ES2268504T3 - Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-metionina. - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
Abstract
Cepa de microorganismos, que es apropiada para la preparación por fermentación de L-metionina, que se puede producir a partir de una cepa de partida, caracterizada porque tiene una actividad, aumentada con relación a la cepa de partida, de un producto génico de yjeH o de un producto génico de una variante de alelo funcional del gen yjeH con una identidad entre secuencias mayor que 30 % con respecto a SEQ ID No. 1, permaneciendo sin embargo conservada la actividad enzimática del respectivo producto génico.
Description
Procedimiento para la preparación por
fermentación de L-metionina.
El invento se refiere a un procedimiento para la
preparación por fermentación de L-metionina.
El aminoácido metionina desempeña un
sobresaliente cometido en la nutrición de animales. La metionina
pertenece a los aminoácidos esenciales, que no se pueden preparar
por biosíntesis en el metabolismo de los animales vertebrados. Como
consecuencia de esto, al realizar la cría de animales se debe
asegurar que la metionina sea ingerida en unas cantidades
suficientes junto con la nutrición. Sin embargo, puesto que la
metionina está presente en plantas forrajeras clásicas (tales como
las de soja o cereales), en particular para cerdos y aves de corral,
con frecuencia en unas cantidades demasiado pequeñas como para
garantizar una nutrición óptima de los animales, es ventajoso añadir
metionina como sustancia aditiva al pienso para animales. La alta
importancia de la metionina para la nutrición de animales ha de ser
atribuida también al hecho de que la metionina, junto con la
L-cisteína (y respectivamente la
L-cistina), constituye la decisiva fuente de azufre
en el metabolismo. El metabolismo animal está ciertamente en
situación de transformar metionina en cisteína, pero no a la
inversa.
En el estado de la técnica se prepara metionina
mediante síntesis química a la escala de > 100.000 toneladas por
año. En tal caso se hacen reaccionar primeramente acroleína y
metil-mercaptano para dar el aldehído
3-metiltio-propiónico, que a su vez
conduce, con un cianuro, amoníaco y monóxido de carbono, a la
hidantoína. Ésta, finalmente, se puede hidrolizar para dar el
racemato, que es una mezcla equimolar de los dos estereoisómeros D-
y respectivamente L-metionina. Puesto que la forma
biológicamente activa de las moléculas representa exclusivamente la
forma L, la forma D contenida en el pienso se debe transformar en el
metabolismo, en primer lugar por des- y
trans-aminación, en la forma L activa.
Ciertamente, se conocen métodos, que permiten
una preparación de L-metionina pura en cuanto a un
enantiómero por desdoblamiento de racematos o mediante
hidantoinasas. A causa de los altos costos, estos métodos no han
encontrado sin embargo hasta ahora ningún acceso a la industria de
los piensos.
En clara contraposición con la metionina, la
preparación de la mayor parte de los otros aminoácidos proteinógenos
naturales se realiza hoy en día de manera predominante por
fermentación de microorganismos. En tal caso se aprovecha el hecho
de que los microorganismos disponen de correspondientes rutas de
biosíntesis para la síntesis de los aminoácidos naturales. Además de
ello, muchos procedimientos de fermentación alcanzan con productos
de partida (eductos) baratos, tales como glucosa y sales minerales,
unos costos de producción muy favorables, y además de ello
proporcionan la forma L, biológicamente activa, del respectivo
aminoácido.
Las rutas de biosíntesis de aminoácidos están
sujetas, sin embargo, en cepas de tipo silvestre a un estricto
control metabólico, que garantiza que los aminoácidos se preparen
solamente para el consumo propio de la célula. Una importante
premisa para eficientes procesos de producción es, por lo tanto, que
estén disponibles apropiados microorganismos que, al contrario que
los organismos de tipo silvestre, tengan un rendimiento de
producción drásticamente aumentado para la preparación de los
deseados aminoácidos.
Tales microorganismos que sobreproducen
aminoácidos se pueden producir mediante clásicos procedimientos de
mutación/selección y/o por medio de modernas técnicas planificadas
de recombinación (en inglés "metabolic engineering" =
ingeniería metabólica). En el caso de esta última, se identifican en
primer término genes o alelos, que mediante su modificación,
activación o desactivación da lugar a una sobreproducción de
aminoácidos. Estos genes/alelos, seguidamente, mediante técnicas de
biología molecular, se incorporan en una cepa de microorganismos o
se desactivan, de manera tal que se consigue una óptima
sobreproducción. Con frecuencia, sin embargo, tan sólo la
combinación de varias medidas diferentes conduce a una producción
realmente eficiente.
La biosíntesis de L-metionina en
microorganismos es muy compleja. El cuerpo de aminoácido de la
molécula se deriva del L-aspartato, que es
convertido en L-homoserina a través de semialdehído
aspartílico/fosfato de aspartilo. Junto a esta molécula, luego, en
tres etapas enzimáticas, (que pasan por
O-succinil-homoserina y
cistationina), se intercambia el grupo hidroxilo por un grupo de
tiol, siendo éste movilizado a partir de una molécula de cisteína y
resultando homocisteína. En la última etapa de la biosíntesis,
finalmente, por metilación del grupo de tiol, se forma
L-metionina. El grupo metilo se deriva del
metabolismo de serina.
Considerado formalmente, la metionina se
sintetiza en un metabolismo microbiano, por lo tanto, a su vez a
partir de los aminoácidos aspartato, serina y cisteína, y necesita
por consiguiente, en comparación con otros aminoácidos, una alta
complejidad de la biosíntesis. Junto a la parte principal de la
síntesis (aspartato - homoserina - homocisteína) se deben adaptar de
una manera óptima también la biosíntesis de cisteína y por
consiguiente la fijación compleja de azufre inorgánico así como el
metabolismo de Cl.
Por estas razones, la preparación por
fermentación de L-metionina no ha sido estudiada muy
intensamente en el pasado. Sin embargo, en los últimos años se han
hecho sin embargo decisivos progresos en el contexto de la
optimización del metabolismo de serina y de cisteína, por lo que
también aparece ahora como realista una preparación por fermentación
de L-metionina. Unos primeros trabajos en esta
dirección han sido descritos, como consecuencia de ello, hace poco
tiempo en el estado de la técnica.
Para la preparación por fermentación de
L-metionina se conocen en el estado de la técnica
los siguientes genes/alelos, cuyo empleo puede conducir a una
sobreproducción de L-metionina:
- -
- alelos metA, tal como se describen en una solicitud de patente del mismo solicitante presentada el 11.10. 2002 o en el documento JP2000139471A.
- Estos alelos metA codifican trans-succinilasas de O-homoserina, que están sujetas a una inhibición de disminuida de retroalimentación (en inglés feedback) por la L-metionina. Por consiguiente, la formación de O-succinil-homoserina se desacopla ampliamente del nivel de metionina de la célula.
- -
- una deleción (supresión) metJ, tal como se describe en el documento JP2000139471A.
- El gen de metJ codifica un regulador génico central del metabolismo de la metionina y desempeña por consiguiente un cometido decisivo en el control de la expresión de los genes de biosíntesis de metionina.
A partir del estado de la técnica es asimismo
evidente que ciertas medidas conocidas, que garantizan una síntesis
mejorada de L-serina y L-cisteína,
tienen una influencia positiva sobre la producción de
L-metionina.
Es misión del presente invento poner a
disposición una cepa de microorganismos que haga posible una
sobreproducción de L-metionina. Una misión adicional
es la de poner a disposición un procedimiento para la preparación de
L-metionina mediante la cepa de microorganismos
conforme al invento.
El problema planteado por la misión mencionada
en primer término se resuelve mediante una cepa de microorganismos,
que se puede producir a partir de una cepa de partida, la cual está
caracterizada porque tiene una actividad, aumentada con respecto a
la de la cepa de partida, del producto génico de yjeH o de un
producto génico de una variante de alelo funcional del gen yjeH con
una identidad entre secuencias mayor que 30% con respecto a SEQ ID
No. 1, permaneciendo sin embargo conservada la actividad enzimática
del respectivo producto génico.
Un aumento de la actividad del producto génico
de yjeH se presenta, en el sentido del presente invento, también en
el caso de que, mediante un cantidad aumentada del producto génico
en la célula, se alcanza una actividad global elevada en la célula y
por consiguiente permanece ciertamente inalterada la actividad
específica del producto génico, pero se aumenta la actividad del
producto génico de yjeH por célula.
El gen yjeH de Escherichia coli fue
identificado en el marco de la secuenciación del genoma (Blattner y
colaboradores 1997, Science 277:1453-1462) como
marco abierto de lectura y codifica una proteína con 418
aminoácidos. Hasta ahora, no se pudo asignar ninguna función
fisiológica al gen yjeH. También una investigación en bancos de
datos para buscar proteínas con una homología entre secuencias
(algoritmo FASTA de GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group
(GLG) Madison, Wisconsin) proporciona pocas conclusiones, puesto que
se indican similaridades significativas solamente con respecto a
proteínas, cuya función es asimismo desconocida.
El gen yjeH y el producto génico de yjeH (la
proteína YjeH) son caracterizados por las secuencias SEQ ID No. 1 y
respectivamente SEQ ID No. 2. Dentro del marco del presente invento,
se han de considerar como alelos yjeH de manera preferida los genes
que en el caso de un análisis con el algoritmo BESTFIT (GCG
Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin)
presentan una identidad entre secuencias mayor que 53%, de manera
especialmente preferida mayor que 70%, siempre y cuando que se trate
de variantes funcionales, que se derivan por deleción (supresión),
inserción o sustitución de nucleótidos a partir de la secuencia
representada en SEQ ID No. 1, conservándose sin embargo la actividad
enzimática del respectivo producto génico.
Asimismo, las proteínas con una identidad entre
secuencias mayor que 30% (algoritmo BESTFIT (GCG Wisconsin Package,
Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin), preferiblemente
mayor que 53% se han de entender como proteínas homólogas de la
YjeH. Es especialmente preferida una identidad entre secuencias
mayor que
70%.
70%.
Los microorganismos conformes al invento, que
tienen una actividad del producto génico de yjeH, que es elevada con
respecto a la cepa de partida, se pueden producir con técnicas
clásicas de la biología molecular.
Como cepas de partida se adecuan en principio
todos los organismos, que tienen la ruta de biosíntesis para formar
L-metionina, que son accesibles a procedimientos de
recombinación y que son cultivables por fermentación. Tales
microorganismos pueden ser hongos, levaduras o bacterias.
Preferiblemente, se trata de bacterias del grupo filogenético de las
Eubacterias. Son especialmente preferidos los microorganismos de la
familia de las Enterobacteriaceas y en particular los de la especie
Escherichia coli.
La elevación de la actividad del producto génico
de yjeH en el microorganismo conforme al invento se consigue por
ejemplo mediante una expresión aumentada del gen yjeH. En tal caso
se puede haber elevado el número de copias del gen yjeH en un
microorganismo y/o se puede haber aumentado, mediante promotores
apropiados la expresión del gen yjeH. Como una expresión aumentada
ha de entenderse en tal caso preferiblemente el hecho de que el gen
yjeH es expresado con una intensidad por lo menos doble de la que se
presenta en la cepa de partida.
La elevación del número de copias del gen yjeH
en un microorganismo se puede llevar a cabo con métodos conocidos
por un experto en la especialidad. Así, por ejemplo, el gen yjeH se
puede clonar en vectores plásmidos con un número múltiplo de copias
por célula (p. ej. pUC19, pBR322, pACYC184 para Escherichia
coli) e incorporar en el microorganismo. Alternativamente, el
gen yjeH se puede integrar múltiples veces en el cromosoma de un
microorganismo. Como procedimiento de integración, se pueden usar
los sistemas conocidos con bacteriófagos temperentes, plásmidos
integrativos o la integración a través de una recombinación homóloga
(p. ej. Hamilton y colaboradores, 1989, J. Bacteriol. 171:
4617-4622).
Se prefiere la elevación del número de copias
mediante clonación de un gen yjeH en vectores plásmidos bajo el
control de un promotor. Se prefiere especialmente la elevación del
número de copias en Escherichia coli por clonación de un gen
yjeH en un derivado de pACYC tal como p. ej. B.
pACYC184-LH (depositado de acuerdo con el Convenio
de Budapest en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen [Colección alemana para microorganismos y cultivos
celulares], Braunschweig, el 18.8.95 bajo el número DSM 10172).
Como región de control para la expresión de un
gen yjeH codificado por un plásmido, puede servir la región natural
de promotor y de operador del gen.
La expresión aumentada de un gen yjeH se puede
efectuar, sin embargo, en particular también mediante otros
promotores. Correspondientes sistemas de promotores tales como, por
ejemplo en Escherichia coli, el promotor constitutivo GAPDH
del gen gapA o los promotores inducibles lac, tac, trc, lambda, ara
o tet, son conocidos para un experto en la especialidad (Makrides S.
C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538). Tales
construcciones artificiales se pueden utilizar de una manera de por
sí conocida en plásmidos o cromosómicamente.
Además, una expresión aumentada se puede
conseguir mediante el recurso de que unas señales de comienzo de la
traducción, tales como p. ej. el sitio de fijación a ribosomas o el
codón de iniciación del gen, están presentes en una secuencia
optimizada en la respectiva construcción artificial o porque codones
raros según el "uso de codones" (del inglés "codon usage")
se intercambien por codones que aparecen con más frecuencia.
Cepas de microorganismos con las mencionadas
modificaciones son formas preferidas de realización del invento.
La clonación de un gen yjeH en vectores
plásmidos se efectúa por ejemplo por medio de una amplificación
específica mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR)
mediando empleo de cebadores específicos, que abarcan el gen
completo de yjeH, y por una subsiguiente ligación con fragmentos de
ADN de vectores.
Como vectores preferidos para la clonación de un
gen yjeH se utilizan plásmidos, que ya contienen promotores para la
expresión aumentada, por ejemplo el promotor constitutivo GAPDH del
gen gapA de Escherichia coli.
El invento se refiere por consiguiente también a
un plásmido, que está caracterizado porque contiene un gen yjeH, tal
como se reproduce en SEQ ID No. 1, con un promotor.
Además, son especialmente preferidos los
vectores que ya contienen un gen/alelo, cuyo empleo conduce a una
inhibición disminuida de la retroalimentación del metabolismo de
L-metionina, tal como por ejemplo un alelo metA
mutado (que se describe en la solicitud de patente alemana
DE-A-10247437). Tales vectores hacen
posible la producción directa de cepas de microorganismos conformes
al invento con una alta sobreproducción de aminoácidos a partir de
una cepa arbitraria de microorganismos, puesto que tal plásmido da
lugar también a una disminución de la inhibición de la
retroalimentación del metabolismo de metionina en un
microorganismo.
El invento se refiere, por consiguiente, también
a un plásmido que está caracterizado por el hecho de que contiene un
elemento genético para la desregulación del metabolismo de
metionina, así como un gen yjeH con un promo-
tor.
tor.
Mediante un método corriente de transformación
(p. ej. de electroporación), los plásmidos que contienen el yjeH se
incorporan en microorganismos y se seleccionan, por ejemplo mediante
la resistencia a antibióticos, en clones portadores de los
plásmidos.
El invento se refiere por consiguiente también a
un procedimiento para la producción de una cepa de microorganismos
conforme al invento, que está caracterizado porque en una cepa de
partida se incorpora un plásmido conforme al invento.
Son especialmente preferidas como cepas para la
transformación con plásmidos conformes al invento, aquellas que en
el cromosoma ya tienen alelos, que asimismo pueden favorecer una
producción de L-metionina, tales como por
ejemplo
- -
- una deleción (supresión) metJ (como se describe en el documento JP2000139471A) o
- -
- alelos, que dan lugar a una mejorada puesta a disposición de serina, tales como variantes serA resistentes a la retroalimentación (tal como se describen por ejemplo en los documentos EP0620853B1 o EP0931833A2)
- -
- o genes, que dan lugar a una mejorada puesta a disposición de cisteína, tales como variantes cysE resistentes a la retroalimentación (tal como se describen por ejemplo en el documento de solicitud de patente internacional WO 97/15673).
La producción de L-metionina con
ayuda de una cepa de microorganismos conforme al invento se efectúa
en un fermentador de acuerdo con procedimientos en y de por sí
conocidos.
El invento se refiere, por consiguiente, también
a un procedimiento para la preparación de
L-metionina, el cual está caracterizado porque una
cepa de microorganismos conforme al invento se emplea en una
fermentación y la L-metionina producida se separa a
partir de la tanda de fermentación.
La cultivación de la cepa de microorganismos en
el fermentador se efectúa como un cultivo continuo, como un cultivo
discontinuo (en inglés batch) o preferiblemente como un cultivo
discontinuo con alimentación o semi-continuo (en
inglés fed-batch). De manera especialmente
preferida, una fuente de C se añade dosificadamente de un modo
continuo durante la fermentación.
Como fuente de C sirven preferiblemente
azúcares, alcoholes de azúcares o ácidos orgánicos. De manera
especialmente preferida, en el procedimiento conforme al invento se
emplean como fuentes de C glucosa, lactosa o glice-
rol.
rol.
Se prefiere la adición dosificada de la fuente
de C en una forma, que garantiza que el contenido de la fuente de C
en el fermentador sea mantenido durante la fermentación en un
intervalo de 0,1- 50 g/l. Se prefiere especialmente un intervalo de
0,5-10 g/l.
Como fuente de N se utilizan en el procedimiento
conforme al invento, de manera preferida, amoníaco, sales de amonio
o materiales hidrolizados de proteínas. En el caso de la utilización
de amoníaco como agente de corrección para la regulación del pH (pH
- estatización), esta fuente de N se añade dosificadamente de modo
posterior regularmente durante la fermentación.
Como otras adiciones a medios se pueden añadir
sales de los elementos fósforo, cloro, sodio, magnesio, nitrógeno,
potasio, calcio, hierro y, en cantidades de vestigios (trazas) (es
decir en concentraciones de micromoles (\muM)), sales de los
elementos molibdeno, boro, cobalto, manganeso, zinc y níquel.
Además, se pueden añadir al medio ácidos
orgánicos (p. ej. acetato, citrato), aminoácidos (p. ej. leucina) y
vitaminas (p. ej. B1, B12).
Como fuentes complejas de sustancias nutritivas
pueden pasar a emplearse p. ej. un extracto de levadura, agua de
maceración de maíz, harina de soja o un extracto de malta.
La temperatura de incubación para
microorganismos mesófilos es de manera preferida de
15-45ºC, de manera especialmente preferida de
30-37ºC.
La fermentación se lleva a cabo preferiblemente
en condiciones aerobias de crecimiento. La incorporación del oxígeno
en el fermentador se efectúa con aire a presión o con oxígeno
puro.
El valor del pH del medio de fermentación está
situado durante la fermentación preferiblemente en el intervalo de
pH de 5,0 a 8,5; es especialmente preferido un valor del pH de
7,0.
Para la preparación de
L-metionina se puede alimentar durante la
fermentación una fuente de azufre. De manera preferida, pasan a
emplearse en tal caso sulfatos o tiosulfatos.
Los microorganismos, que se fermentan de acuerdo
con el procedimiento, segregan L-metionina en el
medio de cultivo según un proceso discontinuo o
semi-continuo después de una fase de crecimiento, en
un período de tiempo de 10 a 150 horas.
La L-metionina producida se
puede obtener con medidas corrientes para el aislamiento de
aminoácidos a partir de caldos de fermentador (p. ej. procedimientos
de intercambiadores de iones, cristalización, etc.).
Los siguientes Ejemplos sirven para la
explicación adicional del invento. Como una cepa de bacterias con un
plásmido conforme al invento con el gen yjeH, que se adecua para la
preparación de L-metionina conforme al invento, se
depositó la cepa W3110\DeltaJ/pKP450 en la DSMZ (Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142
Braunschweig) bajo el número DSM 15421 conforme al Convenio de
Budapest.
\newpage
Ejemplo
1
Con el fin de poner al gen yjeH bajo el control
de un promotor constitutivo, se construyó primeramente un vector de
base con el promotor constitutivo GAPDH del gen gapA para la
glicerol-aldehído-3-deshidrogenasa
de Escherichia coli. Para esto, se llevó a cabo una reacción
en cadena de polimerasa con los cebadores
GAPDHfw: (SEQ. ID. NO:3)
GAPDHrevl: (SEQ. ID. NO: 4)
y con un ADN cromosomal de la cepa
de E. coli W3110 (ATCC27325). El resultante fragmento de ADN
se purificó con ayuda de una electroforesis en gel de agarosa y a
continuación se aisló (con el estuche de extracción en gel Qiaquick
Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Alemania). Después de esto, el
fragmento se trató con las enzimas de restricción PacI/MluI y se
clonó en el vector pACYC184-LH, asimismo cortado con
PacI/MluI, (depositado de acuerdo con el Convenio de Budapest en la
Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares,
Braunschweig, el 18.8.95 bajo el número DSM 10172). La nueva
construcción artificial se denominó con el nombre
pKP228.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El gen yjeH procedente de Escherichia
coli, cepa W3110, se amplificó con ayuda de la reacción en
cadena de polimerasa. Como cebadores específicos sirvieron los
oligonucleótidos
yjeH-fw: (SEQ. ID. NO: 5)
- 5'-ATT GCT GGT TTG CTG CTT-3'
y
yjeH-rev: (SEQ. ID. NO: 6)
- 5'-AGC ACA AAA TCG GGT GAA-3'
así como ADN cromosomales de la
cepa W3110 de E. coli (ATCC27325) como matriz. El resultante
fragmento de ADN se purificó mediante una electroforesis en gel de
agarosa y se aisló (con el Qiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen,
Hilden, Alemania). La clonación se efectuó mediante ligación en
extremo romo (en inglés blunt end) con un vector pKP228 cortado con
BglII, cuyos extremos colgantes (sobresalientes) en 5' se rellenaron
con una enzima de Klenow. Mediante el modo de proceder indicado, el
gen yjeH se coloca detrás del promotor GAPDH de tal manera que la
transcripción puede ser iniciada desde allí. El vector resultante
lleva la denominación
pKP450.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un alelo metA descrito en la solicitud de
patente alemana DE-A-10247437 del
mismo solicitante presentada el 11.10.2002, que codifica una
O-homoserina - trans-succinilasa
resistente a la retroalimentación, se amplificó mediante una
reacción en cadena de polimerasa con el molde (en inglés template)
pKP446 (asimismo descrito en la solicitud de patente
DE-A-10247437) y los cebadores
metA-fw (SEQ. ID. NO: 7)
metA-rev (SEQ. ID.
NO:
8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En tal caso se generaron sitios terminales de
corte para la endonucleasas de restricción NcoI y SacI. El fragmento
de ADN obtenido se digirió precisamente con estas endonucleasas, se
purificó, y se clonó en el vector pKP450 cortado con NcoI/SacI. El
plásmido resultante recibió la denominación pKP451.
Con el fin de producir un plásmido testigo con
un alelo metA, pero sin el gen yjeH, se suprimió el gen yjeH a
partir de pKP451. Para esto, el pKP451 se cortó con Ecl136II y PacI,
los extremos colgantes se digirieron con una enzima de Klenow y el
vector se volvió a ligar. El plásmido así obtenido lleva la
denominación pKP446AC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los genes metJ/B se amplificaron mediante una
reacción en cadena de polimerasa con los cebadores
metJ-fw: (SEQ. ID. NO: 9)
- 5'-GAT CGC GGC CGC TGC AAC GCG GCA TCA TTA AAT TCG A-3'
y
metJ-rev: (SEQ. ID. NO: 10)
- 5'-GAT CGC GGC CGC AGT TTC AAC CAG TTA ATC AAC TGG-3'
y un ADN cromosomal obtenido a
partir de Escherichia coli W3110 (ATCC27325). El fragmento,
que contenía 3,73 kilobases, se purificó, se digirió con la
endonucleasa de restricción NotI y se clonó en el vector
pACYC184-LH cortado con NotI (véase el Ejemplo 1).
Después de esto se introdujo en el gen metJ, junto al sitio de corte
interno con AflIII, un casete de resistencia a kanamicina. Para
esto, se digirió primeramente con AflIII y se produjeron extremos
lisos con la enzima de Klenow. El casete de kanamicina se obtuvo a
su vez mediante restricción con PvuII a partir del vector pUK4K
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) y se introdujo
(insertó) por ligación en el gen metJ. A partir del vector pKP440,
producido de esta manera se obtuvo seguidamente el casete metJ::kan
como un fragmento lineal mediante restricción con NotI, y se integró
en el cromosoma de acuerdo con el método de Winans y colaboradores
(J. Bacteriol. 1985, 161:1219-1221) en la cepa
JC7623 de recBC/sbcB (E. coli Genetic Stock Center CGSC5188).
Como última etapa se transdujo finalmente la mutación metJ::kan
mediante transducción con P1 (Miller, 1972, Cold Spring Harbour
Laboratory, Nueva York, páginas 201-205) en la cepa
de tipo silvestre W3110 (ATCC27325) y con esto se produjo la cepa
W3110\DeltaJ.
Después de la verificación de la inserción de
metJ::kan, la cepa W3110\DeltaJ se transformó en cada caso con los
plásmidos portadores de yjeH y respectivamente con los plásmidos
testigos, y se seleccionaron con tetraciclina unos correspondientes
transformantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Como cultivo preliminar para la fermentación se
inocularon con las cepas de producción 20 ml de un medio LB (10 g/l
de triptona, 5 g/l de un extracto de levadura, 10 g/l de NaCl), que
adicionalmente contenía 15 mg/l de tetraciclina, y se incubaron en
un agitador-sacudidor a 30ºC y 150 rpm. Después de
siete horas, toda la tanda se transfirió a 100 ml de un medio SM1
(12 g/l de K_{2}HPO_{4}; 3 g/l de KH_{2}PO_{4}; 5 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}; 0,3 g/l de MgSO_{4} x 7 H_{2}O;
0,015 g/l de CaCl_{2} x 2 H_{2}O; 0,002 g/l de FeSO_{4} x 7
H_{2}O; 1 g/l de Na_{3}citrato x 2 H_{2}O; 0,1 g/l de NaCl; 1
ml/l de una solución de oligoelementos consistente en 0,15 g/l de
Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O; 2,5 g/l de Na_{3}BO_{3}; 0,7 g/l
de CoCl_{2} x 6 H_{2}O; 0,25 g/l de CuSO_{4} x 5 H_{2}O; 1,6
g/l de MnCl_{2} x 4 H_{2}O; 0,3 g/l de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O),
que había sido suplementado con 5 g/l de glucosa; 0,5 mg/l de
vitamina B_{1} y 15 mg/l de tetraciclina. La incubación ulterior
se efectuó a 30ºC durante 17 horas a 150 rpm.
\newpage
Ejemplo
6
Como fermentador sirvió un aparato Biostat B de
la entidad Braun Biotech (Melsungen, Alemania) con un volumen máximo
de cultivo de 2 l. Con el cultivo preliminar descrito en el Ejemplo
5 (densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 3) el fermentador se
inoculó con 900 ml de un medio SM1, que se había suplementado con 15
g/l de glucosa, 10 g/l de triptona, 5 g/l de un extracto de
levadura, 3 g/l de Na_{2}S_{2}O_{3} x 5H_{2}O, 0,5 mg/l de
vitamina B_{1}, 30 mg/l de vitamina B_{12} y 15 mg/l de
tetraciclina. Durante la fermentación se ajustó una temperatura de
32ºC y el valor del pH se mantuvo constante en un valor de 7,0
mediante adición dosificada de amoníaco al 25%. El cultivo se gaseó
con aire a presión esterilizado a razón de 5 vol/vol/min y se agitó
con un número de revoluciones del agitador de 400 rpm (revoluciones
por minuto). Después de haber descendido la saturación con oxígeno a
un valor de 50%, se aumentó el número de revoluciones a través de un
aparato de control hasta un valor de 1.500 rpm, a fin de obtener una
saturación con oxígeno de 50% (determinada con una sonda de
pO_{2}, calibrada a una saturación de 100% a 900 rpm). Tan pronto
como el contenido de glucosa en el fermentador hubo descendido desde
inicialmente 15 g/l hasta aproximadamente 5-10 g/l,
se efectuó una adición dosificada de una solución de glucosa al 56%.
La alimentación se efectuó con un caudal (velocidad de flujo) de
6-12 ml/h, siendo mantenida constante entre
0,5-10 g/l la concentración de glucosa en el
fermentador. La determinación de la glucosa se llevó a cabo con el
analizador de glucosa de la entidad YSI (Yellow Springs, Ohio,
EE.UU.). La duración de la fermentación fue de 48 horas. Después de
este período de tiempo, se sacaron muestras y las células se
separaron desde el medio de cultivo por centrifugación. Los
materiales sobrenadantes de cultivo resultantes se analizaron
mediante una reversed phase HPLC (cromatografía en fase líquida de
alto rendimiento de fase inversa) en una columna con LUNA 5 \mu
C18(2) de (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un caudal
de 0,5 ml/min. Como eluyente sirvió un ácido fosfórico diluido (0,1
ml de ácido fosfórico concentrado/l). La Tabla 1 muestra los
contenidos conseguidos de L-metionina en el material
sobrenadante de cultivo.
| Cepa | Genotipo (plásmido) | L-metionina [g/l] |
| W3110\DeltaJ/pKP228 | - | < 0,1 g/l |
| W3110\DeltaJ/pKP450 | yjeH | 0,8 g/l |
| W3110\DeltaJ/pKP451 | metA^{fbr} yjeH | 4,8 g/l |
| W3110\DeltaJ/pKP446AC | metA^{fbr} | 0,9 g/l |
| fbr: resistente a la retroalimentación. |
<110> Consortium fuer electrochemische
Industrie GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la preparación de
L-metionina por fermentación
\vskip0.400000\baselineskip
<130> yjeH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1652
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)... (1394)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacgcgt gaggcgagtc agtcgcgtaa tgc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccttaatt aagatctcat atattccacc agctatttgt tag
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para PCR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgctggtt tgctgctt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador para PCR
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipagcacaaaat cgggtgaa
\hfill18
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<210> 7
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para PCR
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcccatggc tccttttagt cattctt
\hfill27
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<210> 8
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para PCR
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<400> 8
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<400> 9
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<220>
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\hskip-.1em\dddseqskipgatcgcggcc gcagtttcaa ccagttaatc aactgg
\hfill36
Claims (15)
1. Cepa de microorganismos, que es apropiada
para la preparación por fermentación de L-metionina,
que se puede producir a partir de una cepa de partida,
caracterizada porque tiene una actividad, aumentada con
relación a la cepa de partida, de un producto génico de yjeH o de un
producto génico de una variante de alelo funcional del gen yjeH con
una identidad entre secuencias mayor que 30% con respecto a SEQ ID
No. 1, permaneciendo sin embargo conservada la actividad enzimática
del respectivo producto génico.
2. Cepa de microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque se trata de un hongo,
una levadura o una bacteria.
3. Cepa de microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque se ha elevado el
número de copias del gen yjeH en el microorganismo o se había
aumentado la expresión del gen yjeH por empleo de apropiados
promotores o de apropiadas señales de traducción.
4. Cepa de microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizada porque el promotor se
selecciona entre el grupo formado por el promotor constitutivo GAPDH
del gen gapA y promotores inducibles lac, tac, trc, lambda, ara y
tet.
5. Cepa de microorganismos de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque se trata de
una cepa de Escherichia coli, en la que la actividad
aumentada de un producto génico de yjeH se debe a la elevación del
número de copias del gen yjeH en un derivado de pACYC.
6. Plásmido, caracterizado porque
contiene un gen yjeH, tal como se reproduce en SEQ ID No. 1, con un
promotor.
7. Plásmido de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque adicionalmente contiene un elemento
genético para la desregulación del metabolismo de metionina.
8. Procedimiento para la preparación de una cepa
de microorganismos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque en una cepa de partida se incorpora un
plásmido de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7.
9. Procedimiento para la preparación de
L-metionina, caracterizado porque una cepa de
microorganismos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, se
emplea en una fermentación y se separa L-metionina a
partir de la tanda de fermentación.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque la cepa de
microorganismos se cultiva en un fermentador como un cultivo
continuo, como un cultivo discontinuo (batch) o como un cultivo
semi-continuo (fed-batch).
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque una fuente de C
se añade de modo continuo durante la fermentación
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque como fuente de
C sirven azúcares, alcoholes de azúcares o ácidos orgánicos.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque la adición
dosificada de la fuente de C se efectúa en una forma, que garantiza
que el contenido de la fuente de C en el fermentador sea mantenido
durante la fermentación en un intervalo de 0,1 - 50 g/l.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque como fuente de
N se utilizan amoníaco, sales de amonio o materiales hidrolizados de
proteínas.
15. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque la fermentación
se efectúa en condiciones aerobias de crecimiento.
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