MX2009000813A - Proceso de fermentacion alimentada de alta densidad celular para producir proteinas recombinantes. - Google Patents

Abstract

Métodos para producir proteínas, por ejemplo, proteínas 2086 meningocócicas recombinantes, utilizando fermentación alimentada con entrada continua de un inductor después de alcanzar un parámetro umbral, y opcionalmente entrada continua de una fuente de carbón, por ejemplo, una entrada a velocidad constante, para mejorar rendimientos de proteína, así como también composiciones de proteína de alta densidad y se proporcionan composiciones para uso en los métodos de la presente invención.

Description

PROCESO DE FERMENTACIÓN ALIMENTADA DE ALTA DENSIDAD CELULAR PARA PRODUCIR PROTEÍNAS RECOMBINANTES Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad para la Solicitud de Patente Provisional U.S No. 60/833,479, titulada PROCESO DE FERMENTACIÓN ALIMENTADA DE ALTA DENSIDAD CELULAR PARA PRODUCIR PROTEÍNAS RECOMBINANTES, presentado en Julio 27, 2006, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Campo de la Invención Esta solicitud se relaciona de manera general con métodos de fermentación alimentada novedosos que proporcionan expresión de proteína mejorada en sistemas bacterianos, así como también composiciones de proteínas de alta densidad y composiciones que se utilizan en métodos de fermentación alimentada novedosos.

Antecedente de la Invención Se han utilizado varias estrategias de fermentación para producir proteínas en cantidades suficientes para uso de laboratorio, clínico o comercial. Se ha utilizado la fermentación alimentada para proporcionar rendimiento de proteínas incrementados sobre aquellos suministrados por los métodos de fermentación de tandas únicas. La fermentación es un proceso en el que, después de una fase de tanda inicial, tiene lugar una fase en la que uno o más nutrientes se suministran al cultivo mediante alimentación.

De manera general, durante la fase de tanda, se hace crecer inicialmente las células a una concentración deseada. En esta fase, el crecimiento celular se amplifica y generalmente no se producirán proteínas objetivo a menos que uno agregue un inductor, tal como arabinosa, lactosa o beta-D-tiogalactosida isopropilo (IPTG), dependiendo del productor, o hay algún escape del promotor. Durante la fase de alimentación, la fuente de carbón y otros requerimientos alimentan típicamente un fermentador en una corriente líquida relativamente concentrada en una cierta velocidad de alimentación. Una vez se alcanza una densidad celular objetivo, se inicia una alimentación con el inductor o el inductor y otros nutrientes. En esta fase, el énfasis es sobre la producción de proteína por las células en crecimiento. El sustrato (que son, los nutrientes y el inductor) que alimenta el fermentador se utiliza en esta etapa generalmente para crecimiento celular y síntesis del producto. El crecimiento celular se controla por la velocidad de alimentación para obtener una producción de proteína y crecimiento celular óptimos. Durante la etapa de producción de proteína, se debe agregar un inductor para organismos recombinantes.

La expresión de proteína sobre un medio que comprende una fuente de carbón común tal como fuente ce carbón basada en glucosa u otro azúcar y un inductor es satisfactorio hasta que surgen condiciones limitantes al final de la fase de alimentación. Ejemplos de condiciones limitantes incluyen la concentración y oxígeno reducido, nutrientes reducidos tal como vitaminas, carbón, nitrógeno y acumulación de compuestos tóxicos en el medio de crecimiento.

Las estrategias de fermentación alimentada frecuentemente involucran diferentes formas de control de retroalimentación, que incluyen la retroalimentación directa e indirecta para controlar el suministro de nutrientes. Uno de tales métodos de fermentación alimentada involucra la aplicación de un algoritmo de control de retroalimentación al alimentar los nutrientes con el fin de controlar un parámetro de proceso en un punto establecido definido. Por ejemplo, el control directo de la alimentación se puede pasar en la medición de la concentración de nutrientes. El control de retroalimentación se relaciona luego directamente con la actividad celular a través de la fermentación. Los parámetros de control que se han utilizado para el control de retroalimentación de fermentación incluyen valor del pH, densidad celular medida en línea o tensión de oxígeno disuelto (DOT).

Sin embargo, la aplicación de los algoritmos de retroalimentación se acompaña de un número de desventajas. Una de tales desventajas es que la velocidad de alimentación depende de los parámetros de proceso actuales. Cualquier interrupción al proceso puede afectar el parámetro distorsionando así la velocidad de alimentación y el rendimiento de proteína resultante. Tales desventajas se magnifican cuando el proceso se hace a gran escala para producir mayores cantidades de proteínas.

Otra desventaja de las estrategias de fermentación alimentada empleadas previamente es que cuando se utiliza el control de retroalimentación, la velocidad de crecimiento específica no se puede controlar o predefinir exactamente, resultando en rendimientos subóptimos en procesos, en donde la formación de productos es dependiente del crecimiento.

Adicionalmente, cuando el flujo de carbón (por ejemplo, alta concentración de glucosa) en la ruta metabólica central excede la capacidad máxima del ciclo de Ácido Tricarboxílico (TCA), se pueden acumular subproductos. La acumulación de subproductos puede inhibir el crecimiento celular y la producción de proteína durante la fermentación.

Adicionalmente, las varias deficiencias de los métodos de fermentación alimentada frecuentemente resultan en uso ineficiente de componentes nutrientes. Como tal, los métodos pueden ser económicamente desventajosos, particularmente para la producción de proteína comercial a gran escala.

Métodos previos para la expresión de proteína recombinante a través de la fermentación alimentada, como se describió anteriormente, tiene varias deficiencias. Dada la importancia de producir cantidades de proteínas suficientes efectivas en costos para varios propósitos, subsiste la necesidad de un método de fermentación alimentada eficiente que resulte en mayor crecimiento celular, formación de producto incrementado (esto es, mayor rendimiento de proteína), y acumulación de subproductos reducida.

Breve descripción de la Invención La presente invención se relaciona con métodos de fermentación alimentada novedosos para producir altos rendimientos de proteínas recombinantes de forma inesperada.

Una modalidad de la presente invención proporciona un método para producir una proteína recombinante que comprende: cultivar una célula bacteriana recombinante para expresar una proteína recombinante que comprende agregar continuamente una fuente de carbón a un cultivo que comprende una célula bacteriana recombinante y agregar continuamente un inductor al cultivo después que el cultivo alcanza un parámetro umbral; y aislar la proteína recombinante del cultivo celular.

Una modalidad adicional de la presente invención proporciona un método para producir una proteína recombinante que comprende: (a) introducir en la célula anfitriona bacteriana un vector de expresión que codifica una proteína recombinante bajo el control de un promotor inducible para formar una célula bacteriana recombinante; (b) introducir la célula bacteriana recombinante dentro de un medio de cultivo para formar un cultivo celular (c) agregar una fuente de carbón al cultivo celular como una alimentación continua; (d) monitorear el crecimiento celular en el cultivo celular para alcanzar una densidad óptica umbral (OD600); (e) agregar un inductor del promotor inducible al cultivo celular como una alimentación continua una vez la densidad óptica umbral se alcance (OD60o); y (f) cosechar la proteína recombinante del cultivo celular.

Todavía una modalidad adicional de la presente invención proporciona un método para producir una proteína recombinante que comprende: cultivar una célula bacteriana recombinante para expresar una proteína recombinante al agregar continuamente un inductor a un cultivo que comprende una célula bacteriana después que el cultivo alcanza un parámetro umbral, en donde la célula bacteriana comprende una secuencia de ácido nucleico que corresponde a un gen del serogrupo B N. meningitidis.

De acuerdo con aún una modalidad adicional, la presente invención proporciona un método para producir una proteína 2086 recombinante (rP2086) que comprende (a) introducir en una célula anfitriona bacteriana un vector de expresión que codifica una proteína 2086 meningocóxica recombinante bajo el control de un promotor inducible para formar una célula bacteriana recombinante; (b) introducir la célula bacteriana recombinante a un medio de cultivo para formar un cultivo; (c) agregar una fuente de carbón al cultivo; (d) monitorear el crecimiento celular en el cultivo para el alcance de una densidad óptica umbral (OD); (e) agregar continuamente un inductor del promotor inducible al cultivo una vez la densidad celular del cultivo alcanza una densidad óptica de aproximadamente 70 a 110; y (f) cosechar la proteína 2086 meningocóxica recombinante del cultivo después de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas después del inicio de agregar continuamente el inductor.

De acuerdo con otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende: un cultivo bacteriano que comprende una proteína 2086 recombinante (rP2086) en una densidad de por lo menos aproximadamente 1.5 g/L basado en el volumen total del cultivo bacteriano.

De acuerdo con aún otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende: un medio de cultivo bacteriano que comprende una proteína 2086 meningocóxica recombinante (rP2086) preparada de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 : Fermentación alimentada en varias velocidades de alimentación constantes sin inducción.

Figura 2: Fermentación alimentada en varias velocidades de alimentación constantes sin inducción.

Figura 3: Inducción en varias densidad ópticas.

Figura 4: Inducción con varios niveles de arabinosa.

Figura 5: Efectos del método de adición de arabinosa en producto rl_P2086.

Figura 6: Efecto de velocidad de alimentación de arabinosa en producción rl_P2086.

Figura 7: Efecto de tiempo de inducción sobre expresión.

Figura 8: Fermentación alimentada para producción rl_P2086 subfamilia B.

Figuras 9a y 9b: SDS-PAGE y Western Blot de inducción de rl_P2086 subfamilia B, respectivamente.

Figura 10: Fermentación alimentada para producción rLP2086 subfamilia A.

Figura 11a y 11b: SDS-PAGE y Western Blot de inducción rl_P2086 subfamilia A, respectivamente.

Figura 12a, 12b y 12c: Alimentación dual de glucosa y arabinosa durante inducción.

Figura 13a: Fermentación alimentada E.coli subfamilia B ri_P2086 a escala de 100L.

Figura 13b: Fermentación alimentada E. coli subfamilia A rl_P2086 a escala de 100L.

Figura 14a: Fermentación alimentada E. coli subfamilia B rl_P2086 con alimentación dual glucosa y arabinosa a escala 100L.

Figura 14b: Fermentación alimentada E. coli subfamilia A rLP2086 con alimentación dual glucosa y arabinosa a escala 100L.

Descripción Detallada de la Invención Los métodos de la presente invención se basan en el descubrimiento sorprendente que se obtienen altos rendimiento de proteína inesperadamente mediante la fermentación alimentada con alimentación continua de un inductor durante la inducción en un medio de cultivo. Opcionalmente, una fuente de carbón se alimenta continuamente antes y/o durante la alimentación continua del inductor. Cuando se induce por arabinosa, aproximadamente 2-3g/L de una lipoproteína 2086 recombinante (rl_P2086) (que se expresa por un microorganismo que tiene una secuencia que corresponde al gen 2086 en el serogrupo B N. meningitidis) que se produce de acuerdo con una modalidad de la invención. Esto representa aproximadamente un incremento de 2-3 veces en el rendimiento del rl_P2086 mediante fermentación alimentada para ambas subfamilias A y B de la proteína 2086 comparado con un proceso de fermentación de tanda comparativo. Más aún, los métodos de la presente invención son fácilmente adaptables a producción a escala comercial de éstas y otras proteínas.

Para los propósitos de promover un entendimiento de las modalidades descritas aquí, se hará referencia a varias modalidades y se utilizará lenguaje específico para describir las mismas. La terminología utilizada aquí solo es para el propósito de describir modalidades particulares, y no está destinada a limitar el alcance de la presente invención. Como se utiliza a lo largo de esta descripción las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De la misma manera, la formas singulares de los términos tal como "medio" incluye referencia al "medio" plural y viceversa. Así, por ejemplo, una referencia a "un medio de cultivo" incluye una pluralidad de tales medios, así como también un único medio; y una referencia a "medio de cultivo" incluye una pluralidad de medios así como también un único medio.

El término "inductor", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier agente que induce, mejora o promueve la expresión de una proteína recombinante, con lo cual la expresión del gen bajo el control del promotor inducible se puede regular directamente mediante la concentración de ese agente.

El término "fuente de carbón", como se utiliza aquí, se refiere a una fuente de carbón y energía para células.

El término "alimentación", "alimento", "que alimenta" o "agregar continuamente", como se utiliza intercambiablemente aquí se refiere a agregar continuamente una sustancia durante un período de tiempo a diferencia de todo de una vez. Los términos contemplan una iniciación única y/o la terminación o múltiples inicios y/o puntos de parada para agregar continuamente la sustancia durante un proceso de fermentación.

El término "proteína recombinante" como se utiliza aquí se refiere a cualquier proteína o porción biológicamente activa de ésta (por ejemplo, una porción que retiene la actividad biológica de la proteína completa) que no es un gen marcador o indicador (por ejemplo, una proteína fluorescente verde) expresada a partir de aminoácidos que codifican material genético recombinante, que incluye péptidos, polipéptidos, proteínas, oligoproteínas y/o proteínas de fusión. Un producto de proteína recombinante puede incluir un producto terapéutico profiláctico o de diagnóstico.

Métodos de la Presente Invención Los métodos de la presente invención proporcionan inesperadamente altos rendimientos de proteínas a través de un proceso de fermentación alimentada novedoso que involucra agregar continuamente el inductor tal como arabinosa, a un medio de cultivo después que el cultivo alcanza un parámetro umbral. Una fuente de carbón, tal como glucosa se agrega generalmente a un cultivo que comprende una célula bacteriana recombinante antes de la fase de inducción. La fuente de carbón puede ser alimentada junto con el inductor. El inductor también puede servir como una fuente de carbón secundaria.

Una fuente de carbón, tal como glucosa, se agrega continuamente al medio de cultivo antes y/o durante la alimentación continua del inductor al medio de cultivo, de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Así, la alimentación continua de la fuente de carbón coincide con la alimentación continua del inductor, de acuerdo con una modalidad. La alimentación continua de la fuente de carbón puede continuar durante la alimentación continua del inductor o solo durante partes de esa duración. En otra modalidad, la alimentación continua de la fuente de carbón no coincide con la alimentación continua del inductor. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, el inductor y/o la fuente de carbón puede alimentar el cultivo a una velocidad constante.

El proceso de fermentación alimentada involucra varias etapas que resultan en la producción de la proteína deseada de acuerdo con una modalidad de la invención. En una etapa inicial, un vector de expresión que codifica un producto de proteína recombinante bajo el control de un promotor inducible se prepara y luego se introduce dentro de una célula anfitriona bacteriana. La célula anfitriona bacteriana se introduce dentro del medio de cultivo. Un inductor del promotor inducible alimenta el cultivo (esto es, el inductor se agrega dentro del cultivo continuamente durante un período de tiempo). El inductor puede alimentar el cultivo a una velocidad constante. Luego, el producto de proteína recombinante se cosecha del cultivo. La proteína recombinante producida de esta forma se puede purificar luego según se desea y/o se utiliza en cualquier forma adecuada tal como en una formulación profiláctica, terapéutica o para diagnóstico.

El rendimiento de proteína mejorado y/o alta densidad celular se alcanza inesperadamente mediante la fermentación alimentada con la alimentación a velocidad constante de un inductor, que proporciona un rendimiento de producto de proteína recombinante de aproximadamente un incremento de 2-3 veces según se compara con la fermentación de tanda, como se ilustra en los ejemplos suministrados adelante. Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a la fermentación a gran escala así como también a la fermentación a pequeña escala. La fermentación a "gran escala" como se utiliza aquí, se refiere a la fermentación en un fermentador que es por lo menos aproximadamente 1000L de capacidad volumétrica, esto es, volumen de trabajo, dejando el cuarto adecuado para cámara de aire. La fermentación a "escala pequeña" se refiere generalmenté a la fermentación en un fermentador que generalmente no es más de aproximadamente 100L de capacidad volumétrica, tal como 5L, 10L, 50L o 100L. Una ventaja demostrada del actual proceso de fermentación alimentada es que éste se puede utilizar para la producción de un producto de proteína recombinante en la escala de fermentador de 5-1 OL y se puede escalar a cualquier volumen. Por ejemplo, 100L, 150L, 250L, 500L, 1000L o más, sin limitación.

Inductores Los métodos descritos aquí se relacionan con la producción de proteína recombinante en donde la expresión de la proteína recombinante está bajo el control transcripcional de un promotor inducible, con lo cual la expresión del gen bajo el control del promotor inducible se puede regular directamente mediante la concentración del inductor presente en el medio de cultivo. El inductor se proporciona continuamente a un medio de cultivo, opcionalmente a una velocidad constante. El inductor se agrega al medio de cultivo una vez se ha alcanzado un parámetro umbral. Por ejemplo, una proteína recombinante puede estar bajo el control de un inductor araB (por ejemplo, ParaB) que se puede regular directamente mediante la concentración de arabinosa que se agrega a una velocidad constante al medio de cultivo. Inductores adecuados para uso en conjunto con la presente invención se conocen bien por las personas expertas en la técnica. Ejemplos de inductores de la presente invención se proporcionan adelante, sin limitación.

Promotor Inductor Promotor arabinosa, tal como, ParaB Arabinosa Plasminógeno humano Factor de necrosis de tumor Inhibidor Activador tipo 1 , Hpai-1 TNF Citocromo P-450 Toxinas Elemento Sensible al Metal CYP1A1 , RMRE Metales Pesados, Mamario de Ratón Virus de Tumor Glucocorticoides Colagenasa Ester de Forbol Estromolisina Ester de Forbol SV40 Ester de Forbol Proliferina Ester de Forbol ?-2-Macroglobulina IL-6 Gen MX de Murina Interferón, Virus de la enfermedad de Newcastle Vimectina Hormona Tiroide Estimulador de la Tiroides Suero Gen de la Hormona a HSP70 Ela, T Grande SV40 Factor de Necrosis de Antígeno de Tumor FMA Interferón Infección Vírica, dsRNA AMP Cíclico Somatostatina AMP Cíclico Fibronectina IPTG Promotor lac/operador Fuente de Carbón: Cualquier fuente de carbón adecuada, por ejemplo, glicerol, succinato, lactato, o fuente de carbón basada en azúcar, por ejemplo, glucosa, lactosa, sacarosa y fructuosa, se contemplan para uso en la presente invención, como se entenderá por una persona medianamente versada en la técnica. Por ejemplo, fuentes de carbón basadas en azúcar que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, sin limitación, polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros sacarida D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico, o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico que incluye homopolisacáridos y heteropolisacáridos por ejemplo, lactosa, amilopectina, almidón, almidón de hidroxietilo, amilasa, sulfato de dextrano, dextrano dextrinas, glicógeno, o la subunidad polisacárida de ácido mucopolisacárido, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tal como polisorbitol y polimantilol; heparina o heparán; o cualquier combinación de éstos, sin limitación. La glucosa es la fuente de carbón primaria de acuerdo con una modalidad de la invención. La arabinosa cuando se utiliza como el inductor, también puede servir como una fuente de carbón secundaria aunque ésta puede ser también una forma primaria de carbón. De acuerdo con una modalidad, las fuentes de carbón incluyen cualquiera de D-glucosa L-arabinosa, sacarosa, l-inositol, D-manitol, ß-D-fructosa, a-L ramnosa, D-xilosa, celulosa, o cualquier combinación de éstas. Se puede utilizar una o más de una fuente de carbón en la presente invención.

Sistemas de Expresión Bacterianos y Plásmidos: La invención también proporciona células bacterianas recombinantes que comprenden un vector de expresión, tal como un plásmido, que comprende una secuencia de control de expresión que tiene secuencias promotoras y secuencias iniciadoras y una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido deseado, la secuencia de nucleótido se ubica en 3' para el promotor y las secuencias iniciadoras. Cualquier secuencia de control de expresión adecuada y las combinaciones de célula anfitriona/vehículo de clonación se contempla como lo sabe la persona experta en la técnica basado en la descripción suministrada aquí.

Las secuencias de control de expresión y las combinaciones de célula anfitriona/vehículo de clonación se conocen bien en la técnica y se describen por vía de ejemplo, en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY. En general, las técnicas de ADN recombinantes involucran obtener por síntesis o aislamiento una secuencia de ADN que codifica la proteína recombinante de interés, e introducirla en un sistema de expresión de célula anfitriona/vector apropiado en donde éste se expresa, preferiblemente bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Cualquiera de los métodos descritos para la inserción de ADN dentro de un vector de expresión se pueden utilizar para ligar un promotor y otros elementos de control reguladores en sitios específicos dentro del vector recombinante seleccionado. Las células anfitrionas recombinadas se transforman luego, se infectan, se transducen o se transfieren con tales vectores o plásmidos mediante técnicas convencionales.

Una variedad de sistemas de célula anfitriona-vector (plásmido) se puede utilizar para expresar la proteína recombinante de interés. El sistema vector, tal como por ejemplo un sistema que incluye el promotor inducible arabinosa es compatible con la célula anfitriona utilizada. El ADN que codifica el producto de proteína recombinante de interés se inserta dentro de un sistema de expresión, y el promotor (preferiblemente el promotor inducible por arabinosa), y los otros elementos de control se ligan en sitios específicos dentro del vector de tal manera que cuando el vector se inserte dentro de una célula anfitriona (por transformación, transduccion o transfeccion, dependiendo del sistema de vector de célula anfitriona utilizado) el ADN que codifica el producto de proteína recombinante de interés se expresa por la célula anfitriona.

El vector se puede seleccionar de uno de los vectores víricos o vectores no víricos descritos anteriormente pero debe ser compatible con la célula anfitriona utilizada. El vector de ADN recombinante se puede introducir dentro de las células anfitrionas apropiadas (bacterias, virus, levadura, células de mamífero o similares) o transformación, transduccion, transfeccion, etc. (dependiendo del sistema de vector/célula anfitriona). Los sistemas de anfitrión-vector incluyen pero no se limitan a bacterias transformadas con ADN bacteriófago, ADN de plásmido o ADN cósmido.

La expresión en procaríotes del producto de proteína recombinante de interés se puede llevar a cabo en cualquier especie adecuada de cepa o bacteria, tal como E. coli, con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas de no fusión.

Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a una proteína codificada allí, al terminal amino o carboxi de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven típicamente a tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente, se introduce en vectores de expresión de fusión, un sitio de división proteolítico en la articulación del grupo funcional de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del grupo funcional de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento de cognato, incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Los vectores de expresión de fusión típica incluyen Pgex (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988), Pmal (New England Biolabs, Beverly; Mass.) y Prit5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan la glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión E maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo.

Ejemplos de vectores de expresión E. coli de no infusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteínas in Escherichia coli, Gene, 69, 301-315), y Pet lid (Studier et al. (1990) Use of 17 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods in Enzymology, 185, 60-89). La expresión del gen objetivo del vector pTrc se basa en la transcripción de polimerasa de ARN anfitrión de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión del gen objetivo del vector lid Pet se basa en la trascripción de un promotor de fusión 0-lag gn1 T7 mediado por un gen gnl J7 de polimerasa de ARN vírico o expresado. Esta polimerasa vírica se suministra por las cepas anfitrionas BL21 (DE3) o HMS I 74(DE3) de un profago residente que cosecha un gen gnl T7 bajo el control trnascripcional del promotor lacUV 5 promoter.

La secuencia reguladora de la construcción de vector es un promotor inducible de acuerdo con una modalidad. El uso de un promotor inducible permitirá niveles básales bajos de proteína activada a ser producidos por la célula durante el cultivo de rutina y expresión agregada. Posteriormente, las células pueden luego ser inducidas para expresar grandes cantidades de la proteína deseada durante la producción o detección. El promotor inducible se puede aislar de genomas víricos o celulares.

Los promotores inducibles que se regulan por compuestos suministrados exógenamente incluyen, sin limitación, el promotor arabinoso, el promotor metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor de virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa 17 (WO 98/10088); el promotor de insecto ecdisona (No ef al., 1996 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351), el sistema reprimible de tetraciclina (Gossen ef al., 1992 Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551), el sistema inducible de tetraciclina (Gossen et al. , 1995 Science, 268:1766-1769, ver también Harvey et al., 1998 Curr. Opin. Chem Biol, 2:512-518), el sistema inducible RU486 (Wang et al., 1997 Nat. Biotech., 15:239-243 and Wang ef al., 1997 Gene Ther., 4:432-441) y el sistema inducible de rapamicina (Magari ef al., 1997 J. Clin. Invest., 100: 2865-2872). De acuerdo con una modalidad de la invención, el promotor es un promotor inducible de arabinosa.

Cualquier célula anfitriona bacteriana adecuada se contempla para uso en la presente invención como se entenderá por la persona experta basado en la descripción suministrada aquí. Por ejemplo, bacterias adecuadas para este propósito incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus, o una combinación de éstas sin limitación. Cualquier cepa adecuada de cualquiera de tales bacterias adecuadas también se contempla por la presente invención. Adicionalmente, el uso de células mutadas como se reconocerá por la persona experta en la técnica, también se contempla por la presente invención. Una persona experta en la técnica será capaz de seleccionar fácilmente una célula anfitriona apropiada para uso bajo circunstancias específicas basado en la guía suministrada aquí.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles adecuados incluyen, sin limitación pTrc (Amann ef al. , 1988 Gene, 69:301 -315), los vectores de expresión arabinosa (por ejemplo, Pbad18, Guzman et al., 1995 J. Bacterio!., 177:4121 -4130), y pETIId (Studier et al., 1990 Methods in Enzymology, 185:60-89). La expresión del gen objetivo del vector pTrc se basa en la trascripción de polimerasa de ARN anfitrión de un promotor trp-lac híbrido. La expresión de gen objetivo del vector pETIId se basa en la trascripción de un promotor de fusión gn10-lac T7 mediado por una gn1 17 de polimerasa vírico coexpresado. Esta polimerasa vírica se suministra por las cepas anfitrionas BL21 (DE3) o HMS I 74(DE3) de un profago residente que cosecha un gen gn1 T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV5. El sistema PBAD se basa en el promotor arabinosa inducible que se regula por el gen araC. El promotor se induce de arabinosa.

Otras modalidades de la presente invención utilizan vectores de expresión regulados por arabinosa, o vectores en donde la expresión de la proteína recombinante de interés está bajo en control de un promotor arabinosa, por ejemplo, el promotor para el operón arabinosa E. coli, PBAD O PARA, sin limitación.

La secuencia de ácido nucleico (nucleótido) que codifica cualquier proteína deseada se contempla por la presente invención. La secuencia de nucleótido puede ser una secuencia de nucleótido de ocurrencia completa o parcialmente natural o una secuencia de nucleótido parcialmente alterada, o cualquier secuencia que híbrida a éstas bajo condiciones rigurosas. Las referencias aquí a las secuencias de ácido nucleico corresponden a un gen se refieren a cualquier secuencia de ácido nucleico que se puede expresar como la proteína deseada.

Por ejemplo, tales secuencias de ácido nucleico alteradas incluyen una eliminación de nucleótido, sustitución, que incluye transición y transversión o inserción, en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones determinadas 5' o 3' de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier parte en donde aquellas posiciones terminales, entremezclados individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótido se determina al multiplicar el número total de nucleótidos y cualquier secuencia de porcentaje numérico del respectivo porcentaje de identidad (dividido por 100) y restar ese producto de dicho número total de nucleótidos en dicha secuencia.

Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad con una cierta secuencia de ácido nucleico; una fuente variada degenerada de ésta o un fragmento de ésta, en donde la secuencia puede incluir hasta nn alteraciones de ácido nucleico sobre la región de polinucleótido completa de la secuencia de ácido nucleico, en donde n„ es el número máximo de alteraciones y se calcula por la fórmula: n„ = x„-(xn*y), en la que x„ es el número total de ácidos nucleicos de cualquier secuencia y y tiene un valor de 0.70, en donde cualquier producto no entero de xn y y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de restar tal producto de xn. Por supuesto, y también puede tener un valor de 0.80 para el 80%, 0.85 para el 85%, 0.90 para el 90%, 0.94 para el 94%, 0.95 para el 95%, 0.96 para el 96%, 0.97 para el 97%, 0.98 para el 98%, o 0.99 para el 99%, etc. Las alteraciones de una secuencia pueden crear mutaciones interruptoras, mutación de aminoácido o mutación por desplazamiento de marco de lectura en esta secuencia de codificación y por lo tanto alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido luego de tales alteraciones.

La presente invención contempla el uso de variantes degeneradas, o un fragmento de éstas. Como se define aquí, una "variante degenerada" es un polinucleótido que difiere de la secuencia de nucleótido (y fragmentos de ésta) debido a la degeneración del código genético, pero codifica a una misma proteína.

La secuencia de ácido nucleico puede comprender ADN, ADN cromosómico cADN y ARN y puede comprender adicionalmente nucleótidos heterólogos. De acuerdo con varias modalidades, el ácido nucleico híbrida a un cierto ácido nucleico, un complemento de éste, una variante degenerada de éste, o un fragmento de éste, bajo altas condiciones de hibridación rigurosas. En aún otras modalidades, el polinucleótido híbrida bajo condiciones de hibridación rigurosas intermedias.

Se apreciará que en los ácidos nucleicos se pueden obtener de fuentes naturales, sintéticas, o semisintéticas; adicionalmente, las secuencias de nucleótido pueden ser secuencias de ocurrencia natural, o se pueden relacionar por mutación, que incluye sustituciones de base sencillas o múltiples, eliminaciones, inserciones e inversiones, para tal una secuencia de ocurrencia natural. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN, ADN, monocatenario o bicatenario, de forma lineal o circular cerrada covalentemente.

Ejemplos de condiciones rigurosas se muestran en la Tabla de Condiciones Rigurosas adelante: las condiciones altamente rigurosas son aquellas que son por lo menos tan rigurosas como, por ejemplo, condiciones A-F; condiciones rigurosas son por lo menos tan rigurosas como, por ejemplo, condiciones G-L; y condiciones rigurosas reducidas son por lo menos tan reducidas, por ejemplo condiciones M-R.

CONDICIONES RIGUROSAS Condiciones Polinucleótido Longitud Temperatura Temperatura de rigurosas híbrido Híbrida de Hibridación lavado y (bp)1 y amortiguador" amortiguador" A ADN:ADN > 50 65EC; 1xSSC - 65EC; 0.3xSSC o- 42EC; 1xSSC, 50% formamida B ADN:ADN < 50 TB; 1xSSC TB; 1xSSC C ADN:ARN > 50 67EC; 1xSSC - 67EC; 0.3xSSC o- 45EC; 1xSSC, 50% formamida D ADN:ARN < 50 TD; 1xSSC TD; 1 xSSC E ARN:ARN > 50 70EC; "I xSSC - 70EC; 0.3xSSC o- 50EC; 1 xSSC, 50% formamida F ARN:ARN < 50 TF; 1xSSC Tf; 1xSSC G ADN:ADN > 50 65EC; 4xSSC - 65EC; 1 xSSC o- 42EC; 4xSSC, 50% formamida H ADN:ADN < 50 TH; 4xSSC TH; 4xSSC 1 ADN:ARN > 50 67EC; 4xSSC - 67EC; 1 xSSC 0- 45EC; 4xSSC, 50% formamida J ADN:ARN < 50 Tj; 4xSSC Tj; 4xSSC K ARN:ARN > 50 70EC; 4xSSC - 67EC; 1xSSC o- 50EC; 4xSSC, 50% formamida L ARN:ARN < 50 TL; 2xSSC TL; 2xSSC M ADN:ADN > 50 50EC; 4xSSC - 50EC; 2xSSC 0- 40EC; 6xSSC, 50% formamid N ADN:ADN < 50 TN; 6xSSC TN; 6xSSC 0 ADN:ARN > 50 55EC; 4xSSC - 55EC; 2xSSC 0- 42EC; 6xSSC, 50% formamida P ADN:ARN < 50 TP; 6xSSC TP; 6xSSC Q ARN:ARN > 50 60EC; 4xSSC - 60EC; 2xSSC o- 45EC; 6xSSC, 50% formamid R ARN:ARN < 50 TR¡ 4XSSC TR; 4xSSC bp1: La longitud híbrida es aquella anticipada por las regiones hibridadas de los polinucleótidos hibridantes. Cuando se híbrida un polínucleótido con un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, la longitud híbrida se asume que es aquella de polinucleótido hibridante. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida se hibridan, la longitud híbrida se puede determinar al alinear las secuencias de los polinucleótidos e identificar la región o regiones de complementariedades de secuencia óptimas. amortiguador": SSPE (IxSSPE is 0.15M NaCI, 10mM NaH2P04, y 1.25mM EDTA, pH 7.4) se pueden sustituir para SSC (1xSSC es 0.15M NaCI y 15mM de citrato de sodio) en la hibridación y amortiguadores de lavado; se desarrollan lavados durante 15 minutos después que se completa la hibridación.

TB a TR: La temperatura de hibridación para híbridos anticipados por ser menores de 50 pares bases de longitud debe ser 5-1 OEC menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares base de longitud Tm (EC) = 2 (# de A + T bases) + 4 (# de G + C bases). Para híbridos entre 18 y 49 pares base de longitud, Tm (EC) = 81.5 + 16.6 (logio [Na+]) + 0.41 (%G + C) - (600/N), en donde N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el amortiguador de hibridación ([Na+] para 1 xSSC = 0.165 M).

Ejemplos adicionales de condiciones de rigor para hibridación de polinucleótidos se proporcionan en Sambrook, J., E. F. Frtisch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harborm NY, chapters 9 and 1 1 , and Current Protocois in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons. Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4, incorporado aquí como referencia.

La invención contempla utilizar polinucleótidos que son completamente complementarios con aquellos polinucleótidos así como también secuencias anticodificantes. Las secuencias anticodificantes, también referidas como oligonucleótidos anticodificantes, incluyen secuencias administradas externamente y generadas internamente que bloquean I expresión de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención.

Las secuencias a nti codificantes de la invención comprenden, por ejemplo, aproximadamente 15-20 pares base, sin limitación. Las secuencias anticodificantes se pueden diseñar, por ejemplo, para inhibir la trascripción al evitar la unión del promotor a una secuencia no traducida en la dirección 5' o al evitar la traslación de un trascripto que codifica un polipéptido de la invención al evitar que la ribosoma se una.

Los polinucleotidos se pueden preparar u obtener en cualquier forma adecuada (por ejemplo, mediante síntesis química, de colecciones de ADN del organismo en si mismo) y puede tomar varias formas tal como, monocatenario, bicatenario, vectores, sondas, cebadores) como lo entenderá la persona experta en la técnica. El término "polinucleótido" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tal como aquellos que contienen estructuras modificadas. De acuerdo con implementaciones adicionales de la presente invención, los polinucleotidos comprenden una colección de ADN, tal como una colección de cADN.

Sistemas de Expresión de Proteína 2086: Un microorganismo recombinante capaz de expresar un polipéptido 2086 serogrupo B de Neisseria meningitidis se proporciona de acuerdo con una modalidad de la presente invención. El microorganismo recombinante comprende una secuencia de control de expresión que tiene secuencias de promotor y secuencias iniciadoras, y una secuencia de nucleótido que codifica para un polipéptido 2086, la secuencia de nucleótido se ubica en 3' a las secuencias iniciadoras y promotoras. En un aspecto adicional, se proporciona aquí una célula anfitriona que comprende un polinucleótido 2086 recombinante como se describe aquí y en la WO 03/063766 y WO 04/094596, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Como tal la presente invención proporciona un método para producir una proteína recombinante 2086, como se describe en la WO 03/063766 y WO 04/094596, por ejemplo, sin limitación.

Una vez las células anfitrionas que expresan una proteína deseada o polipéptido de la invención se han construido por transformación, transfección o infectando células anfitrionas con plásmidos que contienen el polinucleótido 2086 correspondiente, las células anfitrionas se cultivan bajo condiciones tales que los polipéptidos se expresan de acuerdo con los métodos de la presente invención. El polipéptido puede luego ser aislado sustancialmente libre de componentes de células anfitrionas contaminantes por técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el arte.

Parámetros de Umbral: Se pueden utilizar varios parámetros para monitorear y controlar el progreso del cultivo en términos de crecimiento celular y expresión de proteína recombinante. Tales parámetros incluyen, pero no se limitan a, densidad óptica (OD), el oxígeno disuelto (DO), pH, consumo de nutrientes/energía (tal como fuente de carbón), acumulación de subproductos metabólicos (por ejemplo, ácido acético), tiempo de cosecha y temperatura. Cualquier parámetro o combinación adecuada de parámetros se contempla para uso en la presente invención, como lo podrá entender una persona mediadamente versada en la técnica, basado en la guía suministrada aquí.

Un parámetro umbral se establece para determinar el punto en el que el inductor se agrega continuamente al cultivo (esto es, alimento al cultivo durante el tiempo). El parámetro umbral es un parámetro predeterminado. Un parámetro apropiado, tal como densidad óptica predeterminada, se determina fácilmente por la persona experta en la técnica basado en la guía proporcionada aquí de acuerdo con varias modalidades de la presente invención. Se puede utilizar un parámetro de umbral o una combinación de parámetros de umbral.

El parámetro o combinación de parámetros se pueden monitorear en cualquier intervalo de tiempo adecuado en el cultivo, por ejemplo, concentraciones de glucosa y OD600 se pueden monitorear una hora, media hora o intervalos de cuarto de hora sin limitación.

La densidad óptica se utiliza como el parámetro umbral para la iniciación de inductor continuo de alimentación de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Cuando la densidad celular del cultivo alcanza un parámetro umbral predeterminado, tal como una densidad óptica de aproximadamente 70 a aproximadamente 110, el inductor alimenta luego el cultivo como se describe aquí. Un rango más angosto se puede establecer para el parámetro umbral. Por ejemplo, la presente invención contempla que uno puede iniciar la adición continua del inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza una densidad óptica de aproximadamente 70 a aproximadamente 105, aproximadamente 75 a aproximadamente 100, aproximadamente 75 a aproximadamente 95, aproximadamente 75 a aproximadamente 85, aproximadamente 76 a aproximadamente 84, aproximadamente 78 a aproximadamente 82, o aproximadamente 80, de acuerdo con modalidades de la presente invención.

La presente invención también contempla el uso de parámetros de umbral para señalizar la iniciación y/o terminación de la alimentación de la fuente de carbón.

Cualquier dispositivo o combinación de dispositivos se contempla para uso en el monitoreo de los parámetro de umbral, como lo conocerán las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, una sonda o combinación de sondas para medir un parámetro de umbral, se puede montar en el dispositivo de fermentación (el "fermentador") y cualquier forma adecuada, sin limitación.

Velocidades de Alimentación Constantes: Las velocidades de alimentación constantes se refieren a la velocidad en la que se agrega el inductor y/o fuente de carbón al cultivo. El inductor se agrega al cultivo después que se ha alcanzado un parámetro umbral. La fuente de carbón también se puede agregar después que se alcanza un parámetro umbral (y de la misma forma, la adición de la fuente de carbón se puede termina luego de alcanzar un parámetro umbral). Estos parámetros umbral incluyen, sin limitación, densidad óptica (OD) oxígeno disuelto (DO), pH, la concentración de nutriente en el medio de cultivo, la concentración total de la primer fuente de carbón agregada al medio de cultivo, o cualquier combinación de éstos.

Cualquier velocidad de constante adecuada se utiliza para agregar continuamente el inductor y/o fuente de carbón al cultivo como lo entenderá una persona experta en la técnica basado en la guía proporcionada aquí. De acuerdo con varias modalidades de la presente invención, se determina una velocidad constante adecuada mediante DO-DO-stat, como se describe en los ejemplos adelante. Por ejemplo, una velocidad de alimentación equivalente al controlador DO-stat se puede seleccionar al agregar suficiente glucosa para llevar la concentración hasta 15 y 24 g/L cada hora, sin limitación.

Por ejemplo, y/o fuente de carbón se puede agregar al cultivo a una velocidad constante hasta una cierta cantidad de inductor y/o fuente de carbón, tal como de aproximadamente 4 g/l a aproximadamente 40 g/L, tal como, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 9.5 g/L, 9.75 g/L, 10 g/L, 10.25 g/L, 10.5 g/L, 11 g/L, 12 g/L, 13 g/L, 14 g/L, 15 g/L, 16 g/L, 17 g/L, 18 g/L, 19 g/L, 20 g/L, 21 g/L, 22 g/L, 23 g/L, 24 g/L, 25 g/L, 26 g/L, 27 g/L, 28 g/L, 29 g/L, 30 g/L, 31 g/L, 32 g/L, 33 g/L, 34 g/L, 35 g/L, 36 g/L, 37 g/L, 38 g/L, 39 g/L, 40 g/L, basado en el volumen total del cultivo, se ha agregado al cultivo, sin limitación. De acuerdo con varias modalidades la cantidad total de inductor y/o fuente de carbón que alimenta al cultivo es de aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 20 g/L, 7 g/L a aproximadamente 15 g/L, 8 g/L a aproximadamente 14 g/L, 9 g/L a aproximadamente 11 g/L, o aproximadamente 10 g/L.

La cantidad total de inductor a ser agregada al cultivo se puede compensar por la cantidad total de fuente de carbón agregada al cultivo. Por ejemplo, cuando la fuente de carbón es glucosa y el inductor es arabinosa, la cantidad de inductor agregada se puede reducir mediante la adición de glucosa. Por ejemplo, en una modalidad un total de 10 g/L de un inductor (esto es, tal como arabinosa se agrega a un cultivo de 11 g/L de fuente de carbón, tal como glucosa se agrega. El rendimiento de proteína obtenida en esta forma se aproxima al rendimiento cuando una cantidad total de 20 g/L de arabinosa (esto es, 20,000 g o 20 kg total en un cultivo de 1.000L de arabinosa) y no se utiliza glucosa. Así, esta compensación proporcionada por los métodos actuales es ventajosa dado el alto costo de la arabinosa con relación a la glucosa.

De acuerdo con varias modalidades de la invención, la velocidad constante en la que se agrega la fuente de carbón y/o o inductor al cultivo se puede establecer en el rango de aproximadamente 1.5 g/L a aproximadamente 24 g/L cada hora. Por ejemplo, cuando la fuente de carbón es glucosa, la velocidad constante para la adición de la glucosa puede incluir, sin limitación, 1.8 g de glucosa/L/h, 3.3 g de glucosa/L/h, 6.7 g de glucosa/L/h, 15 g de glucosa/L/h, 16.4 g glucosa/L/h, 18 g glucosa/L/h, 24 g glucosa/L/h, etc. 16.4 g glucosa/L/h, 18 g glucosa/L/h, 24 g glucosa/L/h, etc. De acuerdo con varias modalidades, se agrega un inductor tal como arabinosa en velocidades constantes de aproximadamente 1.5 g/L/h a aproximadamente 16 g/L/h.

De acuerdo con varias modalidades, una vez se ha alcanzado un parámetro umbral, la alimentación sobre la fuente de carbón se puede continuar, detener o interrumpir temporalmente. La alimentación de la fuente de carbón se puede interrumpir en cuyo caso la alimentación se reiniciará a una velocidad constante una vez se alcance un umbral de partida de alimentación. Así, de acuerdo con una modalidad, un umbral de inicio y un umbral de detección se pueden utilizar para regular la alimentación de la fuente de carbón en el cultivo. De acuerdo con otra modalidad, la glucosa y arabinosa alimentan a una velocidad constante basado en el parámetro umbral, sin detener o reiniciar la alimentación.

La cantidad total apropiada de fuente de carbón para agregar a cualquier cultivo específico se puede determinar fácilmente por una persona experta en la técnica basada en la guía suministrada aquí. La cantidad total de la fuente de carbón agregada al cultivo puede variar de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 100 g/L (basado en el volumen total en litros del cultivo) de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Por ejemplo, de acuerdo con una modalidad, se agregan 50 g/L de glucosa durante la fase de crecimiento al partir con 10 g/L en el medio, comenzar la alimentación de glucosa a velocidad constante cuando el nivel de glucosa alcanza cero, y continuar la alimentación de glucosa a velocidad constante hasta que OD alcanza 80 en cuyo tiempo aproximadamente 40 g/L de glucosa habría sido alimentado en adición a los 10 g/L de glucosa iniciales. De acuerdo con modalidad, las cantidades totales de fuente de carbón se proporcionan en forma concentrada para facilidad de producción a escala. Estas cantidades se convierten fácilmente en masa total de la fuente de carbón a ser utilizada en una circunstancia particular. Por ejemplo, 10 g/L de fuente de carbón se agrega a un cultivo de 1 ,000 L, la cantidad total de fuente de carbón a ser agregada se determina fácilmente como 10 g/L X 1 ,000 L = 10,000 gramos (o 10 kg) de fuente de carbón total. La cantidad total de fuente de carbón agregada puede servir como un parámetro umbral de acuerdo con varias modalidades como se describe aquí.

La cantidad total apropiada de inductor para agregar a cualquier cultivo específico se puede determinar fácilmente por una persona experta en la técnica basada en la guía proporcionada aquí. La cantidad total de inductor agregada al cultivo puede variar de aproximadamente 4 g/L a aproximadamente 40 g/L (basado en el volumen total en litros del cultivo) de acuerdo con varias modalidades. De acuerdo con varias modalidades, la cantidad total de fuente de carbón agregada al cultivo es aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 20 g/L, 7 g/L a aproximadamente 15 g/L, 8 g/L a aproximadamente 14 g/L, 9 g/L a aproximadamente 11 g/L, o aproximadamente 10 g/L basado en el volumen total del cultivo. De acuerdo con una modalidad, las cantidades totales de inductor se proporcionan en forma concentrada para facilidad de producción a escala. Estas cantidades se convierten fácilmente en la masa total del inductor a ser utilizada en una circunstancia particular. Por ejemplo, cuando 10 g/L de inductor se agrega a un cultivo de 1 ,000 L. la cantidad total de inductor a ser agregada se determina fácilmente como 10 g/L X 1 ,000 L = 10,000 gramos (o 10 kg) de inductor total.

El medio de cultivo fresco contendrá típicamente una cantidad inicial de una primera fuente de carbón en el momento de inoculación con una célula anfitriona, creando así un cultivo. La concentración inicial se puede monitorear y la concentración de la primera fuente de carbón utilizada como un parámetro umbral.

Cualquier suplemento adecuado o nutriente además de una fuente de carbón también puede alimentar el cultivo en cantidades apropiadas. El otro nutriente o complemento se pueden monitorear y establecer los umbrales apropiadamente. Los suplementos tal como nitrógeno o fuentes de fosfato inorgánicos se contemplan para uso en la presente invención. Ejemplos de compuestos no limitantes que se contemplan para uso en los métodos de la presente invención incluyen KH2P04, K2HP04, citrato de sodio, dihidrato, (NH4)2S0 , MgS04, (Na)2S04, CaCI2, FeS04, cloramfenicol o cualquier combinación de estos. También se contempla el uso de una fuente de carbón o fuentes de carbón adicionales.

Densidad óptica y fase de crecimiento Log: La introducción de una célula anfitriona bacteriana de medio de cultivo fresco crea un cultivo que va típicamente a través de cuatro fases de crecimiento más o menos distintas: (i) fase lag, (ii) fase log (logarítmica o exponencial), (iii) fase estacionaria, y (iv) fase de declinación (muerte). La fase log en sí misma se puede dividir adicionalmente en varias fases, tal como la fase de crecimiento log temprana, fase de crecimiento log media, y fase de crecimiento log tardía. La densidad óptica se relaciona con la fase de crecimiento log. La fase de crecimiento Log y la densidad óptica también se pueden utilizar como parámetros umbral para señalizar el inicio y/o detención de la alimentación constante de la fuente de carbón y/o inductor.

Por ejemplo, inducción, o adición continua del inductor puede comenzar en la fase de crecimiento log temprana, la fase de crecimiento log media, y la fase de crecimiento log tardía. La fase de crecimiento log tardía puede ocurrir en un OD de aproximadamente 70 a aproximadamente 110. En una modalidad de la invención, la alimentación a velocidad constante del inductor empezará en la fase de crecimiento log tardía del medio de cultivo o en un OD de aproximadamente 70 a aproximadamente 110, aproximadamente 70 a aproximadamente 105, aproximadamente 75 a aproximadamente 85, o aproximadamente 80 de acuerdo con varias modalidades.

El OD se puede medir en varias longitudes de onda que se emplean comúnmente por aquellos expertos en la técnica. Típicamente, el OD600 se utiliza como una medida de crecimiento celular y la densidad de las células en el cultivo. A menos que se indique otra cosa, el "OD" como se utiliza aquí se refiere a OD60o- Oxígeno disuelto: Otro parámetro que puede servir como un activador para el inicio y/o detención del controlador de alimentación es oxígeno disuelto (DO) (esto es, fermentación de tanda de alimento DO-stat). El DO se puede controlar al ajustar la agitación, flujo de aire, complemento de oxígeno, y presión en el recipiente para contener el medio de cultivo. El umbral de DO se puede establecer en el rango 5% a 80% DO, tal como, 20%, 40%, o 80%. Una vez se ha establecido un umbral, el controlador de alimentación para una fuente de carbón o inductor se puede encender hasta que el umbral haya cumplido esta señal que detiene la alimentación de control. El umbral de detención puede ser otro umbral DO u otro parámetro, tal como la cantidad de fuente de carbón o inductor. Por ejemplo, siempre que el DO este por encima de 30% o 40% en un medio de cultivo, el controlador de alimentación puede iniciar hasta el momento en que el DO cae al 20%, o alternativamente, hasta 0.5 g/L o 1 g/L de una fuente de carbón o inductor que se ha agregado nuevamente de acuerdo con varias modalidades de la presente invención.

PH : Otro parámetro que puede servir como un activador para el inicio y/o detención del controlador de alimentación es el pH (esto es, fermentación de tanda de alimento pH-stat). El pH se puede controlar mediante la adición de ácido o base al medio de cultivo. El umbral de pH se puede establecer en el rango de 6.8 a 7.2, tal como 7.0. Una vez se ha cumplido el umbral, el controlador de alimentación para una fuente de carbón o inductor se puede encender hasta que se haya cumplido el umbral que señala la detención de la alimentación de control. El umbral de detención puede ser otro umbral pH u otro parámetro, tal como la cantidad de fuente de carbón o inductor. Por ejemplo, siempre que el pH se eleve a 6.97 en un medio de cultivo, el controlador de alimentación puede empezar hasta el momento en que el pH a 6.95, o alternativamente, hasta 1 g/L de una fuente de carbón o inductor que se haya agregado nuevamente de acuerdo con varias modalidades de la presente invención.

Tiempo de Cosecha: El tiempo de cosecha representa la cantidad de tiempo que pasa después de la inducción inicial o adición de un inductor. Cualquier tiempo de cosecha adecuado se contempla por la presente invención. El tiempo de cosecha puede variar de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 10 horas, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas, aproximadamente 2.5 horas a aproximadamente 7 horas, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, etc., de acuerdo con varias modalidades de la presente invención. Utilizando la alimentación a velocidad constante, el tiempo de cosecha, y la cantidad total de inductor, aquellos medianamente versados en la técnica apreciaran que cada parámetro se puede ajustar para los resultados deseados. La persona experta en la técnica pondrá entender cuando cosechar con base en la cantidad de alimento arabinosa debido a que ellos pueden determinar fácilmente la cantidad de alimento basado en la velocidad de alimentación y el periodo de tiempo. De esta forma, las concentraciones finales de inductor de 5, 10, 20, 30, y 40 g/L de alimento 3 horas se puede alcanzar, por ejemplo, sin limitación.

Concentración del inductor: Un inductor en cualquier concentración adecuada se contempla por la presente invención. Concentraciones del inductor útiles para inducir celular anfitrionas pueden variar de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 20% (v/v), sin limitaciones.

Temperatura: El cultivo de las actuales modalidades se puede incubar en cualquier temperatura que permita el crecimiento de las células. Varias temperaturas en las que se incuba el cultivo asociado con crecimiento abundante incluyen, sin limitación, 22°C, 28°C, 37°C, o cualquier combinación de éstos.

Dispositivo de Fermentación: Cualquier dispositivo de fermentación adecuado (esto es, "termentador") se contempla para uso en la presente invención, como se conoce por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, el termentador puede contener cualquier número de rotores (tal como, rotores Rushton), sondas de medición y/o admisión. De acuerdo con una modalidad, el termentador se configura para incluir tres rotores Rushton y un anillo o tubo burbujeador para introducción de aire en el termentador. La presente invención contempla el uso de sistemas basados en computador y/o manuales. Como tal, el sistema de fermentación puede hacer interfaz con un sistema computarizado para monitorear y controlar las fermentaciones. De esta forma, el sistema se puede automatizar completamente o parcialmente, de acuerdo con las modalidades de la presente invención.

Composiciones de la presente invención: Composiciones que comprende proteínas recombinantes, tal como aquellas preparadas de acuerdo con los métodos de la presente invención se proporcionan aquí, de acuerdo con las modalidades de la presente invención. Las composiciones de la presente invención comprenden proteínas recombinante en alta densidad en un cultivo, tal como las proteínas recombinantes preparadas de acuerdo con los métodos de la presente invención, sin pretender estar limitada a éstas.

La composición comprende un cultivo que tiene proteínas recombinantes en una densidad de por lo menos aproximadamente 1.5 g/L basado en el volumen total del cultivo. La densidad de la proteína recombinante es por lo menos aproximadamente 1.7 g/L basado en el volumen total del cultivo de acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención. La densidad de la proteína recombinante es por lo menos aproximadamente 2.0 g/L basado en el volumen total del cultivo de acuerdo con otra modalidad de la presente invención. La densidad de la proteína recombinante es por lo menos aproximadamente 3.0 g/L basado en el volumen total del cultivo de acuerdo con otra modalidad de la presente invención.

Una composición que comprende proteína 2086 recombinante se proporciona en una modalidad de la presente invención. La proteína 2086, como se refiere aquí, es una proteína expresada por un polinucleótido que corresponde al gen 2086 en el serogrupo B en N. meningitidis, que incluye cualquier fragmento, derivado o mutación de éste. Polinucleótidos y proteínas 2086 de ejemplos no limitantes se describen en la WO 03/063766 y WO 04/094596.

La composición de proteína 2086 recombinante comprende la proteína 2086 recombinante en un cultivo en donde la proteína 2086 recombinante esta en una densidad de por lo menos aproximadamente 1.5 g/L basado en el volumen total del cultivo. La densidad de la proteína 2086 recombinante es por lo menos aproximadamente 1.7 g/L basado en el volumen total del cultivo de acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención. La densidad de la proteína 2086 recombinante es por lo menos aproximadamente 2.0 g/L basado en el volumen total del cultivo de acuerdo con otra modalidad de la presente invención. La densidad de la proteína 2086 recombinante es por lo menos aproximadamente 3.0 g/L basado en el volumen total del cultivo de acuerdo con otra modalidad de la presente invención.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender cualquier proteína, tal como una proteína preparada de acuerdo con un método de la presente invención. Las proteínas recombinantes se pueden ser proteínas lapidadas o no lipidadas. En una modalidad de la invención, la proteína recombinante es la proteína 2086 recombinante lapidada o no lapidada. La proteína 2086 recombinante puede ser una proteína de subfamilia A o subfamilia B, o una combinación de éstas. Las composiciones de la presente invención pueden incluir una proteína o más de una proteína. Las proteínas se pueden ser proteínas relacionadas o no relacionadas. Por ejemplo, una composición de la presente invención puede incluir la proteína 2086 que corresponde a una o más cepas de la subfamilia A y/o una o más cepas de la subfamilia B.

Las composiciones que comprenden material para uso en conducir los métodos de la presente invención también se proporcionan aquí. Tales composiciones incluyen los componentes necesarios para el cultivo, que incluyen células recombinantes y nutrientes, de acuerdo con modalidades de la presente invención. Las varias composiciones se pueden proporcionar junto con un kit, de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Por ejemplo, los componentes para formar el cultivo se pueden pre-empacar convenientemente en las cantidades requeridas para facilitar el uso en instalaciones de laboratorio o industriales, sin limitación. Tal un kit también puede incluir etiquetas, indicios y directrices para facilitar el uso de cada componentes y la forma de combinar los componentes de acuerdo con varias modalidades de la presente invención.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar varias modalidades de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en el arte que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la practica de la invención, y así se pueden considerar que constituyen varios modos para su practica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica debe, en vista de la actual descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y obtienen aún un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Fermentación alimentada con alimento a velocidad constante.

Se utiliza E. coli (pPW62) subfamilia B como una cepa modelo para un proceso de fermentación alimentada. Basado en los resultados, el proceso se aplicara a la subfamilia A de E. coli (pPW102).

Una solución de alimentación y medio para la fermentación alimentada se prepara utilizando los componentes como se listan en las siguientes tablas.

Solución de alimentación y medio: Tabla 1 : Medio Basal Tabla 3: Solución de Alimentación de Glucosa Concentrada Componente Cantidad por litro Glucosa 500/700 g KH2P04 3 g K2HP04 5 g (NH4)2S04 2 g Tabla 4: Solución de Alimentación de Arabinosa Concentrada Métodos: La fermentación alimentada con velocidad de alimentación constante se utiliza para alcanzar alta densidad celular en fermentación de E. coli. La concentración de glucosa inicial es 10g/L en el medio. La concentración (NH4)2S0 se incrementa a 3 g/L en el medio de fermentación, pero se mantiene en 1 g/L en el medio de cultivo sembrado. Para determinar la velocidad de alimentación, se desarrolla primero la tanda de alimento DO-stat. El nivel DO se controla al 20% mediante un controlador de cascada que incrementa la velocidad de agitación al máximo y luego utiliza complementación con oxígeno. Cuando se agota la glucosa, el DO se levanta agudamente (por encima de 40%) y el concentrado de glucosa se agrega a la concentración final de 1 g/L en el termentador. Después de cada adición de glucosa, la bomba permanece apagada durante un tiempo establecido antes de permitir hacer la siguiente adición. El OD Máximo de aproximadamente 160 se alcanza cuando se desarrolla la fermentación alimentada DO-stat. La velocidad constante se selecciona luego para ser equivalente al controlador DO-stat que agrega suficiente glucosa para llevar la concentración hasta 18 g/L o 24 g/L cada hora. Durante la fermentación alimentada con alimentación a velocidad constante, la alimentación de glucosa se inicia a la velocidad constante deseada cuando hay un incremento agudo al 40% en DO.

Se inicia los cultivos de semillas utilizando un frasco de E. coli (pPW62) por litro de medio basal + 15 g/mL cloramfenicol en un frasco Fernbach de 2800 ml_. Los frascos se incuban a 32°C, 150 rpm durante la noche (~16 hrs). El OD600 final es normalmente ~ 3. Se utiliza tamaño de inoculo 10% para inocular cada fermentador. Cada fermentador utiliza 3 rotores Rushton y un burbujeador de anillo. Puntos de tiempo iniciales: temperatura: 36°C, pH: 7.00 ± 0.05 (controlado con 7.4 N NH OH), flujo de aire: ~1 vvm, DO: 20%. El DO se controla mediante una cascada de agitación (min: 150 rpm, max: 1000 rpm) y adición de 02 por via de una unidad de mezcla de gas. La espuma se controla, si es necesario, mediante adición manual de PPG-2000. 0.35 mL/L AF se agrega al medio antes de esterilización. Durante la fermentación, se toman muestras cada hora para monitorear la glucosa, pH, y OD600 fuera de línea. Los sobrenadantes se preparan a partir muestras 1 mL y se almacenan para análisis posterior de ácidos orgánicos por HPLC.

Resultados: Fermentación alimentada con alimentación a velocidad constante: La Figura 1 muestras los cursos de tiempos de OD, consumo de glucosa, y acumulación de ácido acético con velocidad de alimentación constante. Los OD Máximos de 158 y 150 se obtienen con velocidades de alimentación constantes de 24 g glucosa/L/h y 18 g glucosa/L/h, respectivamente. Se acumula 28 g/L de alta glucosa durante la serie cuando se utiliza una velocidad de alimentación de 24 g/L/h. la glucosa se acumula a 12 g/L cuando una velocidad de alimentación de 18 g/L/h se utiliza. Se produce poco ácido acético (esto es menos de 1.5 g/L) en ambos casos. La fase de crecimiento exponencial termina cerca de OD 100. La velocidad de crecimiento especifica es aproximadamente 0.60 (hr ) en ambos casos.

Para reducir la acumulación de glucosa, la baja velocidad de alimentación constante de 16.4 g/L/h y 15 g/L/h se examina. La Figura 2 muestras los cursos de tiempos de OD, consumo de glucosa, y acumulación de ácido acético con velocidades de alimentación constante mencionadas anteriormente. Los OD Máximos son 142 y 147, respectivamente. Como en series anteriores, el cultivo con velocidad de alimentación más rápida acumula más glucosa, aunque la cantidad de glucosa acumulada es mucho menor que en experimentos anteriores. Aproximadamente 8 g/L de glucosa se acumula durante los 16.4 g/L/h, y 5.4 g/L de glucosa durante 15 g/L/h de fermentación. Se produce poco ácido acético (tal como menos de 1.5 g/L) en ambos casos (Ver Figura 2). La velocidad de crecimiento específico es aproximadamente 0.60 (hf 1) en ambos casos. Así, la velocidad de crecimiento específica no se afecta por la velocidad de alimentación entre 15 g/L/h y 24 g/L/h.

Inducción en Varios Crecimientos OD: Se utiliza una velocidad de alimentación constante de glucosa/Uh 15 g para el estudio de inducción de arabinosa ya que esto resulta en alta densidad celular y baja acumulación de ácido acético y glucosa. En este experimento, las inducciones en la fase de crecimiento log media OD ~55 y la fase de crecimiento tardía OD -80 se compara. El cultivo se induce al sustituir simplemente la alimentación arabinosa para la alimentación de glucosa y alimentar la arabinosa a una velocidad constante de 13.4 g/L/h. se agrega un total de 40 g/L arabinosa a cada cultivo durante el curso de 3 horas. Después de inducción, se toman muestras cada hora para ensayo rLP2086 por SDS-PAGE, ensayos de arabinosa y ácido orgánico por HPLC.

La Figura 3 muestra los cursos de tiempo de OD y la producción de rLP2086 cuando se inducen en ODs -55 y ~80. El OD Máximo y el rendimiento de rLP2086 son mayores cuando las células se inducen en OD ~80 (OD Máximo: 101 vs. 84; rendimiento máximo: 1.8 g/L vs. 1.2 g/L).

Inducción con Varios Niveles de Arabinosa: El propósito de los siguientes experimentos es evaluar la cantidad total de alimento arabinosa al cultivo y examinar si la reducción de la cantidad total de alimento arabinosa al cultivo resultaría en alta expresión rLP2086. El concentrado Arabinosa alimenta 4 diferentes cultivos cada uno en diferentes velocidades de alimentación durante el curso de 3 horas, que resulta en concentraciones de arabinosa finales de 10, 20, 30, y 40 g/L. Todos los cultivos se inducen en OD60o ~ 80. La Figura 4 muestras el curso de tiempo de OD y producción rl_P2086. La Tabla 5 resume el OD y los rendimientos rLP2086 para cada una de las cuatro condiciones. Esto muestra el rendimiento rLP2086 máximo de: 1.2 g/L para 10 g/L total arabinosa agregada; 1.6 g/L para 20 g/L total arabinosa agregada; 1.7 g/L para 30 g/L total arabinosa agregada; 2.0 g/L para 40 g/L total arabinosa agregada. Una alimentación de arabinosa de entre 20 g/L y 40 g/L resulta en rendimiento de rLP2086, similar, sin embargo, 10 g/L de arabinosa produce mucho menos rLP2086 (esto es, 1.2 g/L). Estos resultados sugieren que la cantidad total de arabinosa agregada para inducción se puede reducir de 40 g/L a 20 g/L sin reducir la productividad de rLP2086. Así, la reducción en el uso de arabinosa será más efectiva en costos, especialmente considerando el alto costo de la arabinosa (aproximadamente $500/kg US).

Tabla 5: Inducción con varios niveles de arabinosa Comparación del método de adición de arabinosa: Se conduce el siguiente experimento para examinar si una estrategia de alimentación continua es superior a una estrategia de adición de tanda única cuando se aplica a arabinosa para inducción. En la serie X-BRN05-039, 20g/L de arabinosa se agrega al termentador todo de una vez, a diferencia de alimentación durante el curso del tiempo, cuando el OD es aproximadamente 80. La Figura 5 muestras el curso de tiempo del OD, glucosa y el consumo de arabinosa, y la producción de rLP2086. Se obtiene un máximo de 1.3 g/L de rLP2086 la adición de tanda de la arabinosa, aunque operacionalmente más simple, produce menos rLP2086 que la alimentación continua. Así, una estrategia de alimentación de arabinosa continua es superior a la adición de tanda única.

Para examinar si la arabinosa puede ser más eficientemente utilizada al reducir la velocidad de alimentación de arabinosa, la velocidad de alimentación de 3.3 g arabinosa/L/h y 6.7 g arabinosa/LJh se compara. La Figura 6 muestra el curso de tiempo de OD y producción de rLP2086. El concentrado de Arabinosa alimenta a un cultivo a una velocidad de alimentación de 6.7 g/L/h durante el curso de 3 horas, y un segundo cultivo alimenta a una velocidad de 3.3 g/L/h durante el curso de 6 horas. Para ambos cultivos, la cantidad total de arabinosa agregada es 20 g/L. Como se muestra en Figura 6, ambas condiciones producen la misma cantidad de rLP2086 Máxima (esto es, 2.2 g/L), pero hay diferencias en las cinéticas de la producción. La mayor velocidad de alimentación resulta en una mayor velocidad de producción. El RLP2086 Máximo se alcanza en 3 horas y 6 horas después de inducción con velocidad de alimentación de 6.7 g/L/h y 3.3 g/L/h, respectivamente. La ventaja de utilizar una velocidad de alimentación mayor (esto es, 6.7 g/L/h) es que los costos de producción (por ejemplo, costo de utilidad) será menor cuando se utiliza una mayor velocidad de alimentación que cuando se utiliza una velocidad de alimentación menor.

Efecto del tiempo de inducción en rendimiento de expresión rLP2086: Para determinar el tiempo de cosecha óptimo, el perfil de alimentación normal (20 g/L de alimento arabinosa durante 3 horas) se extiende a 40 g/L de alimento durante 6 horas. En series X-BRN05-028 y X-BRN05-029, las células se inducen en OD -55 y OD ~80, respectivamente. La Figura 7 muestra el curso de tiempo de OD y la producción rLP2086. Aunque la alimentación arabinosa se extiende de 3 horas a 6 horas, de manera interesante, el título de del pico se obtiene aún alrededor de 3 horas después de inducción. El título del producto es ligeramente mayor en el cultivo que se induce en OD mayor. El máximo rendimiento rLP2086 en inducción OD -55 es 2.0 g/L (X-BRN05-028) mientras que este es 2.4 g/L en inducción OD-80 (X-BRN05-029). Este resultado sugiere que las células se deben cosechar 3 horas después de inducción.

Comparación de la solución de alimentación con y sin sales: Para examinar si las sales agregadas son esenciales en la glucosa y la soluciones de alimentación arabinosa, se comparan los alimentos arabinosa y glucosa planos con glucosa estándar más sales (esto es, K2HPO4/KH2PO4 + (NH4)2S04) y arabinosa + alimentación de sales. Para ambos cultivos, 20 g/L de arabinosa alimenta durante el curso de 3 horas. Los perfiles de producción rLP2086 y de crecimiento son muy similares. El rendimiento rLP2086 máximo es 1.8 g/L cuando se agregan las sales a los alimentos, y 2.0 g/L cuando los alimentos de glucosa y arabinosa se preparan sin sales. Estos resultados sugieren que no es necesario agregar sales a las soluciones de alimento de glucosa y arabinosa.

Fermentación alimentada con velocidad constante de alimentación para cepa de subfamilia B: Se inician cultivos de semillas al inocular 1 L de medio basal que contiene 15 µg/mL cloramfenicol con 1 mi de semilla de trabajo descongelada. El cultivo se hace crecer en un frasco Fembach 2.8 L y se incuba durante aproximadamente 16 horas a 32°C y 150 rpm. El OD600 final es ~3.0. Los cultivos de semillas de 350 mL son transferidos asépticamente en un medio basal de 3.15L que contiene 3 g/L (NH4)2S04 sin cloramfenicol. La fermentación se controla en pH 7.0±0.05 por 7.4 N NH4OH, temperatura a 36°C, DO al 20%, y flujo de aire en 1 vvm. El DO se controla mediante una cascada de agitación (min: 150 rpm, max: 1000 rpm) y adición de oxígeno. El PPG-2000 antiespuma se agrega automáticamente para controlar la espuma. Durante la fermentación, se toman muestras cada hora para monitorear la glucosa y el OD fuera de línea. Después inoculación, el DO cae de ~100% a 20% y luego se mantiene en 20%. Cuando hay un aumento agudo en DO del 20% a más del 40% (usualmente 6 horas de tiempo de fermentación) (EFT)), la bomba de alimentación de glucosa (sin sales) se enciende a una velocidad de 15 g/L/h. Como se muestra en Figura 8, la glucosa se agota completamente después de 6 EFT, que resulta en un aumento agudo en el DO. Las muestras se toman cada media hora cuando el OD alcanza -40. La alimentación de glucosa se apaga en OD 90 y la alimentación de arabinosa se enciende a una velocidad de 13.4 g/L/h. Después 3 horas de alimentación de arabinosa (sin sales) (esto es, un total de adición de arabinosa de 20g/L), La alimentación de arabinosa se apaga y a la fermentación se le permite continuar durante otra hora. Como se muestra en la Figura 8, un OD de 102 se obtiene y 2.0 g/L de MnB rLP2086 se expresa basadd en el SDS-PAGE (ver Figura 9). El pico ocurre 3 horas después de inducción (esto es, ~12-hora EFT). El SDS-PAGE y Western Blot muestran que la proteína expresada es de hecho rLP2086 subfamilia B.

Aplicación del proceso de fermentación alimentada para cepa de subfamilia A rl_P2086 MnB: Para probar si un proceso de fermentación alimentada utilizado para la subfamilia B rl_P2086 se puede aplicar a la subfamilia A rl_P2086, se conduce el proceso utilizando el procedimiento establecido para la cepa de subfamilia B. la Figura 10 muestra el curso de tiempo de OD, consumo de glucosa y arabinosa, y producción rl_P2086. Los perfiles de producción de rLP2086 y de crecimiento para la subfamilia A son similares a aquellos obtenidos para la subfamilia B (compare con la Figura 8). El SDS-PAGE y Western Blot muestran que la proteína expresada es de hecho rl_P2086 subfamilia A (ver Figura 11). La Tabla 6 lista el OD Máximos y los rendimientos de expresión rLP2086 para seis diferentes series de subfamilia A. el rango de rendimiento de la expresión rLP2086 máxima es 1.5-2.1 g/L (rendimiento máximo promedio: 1.8±0.2 g/L), similar a los resultados de las fermentaciones alimentadas utilizadas para producir rLP2086 subfamilia B. Así, la fermentación alimentada desarrollada para la cepa de subfamilia B también es adecuada para la cepa de la subfamilia A.

Tabla 1 : Proporción de expresión de rLP2086 de la subfamilia máxima A y OD Lote Máximo rLP2086 (g/L) Máximo OD X-BRN10-118 1.9 104 X-BRN10-119 1.9 104 X-BRN10-120 1.6 100 X-BRN05-042 1.5 100 X-BRN05-043 2.0 77 X-BRN10-121 2.1 92 Alimentación de Glucosa dual y arabinosa durante la inducción de arabinosa Para reducir la cantidad de arabinosa necesitada sin reducir la producción de rLP2086, la alimentación de glucosa dual y arabinosa durante el periodo de inducción se investiga.

La estrategia es alimentar con 10 g/L de arabinosa durante 3 hrs (la mitad de la cantidad usual) mientras se continúa la alimentación de glucosa durante la fase de inducción a 25% (3.75 g/L/h), 50% (7.5 g/L/h), y 100% (15 g/L/h) de la velocidad de alimentación de la glucosa estándar. Todas las alimentaciones, glucosa y arabinosa, se preparan sin aditivos.

Las Figuras 12a, 12b, y 12c, muestran el curso de tiempo del crecimiento celular de la subfamilia B, la glucosa, arabinosa, concentraciones de ácido acético, y la producción de rLP2086. Todas las tres series se inducen a OD ~80. Como se muestra en la Figura 12a, el OD de la serie de alimentación de glucosa al 100% continúa surgiendo después de inducción, pico a 117, mientras el pico de serie a 50% a 106 (Figura 12b) y la serie a 25% se mantiene alrededor 100 (Figura 12c) después de inducción. La alimentación de glucosa al 100% empieza a acumular glucosa y arabinosa durante 3 horas postinducción. La serie de glucosa a 50% solo muestra una cantidad ligera de glucosa en la última muestra (lectura = 0.21 g/L). No hay acumulación de glucosa en la serie de glucosa a 25%. Ninguna de las tres series acumula cualquier arabinosa. Las series de alimentación de glucosa a 100% (Figura 12a) y 50% (Figura 12b) producen ~1.5 y 1.7 g/L de rLP2086, respectivamente, mientras la serie a 25% (Figura 12c) produce 2.1 g/L. El pico de producción de las series a 100% antes de la serie de arabinosa, sugiere que la expresión rLP2086 se puede haber suprimido mediante la acumulación de glucosa y ácido acético. El pico de producción de las series a 50% del tiempo aproximado de la serie de arabinosa y el pico de producción de la serie a 25% después de que la serie de arabinosa sugiere que la expresión 2086 no se suprime tanto como la concentración de glucosa se controla a un nivel mínimo (no hay glucosa acumulada en las Figuras 12b y 12c). Aunque solo 10 g/L de arabinosa alimenta a estos cultivos, su producción de rLP2086 es similar a aquel obtenido cuando se alimenta con 20 g/L. Las alimentaciones simultáneas de glucosa y arabinosa pueden reducir el consumo de arabinosa por 50% y todavía alcanza el mismo rendimiento del rLP2086 cuando la concentración de glucosa se controla a un nivel bajo durante la inducción. Así, el costo de químicos se puede reducir significativamente.

Para examinar si uno puede adicionalmente reducir el consumo de arabinosa e incrementar el rendimiento de rLP2086, varías velocidades de alimentación de glucosa, cantidades totales de la alimentación de arabinosa, y la inducción OD se investigan. La Tabla 7 lista combinaciones diferentes de estas condiciones. Esto parece que la velocidad de alimentación de glucosa entre 2.25 y 7.5 g/LJh y la velocidad de alimentación de arabinosa entre 1.7 y 6.7 g/L/h no afectaría el rendimiento de rLP2086 significativamente. La Inducción de los OD entre 80 y 105 resulta en rendimientos de rLP2086 similares.

Tabla 2: OD Máximo y rLP2086 bajo velocidad de alimentación de glucosa diferente, cantidad diferente de la adición de arabinosa, e inducción de varios OD Lote número Veloci Velocid Cantidad Inducci OD RLP2086 Máximo dad de ad de de ón OD Máxim (g/L) alimen aliment alimentaci o tación ación ón de de de arabinosa glucos arabino a sa (g/L/h (g/L/h ) ) X-BRN10-127 3.75 1.7 5 g/L en 3 74 86 1.6 horas X-BRN05-056 3.75 3.3 20 g/L en 79 122 2.8 3 horas X-BRN05-058 3.75 1.7 10.g/L en 94 122 3.0 6 horas X-BRN10-129 3.75 6.7 20.g/L en 110 124 2.7 3 horas X-BRN05-059 3.75 3.3 20.g/L en 105 126 2.9 6 horas X-BRN05-061 5.25 3.3 20.g/L en 102 112 2.6 .6 horas X-BRN10-130 2.25 3.3 20.g/L en 93 108 2.4 6 horas Ejemplo 3: Fermentación alimentada a escala para escala de 100L El cultivo de semilla se inicia a inocular 2 X 1 L de medio basal que contiene 15 µg/mL de cloramfenicol con 1 mi (que es, 1 frasco) de semilla descongelada para trabajo. El cultivo en 2.8 L de Fernbach se incuba durante aproximadamente 16 horas a 32°C y 150rpm en un agitador rotatorio.

Dos cultivos de semilla de 1 L Fernbach durante la noche se transfieren asépticamente en un fermentador de 150 L que contiene 70 L de medio basal sin cloramfenicol. La fermentación de 150L en medio basal se controla a pH 7.0±0.05 por 7.4 N de NH4OH, temperatura 36°C, DO 20%, y flujo de aire a 1vvm. El DO se controla mediante una cascada de agitación y la adición de oxígeno. La antiespuma PPG-2000 se agrega automáticamente a la espuma de control. Durante la fermentación, la caída de DO de ~100% a 20% y se mantiene a 20%. Cuando hay incremento agudo en DO de 20% a más de 40% (usualmente a OD ~20), la señalización del agotamiento de glucosa, la bomba de alimentación se activa para liberar el concentrado de glucosa (que es, 500 g/L) a una proporción de 15 g glucosa/L/h. Durante la fermentación, las muestras se toman cada hora para monitorear la glucosa y OD fuera de línea. Las muestras se toman cada media hora cuando alcanzan OD ~40. Una vez el OD alcance ~ 80, la alimentación de glucosa se detiene y la alimentación de arabinosa se inicia (por ejemplo, 500g/L del concentrado de arabinosa) a una proporción de 6.7 g arabinosa/L/h durante 3 horas.

La Figura 13a muestra el curso de tiempo del crecimiento celular de la subfamilia B, consumo de glucosa, consumo de ácido acético, y la producción de rLP2086 a escala de 100L. El perfil de fermentación en la escala de 100L es similar a aquel que se ve en una escala pequeña. Se obtienen un OD Máximo de 99 y una proporción máxima de 1.9 g/L de rLP2086. Estos resultados demuestran que la fermentación alimentada es escalable.

La Figura 13b muestra el curso de tiempos del crecimiento celular de la subfamila A, el consumo de glucosa, la acumulación de ácido acético, y la producción de rLP2086 a la escala de 100L. El perfil de fermentación a escala de 100 L es similar a aquel que se ve en una escala pequeña. Se obtienen un OD Máximo de 96 y una proporción máxima de 2.0 g/L de rLP2086. Estos resultados demuestran que la fermentación alimentada es escalable y robusta.

La Figura 14a muestra el curso de tiempos de la densidad celular de la subfamilia B, glucosa, arabinosa, concentraciones de ácido acético, y rendimiento de rLP2086 con la alimentación de glucosa dual y arabinosa a escala de 100 L. Durante la inducción, las velocidades de alimentación se controlan a 3.75 y 1.67 g/L/h para alimentación de glucosa y arabinosa, respectivamente. La arabinosa dual y glucosa alimentan durante 5 horas. Un OD Máximo de 90 y una proporción máxima de 1.8 g/L de rLP2086 se obtienen. La proporción máxima de rLP2086 aparece una inducción de 4 horas. El OD Máximo promedio y la proporción máxima promedio de rLP2086 para la subfamilia B son 84.8 ± 6.8 y 1.6 ± 0.3 g/L, respectivamente. Estos resultados demuestran que la fermentación alimentada con la alimentación de glucosa dual y arabinosa durante la fase de inducción es escalable.

La Figura 14b muestra el curso de tiempos del crecimiento celular de la subfamila A, el consumo de glucosa, la acumulación de ácido acético, y la producción de rLP2086 a la escala de 100L. La serie de fermentación a las mismas condiciones como en el parágrafo

[0129] y las células se inducen durante 6 horas. Un OD Máximo de 89 y una proporción máxima de 1.8 g/L rLP2086 se obtienen. La proporción máxima de rLP2086 aparece a inducción de 4 horas. El OD Máximo promedio es 87.9 ± 10.5 y la proporción máxima promedio de rLP2086 es 1.8 ± 0.2 g/L para la subfamilia A. Estos resultados demuestran que la fermentación alimentada es escalable y robusta.

Mientras la invención se ha descrito con referencia para varias modalidades y ejemplos, aquellos expertos en la técnica reconocen que varias modificaciones se pueden hacer para la invención sin apartarse de su espíritu y alcance.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para producir una proteína recombinante que comprende: cultivar una célula bacteriana recombinante para expresar una proteína recombinante que comprende agregar continuamente una fuente de carbón a un cultivo que comprende la célula bacteriana recombinante y agregar continuamente un inductor al cultivo después que el cultivo alcanza un parámetro umbral, y aislar la proteína recombinante del cultivo. El método de la reivindicación 1 , en donde el parámetro umbral es la densidad óptica (OD), el oxígeno disuelto (DO), la concentración de nutriente en medio de cultivo, la concentración total de fuente de carbón agregada al medio de cultivo, o cualquier combinación de estos. El método de la reivindicación 2, en donde el parámetro umbral es la densidad óptica (OD) del cultivo. El método de la reivindicación 3, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 70 a aproximadamente 110. El método de la reivindicación 4, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD6oo de aproximadamente 70 a aproximadamente 105. El método de la reivindicación 5, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD600 de aproximadamente 75 a aproximadamente 85. El método de la reivindicación 6, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD600 de aproximadamente 80. 8. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar el inductor al cultivo a una velocidad constante, agregar el inductor al cultivo mediante una alimentación DO-stat o agregar el inductor al cultivo mediante alimentación pH-stat. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar el inductor al cultivo a una velocidad constante de aproximadamente 3.35 g/LJh a aproximadamente 16 g/L/h, agregar el inductor al cultivo mediante una alimentación DO-stat o mediante alimentación pH-stat. El método de la reivindicación 1 , en donde la cantidad total del inductor agregada al cultivo es aproximadamente 4 g/L a aproximadamente 40 g/L. El método de la reivindicación 10, en donde la cantidad total del inductor agregada al cultivo durante la alimentación del inductor es de aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 20 g/L. El método de la reivindicación 11 , en donde la cantidad total del inductor agregada al cultivo durante la alimentación del inductor es de aproximadamente 7 g/L a aproximadamente 15 g/L. El método de la reivindicación 12, en donde la cantidad total del inductor agregada al cultivo durante la alimentación del inductor es aproximadamente 10 g/L. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo durante aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas después del inicio del método. 15. El método de la reivindicación 14, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo durante aproximadamente 3 a aproximadamente 6 horas después del inicio. 16. El método de la reivindicación 1 , que comprende aislar la proteína recombinante aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas después de empezar a agregar el inductor al cultivo. El método de la reivindicación 16, que comprende aislar la proteína recombinante aproximadamente 3 a aproximadamente 6 horas después de empezar a agregar el inductor al cultivo. El método de la reivindicación 1 , en donde el inductor es arabinosa. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar continuamente la fuente de carbón al cultivo antes de inducción. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar continuamente la fuente de carbón al cultivo antes de y durante inducción. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar continuamente la fuente de carbón al cultivo mientras el inductor se agrega continuamente al cultivo. El método de la reivindicación 1 , que comprende agregar continuamente la fuente de carbón al cultivo hasta que la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 70 a aproximadamente 110. El método de la reivindicación 1 , en donde la fuente de carbón es una fuente de carbón basada en azúcar. El método de la reivindicación 23, en donde la fuente de carbón basada en azúcar es glucosa. El método de la reivindicación 24, en donde el inductor es arabinosa. El método de la reivindicación 25, que comprende agregar continuamente la glucosa al medio de cultivo mientras la arabinosa se agrega continuamente al medio de cultivo. El método de la reivindicación 25, que comprende agregar continuamente la glucosa hasta que la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 80. Un método para producir una proteína recombinante que comprende: a) introducir en una célula anfitriona bacteriana un vector de expresión que codifica una proteína recombinante bajo el control de un promotor inducible para formar una célula bacteriana recombinante; b) introducir la célula bacteriana recombinante en un medio de cultivo para formar un cultivo celular; c) agregar una fuente de carbón al cultivo celular como una alimentación continua; d) monitorear el crecimiento celular en el cultivo celular para el alcance de una densidad óptica umbral (OD60o); e) agregar un inductor del promotor inducible al cultivo celular como una alimentación continua una vez se alcanza la densidad óptica umbral (OD6oo); y f) aislar la proteína recombinante del cultivo celular. El método de la reivindicación 28, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 70 a aproximadamente 110. El método de la reivindicación 29, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD6oo de aproximadamente 70 a aproximadamente 105. El método de la reivindicación 30, que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 75 a aproximadamente 85. 32. El método de la reivindicación 31 , que comprende agregar continuamente el inductor al cultivo cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 80. 33. El método de la reivindicación 28, en donde el inductor se agrega al cultivo a una velocidad constante, el inductor se agrega al cultivo mediante una alimentación DO-stat o el inductor se agrega al cultivo mediante alimentación pH-stat. 34. El método de la reivindicación 33, en donde el inductor se agrega al cultivo a una velocidad constante de aproximadamente 3.35 g/L/h a aproximadamente 16 g/L/h, el inductor se agrega al cultivo mediante una alimentación DO-stat o el inductor se agrega al cultivo mediante alimentación pH-stat. 35. El método de la reivindicación 28, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo es de aproximadamente 4 g/L a aproximadamente 40 g/L. 36. El método de la reivindicación 35, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo es de aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 20 g/L. 37. El método de la reivindicación 36, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo es de aproximadamente 7 g/L a aproximadamente 15 g/L. 38. El método de la reivindicación 37, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo es aproximadamente 10 g/L. 39. El método de la reivindicación 28, que comprende aislar la proteína recombinante del cultivo aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas después del inicio de la alimentación del inductor. 40. El método de la reivindicación 39, que comprende aislar la proteína recombinante del cultivo aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas después del inicio de la alimentación del inductor. El método de la reivindicación 28, en donde la fuente de carbón se agrega al cultivo celular durante la alimentación a velocidad constante de la fuente de carbón y el inductor, durante la alimentación DO-stat de la fuente de carbón y el inductor o durante la alimentación pH-stat de la fuente de carbón y el inductor. El método de la reivindicación 28, en donde el inductor es arabinosa. El método de la reivindicación 28, en donde la fuente de carbón es una fuente de carbón basada en azúcar. El método de la reivindicación 43, en donde la fuente de carbón basada en azúcar es glucosa. El método de la reivindicación 28, en donde la fuente de carbón es glucosa y el inductor es arabinosa. El método de la reivindicación 45, que comprende agregar continuamente glucosa al cultivo celular mientras la arabinosa se agrega continuamente al cultivo celular. El método de la reivindicación 45, que comprende agregar continuamente glucosa al cultivo celular hasta que la densidad celular del cultivo celular alcanza un OD6oo de aproximadamente 80. Un método para producir una proteína recombinante que comprende: cultivar una célula bacteriana recombinante para expresar una proteina recombinante al agregar continuamente un inductor a un cultivo que comprende la célula bacteriana después que el cultivo alcanza un parámetro umbral, en donde la célula bacteriana comprende una secuencia de ácido nucleico que corresponde a un gen de N. meningitidis serogrupo B. El método de la reivindicación 48, en donde el parámetro umbral es la densidad óptica (OD), el oxígeno disuelto (DO), pH, la concentración de nutriente en medio de cultivo, la concentración total de fuente de carbón agregada al medio de cultivo, o cualquier combinación de estos. El método de la reivindicación 49, en donde el parámetro umbral es la densidad óptica (OD) del cultivo. El método de la reivindicación 50, en donde la alimentación del inductor continua se inicia cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD6oo de aproximadamente 70 a aproximadamente 110. El método de la reivindicación 51 , en donde la alimentación del inductor continua se inicia cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 70 a aproximadamente 105. El método de la reivindicación 52, en donde la alimentación del inductor continua se inicia cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD600 de aproximadamente 75 a aproximadamente 85. El método de la reivindicación 53, en donde la alimentación del inductor continua se inicia cuando la densidad celular del cultivo alcanza un OD60o de aproximadamente 80. El método de la reivindicación 48, en donde el inductor se agrega al cultivo a una velocidad constante de aproximadamente 3.35 g/L/h a aproximadamente 16 g/L/h, el inductor se agrega mediante una alimentación DO-stat o el inductor se agrega mediante alimentación pH-stat. El método de la reivindicación 48, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo durante inducción es de aproximadamente 4 g/L a aproximadamente 40 g/L. 57. El método de la reivindicación 56, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo durante inducción es de aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 20 g/L. El método de la reivindicación 57, en donde la cantidad total del inductor agregado al medio de cultivo durante inducción es aproximadamente 7 g/L a aproximadamente 15 g/L. El método de la reivindicación 58, en donde la cantidad total del inductor agregado al cultivo durante inducción es aproximadamente 10 g/L. El método de la reivindicación 48, en donde la alimentación del inductor continúa durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas después del inicio del método. El método de la reivindicación 60, en donde la alimentación del inductor continúa durante aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas después del inicio del método. El método de la reivindicación 48, en donde la proteína recombinante se cosecha de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas después del inicio de la alimentación del inductor. El método de la reivindicación 62, en donde el producto de proteína recombinante se aisla de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas después del inicio de la alimentación del inductor. El método de la reivindicación 48, en donde la alimentación de fuente de carbón al medio de cultivo continúa durante la alimentación del inductor al cultivo. El método de la reivindicación 48, en donde el inductor es arabinosa. El método de la reivindicación 48, en donde la fuente de carbón es una fuente de carbón basada en azúcar. El método de la reivindicación 66, en donde la fuente de carbón basada en azúcar es glucosa. 68. El método de la reivindicación 67, en donde el inductor es arabinosa. 69. El método de la reivindicación 68, en donde la glucosa alimenta al cultivo a una velocidad de alimentación constante durante la alimentación a velocidad constante de arabinosa al cultivo, durante DO-stat de la glucosa y el inductor o mediante alimentación pH-stat de la glucosa y el inductor. 70. El método de la reivindicación 68, en donde la glucosa alimenta al cultivo a una velocidad de alimentación constante durante la alimentación a velocidad constante de arabinosa al cultivo, mediante la alimentación DO-stat de la glucosa y el inductor hasta la densidad celular en el cultivo que alcanza un OD60o de aproximadamente 80 o mediante alimentación pH-stat de la glucosa y el inductor hasta que la densidad celular en el cultivo alcanza un OD600 de aproximadamente 80. 71. El método de la reivindicación 68, en donde la proteína 2086 meningocócica recombinante comprende una lipoproteína (rLP2086). 72. El método de la reivindicación 68, en donde la proteína comprende una proteína no lipidada. 73. El método de la reivindicación 68, en donde la proteína comprende proteína 2086 meningocócica de la subfamilia A. 74. El método de la reivindicación 68, en donde la proteína comprende proteína 2086 meningocócica de la subfamilia B. 75. Un método para producir una proteína 2086 meningocócica recombinante (P2086) que comprende: (a) introducir en una célula anfitriona bacteriana un vector de expresión que codifica una proteína 2086 recombinante bajo el control de un promotor inducible para formar una célula bacteriana recombinante; (b) introducir la célula bacteriana recombinante a un medio de cultivo para formar un cultivo; (c) agregar una fuente de carbón al cultivo; (d) monitorear el crecimiento celular en el cultivo para el alcance de una densidad óptica umbral (OD); (e) agregar continuamente un inductor del promotor inducible al cultivo una vez la densidad celular del cultivo alcanza una densidad óptica de aproximadamente 70 a 110; y (f) aislar la proteína 2086 meningococica recombinante del cultivo después de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas después empezar a agregar continuamente el inductor. Una composición que comprende: un cultivo bacteriano que comprende una proteína 2086 meningococica recombinante a una densidad de por lo menos aproximadamente 1.5 g/L con base en el volumen total del cultivo bacteriano. La composición de la reivindicación 76, en donde la proteína 2086 meningococica recombinante es proteína lipidada. La composición de la reivindicación 76, en donde la proteína 2086 meningococica recombinante es proteína no lipidada. La composición de la reivindicación 76, en donde la proteína 2086 meningococica recombinante es una proteína 2086 de la subfamilia A. La composición de la reivindicación 76, en donde la proteína recombinante es una proteína 2086 de la subfamilia B. 81. La composición de la reivindicación 80, en donde el cultivo comprende una segunda proteína 2086 meningocócica recombinante. 82. La composición de la reivindicación 81 , en donde la proteína 2086 meningocócica recombinante es una proteína 2086 de la subfamilia A. 83. La composición de la reivindicación 76, en donde la densidad de la proteína 2086 meningocócica recombinante es por lo menos aproximadamente 1.7 g/L con base en el volumen total del cultivo bacteriano. 84. La composición de la reivindicación 76, en donde la densidad de la proteína 2086 meningocócica recombinante es por lo menos aproximadamente 2.0 g/L con base en el volumen total del cultivo bacteriano. 85. La composición de la reivindicación 76, en donde la densidad de la proteína 2086 meningocócica recombinante es por lo menos aproximadamente 3.0 g/L con base en el volumen total del cultivo bacteriano. 86. Una composición que comprende: un cultivo bacteriano que comprende una proteína 2086 meningocócica recombinante preparada de acuerdo con el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-75.