^ buněk cysteinauxotrofního indikátorového kmenu JM39 na ml a inkubováno po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C. Průměr narostlé plošky kolem testované kolonie (halo) byl posuzován jako semikvantitativní míra vylučování cysteinu testovaným kmenem. Všechny revertanty, které vykazovaly růstovou zónu větší než 2 mm, byly hodnoceny jako positivní a po několika čisticích přeočkováních isolovány a konzervovány.
K vyšetření-bíočhemTckě“podstatý“přo“vylučováni^cys - “ teinu revertanty byla stanovena aktivita serin-acetyltransferásy in vitro a rovněž její inhibice cysteinem. Ke stanovení se použije extrakt S30 (desintegrované buňky se centrifugují 20 minut při 30 000 g a teplotě 4 °C) vybraných revertantů, výchozích kmenů a srovnávacího kmenu E.coli V311Ů (ATTC 27325}. Byla nalezena řada revertantů, jejichž serin-acetyltransferázová aktivita v přítomnosti různých koncentrací inhibitoru L-cysteinu vykazovala ještě významnou zbytkovou aktivitu (hodnota K^ mezi 5 a 50 μΜ ) .
Ke stanovení schopnosti vylučovat cystein v kapalném mediu pomocí kvantitativního stanovení cysteinu se inkubuje 50 vybraných revertantů cvsE v 20 ml standardního produkčního media po dobu 48 hodin při teplotě 30 °C a 170 otáčkách • ·
-22♦ * · * · «to ·<· to • · · to · · · to···· · · · to · · toto · · · λ ·· «to za minutu. Standardní produkční medium sestává z 15 g/1 glukosy, 0,08 g/1 bactotryptonuy, 0,04 g/1 kvasinkového extraktu, 5 mg/1 vitaqmínu Bl, 3 g/1 KH2P04, 12 g/1 K2HP04, 0,3 g/1 MgS04 x 7 H20, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NH4)2SO4, 14,7 mg/1 CaCl2 x 2 H20, 2 mg/1 FeSO4 x 2 H20, 1 g/1 Na^-citrátu x 2 H20, 5 g/1 Na2S203 x 5 H20 a 1 ml/1 roztoku stopových prvků (viz výše) . Po 24 a 48 hodinách se vždy odebere vzorek (10 μΐ) , případně se zředí a ve zbytku neobsahujícím buňky se stanovuje koncentrace cysteinu kalorimetricky podle Gaitonde, M.K. (1967), Biochem.J. 104, 627-633. Míra vylučování cysteinu těchto mutantů kolísá mezi 5-60 mg/1 cysteinu ve zbytku kultury. V kmenech divokého typu E.coli se oproti tomu nemohlo prokázat žádné vylučování cysteinu.
Z tohoto screeningu bylo vybráno 8 revertantů, jejichž vylučování cysteinu leží mezi 40 a 60 mg/1.
K exaktní analyse genetické podstaty resistence konečných produktů serin-acetyltransferázy těchto 8 mutantů byly j ej ich strukturní geny cysĚ klonovány a stanovena jejich sekvence DNA.
Protože DNA sekvence divokého typu genu cvsE a rovněž chromosomální restrikční mapa oblastí navazuj ících na gen cysE E.coli jsou známé (Denk a Bóck, 1987, J.Gen.Microbiol. 133, 515-525), je zřejmé, že strukturní gen cysE leží na 2,25 kb velkém fragmentu PvuII-DNA.
Ke klonování genu cysE kódujícího pro cystein-insesitivní serin-acetyltransferázy se chromosomální DNA selektovaných revertantů úplně štěpí pomocí PvuII, hydrolysát DNA se rozdělí přes preparativní agarový gel a DNA se isoluje v rozmezí velikostí 2-3 kb. Isolovaný hydrolysát PvuII se pomocí ligásy T4 DNA spojí s plasmidovým vektorem pUC19,
-23fl· «·«« ee fl ee es * · * · · · · · · >
• · · · · ♦ -···· • Φ * · ·«<··· c ··» · « • · «·· · · « • flflfl ·' flfl & tflfl fl· linearisovaným pomocí Smál a defosforylovaným alkalickou fosfatásou (dodávaný fou Boehringer Mannnheim).
Cystein-auxotrofní kmen cvsE JM15 (CGSC # 5042) se transformuje s danou ligační směsí a provede se selekce na minimálním mediu neobsahujícím cystein a obsahujícím ampicilin (50 mg/1). Selektované plasmidy a plasmidy komplementující cystein-auxotrofii hostitelského kmene (viz obrázek 7) vykazují v restrikčním vzorku štěpicí vzorek potřebný pro gen cysE (Denk a Bóck, 1987, J.Gen.Microbiol.
133, 515-525). Také v křížovém vyživovacím testu vyvolávají selektované transformanty intenzivní růst indikátorového kmene JM35 (halo > 4 mm). Stanovení aktivity serin-acetyltransf erázy v buněčném extraktu těchto mutantů cysE, které se získají 20 minutovou centrifugací při 30 000 g a teplotě 4 °C, svědčí o redukované senzitivitě vůči L-cysteinu.
K exaktní identifikaci změn ve strukturních genech jednotlivých cysE*-alel. vedoucích k resistenci konečného produktu! še ’j ěj”ičh DNA'šékvenuj i za použití cysE-gen specifických oligonukleotidů a zjištěné sekvence nukleotidů se srovnávaj i s divokým typem genu cysE. Toto srovnání sekvencí nukleotidů poskytuje rozdíly v sekvenci DNA a aminokyselin formy divokého typu, shrnuté v následující Tabulce 2 (srovnej obrázky 5 a 6).
-24Tabulka 2 : Feedback-rezistentní cysE-alela, vzniklá chemickou mutagenesí fefe «··· ·· fe ·· ·· <* · · < · · fefe·· * fe ·' * fe 9 fe · · · «' fe fe? fe fefe·'·· fe, ·«· · fe • · fe · fe fe fe fe ···· i fefe ffeý fefe fefe
| Mutanty cysE | Výměna nukleotidu (č.) | Výměna aminokyseliny (č.) | Κ±(μΜ) |
| cysEII | GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 | 10 |
| cysEIII | GGT->GAT (716) | Glyl65->Aspll65 | 10 |
| cysEVII | GCT->GTT (932) | Ala237->Val237 | 10 |
| cysEX | ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | 50 |
| cysEXI | GGT->AGT (955) ACG->GCG (721) | Gly245->Ser245 Thrl67->Alal67 | 700 |
| cysEXII | AAA->CAA (511) GGC->AGC (934) TTT->TTG (1023) | Lys97->Gln97 Gly238->Ser238 Phe267->Leu267 | 40 |
| cysEXIII | GTT->GCT (713) TTT->TTG (1023) | Vall64->Alal64 Phe267->Leu267 | 30 |
| cysEXVI | GAT->GGT (971) AAG->TAG (973) | Asp250->Gly250 Lys251->Stop251 | 50 |
Příklad2
Výroba serin-acetyltransferáz insenzitivních ke konečnému produktu cílenou výměnou bází ve strukturním genu cysE.
V příkladu 1 se popisuje celkem 8 různých cvsE-alel. které na základě výměny bází a s tím spojených změn aminokyselin vykazují značnou insenzitivaci serin-acetyltransferázy oproti inhibitoru L-cysteinu. Tyto změněné,enzymy se nerozlišuj i pouze v pozici výměny aminokyselin vedoucí k rezistenci, nýbrž také v míře senzitivity vůči inhibitoru L-cysteinu. Ortospecifickou mutagenezi byly konstruovány
9
-25<· «««>> 9 9 4 * · ·> * * , _ • ♦ 9 9 9 9 9 · « · • · < ·' ·····« 9 9 9 9 9 • 4 9 9 · · · · * · · * t · ♦ ·; 9 · » » serin-acetyltransferázové enzymy rezistentní vůči konečnému produktu s novými vlastnostmi, ve kterých byly navzáj em kombinovány výměny aminokyselin popsané v příkladu 1.
K tomu potřebné mutageneze byly provedeny způsobem podle stavu techniky, metodou, kterou popsal Kunkel a spol., (1987), Meth.Enzymol. 154, 367-382.
Jako výchozí plasmid pro mutagenezi se použije cvsE plasmid pPC43 zobrazený na obr. 8 (založené v Deutschen Sammlung ftir Mikroorganismen v Braunschweigu pod zakládacím číslem DSM 171), který obsahuje 1,15 kb velké divoké typy genu cvsE na pozici EcoRI-BamHI fágemidového vektoru pBluescriptll SK+ (firma Stratagene, Heidelberg). Tento gen divokého typu cvsE se amplifikuje metodou polymerásové řetězové reakce (PCR) (Saiki a spol, 1988, Science 239,
487-491 z genomické DNA E,coli divokého typu kmene V3110 (ATTC 27325). Používají se oligonukleotidy cvsE-fwT (SEQ ID č.:3) (sense-Primer) a cvsE-revl (SEQ ID č.:4) (antisense-Primer). Sekvence nukleotidů tohoto primerumá následuj ící sestavu :
cvsE-fvl: (SEQ ID č:3)
-GCCTGGATTCTGCAGTCGACCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3 , tučně značená část odpovídá bázím 9 až 30 ze sekvence cysE-DNA podle obrázku 6, podtržené je místo inkorporované BamHI.
cvsE-revl: (SEQ ID č:4)
-GTAGGAGCTCTGCAGAATTCGGGTATCCGGGAGCGGTATTG-3 , ♦ 4 ·»·» r *
-26«5 · · · · ·
tučně značená část odpovídá bázím 1106 až 1126 ze sekvence cysE-DNA podle obrázku 6, podtržené je místo inkorporované EcoRI.
PCR-experimenty se provádějí ve 30 cyklech, v přítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), po 1 μΜ odpovídajícího oligonukleotidu, 100 ng V3110-DNA, v reakčním pufru (10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % želatiny) a 5 jednotek teplotně stabilní polymerásy Vent-DNA (firma Biolabs) v termocykleru (Gene-ATAQ-Controler, firma Pharmacia) za následujících podmínek : 96 °C, 1,5 min; 62 °C, 1 minuta; 72 °C, 3 minuty. Produkt amplifikace se hydrolyzuje s BamHI a EcoRI, čistí přes agarový gel a jako 1,15 kb velký fragment DNA se klonuje v fágemidovém vektoru Bluescriptll SK+ linearizovaném s BamHI a EcoRI, přičemž vznikne cysE plasmid pPC43 (obrázek 8).
Požadované násobné mutanty se připravuj í následuj íčim postupem :
1) Výroba cysE-IV-alely : Dvojitý mutant Val237 + Ser2^g
Vycházejíce z divokého typu plasmídu cvsE pPC43 se ortospecifickou mutagenesí za použití mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-1 (SEQ ID č.:5) (tabulka 3) zavede nejprve na pozici 238 glycinu serin a do přitom vyrobeného mutantu cysE pPC34 za použití mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-3 (SEQ“ID č.:6) (tabulka 3) na pozici 237 místo alaninu valin, přičemž vznikne cysE-IV-alela.
2) Výroba cys-VIII-alely : Dvojitý mutant Val2j2 + Ile25g • ·
-27·. ·' » ♦ · · * · · « · «··* • « ♦ · a ·««» « · a. «;
0.
·♦· · 0 a · 0 ·» «.0
Vycházej íce z divokého typu plasmidu cvsE pPC43 se ortospecifickou mutagenesí za použití mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-6 (SEQ ID č.:7) (tabulka 3) zavede nejprve na pozici 256 za methionin isoleucin, přičemž vznikne cysEI-alela. Do tohoto se za použití mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-3 (SEQ ID č.:6) (tabulka 3) zavede na pozici 237 místo alaninu valin, přičemž vznikne alela cvsB-VIII.
3) Výroba cysE-VI-alely : Dvojitý mutant Ser238 + Ile256
Do cysE-I-alely (mutant Ile25g) se s pomocí mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-1 (SEQ ID č.:5) (tabulka 3) zavede na pozici 238 místo glycinu serin, přičemž vznikne cysE-VIalela.
4} Výroba eysE-V-alely : Trojitý mutant Val237- +- Ser238 IT e 2 5 6 ~ -----------V cysE-IV-alele (dvojitý mutant Val237 + Ser23g) se s pomocí mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-6 (SEQ ID č.:7) (tabulka 3) nahradí na pozici 256 methioninisoleucinem. Přitom vznikne cysE-V-alela.
5) Výroba cysE-XIV-alely : Dvojitý mutant Ala-^7 + Stop25i
Vycházejíce z alely-cysE-Del 255 (srovnej příklad 3) se za použití mutačního oligonukleotidu cvsE-Mut-10 (SEQ ID č.:8) (tabulka 3) zavedena pozici 167 místo thřeoninu alanin, přičemž vznikne cysE-XIV-alela.
6) Výroba cysE-XVII-alely : Dvojitý mutant Asp-^g^ + Ala^gy « ·
-28<% ·«·· ·· ·' · « 9 · · • > 9 « « · < · < · · ···· β 4 · · 9 • · · · · · < Jí
Vycházejíce z cysE-III-alely (mutant Asp-j^g , srovnej příklad 1) se za pomoci oligonukleotidů cysE-Mut-10 (SEQ ID č.:8) (tabulka 3) nahradí na pozici 167 aminokyselina threonin alaninem. Přitom vznikne alela-cysE-XVII.
7) Výroba cysE-XXIII-alely : Trojitý mutant Ala-j^y + Val237 + Ser238
Do cysE-IV-alely (dvojitý mutant Val237 + Ser23g) se s pomocí mutačního oligonukleotidů cysE-Mut-10 (SEQ ID
č.:8) (tabulka 3) zavede na pozici 167 místo threoninu alanin, přičemž vznikne cysE-XXIII-alela.
Správnost zavedených mutací se přezkoumá sekvenční analýzou DNA celého strukturního genu daného mutantu. Přehled násobných mutantů cysE* je uveden v tabulce 4.
-Ke— stanovení-bi-ochemických-parametrů.jako_j„e.__enzymová aktivita a inhibiční konstanta K^ se postupuje analogicky, jako je popsáno v příkladu 1.
Tabulka 3 : Oligonukleotidy, používané pro ortospecifické mutace k výrobě nových feedback-rezistentních cysE-alel
| SEQ ID č | Mutační oligonukleotid | Sekvence nukleotidu | Pozice na obr. 6 | Výměna aminokyselin |
| 5 | cysE-Mut-1 | viz A | 928-945 | Gly238->Ser238 |
| 6 | cysE-Mut-3 | viz B | 913-933 | Ala237->Val237 |
| 7 | cysE-Mut-6 | viz C | 976-999 | Met256->Ile256 |
| 8 | cysE-Mut-10 | viz D | 709-732 | Thrl67->Alal67 |
-29• · ♦ • · *’
Sekvence A : 5 -GCCGCTAGCGTTCCGGCT-3
B : 5 -CCGCCGCATACCACCGCCGTT-3 C : 5 -CCATCAATGGATATAGACCAGCAT-3 D : 5 -GTCGTTGGTGAAGCGGCGGTGATT-3
Tabulka 4 : Feedback-rezistentní cysE-alela vzniklá cílenou ortospecifickou mutagenezí
| Mutanty cysE | Výměna nukleotAsp (č.) | . Výměna aminokyseliny (č.) | Κ±(μΜ) |
| cysEIV | GCT->CTT (932) | Ala237->Val237 | 40 |
| GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 | ||
| cysEV | GCT->GTT (932) | Ala237->Val2375 | 10 |
| GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 | ||
| ATG-> AT A (990) | Met256->Ile256 | ||
| cysEVI | GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 _ | 10 |
| ATG->ATA (990) | Met256->Ile256 | ||
| cysEVIII | GCT->GTT (932) | Ala237->Val237 | 30 |
| ATG->ATA (990) | Met256->Ile256 | ||
| cysEXIV | ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | >1000 |
| ATG->TAG (988+989) | Met256->Stop256 | ||
| cysEXVII | GGT->GAT (716) | Glyl65->Aspl65 | 100 |
| ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | ||
| cysEXXIII | ACG->GCG (721) | Thrl67->Alal67 | 2300 |
| GCT->GTT (932) | Ala237->Val237 | ||
| GGC->AGC (934) | Gly238->Ser238 |
-30*' ·
9, ···· * ► > 9 9 9 9 »· · · · » · « · «· * < * · · 9 9-99 9 999 9 9
9 · 9 9 9· · · ··'·* ·< ί) ♦» 9)9
Příklad 3
Výroba serin-ačetyltransferáz insenzitivních ke konečnému produktu řízeným zkrácením karboxylového konce enzymu pomocí PCR
Cílené změny jednotlivých nebo několika aminokyselin v rámci jednoho proteinu odpovídají stavu techniky a je možné je dobře provádět pomocí technologie PCR (Saiki a spol., 1988, Science 239, 487-491) za použití vhodných mutačních primerů na rovině DNA. Pro expresi změněných proteinů se získané produkty PCR klonují do vhodného plasmidového/hostitelského systému.
Za použití oligonukleotidového primeru uvedeného v Tabulce 5 se z genomické DNA E.coli kmene divokého typu V3110 (ATTC 28325) vyrobí cysE mutanty s delecemi v karboxylovém konci rozdílné délky, které jsou shrnuty v Tabulce 6 .
PCR-experimenty se provádějí ve 30 cyklech v přítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , po 1 μΜ odpovídajícího oligonukleotidu sense primer cvsE-LHfvl (SEQ ID č. 9) a odpovídajícího antisense primer (SEQ ID č. 10-23) (Tabulka 5), 100 ng V3110-DNA, v reakčním pufru (TO mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2> 0,01 % želatiny) a 5 jednotek teplotně stabilní polymerásy VentDNA (firma Biolabs) v termocykleru (Gene-ATAQ-Controler, firma Pharmacia) za následuj ících podmínek 96 °C, 1,5 min; 62 °C, 1 minuta; 72 °C, 3 minuty.
cvsE-LHfvl (SEQ ID č. 9)
-315 -TGGACCAGAGCTCTGgCTGGCGCATCGCITCGGCGTTG-3 tučně značená část odpovídá bázím 9 až 30 ze sekvence cysE podle obrázku 6, podtržena jsou místa inkorporované BstXI/
Sací.
Produkt vzniklý po amplifikaci se štěpí enzymy Sací a Nsil, následně se čistí přes agarosový gel a dané isolované cysE-DNA-fragmenty se ligují ve vektoru pACYC184-LH /DSM 10172 linearisovaném pomocí Sací a Nsil (viz obrázek 9) . Daná násada ligásy se transformuje v cystein-auxotrofním kmenu cysE JM15 (CGSC # 5042) a provádí se selekce na minimálním mediu neobsahujícím cystein, ale obsahujícím tetracyklin (20 mg/1).
Plasmidy vzešlé z tohoto klonování se označují způsobem odpovídajícím miře jejich delece jako pACYC184/ cysEDel (srovnej obrázek 9 k plasmidové mapě). Stanovení enzymatické” aktivity~á~inhibiční—konstanty- K - a rovněž----křížového vyživovacího testu se provádí analogicky, jak se popisuje v příkladu 1. Správnost zavedených delecí se potvrzuje sekvenční analysou DNA.
Výsledky těchto šetření j sou uvedeny v tabulce 6.
♦.*; »»♦»
-32• · · · fc « « «I · • ····
O ti •
N
O
| CM | σι | 10 | rt | σ | CM | σ' | 10 | Γ* | σ\ | ||||
| ΓΊ | CM | rH | σι | σ | σ | σ | C0 | Γ* | Ό | <0 | ιη | ΓΊ | |
| tí | O | O | O | σ | σ | σ | σ | σ | cn | σ» | σ | σ' | σ' |
| X | H | H | iH | ||||||||||
| o | | | | | 1 | ι | ι | ι | 1 | ι | 1 | I | ι | ι | ι |
| O | in | cn | σ | V0 | η· | ι—1 | νο | γί | ο | rM | ΓΊ | ||
| c | O | o | co | Γ- | Γ— | νο | <0 | 0 | Μ· | η | ι—ί | ||
| O | o | cn | σ | σ | σ | σ | σ | σ' | σι | σ | σ» | σ' |
Tabulka 5 : Antisens-oligonukleotidy pro výrobu cysE-alely s delecemi v karboxylovém konci o
o tí o
>
dd ω
CZ) cn cn cn
o o CJ CJ
| Ε-ι | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí |
| < | < | < | *c | < | < | <c | < | ||||
| ο | Ο | υ | ο | υ | υ | υ | υ | O | CJ | CJ | CJ |
| Ο | υ | ο | ο | ο | ο | ο | CJ | o | o | cj | CJ |
| tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí |
| < | < | < | < | < | < | < | *c | < | < | ||
| Ο | CJ | ο | ο | CJ | ο | CJ | CJ | o | CJ | o | CJ |
| Ο | CJ | ο | ο | ο | CJ | υ | CJ | CJ | CJ | CJ | CJ |
| Ε-ι | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí | tí |
| Ο | CJ ι | Ο I | ο I | υ Ί | υ 1 | υ I | CJ 1 | CJ | | CJ I | CJ | CJ | |
| ι S. | 1 *» | 1 ·> ' | 1 | 1 »7» | S. | *fc | |||||
| ιη | ιη | ιη | ιη | ιη | ιη | ιη | in | in | in | in | . in |
| Ό • | o | co | cn | σ | co | r~ | 10 | in | o | σ | co | in | σ | |
| MD | «5 | in | in | in | in | in | LD | n· | 73· | n· | cn | |||
| fll | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | |
| i—4 | rH | . l—l | r—l | r—l | i—i | t—l | r-l | 1—1 | r—l | p—l | l—( | i—l | ||
| 3 | Φ | Φ | G | ai | G | ω | G | Ql | G | G | G | G | G | |
| a | S3 | a | Q | a | Q. | a | a | Q ’ | Q | a | a | a | a | a |
| >Q | S | 1 | I | 1 | 1 | 1 | I | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| O | W | ω | w | td | w | w | ω | ω | td | w | td | td | fd | |
| 00 | w | ω | Ul | Ul | Ul | Ul | Ul | Ul | Ul | Ul | Ul | . Ul | Ul. | |
| • F—< | >< | >7 | >7 | >7 | >7 | >7 | >7 | >7 | >1 | >7 | ||||
| o | a | ϋ | G | G | G | G | u | G | G | O | 0 | G | G |
σ .
ω >υ
CZ!
cm cn cysE-Del227, 5'-CTCGAŤGCATTACGTATTACAGCACCACGGAACCTGCGCCAATCTT-3' 877- 903 srtnot^co CTi Or-ifNn r—( M .rH rH r-l <-l CM CM CM CM
-33• 9 ¢9 ¢¢¢5 «β 4
Φ .· · 9 * · < ' • · 9 999 9 9 9 9 ♦- 9 9 9' » ·»·· ·, 99 9 9' 9 • · · 9 9 9 9 9 ···· 9 9 9 9 9 9 9'9 '
Tučně značená část odpovídá daným bázím v sekvenci podle obrázku 6, podtržená jsou místa Nsil.
Tabulka 6 : Feedback-rezistentní cysE-alela vzniklá delecí v karboxylovém konci
| Mutanty cysE | Počet deletovaných aminokyselin | Terminální aminokyseliny | K±(gm) |
| cysE-Del259 | 14 | His259 | 7,5 |
| cysE-Del258 | 15 | Gln258 | 5 |
| cysE-Del257 | 16 | Asp257 | 7.5 |
| cysE-Del256 | 17 | Met256 | 12,5 |
| cysE-Del255 | 18 | Asp255 | 30 |
| cysE-De!250 | 23 | Asp250 | 20 |
| cysE-Del249 | 24 | Ser249 | 15 |
| cysE-Del248 | 25 | Asp248 | ~ 12/5 |
Příklad 4
Transformace hostitelského kmenu E.coli se změněnou serinacetyltransferázou k nadprodukci L-cysteinu případně produktů příbuzných L-cysteinu v třepací baňce
K výrobě se použije vektor pACYC184-LH, který se vyznačuje nízkým počtem kopií. K tomu se amplifikují cysE geny pomocí PCR na plasmidy z příkladů 1 a 2.
PCR-experimenty se provádějí ve 30 cyklech v přítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dCTP, dGTP,
-34• ·- 0 0 ·. 0 • ''0 · · · · 10 · · .0 0 00·· 0 · • 0 · · ······ · · · » ® · · '0 ' e · dTTP), po 1 μΜ oligonukleotidu sense-primer cysE-LHfwl (SEQ ID č.:9) a odpovídajícího antisense primer cysELHrevl (SEQ ID c.24), 10 ng daného plasmidu DNA, v reakčním pufru (10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2. 0,01 % želatiny) a 5 jednotek teplotně stabilní polymerásy Vent-DNA (firma Biolabs) v termocykleru (Gene-ATAQ-Controler, firma Pharmacia) za následujících podmínek : 96 °C,
1,5 min; 62 °C, 1 minuta; 72 °C, 3 minuty.
cysE-LHfwl (SEQ ID č.:9)
-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCCTTG- 3
Podtržené báze odpovídají inkorporovaným štěpícím místům restrikčních enzymů BstXI a Sací, zbývající, tučně vytištěné báze odpovídají pozicím 10 až 30 sekvence cysE obrázku 6.
cysE-LHrevl (SEQ ID č.:24),
- CTCGATGCATTACGTAGGGGTATCCGGGAGCGGTATTG- 3
Podtržené báze odpovídají inkorporovanému štěpícímu místu restrikčního enzymu Nsil, zbývající, tučně vytištěné báze odpovídají pozicím 1106 až 1127 sekvence cysE podle obrázku 6.
Produkt vzniklý po amplifikaci se štěpí enzymy Sací a Nsil, následně se čistí pomoci agarosového gelu a izolovaný fragment cysE-DNA se liguje do vektoru pACYC184-LH (DSM 10172) linearizovaného Sací a Nsil.
Daná násada ligasy se transformuje v cystein- auto-
·· ··
-35trofním kmenu cysE JM15 (CGSC # 5042) a provede se selekce v minimálním mediu neobsahuj ícím cystein s obsahem tetracyklinu (20 mg/1). Řada feedback-rezistentních cysE-plasmidů vzniklých z tohoto klonování se označuje jako pACYC184/cysE (viz obrázek 9), přičemž každý klon je opatřen odpovídajícím číslem cysE-alely.
Ke stanovení enzymatické aktivity, inhibiční konstanty K^ a vyživovacího testu se postupuje analogicky, jak je popsáno v příkladu 1.
Ke stanovení produkční kapacity v kapalném médiu se očkuje 20 ml standardního produkčního média jednotlivou kolonií a inkubuje se 48 hodin při teplotě 30 °C a 170 otáčkách za minutu. Produkční medium sestává z 15 g/1 glukosy, 0,08 g/1 bactotryptonu, 0,04 g/1 kvasinkového extraktu, 5 mg/1 vitaminu Bl, 3 g/1 KH2PO4, 12 g/1 K2HPO4, 0,3 g/1 MgS04 x 7 H20, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NH4)2SO4, 14,7 mg/1 CaCl2 x 2 H2O, 2 mg/1 FeSO4 x 2 H2O, 1 g/1 Na^-citrátu x 2 H2O, 5 g/1 Na2S2C>3 x 5 H2O a 1 ml/1 roztoku stopových prvků, 0,025 mg/1 tetracyklinu. Roztok stopových prvků sestává z 0,15 g/1 Na2Mo04 x 2 H2O, 2,5 g/1 H3BO3, 0,7 g/1 CoCl2 x 6 H2O, 0,25 g/1 CuSO4 x 5 H20, 1,6 g/1 MnCl2 x 4 H2O, 0,3 g/1 ZnS04 x 7 H2O. Po 24 a 48 hodinách se vždy odebere vzorek (10 μΐ), přiměřeně se zředí a ve zbytku neobsahujícím buňky se stanovuje koncentrace produktu kalorimetricky podle Gaitonde, M.K, (1967), Biochem.J. 104, 627-633. Pro produkční kmeny JM15 s rozdílnými cvsE-mutanty se, přitom naměří koncentrace cysteinu mezi 50 a 300 mg/1.
• toto to
Příklad 5
Konstrukce chromosomálně kódované, feedback-rezistentní cysE-alely pomocí rekombinantního lambda-profága a produkce
L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu v 1 fermentoru
K integraci do chromozomální attachment site (attlambdá) se klonují cysE-alely cysEIV, cysEX a cysEXI do plasmidu pRS551 (Simons a spol., 1987, Gene, 53, 85-96).
K tomu se vždy daná cysE-a.lela amplifikuje PCR z odpovídajícího cysE-plasmidu. Použité oligonukleotidy cysE-fwl a cysE-revl jsou popsány v příkladu 1. Amplifikace se . provádí stejně, jakó se popisuje v příkladu 3. Získané fragmenty se štěpí EcoRI/BamHI, čistí přes agarosový gel a ligují do vektoru pRS551 štěpeného v EcoRI/BamHI. Přitom vzniknou rekombinantní plasmidy pRCcysEIV, X a XI odvozené z vektoru pRS551.
Přípravou lysátu na kmenu recA+ nesoucím pRScysE (příkladně YMC9, ATCC 3397) s fágem ZamĎdaRS45 se in vivo vyrobí homologní rekombinací heterogenní lambda-lysáb, který vedle fágů lambdaRS45 obsahuje také rekombinantní deriváty lambdaRS45 nesoucí eysE-alelu (Simons a spol., 1987, Gene, 53, 85-96).
K selekci na rekombinantní deriváty RS45 se použije cysE kmen JM15, který se nejprve infikuje heterogením lambda-lysát&m a následně se plátuje.na LB-miskách obsahujících kanamycin (25 mg/1). Získané lysogení, vůči kanamycinu rezistentní klony se potom testuj i z hlediska j ej ich schopnosti růstu na deskách s minimálním mediem bez cysteinu. Vybere se vždy jeden cystein-protrofní klon
-37·« ·«·« • 9
·· ·· • · · · • · ·· • · · · « • e e a použije se k výrobě homogeního cysE-lambda-lysábu (UV-indukcí, Simons a spol., 1987, Gene, 53, 85-96.
S těmito získanými homogeními cysE- lambda-Iysárty se infikuje kmen JM 15. Z toho vzešlé kmeny JM15attlambda:: cysE se fermentují stejně, jako se popisuje v příkladu 6. Dané medium obsahuje místo tetracyklinu jako selekční činidlo vždy 25 mg/1 kanamycinu.
Vytěžky cysteinu činí pro cysEIV 0,5, pro cysEEX 1,8 a pro cysEEXI 2,1 g/1 (viz Tabulka 7).
Příklad 6
Vliv rozdílných cysE-alel kódovaných plasmidem na produkci L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu vil fermentoru za použití hostitelského kmenu JM15 ml media LB (1 % tryptonu, 0,5 % kvasinkového extraktu, 0,5 % NaCl) se ve 100 ml Erlenmayerově baňce očkuje jednotlivou kolonií produkčního kmenu JM15 (CGSC#5042) transformovaného daným cysE-plasmidem.
Po 7 hodinové inkubaci v třepačce (150 otáček/minuta, 30 °C) se získané předkultury převedou do 100 ml media SMI. Medium SMI obsahuje 5 g/1 glukosy, 5 mg/1 vitaminu Bl , 3 g/1 KH2P04 , 12 g/1 K2HPO4, 0,3 g/1 MgSO4 x 7 H20, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NH4)2SO4, 14,7 mg/1 CaCl2 x 2 H20, 2 mg/1 FeSO4 x 2 H2G, 1 g/1 Na^-citrátu x 2 H20, a 1 ml/1 roztoku stopových prvků, 25 mg/1 tetracyklinu. Roztok stopových prvků sestává z 0,15 g/1 Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g/1 H3BO3,
-38·· »»·· * · · ♦ • · ···· • · «
0,7 g/1 CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/1 CuS04 x 5 H20, 1,6 g/1 MnCl2 x 4 H2O a 0,3 g/1 ZnS04 x 7 H20. Kultury se třepou v 1 l Erlenmayerově baňce při teplotě 30 C po dobu 17 hodin při 150 otáčkách za minutu. Po této inkubaci činí Οϋ^θθ mezi 4 a 5. Další fermentace se provádí v pokusných reaktorech Biostat M firmy Braun-Melsungen. Použije se nádoba na kulturu s celkovým obsahem 2 1.
Fermentační medium obsahuje 15 g/1 glukosy, 5 g/1 NaCl, 0,3 g/1 MgS04 x 7 H20, 15 mg/1 CaCl2 x 2 H20, 75 mg/1 FeSO4 x 2 H20, 1 g/1 Na^-citrátu x 2 H20, 1,5 g/1 KH2P04 a 1 ml/1 roztoku stopových prvků (viz výše), 5 mg/1 vitaminu Bl, 2,5 g/1 extraktu kvasinek (Difco), 2,5 g/1 tryptonu (Difco) a 25 mg/1 tetracyklinu.
Koncentrace glukosy ve fermentoru se na počátku nastaví přičerpávánim 700 g/1 (w/v) roztoku glukosy (sterilovaný) na hodnotu 15 g/1 a hodnota pH se nastaví přičerpáním 25 % roztoku NH40H na 7,0. Po dosažení OD^qq 10 se přidá sterilní thiosulfátový zásobní roztok o koncentraci 100 g/1 (w/v) 300 mg za hodinu. Do nádoby fermentoru se k naočkování přečerpá 100 ml předkultury. Počáteční objem činí asi 1 1. Kultury se nejprve míchají při 400 otáčkách za minutu a zavzdušňují se 1,5 vvm tlakového vzduchu sterilovaného přes sterilizační filtr. Fermentace se provádí při 30 ’C.
Hodnota pH se automatickou korekcí pomocí 25 % roztoku NH40H udržuje na 7,0. Nasycení kyslíkem ve fermentačním roztoku by nikdy nemělo klesnout pod 20 %, řídí se rychlostí míchání. Ve dvou až tříhodinových intervalech se zjišťuje obsah glukosy v živném roztoku, optická hustota a obsah cysteinu. Stanovení glukosy se provádí enzymaticky s pomocí glukosového analyzátoru firmy YSI. Koncentrace glukosy se
-39*· «··· ♦ · 9
99
9
9 9 9 · ·· • 9999 9 9999 9 •9 · e e • ·· ·« kontinuálním dodáváním udržuje mezi 10 a 20 g/1.
Obsah produktu v mediu se stanovuje kalorimetricky ze zbytku vzorku neobsahujícího buňky podle Gaitonde, M.K. (1967), Biochem.J. 104, 627-633.
Po 44-50 hodinách se fermentace přeruší. Vyprodukovaná množství cysteinu v g/1 po 48 hodinách jsou v Tabulce 7.
Tabulka 7 : Výtěžky cysteinu z produkčního kmenu JM 15, transformovaného rozdílnými cysE-Alleny (1 1 fermentor)
| cysE-alela | Výtěžek cysteinu [g/1] [48 h] |
| pACYC184/cysEIV | 1,6 |
| pACYCl84/cysEV | 1,3 |
| pACYC184/cysEVI | 1,4 |
| pACYC184/cysEX | 3,4 |
| pACYC184/cysEXI | 3,4 |
| pACYCl84/cysEXII | 1,2 |
| pACYC184/cysEXIV | 2,3 |
| pACYC184/cysEXV | 3,0 |
| pACYCl84/cysEXVI | 2,2 |
| pACYC184/cysEXXIII | 2,7 |
| pACYC184/cysEDell255 | 3,9 |
·· ··»·
• · · • · · · • · · ···· « • · · ·· ·· • · a · • · ·· ··· · · • 9 · ·· ··
Příklad 7
Produkce L-cysteinu nebo produktů odvozených od
L-cysteinu s bakteriemi Coryne
Feedback-rezistentní cysE-alely cysEIV, cysEX, cysEXI a cysEXIV (viz Tabulka 2, v příkladu 1) se restrikčnimi enzymy BamHI a EcoRI (firma Boehringer Mannheim) štěpí z jejich odpovídajících plasmidů a vždy 1,15 kb velký fragment DNA se vyčistí přes agarový gel a isoluje. V daném fragmentu DNA se působením Klenowova fragmentu DNA polymerásy I z E.coli (firma Boehringer Mannheim) zatupí konce. Vektor pVSTl se hydrolyzuje restrikčním enzymem Smál (firma Boehringer Mannheim) a spojí se s fragmentem DNA s tupým koncem pomocí T4 DNA ligásy. Vektor pVSTl je shuttle vektor E. coli/Coryne a může se replikovat jak v E.coli tak i v bakteriích Coryne. Replikon z bakterií Coryne pochází z kmene Corynebacterium glutamicum ATCC 19223. Výroba vektoru pVSTl se popisuje v US-A 4 965 197. Použije se ligační násada, aby se transformoval pro cystein auxotrofní mutant JM15. Komplementující plasmidy se označují způsobem odpovídajícím jejich insertovaným cysE-alela, pVSTl-cysEIV, pVSTl-cysEX, pVSTl-cysEXI a pVSTl-cysEXIV.
Plasmidy pVSTl-cysE se použijí k transformaci Corynebacterium glutamicum ATCC 21851. Transformace se provádí elektrokorporací technikou podrobně popsanou v Liebl, V. a spol., 1989, FEMS Microbiol. Letters, 65, 299-304.
Selekce rekombinantních klonů se provádí přes plasmidově kodovanou kanamycinovou resistenci na agarových deskách s 25 mg/1 kanamycinu.
Fermentace se provádí za podmínek, které jsou
-41s>
analogické podmínkám popsaným v příkladu 6 s tou výjimkou, že místo tetracyklinu se jako selekční antibiotikum použije kanamycin v koncentraci 50 mg/1.
Při fermentaci se ukazuje, že kmen, který na plasmidu nese cysEXI-alelu, dosahuje nejvyšších výtěžků cysteinu.
SEKVENČNÍ PROTOKOL
| (1) Všeobecné informace | |||
| (i) | Přihlašovatel | ||
| (A) | J méno : | Consortium fuer elektrochemische Industrie, GmbH | |
| (B) | Ulice : | Zielstattstr. 20 | |
| (C) | Místo : | Muenchen | |
| (E) | Země : | ,Germany | |
| (F) | Poštovní | směrovací číslo : 81379 | |
| (G) | Telefon | : 085/748440 | |
| (H) | Telefax | : 089/74844350 | |
| (I) | Telex : | 5215553 cons d |
(ii) Název přihlášky : Způsob výroby O-acetylserinu,
L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu (iii) Počet sekvencí : 24 (iv) Forma uložená v počítači :
(A) Nosič dat : pružný disk (B) Počítač : IBM PC kompatibilní (C) Provozní Systém : PC-DOS/MS-DOS (D) Software : Patentln Release #1.0, verze #1,30 (EPA) (2) Informace k SEQ ID č. 1 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 273 aminokyselin (B) Druh : aminokyselina (C) Struktura :
(D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : protein • · · · «· % • ·
-43(vi) Prvotní původ :
(A) Organismus : Escherichia Coli (B) Kmen : V3110
| (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.l : | |||||||||||||||
| Met | Ser | Cys | Glu | Glu | Leu | Glu | Ile | Val | Trp | Asn | Asn | Ile | Lys | Ala | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Glu | Ala | Arg | Thr | Leu | Ala | Asp | Cys | Glu | Pro | Met | Leu | Ala | Ser | Phe | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| !ΐ | Tyr | His | Ala | Thr | Leu | Leu | Lys | His | Glu | Asn | Leu | Gly | Ser | Ala | Leu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Tyr | Met | Leu | Ala | Asn | Lys | Leu | Ser | Ser | Pro | Ile | Met | Pro | Ala | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ile | Ala | Ile | Arg | Glu | Val | Val | Glu | Glu | Ala | Tyr | Ala | Ala | Asp | Pro | |
| 65 | 70 | 75 | |||||||||||||
| Glu | Met | Ile | Ala | Ser | Ala | Ala | Cys | Asp | Ile | Gin | Ala | Val | Arg | Thr | |
| 80 | 85 | 90 | |||||||||||||
| Arg | Asp | Pro | Ala | Val | Asp | Lys | Tyr | Ser | Thr | Pro | Leu | Leu | Tyr | Leu | |
| 95 | 100 | 105 | |||||||||||||
| Lys | Gly | Phe | His | Ala | Leu | Gin | Ala | Tyr | Arg | Ile | Gly | His | Trp | Leu | |
| 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
| Trp | Asn | Gin | Gly | Arg | Arg | Ala | Leu | Ala | Ile | Phe | Leu | Gin | Asn | Gin | |
| 125 | 130 | 135 | |||||||||||||
| Val | Ser | Val | Thr | Phe | Gin | Val | Asp | Ile | His | Pro | Ala | Ala | Lys | Ile | |
| 140 | 145 | 150 | |||||||||||||
| Gly | Arg | Gly | Ile | Met | Leu | Asp | His | Ala | Thr | Gly | Ile | Val | Val | Gly | |
| 155 | 160 | .. | 165 | ||||||||||||
| (4 | Glu | Thr | Ala | Val | Ile | Glu | Asn | Asp | Val | Ser | Ile | Leu | Gin | Ser | Val |
| 170 | 175 | 180 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Gly | Gly | Thr | Gly | Lys | Ser | Gly | Gly | Asp | Arg | His | Pro | Lys | |
| 185 | 190 | 195 |
• 4
-44· · 4 4 • 4 4 · 4 · · 4 «4 · · · · · 4- 4 4 4 4 9
Λ » · 4 4 4
| Ile | Arg | Glu | Gly | Val | Met | Ile | Gly | Ala | Gly | Ala | Lys | Ile | Leu | Gly |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Asn | Ile | Glu | Val | Gly | Arg | Gly | Ala | Lys | Ile | Gly | Ala | Gly | Ser | Val |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| Val | Leu | Gin | Pro | Val | Pro | Pro | His | Thr | Thr | Ala | Ala | Gly | Val | Pro |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ala | Arg | Ile | Val | Gly | Lys | Pro | Asp | Ser | Asp | Lys | Pro | Ser | Met | Asp |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Met | Asp | Gin | His | Phe | Asn | Gly | Ile | Asn | His | Thr | Phe | Glu | Tyr | Gly |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| Asp | Gly | Ile |
(2) Informace k SEQ ID č. 2 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 1135 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : dvouřetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Genom-DNA (vi) Prvotní původ :
(A) Organismus : Escherichia Coli (B) Kmen : V3110 (vii) Bezprostřední původ :
(B) Clon(E) : pPC43
-45β · · · · fe » · fe • « ···* · · · · • · fe fe ·····< · · · · · β Λ · · · * , · (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.2 :
| TCCGCGAACT | GGCGCATCGC | TTCGGCGTTG | AAATGCCAAT | AACCGAGGAA | ATTTATCAAG | 60 |
| TATTATATTG | CGGAAAAAAC | GCGCGCGAGG | CAGCATTGAC | TTTACTAGGT | CGTGCACGCA | 120 |
| AGGACGAGCG | CAGCAGCCAC | TAACCCCAGG | GAACCTTTGT | TACCGCTATG | ACCCGGCCCG ' | 180 |
| CGCAGAACGG | GCCGGTCATT | ATCTCATČGT | GTGGAGTAAG | CAATGTCGTG | TGAAGAACTG | 240 |
| GAAATTGTCT | GGAACAATAT | TAAAGCCGAA | GCCAGAACGC | TGGCGGACTG | TGAGCCAATG | 300 |
| CTGGCCAGTT | TTTACCACGC | GACGCTACTC | AAGCACGAAA | ACCTTGGCAG | TGCACTGAGC | 360 |
| TACATGCTGG | CGAACAAGCT | GTCATCGCCA | ATTATGCCTG | CTATTGCTAT | CCGTGAAGTG | 420 |
| GTGGAAGAAG | CCTACGCCGC | TGACCCGGAA | ATGATCGCCT | CTGCGGCCTG | TGATATTCAG | 480 |
| GCGGTGCGTA | CCCGCGACCC | GGCAGTCGAT | AAATACTCAA | CCCCGTTGTT | ATACCTGAAG | 540 |
| ggttttcatg | CCTTGCAGGC | CTATCGCATC | GGTCACTGGT | TGTGGAATCA | GGGGCGTCGC | 600 |
| GCACTGGCAA | TCTTTCTGCA | AAACCAGGTT | TCTGTGACGT | TCCAGGTCGA | TATTCACCCG | 660 |
| GCAGCAAAAA | TTGGTCGCGG | TATCATGCTT | GACCACGCGA | CAGGCATCGT | CGTTGGTGAA | 720 |
| ACGGCGGTGA | TTGAAAACGA | CGTATCGATT, | CTGCAATCTG | TGACGCTTGG | CGGTACGGGT | 780 |
| AAATCTGGTG | GTGACCGTCA | CCCGAAAATT | CGTGAAGGTG | TGATGATTGG | CGCGGGCGCG | 840 |
| AAAATCCTCG | GCAATATTGA | AGT-.TGGGCGC | GGCGCGAAGA | TTGGCGCAGG | TTCCGTGGTG | 900 |
| CTGCAACCGG | TGCCGCCGCA | TACCACCGCC | GCTGGCGTTC | CGGCTCGTAT | TGTCGGTAAA | 960 |
| CCAGACAGCG | ATAAGCCATC | AATGGATATG | GACCAGCATT | TCAACGGTAT | TAACCATACA | 1020 |
| TTTGAGTATG | GGGATGGGAT | CTAATGTCCT | GTGATCGTGC | CGGATGCGAT | GTAATCATCT | 1080 |
| ATCCGGCCTA | CAGTAACTAA | TCTCTCAATA | CCGCTCCCGG | ATACCCCAAC | TGTCG | 1135 |
(2) Informace k SEQ ID č. 3 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 42 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární
-46« · · • · · · · • · 4
S β (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE3-fwl (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.3 :
GCCTGGATCC TGCAGTCGAC CTGGCGCATC GCTTCGGCGT TG (2) Informace k SEQ ID č. 4 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 41 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-revl (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.3 :
GTAGGAGCTC TGCAGAATTC GGGTATCCGG GAGCGGTATT G (2) Informace k SEQ ID č. 5:
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 18 párů bází (B) Druh : nukleotid
-4Ί9 ·
9 9 9 9 (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Mut-l (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.5 : GCCGCTAGCG TTCCGGCT (2) Informace k SEQ ID č. 6 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 21 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Mut-3 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.6 : CCGCCGCATA CCACCGCCGT T (2) Informace k SEQ ID č. 7 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 24 párů bází (B) Druh : nukleotid • ·
0 c e c c o e e e
-48e ee e
0i • «
0000 « (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Mut-6 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.7 : CCATCAATGG ATATAGACCA GCAT (2) Informace k SEQ ID č. 8 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 24 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Mut-10 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.8 : GTCGTTGGTG AAGCGGCGGT GATT (2) Informace k SEQ ID č. 9 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 38 párů bází • β
-49«fl «' β® • fl · · · · • · · ® · · ····· Φ ···· 9 (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-LHfwl (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.9 :
TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGGCGTTG (2) Informace k SEQ ID č. 10 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del270 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.10 :
CGCGATGCAT TACGTATTAC GCATACTCAAA ATCTATGGTT AATACC (2) Informace k SEQ ID č. 11 (i) Sekvenční charakteristika :
β 9
-50· · « 999 9 9 99
9' #' 9,ι 9 9*99 9 9 9999 ·
9 · 9 * 9 9 9
9999 9' 99 9 99 9 9 (A) Délka : 46 párů bází (Β) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del286 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.ll :
CTCGATGCAT TACGTATTAC TCAAATGTAT GGTTAATACC GTTGAA (2) Informace k SEQ ID č. 12 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del263 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.12 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA ATACCGTTGA AATGCTGGTC CATATC • ·'
-514 β © e β • · · · · • · »444 4 4 4 4 f 4 4 4 4 444 4 4 4444 * « 4 4 4 4 4 4 (2) Informace k SEQ ID č. 13 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del259 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.13 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TGCTGGTCCA TATCCATTGA TGGCTT (2) Informace k SEQ ID č. 14 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : j ednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del258 » · · 4 » · ·· ccc c <
• · 1 e e e e
-52A * • · · • · · · « (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.14 :
CTCXjATGCAT TACGTATTAC TGGTCCATAT CCATTGATGG CTTATC (2) Informace k SEQ ID č. 15 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 47 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del257 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.15 :
CGCGATGCAT TACGTATTAG TCCATATCCA TTGATGGCTT ATCGCTG (2) Informace k SEQ ID č. 16 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : j ednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del256
(xi) Popis sekvence : SEQ ID č.16 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC ATATCCATTG ATGGCTTATC GCTGTC (2) Informace k SEQ ID č. 17 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis ; /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) ; cysE-Del255 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.17 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TCCATTGATG GCTTATCGCT GTCTGG (2) Informace k SEQ ID č. 18 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc « oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
····
-54ee ·· » · · · » » · · βββ β fl (A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del250 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.18 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA TCGCTGTCTG GTTTACCGAC AATACG (2) Informace k SEQ ID č. 19 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del249 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.19 :
CTCGATGCAT TACGTATTAG CTGTCTGGTT TACCGACAAT ACGAGC (2) Informace k SEQ ID č. 20 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid , t (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide
-55• · ···· ee e ·· • e · e · * * e · · e · · · • e · o ··♦»«« ee • e e e e • e e · e «« e ·: · • 00· (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del248 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.20 :
CTCXJATGCAT TACGTATTAG TCTGGTTTAC CGACAATACG AGCCGG (2) Informace k SEQ ID č. 21 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bázi (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del245 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.21 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA CCGACAATAC GAGCCGGAAC GCCAGC (2) Informace k SEQ ID č. 22 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární • ·· · • · φ ee
-56e e e e e • · · íí e e (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ ;
(Á) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) ; cysE-Del239 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.22 :
CTCGATGCAT TACGTATTAA ACGCCAGCGG CGGTGGTATC CGGCGG (2) Informace k SEQ ID č. 23 :
(1) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 46 párů bází (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-Del227 (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.23 :
CTCGATGCAT TACGTATTAC AGCACCACGG AACCTGCGCC AATCTT (2) Informace k SEQ ID č. 24 :
(i) Sekvenční charakteristika ;
(A) Délka : 38 párů bází es
-57« · · · · · · · • · 9 9 9 9999 9 ··· · • · · · 9 9 9
9999 9 99 9 · · (B) Druh : nukleotid (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : Jiné nukleové kyseliny (A) Popis : /desc = oligonucleotide (vii) Bezprostřední původ :
(A) Knihovna : syntetická (B) Clon(E) : cysE-LHrevl (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.24 :
CTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG CGGTATTG
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Serin-acetyltransferázy, které ve srovnání s divokým typem enzymu vykazují sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a jejichž proteinová sekvence ve srovnání se sekvencí divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, vyznačující se tim, že se mutace nachází v sekvenční oblasti od aminokyseliny v pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 nebo delece v sekvenční oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 227, přičemž pozice jedna je iniciační methionin z obrázku 5 (SEQ ID č.:1) a přičemž je vyloučena mutace Met na Ile v pozici 256, a že serin-acetyltransferáza má inhibíční konstantu K^ 0,02 až 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA.
- 2. Serin-acetyltransferázy, které ve srovnání s divokým typem enzymu vykazuj í sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a jejichž proteinová sekvence ve srovnání se sekvencí divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, vyznačující se tím, že jejich proteinová sekvence zahrnuje výměnu aminokyselin nejméně jednoho z mutantů cysE uvedených v tabulce la nebo lb.
- 3. Sekvence DNA, která kóduje pro serin-acetyltransferázu podle jednoho z nároků 1 nebo 2.
- 4. Sekvence DNA, která kóduje pro serin-acetyltransferázy, které ve srovnání s divokým typem enzymu vykazují sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu, ·· « ·· · ·« (i.-59»· ···· vyznačující se tím, že obsahují od bp 510 do bp 1040 nejméně jednu mutaci, přičemž bp 1 jsou první báze podle obrázku 6 (SEQ ID č.: 2), přičemž je vyloučena mutace guaninu následujícího po adeninu, thymidinu nebo cytosinu v pozici 990.
- 5. Mikroorganismy, vyznačující se tím, že obsahují jednu výměnu cysteinu deregulovanou nejméně sekvencí DNA podle nároku 3 nebo 4.
- 6. Způsobu výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a sloučenin odvozených od L-cysteinu, vyznačující se tím, že se mikroorganismy podle nároku 5 kultivují obecně známým způsobem v živném mediu.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že živné medium obsahuje dostatečné množství donoru síry.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se jako donor síry použije thiosulfát.ř1CH3THF: N5-Methyltetrahydrofolát
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19539952A DE19539952A1 (de) | 1995-10-26 | 1995-10-26 | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ126998A3 true CZ126998A3 (cs) | 1998-07-15 |
| CZ294539B6 CZ294539B6 (cs) | 2005-01-12 |
Family
ID=7775886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19981269A CZ294539B6 (cs) | 1995-10-26 | 1996-10-24 | Serin-acetyltransferáza, sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu, mikroorganismus, který má metabolismus cysteinu deregulovaný a způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6218168B1 (cs) |
| EP (1) | EP0858510B1 (cs) |
| JP (1) | JP3329825B2 (cs) |
| KR (1) | KR100275287B1 (cs) |
| CN (1) | CN1155711C (cs) |
| AT (1) | ATE211175T1 (cs) |
| BR (1) | BR9610910A (cs) |
| CA (1) | CA2235752C (cs) |
| CZ (1) | CZ294539B6 (cs) |
| DE (2) | DE19539952A1 (cs) |
| DK (1) | DK0858510T3 (cs) |
| ES (1) | ES2169269T3 (cs) |
| HU (1) | HU224097B1 (cs) |
| MX (1) | MX9803317A (cs) |
| PL (1) | PL186403B1 (cs) |
| TW (1) | TW554043B (cs) |
| WO (1) | WO1997015673A1 (cs) |
Families Citing this family (92)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19726083A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
| FR2787466B1 (fr) * | 1998-12-17 | 2001-02-16 | Rhone Poulenc Agrochimie | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
| DE19949579C1 (de) * | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
| DE10136986A1 (de) * | 2000-09-03 | 2002-03-21 | Degussa | Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen |
| US6822085B2 (en) | 2000-09-03 | 2004-11-23 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the cysD, cysN, cysK, cysE and cysH genes |
| DE10046934A1 (de) | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| DE10104722A1 (de) * | 2001-02-02 | 2002-08-14 | Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cystein, Cystin und Glutathion |
| DE10104721B4 (de) * | 2001-02-02 | 2006-02-09 | IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Verfahren zur Erhöhung des Gehalts von Schwefelverbindungen in Pflanzen |
| JP4622111B2 (ja) * | 2001-02-09 | 2011-02-02 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| DE10107002A1 (de) | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| ATE406455T1 (de) * | 2001-07-11 | 2008-09-15 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-threonine unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae |
| DE60230823D1 (de) | 2001-09-28 | 2009-02-26 | Ajinomoto Kk | L-cystein herstellendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-cystein |
| US7348037B2 (en) * | 2002-08-16 | 2008-03-25 | Evonik Degussa Gmbh | Sulfur-containing animal-feed additives |
| JP2006517796A (ja) | 2003-02-18 | 2006-08-03 | メタボリック エクスプローラー | 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| EP1650296B1 (en) * | 2003-07-16 | 2012-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant serine acetyltransferase and process for producing l-cysteine |
| RU2275425C2 (ru) * | 2003-11-03 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина |
| JP4479283B2 (ja) | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007119574A2 (en) | 2006-03-23 | 2007-10-25 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna |
| WO2007119890A1 (en) | 2006-04-18 | 2007-10-25 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007136133A1 (en) | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
| JP5297804B2 (ja) | 2006-07-25 | 2013-09-25 | 協和発酵バイオ株式会社 | アミノ酸の製造法 |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2008090770A1 (ja) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| DE102007007333A1 (de) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP5319521B2 (ja) | 2007-04-06 | 2013-10-16 | 協和発酵バイオ株式会社 | ジペプチドの製造法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| EP2248906A4 (en) | 2008-01-23 | 2012-07-11 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| EP2246420B1 (en) * | 2008-02-21 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium, and method for production of l-cysteine |
| DE602009000714D1 (de) * | 2008-03-06 | 2011-03-24 | Ajinomoto Kk | L-Zystein-produzierendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-Zystein |
| JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2298880A4 (en) | 2008-03-18 | 2012-02-08 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | INDUSTRIALLY USEFUL MICROORGANISM |
| EP2330184B1 (en) | 2008-09-01 | 2020-11-25 | Shinshu University | Process for producing a useful substance in coryneform bacteria |
| BRPI0918299B1 (pt) | 2008-09-08 | 2018-08-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para produzir um l-aminoácido |
| EP2382320B1 (en) | 2009-01-23 | 2018-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration |
| US9023622B2 (en) | 2009-02-10 | 2015-05-05 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for producing L-amino acid using a microorganism with decreased aspartate aminotransferase activity |
| JP5521347B2 (ja) | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JPWO2010095642A1 (ja) | 2009-02-18 | 2012-08-23 | 国立大学法人信州大学 | 有用物質の製造方法 |
| JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP5359409B2 (ja) * | 2009-03-12 | 2013-12-04 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JPWO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2013-01-10 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2009136544A (ru) | 2009-10-05 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae |
| CN102639691B (zh) | 2009-11-30 | 2014-04-16 | 味之素株式会社 | 生产l-半胱氨酸的细菌以及生产l-半胱氨酸的方法 |
| RU2460793C2 (ru) * | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| EP2617808B1 (en) | 2010-09-14 | 2016-06-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Sulfur-containing amino acid-producing bacterium and method for producing sulfur-containing amino acids |
| WO2012053794A2 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| US9567616B2 (en) | 2011-02-09 | 2017-02-14 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing target substance by fermentation |
| JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| WO2012137689A1 (ja) | 2011-04-01 | 2012-10-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－システインの製造法 |
| US9234223B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-01-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-cysteine |
| JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システインの製造法 |
| DE102011075656A1 (de) | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| US20150118720A1 (en) | 2012-04-13 | 2015-04-30 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing amino acid |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012016716A1 (de) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden |
| DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| US9611461B2 (en) | 2013-03-19 | 2017-04-04 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | Enterobacteriaceae bacteria exhibiting increased L-cysteine producing ability |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| RU2628696C1 (ru) | 2013-10-02 | 2017-08-21 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения основной аминокислоты (варианты) |
| JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| KR102669270B1 (ko) | 2014-03-31 | 2024-05-27 | 임파서블 푸즈 인크. | 재조합 효모 |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| CN109121422B (zh) | 2016-02-25 | 2021-12-21 | 味之素株式会社 | 使用过表达编码铁输出蛋白基因的肠杆菌科的细菌生产l-氨基酸的方法 |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN109517748A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 吉林大学 | 黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途 |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
| BR112021017870A2 (pt) | 2019-04-05 | 2021-12-07 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
| JP2022550084A (ja) | 2019-09-25 | 2022-11-30 | 味の素株式会社 | 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法 |
| US20230124898A1 (en) | 2020-04-03 | 2023-04-20 | Wacker Chemie Ag | Biocatalyst as a core component of an enzyme-catalyzed redox system for the biocatalytic reduction of cystine |
| EP4172310A1 (de) | 2020-06-26 | 2023-05-03 | Wacker Chemie AG | Verbesserte cystein produzierende stämme |
| CN116096909A (zh) | 2021-07-05 | 2023-05-09 | 瓦克化学股份公司 | 用于将亚磺酸酶促氧化成磺酸的方法 |
| CN114214341B (zh) * | 2021-12-30 | 2023-12-26 | 山西大学 | 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用 |
| WO2023165684A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4965197A (en) | 1987-06-12 | 1990-10-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Coryneform expression and secretion system |
-
1995
- 1995-10-26 DE DE19539952A patent/DE19539952A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-10-24 EP EP96937217A patent/EP0858510B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 PL PL96327187A patent/PL186403B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 BR BR9610910A patent/BR9610910A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 DK DK96937217T patent/DK0858510T3/da active
- 1996-10-24 CN CNB961978945A patent/CN1155711C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 TW TW085113019A patent/TW554043B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 WO PCT/EP1996/004613 patent/WO1997015673A1/de active IP Right Grant
- 1996-10-24 DE DE59608521T patent/DE59608521D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 HU HU9900078A patent/HU224097B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 US US09/065,104 patent/US6218168B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 AT AT96937217T patent/ATE211175T1/de active
- 1996-10-24 KR KR1019980703063A patent/KR100275287B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 CA CA002235752A patent/CA2235752C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 CZ CZ19981269A patent/CZ294539B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-10-24 ES ES96937217T patent/ES2169269T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 JP JP51628297A patent/JP3329825B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-27 MX MX9803317A patent/MX9803317A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW554043B (en) | 2003-09-21 |
| DK0858510T3 (da) | 2002-03-25 |
| KR100275287B1 (ko) | 2001-02-01 |
| DE59608521D1 (de) | 2002-01-31 |
| HUP9900078A3 (en) | 2001-08-28 |
| EP0858510B1 (de) | 2001-12-19 |
| JP3329825B2 (ja) | 2002-09-30 |
| BR9610910A (pt) | 1999-07-13 |
| CZ294539B6 (cs) | 2005-01-12 |
| JP2000504926A (ja) | 2000-04-25 |
| DE19539952A1 (de) | 1997-04-30 |
| CA2235752C (en) | 2002-04-16 |
| ES2169269T3 (es) | 2002-07-01 |
| WO1997015673A1 (de) | 1997-05-01 |
| EP0858510A1 (de) | 1998-08-19 |
| PL186403B1 (pl) | 2004-01-30 |
| PL327187A1 (en) | 1998-11-23 |
| MX9803317A (es) | 1998-09-30 |
| KR19990067120A (ko) | 1999-08-16 |
| US6218168B1 (en) | 2001-04-17 |
| ATE211175T1 (de) | 2002-01-15 |
| HUP9900078A2 (hu) | 1999-04-28 |
| HU224097B1 (hu) | 2005-05-30 |
| CN1200764A (zh) | 1998-12-02 |
| CN1155711C (zh) | 2004-06-30 |
| CA2235752A1 (en) | 1997-05-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ126998A3 (cs) | Způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu | |
| JP5164566B2 (ja) | フィードバック感受性が変化した組み換え酵素 | |
| EP2796549B1 (en) | O-phosphoserine sulfhydrylase mutants and method for production of cysteine using the same | |
| US20040038352A1 (en) | Method for fermentative production of amino acids and amino acid derivatives of the phosphoglycerate family | |
| JP5944323B2 (ja) | メチオニンの生産における誘導プロモーターの使用 | |
| KR101915819B1 (ko) | 메티오닌 생산을 위한 균주 및 방법 | |
| ES2268504T3 (es) | Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-metionina. | |
| ES2283906T3 (es) | Variantes de 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa con una reducida inhibicion por l-serina, y genes que las codifican. | |
| JP2005137369A (ja) | エシェリヒア属細菌を用いたｌ−システインの製造法 | |
| US7195897B2 (en) | Feedback-resistant homoserine transsuccinylases having a modified c-terminus | |
| WO2023284419A1 (zh) | 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 | |
| JP2019523271A (ja) | Ｎ−アセチルホモセリン | |
| US7371551B1 (en) | Feedback-resistant homoserine transsuccinylases | |
| KR101153400B1 (ko) | 신규 리포산 합성효소와 리포산 단백질 리가제를 이용한 알파-리포산의 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20071024 |