BRPI0715360B1

BRPI0715360B1 - método para a produção de uma proteína recombinante; método para a produção de uma proteína 2086 meningocócica recombinante (p2086); e composição

Info

Publication number: BRPI0715360B1
Application number: BRPI0715360-0A
Authority: BR
Inventors: Wei-Qiang Willie Sun
Original assignee: Wyeth
Priority date: 2006-07-27
Filing date: 2007-07-21
Publication date: 2021-01-19
Also published as: CA2657135C; CA2657135A1; PT2061897T; IL196496A0; US20160289725A1; JP2009544321A; RU2008152445A; US9279000B2; MX2009000813A; EP2061897B1; IL196496A; US10301663B2; EP2061897A2; BRPI0715360A2; CN101535493A; JP2014064583A; DK2061897T3; HUE048973T2; KR20090034375A; SI2061897T1

Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE; MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA 2086 MENINGOCÓCICA RECOMBINANTE (P2086); E COMPOSIÇÃO. Apresentam-se métodos para a produção de proteínas, por exemplo, proteínas 2086 meningocócícas recombinantes, usando fermentação por batelada alimentada com entrada contínua de um indutor depois de se atingir um parâmetro de limiar e, opcionalmente, a entrada contínua de uma fonte de carbono, por exemplo, uma entrada a taxa constante, para melhorar os rendimentos de proteína, assim como composições de proteínas de alta densidade e composições para uso nos métodos da presente invenção.

Description

Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisória n2 de série U.S. 60/833.479, intitulado "HIGHCELL DENSITY FED-BATCH FERMENTATION PROCESS FOR PRODUCING

RECOMBINANT PROTEIN", depositado em 27 de julho de 2006, cujo teor está incorporado integralmente ao presente à guisa de referência.

Campo da Invenção

Este pedido refere-se, genericamente, a novos métodos de fermentação por batelada alimentada que proporcionam uma melhor expressão de proteínas em sistemas bacterianos, assim como a composições de proteínas de alta densidade e a composições que são usadas nos novos métodos de fermentação por batelada alimentada.

Fundamentos da Invenção

Várias estratégias de fermentação foram usadas para produzir proteínas em quantidades suficientes para uso laboratorial, clínico ou comercial. A fermentação por batelada alimentada foi usada para proporcionar maiores rendimentos de proteínas com relação aos conseguidos por métodos de fermentação por bateladas simples. A fermentação por batelada alimentada é um processo em que, após uma fase de batelada inicial, ocorre uma fase em que um ou mais nutrientes são supridos à cultura por alimentação.

Genericamente, durante a fase de batelada, as células são inicialmente cultivadas até uma concentração desejada. Nessa fase, o crescimento celular é amplificado, e, em geral, nenhuma proteina alvo é produzida, a menos que 5 se adicione um indutor, como arabinose, lactose ou isopropil beta-D-tiogalactosida (IPTG), dependendo do promotor, ou haja algum vazamento do promotor. Durante a fase de alimentação, a fonte de carbono e outras exigências são tipicamente alimentadas a um fermentador em uma corrente liquida relativamente concentrada a uma certa taxa de alimentação. Uma vez que uma densidade celular alvo seja atingida, começa-se a alimentação com o indutor ou com indutor e outros nutrientes. Nessa fase, a ênfase é na produção de proteínas pelas células cultivadas. O substrato (isto é, os nutrientes e o indutor) que é alimentado ao fermentador é, nesse estágio, usado genericamente para crescimento celular e sintese de produto. O crescimento celular é controlado pela taxa de alimentação, para se obter um crescimento celular e uma produção de proteina ótimos.

Durante o estágio de produção de proteínas, um indutor tem de ser adicionado para organismos recombinantes.

A expressão de proteinas em um meio compreendendo uma fonte de carbono comum, como glicose ou outra fonte de carbono à base de açúcar, e um indutor é satisfatória até 25 que surjam condições limitativas ao término da fase de alimentação. Exemplos de condições limitativas incluem concentração reduzida de oxigênio, nutrientes reduzidos como vitaminas, carbono, nitrogênio, e acúmulo de compostos tóxicos no meio de crescimento.

Estratégias de fermentação por batelada alimentada frequentemente envolvem diferentes formas de controle por 5 retroalimentação, incluindo retroalimentação indireta e direta para controlar o suprimento de nutrientes. Um desses métodos de fermentação por batelada alimentada envolve a aplicação de um algoritmo de controle de retroalimentação por alimentação dos nutrientes para controlar um parâmetro de processo em um momento definido. Por exemplo, o controle direto da alimentação pode se basear na medição da concentração do nutriente. O controle de retroalimentação é, então, diretamente relacionado à atividade celular durante toda a fermentação. Parâmetros de controle que foram usados para controle de retroalimentação de fermentações incluem o valor de pH, densidade celular medida on line ou tensão de oxigênio dissolvido (DOT).

Entretanto, a aplicação de algoritmos de retroalimentação é acompanhada por inúmeras desvantagens.

Uma dessas desvantagens é que a taxa de alimentação depende de parâmetros de processo atuais. Qualquer perturbação no processo pode afetar o parâmetro, distorcendo, assim, a taxa de alimentação e o rendimento de proteina resultante. Essas desvantagens são amplificadas quando o processo é escalonado para produzir maiores quantidades de proteina.

Outra desvantagem de estratégias de batelada alimentada anteriormente empregadas é que, quando se usa controle de retroalimentação, a taxa de crescimento especifica não pode ser predefinida ou controlada com exatidão, resultando em rendimentos subótimos nos processos, quando a formação de produto é dependente do crescimento.

Além disso, quando o fluxo de carbono (por 5 exemplo, alta concentração de glicose) para a via metabólica central excede a capacidade máxima do ciclo de ácido tricarboxilico (TCA), podem-se acumular subprodutos. O acúmulo de subprodutos poderia inibir o crescimento celular e a produção de proteínas durante a fermentação.

Além do mais, as várias deficiências dos métodos de fermentação por batelada alimentada frequentemente resultam em um uso ineficiente dos componentes nutrientes. Assim, os métodos podem ser economicamente desvantajosos, particularmente para produção comercial de proteínas em 15 grande escala.

As abordagens anteriores de expressão de proteínas recombinantes mediante fermentação por batelada alimentada, conforme acima descritas, têm várias deficiências. Dada a importância da produção eficiente em termos de custo de 20 quantidades suficientes de proteínas para várias finalidades, há necessidade de um método de fermentação por batelada alimentada eficiente que resulte em maior crescimento celular, maior formação de produto (isto é, maior rendimento de proteína) e menor acúmulo de 25 subprodutos.

Sumário da Invenção

A presente invenção se refere a novos métodos de fermentação por batelada alimentada para a produção de rendimentos inesperadamente altos de proteinas recombinantes.

Uma modalidade da presente invenção apresenta um método para a produção de uma proteina recombinante 5 compreendendo: o cultivo de uma célula bacteriana recombinante para expressar uma proteina recombinante compreendendo a adição continua de uma fonte de carbono a uma cultura compreendendo a célula bacteriana recombinante e a adição continua de um indutor à cultura após a cultura 10 atingir um parâmetro de limiar; e o isolamento da proteina recombinante da cultura celular.

Uma modalidade adicional da presente invenção apresenta um método para a produção de uma proteina recombinante compreendendo: (a) a introdução em uma célula 15 hospedeira bacteriana de um vetor de expressão que codifique uma proteina recombinante sob o controle de um promotor induzivel para formar uma célula bacteriana recombinante; (b) a introdução da célula bacteriana recombinante em um meio de cultura para formar uma cultura celular; (c) a 20 adição de uma fonte de carbono à cultura celular como uma alimentação continua; (d) a monitorização do crescimento celular na cultura celular quanto a atingir uma densidade óptica de limiar (OD60o) ; (θ) a adição de um indutor do promotor induzivel à cultura celular como uma alimentação 25 continua uma vez que a densidade óptica de limiar (OD6oo) seja atingida; e (f) a colheita da proteina recombinante da cultura celular.

Ainda outra modalidade da presente invenção apresenta um método para a produção de uma proteina recombinante compreendendo: o cultivo de uma célula bacteriana recombinante para expressar uma proteina recombinante por adição continua de um indutor a uma cultura compreendendo a célula bacteriana após a cultura atingir um parâmetro de limiar, em que a célula bacteriana compreende uma sequência de ácido nucléico correspondente a um gene de N. meningitidis sorogrupo B.

De acordo com ainda outra modalidade, a presente invenção apresenta um método para a produção de uma proteína 2086 recombinante (rP2086) compreendendo: (a) a introdução em uma célula hospedeira bacteriana de um vetor de expressão que codifique uma proteína 2086 meningocócica recombinante sob o controle de um promotor induzível para formar uma célula bacteriana recombinante; (b) a introdução da célula bacteriana recombinante em um meio de cultura para formar uma cultura; (c) a adição de uma fonte de carbono à cultura; (d) a monitorização do crescimento celular na cultura quanto a atingir uma densidade óptica de limiar (OD); (e) a adição contínua de um indutor do promotor induzível à cultura uma vez que a densidade celular da cultura atinja uma densidade óptica de cerca de 70 a 110; e (f) a colheita da proteína 2086 meningocócica recombinante da cultura após cerca de 3 horas a cerca de 6 horas depois do início da adição contínua do indutor.

De acordo com outra modalidade, a presente invenção apresenta uma composição compreendendo: uma cultura

bacteriana compreendendo uma proteína 2086 recombinante (rP2086) a uma densidade de pelo menos cerca de 1,5 g/L com base no volume total da cultura bacteriana.

De acordo com ainda outra modalidade, a presente invenção apresenta uma composição compreendendo: um meio de cultura bacteriana compreendendo uma proteína 2086 meningocócica recombinante (rP2086) preparada de acordo com os métodos da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Fermentação por batelada alimentada a várias taxas de alimentação constantes, sem indução. Figura 2: Fermentação por batelada alimentada a várias taxas de alimentação constantes, sem indução. Figura 3: Indução a várias densidades ópticas. Figura 4: Indução com vários níveis de arabinose. Figura 5: Efeitos do método de adição de arabinose sobre o rendimento de rLP2086. Figura 6: Efeito da taxa de alimentação de arabinose sobre a produção de rLP2086. Figura 7: Efeito do tempo de indução sobre a expressão. Figura 8: Fermentação por batelada alimentada para produção de rLP2086 subfamília B. Figura 9: e 9b: SDS-PAGE e Western Blot da indução de rLP2086 subfamília B, respectivamente. Figura 10: Fermentação por batelada alimentada para produção de rLP2086 subfamília A. Figuras 11a e 11b: SDS-PAGE e Western Blot da indução de rLP2086 subfamilia A, respectivamente. Figuras 12a, 12b e 12c: Alimentação dupla de glicose e arabinose durante a indução. Figura 13a: fermentação por batelada alimentada de rLP2086 subfamilia B de E. coli a uma escala de 100 L. Figura 13b: fermentação por batelada alimentada de rLP2086 subfamilia A de E. coli a uma escala de 100 L. Figura 14a: fermentação por batelada alimentada de rLP2086 subfamilia B de E. coli com alimentação dupla de glicose e arabinose a uma escala de 100 L. Figura 14b: fermentação por batelada alimentada de rLP2086 subfamilia A de E. coli com alimentação dupla de glicose e arabinose a uma escala de 100 L.

Descrição Detalhada da Invenção

Os métodos da presente invenção se baseiam na descoberta surpreendente de que rendimentos de proteína inesperadamente altos são obtidos por fermentação por batelada alimentada com alimentação continua de um indutor durante a indução em um meio de cultura. Opcionalmente, uma fonte de carbono é continuamente alimentada antes da e/ou durante a alimentação contínua de indutor. Quando induzido por arabinose, cerca de 2 - 3 g/L de uma lipoproteína 2086 recombinante (rLP2086) (que é expressa por um microorganismo com uma sequência correspondendo ao gene 2086 gene em N. meningitidis sorogrupo B) foram produzidos de acordo com uma modalidade da invenção. Isso representa um aumento de aproximadamente 2 a 3 vezes no rendimento de rLP2086 por fermentação por batelada alimentada para ambas as subfamílias A e B da proteina 2086 em comparação com um processo de fermentação por batelada comparativo. Além disso, os métodos da presente invenção são prontamente 5 adaptáveis à produção em escala comercial dessas e de outras proteinas.

Para fins de promover um entendimento das modalidades aqui descritas, será feita referência a várias modalidades, e uma linguagem especifica será usada para 10 descrevê-las. A terminologia aqui usada é apenas para fins de descrever modalidades particulares e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção. Conforme usadas nesta exposição, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem a referência plural, a menos que o contexto 15 claramente determine de outra forma. Da mesma forma, as formas singulares de termos como "meio" incluem a referência ao plural "meios" e vice-versa. Assim, por exemplo, uma referência a "um meio de cultura" inclui uma pluralidade desses meios, assim como um único meio; e uma referência a 20 "meio de cultura" inclui uma pluralidade de meios, assim como um único meio.

O termo "indutor", conforme aqui usado, refere-se a qualquer agente que induza, intensifique ou promova a expressão de uma proteina recombinante, em que a expressão 25 do gene sob o controle do promotor induzível possa ser diretamente regulado pela concentração desse agente.

O termo "fonte de carbono", conforme aqui usado, refere-se a uma fonte de carbono e energia para as células.

Os termos "alimentação", "alimentado", "alimentando" ou "adição continua", conforme aqui usados de maneira intercambiável, referem-se à adição de uma substância continuamente durante um periodo de tempo, em vez de tudo de uma vez. Os termos consideram um inicio e/ou término únicos ou múltiplos pontos de partida e/ou parada para a adição continua da substância durante um processo de fermentação. 0 termo "proteina recombinante", conforme aqui usado, refere-se a qualquer proteina ou sua parte biologicamente ativa (por exemplo, uma parte - que retenha atividade biológica da proteina completa) que não seja um gene repórter ou marcador (por exemplo, uma proteina fluorescente verde) expressada por material genético recombinante que codifique aminoácidos, incluindo peptidios, polipeptidios, proteínas, oligoproteinas e/ou proteínas de fusão. Um produto de proteina recombinante pode incluir um produto terapêutico, profilático ou diagnóstico.

Métodos da Presente Invenção:

Os métodos da presente invenção proporcionam rendimentos inesperadamente altos de proteina mediante um novo processo de fermentação por batelada alimentada envolvendo a adição continua de um indutor, como arabinose, a um meio de cultura após a cultura atingir um parâmetro de limiar. Uma fonte de carbono, como glicose, é em geral adicionada a uma cultura compreendendo uma célula bacteriana recombinante antes da fase de indução. A fonte de carbono pode ser alimentada juntamente com o indutor. 0 indutor também pode servir de fonte de carbono secundária.

Uma fonte de carbono, como glicose, é continuamente adicionada ao meio de cultura, antes e/ou 5 durante a alimentação continua do indutor ao meio de cultura, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Assim, a alimentação continua da fonte de carbono se superpõe à alimentação continua do indutor, de acordo com uma modalidade. A alimentação contínua da fonte de carbono 10 pode continuar durante toda a duração da alimentação contínua de indutor ou apenas durante parte (s) dessa duração. Em outra modalidade, a alimentação contínua da fonte de carbono não se superpõe à alimentação contínua do indutor. De acordo com uma modalidade da presente invenção, 15 o indutor e/ou a fonte de carbono podem ser alimentados à cultura a uma taxa constante.

O processo de fermentação por batelada alimentada envolve várias etapas, resultando na produção da proteína desejada de acordo com uma modalidade da invenção. Em uma 20 etapa inicial, um vetor de expressão que codifica um produto de proteína recombinante sob o controle de um promotor induzivel é preparado e, então, é introduzido em uma célula hospedeira bacteriana. A célula hospedeira bacteriana é introduzida em um meio de cultura. Um indutor do promotor 25 induzivel é alimentado à cultura (isto é, o indutor é adicionado à cultura continuamente durante um período de tempo) . 0 indutor pode ser alimentado à cultura a uma taxa constante. Então, o produto de proteína recombinante é colhido da cultura. A proteína recombinante produzida dessa maneira pode ser, então, purificada conforme desejado e/ou usada de qualquer maneira adequada, como em uma formulação profilática, terapêutica ou diagnóstica.

Uma alta densidade celular e um rendimento de proteína aumentado foram inesperadamente conseguidos pela fermentação por batelada alimentada com a alimentação a taxa constante de um indutor, o que proporciona um rendimento de produto de proteína recombinante aproximadamente 2 a 3 vezes 10 maior em comparação com a fermentação por batelada, conforme ilustrado nos exemplos apresentados abaixo. Os métodos da presente invenção são aplicáveis a fermentação em grande escala, assim como a fermentação em pequena escala. Fermentação em "grande escala", conforme aqui usado, refere- 15 se a fermentação em um fermentador que tenham pelo menos aproximadamente 1.000 L de capacidade volumétrica, isto é, volume de trabalho, deixando um espaço adequado para o espaço superior. Fermentação em "pequena escala" se refere genericamente a fermentação em um fermentador com no máximo 20 aproximadamente 100 L de capacidade volumétrica, como 5 L, L, 50 L ou 100 L. Uma vantagem demonstrada do presente processo de fermentação por batelada alimentada é que pode ser utilizada para a produção de um produto de proteína recombinante na escala de fermentador de 5 a 10 L e ser 25 escalonável para qualquer volume, por exemplo, 100 L, 150 L, 0 L, 500 L, 1.000 L ou mais, sem limitação.

Indutores:

Os métodos aqui descritos se referem à produção de proteina recombinante, em que a expressão de proteina recombinante está sob o controle transcricional de um promotor induzivel, pelo que a expressão do gene sob o 5 controle do promotor induzivel pode ser diretamente regulada pela concentração do indutor presente no meio de cultura. 0 indutor é continuamente fornecido ao meio de cultura, opcionalmente a uma taxa constante. 0 indutor é adicionado ao meio de cultura uma vez que um parâmetro de limiar tenha 10 sido atingido. Por exemplo, uma proteina recombinante pode estar sob o controle do promotor araB (por exemplo, ParaB), que pode ser diretamente regulado pela concentração de arabinose que é adicionada a uma taxa constante ao meio de cultura. Indutores adequados para uso juntamente com a 15 presente invenção são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos de indutores da presente invenção são apresentados abaixo, sem limitação.

Fonte de Carbono: de carbono adequada, por exemplo glicerol, succinato, lactato, ou fonte de carbono à base de açúcar, por exemplo, glicose, lactose, sacarose e frutose, é considerada para uso na presente invenção, conforme será compreendido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, fontes de carbono à base de açúcar que podem ser usadas na presente invenção incluem, sem limitação, polissacarideos ramificados ou não ramificados que compreendam os monômeros sacaridicos D-manose, D- e L-galactose, fucose, frutose, D- xilose, L-arabinose, ácido D-glucurônico, ácido siálico, ácido D-galacturônico, ácido D-manurônico (por exemplo, ácido polimanurônico ou ácido alginico), D-glucosamina, D- galactosamina, D-glicose e ácido neuraminico, incluindo 5 homopolissacarideos e heteropolissacarideos, por exemplo, lactose, amilopectina, amido, hidroxietil amido, amilose, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicogênio, ou a subunidade polissacaridica de mucopolissacarideos ácidos, por exemplo, ácido hialurônico; polimeros de álcoois de açúcar, como polissorbitol e polimanitol; heparina ou heparano; ou quaisquer de suas combinações, sem limitação. A glicose é a fonte de carbono primária de acordo com uma modalidade da invenção. Arabinose, quando usada como o indutor, também pode servir de fonte de carbono secundária, embora também possa ser a fonte de carbono primária. De acordo com uma modalidade, as fontes de carbono incluem qualquer um de D-glicose, L-arabinose, sacarose, I-inositol, D-manitol, β-D-frutose, α-L ramnose, D-xilose, celulose, ou qualquer de suas combinações. Uma ou mais de uma fonte de carbono pode ser usada na presente invenção. Sistemas de Expressão Bacteriana e Plasmidios: Esta invenção também apresenta células bacterianas recombinantes compreendendo um vetor de expressão, como um plasmidio, compreendendo uma sequência de controle de 25 expressão com sequências promotoras e sequências iniciadoras e uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptidio desejado, a sequência de nucleotideos estando localizada de 3' para as sequências promotoras e iniciadoras. Consideram- se quaisquer sequências de controle de expressão e células hospedeiras/veiculos de clonagem adequados, conforme seria sabido por alguém versado na técnica com base na exposição aqui apresentada. Sequências de controle de expressão e combinações de célula hospedeira/veiculo de clonagem adequadas são bem conhecidas na técnica e estão descritas, a titulo de exemplo, em Sambrook, J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Genericamente, técnicas de DNA recombinante envolvem a obtenção, por sintese ou isolamento, de uma sequência de DNA que codifique a proteina recombinante de interesse, e sua introdução em urn sistema de expressão vetor/célula hospedeira apropriado, onde é expresso, de preferência sob o controle de um promotor induzivel por arabinose. Qualquer um dos métodos descritos para a inserção de DNA em um vetor de expressão pode ser usado para ligar um promotor e outros elementos de controle reguladores em sitios específicos dentro do vetor recombinante selecionado. Células hospedeiras adequadas são, então, transformadas, infectadas, transduzidas ou transfectadas com esses vetores ou plasmidios por técnicas convencionais. Vários sistemas de célula hospedeira-vetor (plasmidio) podem ser usados para expressar a proteina recombinante de interesse. O sistema de vetor, como, por exemplo, um sistema incluindo promotor induzivel por arabinose, é compatível com a célula hospedeira usada. O DNA que codifica o produto de proteina recombinante de interesse é inserido em um sistema de expressão, e o promotor (de preferência o promotor induzivel por arabinose) e outros elementos de controle são ligados em sitios específicos 5 dentro do vetor, de modo que, quando o vetor é inserido em uma célula hospedeira (por transformação, transdução ou transfecção, dependendo do sistema célula hospedeira-vetor usado), o DNA que codifica o produto de proteina recombinante de interesse é expresso pela célula hospedeira. O vetor pode ser selecionado de um dos vetores virais ou vetores não virais acima descritas, mas tem de ser compatível com a célula hospedeira usada. O vetor de DNA recombinante pode ser introduzido em células hospedeiras apropriadas (bactérias, virus, levedura, células de mamíferos ou outras) por transformação, transdução ou transfecção e outros (dependendo do sistema vetor/célula hospedeira). Sistemas hospedeiro-vetor incluem, mas não se limitam a, bactérias transformadas com DNA de bacteriófago, DNA de plasmidio ou DNA de cosmidio. A expressão em procariotos do produto de proteina recombinante de interesse pode ser realizada em qualquer espécie adequada ou cepa de bactéria, como E. coli, com vetores contendo promotores constitutivos ou induziveis que direcionem a expressão de proteínas de fusão ou de não 25 fusão. Vetores de fusão acrescentam um número de aminoácidos a uma proteina codificada, na terminação amino ou carbóxi da proteina recombinante. Esses vetores de fusão servem tipicamente a três finalidades: 1) aumentar a expressão da proteina recombinante; 2) aumentar a solubilidade da proteina recombinante; e 3) auxiliar na purificação da proteina recombinante por ação como um ligante em purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, introduz-se um sitio de clivagem proteolitica na junção da fração de fusão com a proteina recombinante para permitir a separação da proteina recombinante da fração de fusão após a purificação da proteina de fusão. Essas enzimas, e suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enteroquinase. Vetores de expressão de fusão tipicos incluem Pgex (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988), Pmal (New England Biolabs, Beverly; Mass.) e Prit5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), que fundem glutationa S-transferase (GST), proteina de ligação E a maltose ou proteina A, respectivamente, à proteina recombinante alvo. Exemplos de vetores de expressão em E. coli de não fusão induzivel adequados incluem pTrc (Amann et al. (1988) Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli, Gene, 69, 301-315), e Pet lid (Studier et al. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods in Enzymology, 185, 60-89). A expressão do gene alvo pelo vetor pTrc se baseia na transcrição de RNA polimerase do hospedeiro a partir de um promotor de fusão trp-lac hibrido. A expressão do gene alvo pelo vetor Pet lid se baseia na transcrição a partir de um promotor de fusão T7 gnl 0-lac mediada por uma RNA polimerase viral coexpressa J7 gnl. Essa polimerase virai é suprida por cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS I 74(DE3) de um pró-fago residente portador de um gene T7 gnl sob o controle transcricional do promotor lacUV 5. A sequência reguladora do construto de vetor é um promotor induzivel de acordo com uma modalidade. O uso de um promotor induzivel permitirá que baixos niveis basais de proteina ativada sejam produzidos pela célula durante o cultivo de rotina e adição de expansão. Subsequentemente, as células podem ser, então, induzidas a expressar grandes quantidades da proteina desejada durante a produção ou triagem. O promotor induzivel pode ser isolado de genomas celulares ou virais. Promotores induziveis que são regulados por compostos supridos exogenamente incluem, sem limitação, o promotor de arabinose, o promotor de metalotionina de ovelha induzivel por zinco (MT), o promotor do virus de tumor mamário de camundongo (MMTV) induzivel por dexametasona (Dex), o sistema promotor de T7 polimerase (WO 98/10088); o promotor de inseto ecdisona (No et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:3346-3351), o sistema repressive! por tetraciclina (Gossen et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:5547-5551), o sistema induzivel por tetraciclina (Gossen et al., 1995 Science, 268:1766-1769, veja também Harvey et al., 1998 Curr. Opin. Chem Biol, 2:512-518), o sistema induzivel por RU486 (Wang et al. Biotech., 15:239-243 e Wang et al., 1997 Gene Ther., 4:432441) e o sistema induzivel por rapamicina (Magari et al., 1997 J. Clin. Invest., 100: 2865-2872) . De acordo com uma modalidade da invenção, o promotor é um promotor induzivel 5 por arabinose. • Qualquer célula hospedeira bacteriana adequada é considerada para uso na presente invenção, conforme seria compreendido por aqueles versados na técnica com base na * exposição aqui apresentada. Por exemplo, bactérias adequadas para essa finalidade incluem Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus, ou uma combinação delas, sem limitação. Qualquer cepa adequada de qualquer uma dessas 15 bactérias adequadas também é considerada pela presente invenção. Além disso, o uso de células mutantes adequadas, conforme seria reconhecido por aqueles versados na técnica, também é considerado pela presente invenção. Aqueles versados na técnica seriam prontamente capazes de selecionar 20 uma célula hospedeira apropriada para usar sob circunstâncias especificas mediante a orientação aqui apresentada. Exemplos de vetores de expressão em E. coli induziveis adequados incluem, sem limitação, pTrc (Amann et 25 al., 1988 Gene, 69:301-315), os vetores de expressão de arabinose (por exemplo, Pbadlδ, Guzman et al., 1995 J. Bacteriol., 177:4121-4130), e pETIId (Studier et al., 1990 Methods in Enzymology, 185:60-89). A expressão do gene alvo pelo vetor pTrc se baseia na transcrição de RNA polimerase do hospedeiro a partir de um promotor de fusão trp-lac hibrido. A expressão do gene alvo pelo vetor pETIId se baseia na transcrição a partir de um promotor de fusão T7 gnlO-lac mediada por uma RNA polimerase viral coexpressa T7 gn 1. Essa polimerase virai é suprida por cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS I 74(DE3) a partir de um pró-fago residente portador de um gene T7 gnl sob o controle -t transcricional do promotor lacUV5. 0 sistema PBAD se baseia no promotor de arabinose induzivel que é regulado pelo gene araC. O promotor é induzido na presença de arabinose.

Outras modalidades da presente invenção utilizam vetores de expressão regulados por arabinose ou vetores em que a expressão da proteina recombinante de interesse esteja sob o controle do promotor de arabinose, por exemplo, o promotor para o óperon de arabinose de E. coli, PBAE> OU PARA, sem limitação.

Uma sequência de ácido nucléico (nucleotideos) que codifique qualquer proteina desejada é considerada pela presente invenção. A sequência de nucleotideos pode ser uma sequência de nucleotideos de ocorrência natural completa ou parcial ou uma sequência de nucleotideos alterada completa ou parcial, ou qualquer sequência que se hibridize a elas sob condições rigorosas. Referências aqui a sequências de ácidos nucléicos que correspondam a um gene se referem a qualquer sequência de ácido nucléico expressável como a proteina desejada. Por exemplo, essas sequências de ácidos nucléicos alteradas incluem uma deleção, substituição, incluindo transição e transversão, ou inserção de nucleotidio, e em que as ditas alterações podem ocorrer nas posições terminais 5 5' ou 3' da sequência de nucleotideos de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre os nucleotideos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contiguos dentro da sequência de referência. 0 número de alterações de 10 nucleotideos é determinado multiplicando-se o número total de nucleotideos em qualquer sequência pela porcentagem numérica da respectiva porcentagem de identidade (dividida por 100) e subtraindo-se esse produto do número total de nucleotideos na dita sequência. Por exemplo, a presente invenção considera o uso de uma sequência de nucleotideos que tenha pelo menos 70% de identidade com uma certa sequência de ácido nucléico; sua variante degenerada ou seu fragmento, em que a sequência pode incluir até nn alterações no ácido nucléico por toda a 20 região polinucleotidica da sequência de ácido nucléico, em que nn é o número máximo de alterações e é calculado pela fórmula: nn = xn—(xn*y), em que xn é o número total de ácidos nucléicos de 25 qualquer sequência, e y tem um valor de 0,70, em que qualquer produto não inteiro de xn e y é arredondado para baixo até o inteiro mais próximo antes de se subtrair esse produto de xn. Evidentemente, y também pode ter um valor de 0.80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,94 para 94%, 0,95 para 95%, 0,96 para 96%, 0,97 para 97%, 0,98 para 98% ou 0,99 para 99%, e assim por diante. Alterações de uma sequência podem criar mutações sem sentido, de sentido 5 deturpado ou de deslocamento de quadro nessa sequência codificadora e, dessa forma, alterar o polipeptídio codificado pelo polinucleotideo após essas alterações.

A presente invenção considera o uso de variantes degeneradas ou seus fragmentos. Conforme aqui definido, uma "variante degenerada" é um polinucleotideo que difira da sequência de nucleotideos (e seus fragmentos) devido a uma degeneração do código genético, mas que ainda codifique a mesma proteina. 0 ácido nucléico pode compreender DNA, DNA cromossômico, cDNA e RNA e também podem compreender nucleotideos heterólogos. De acordo com várias modalidades, o ácido nucléico se hibridiza com um certo ácido nucléico, seu complemento, sua variante degenerada ou seu fragmento, sob condições de hibridização de alto rigor. Em ainda outras modalidades, o polinucleotideo se hibridiza sob condições de hibridização de rigor intermediário.

Deve-se perceber que os ácidos nucléicos podem ser obtidos de fontes naturais, sintéticas ou semi-sintéticas; além disso, a sequência de nucleotideos pode ser uma 25 sequência de ocorrência natural ou pode estar relacionada por mutação, incluindo substituições, deleções, inserções e inversões de bases únicas ou múltiplas, com essa sequência de ocorrência natural. A molécula de ácido nucléico pode ser RNA, DNA, de fita simples ou fita dupla, linear ou de forma circular covalentemente fechada. Exemplos de condições de rigor são mostradas na Tabela de Condições de Rigor abaixo: condições altamente 5 rigorosas são aquelas que são pelo menos tão rigorosas quanto, por exemplo, as condições A - F; condições rigorosas são pelo menos tão rigorosas quanto, por exemplo, as condições G - L; e condições de reduzido rigor são pelo menos tão rigorosas quanto, por exemplo, as condições M - R.

pb1: 0 comprimento do híbrido é aquele antecipado para a(s) região(ões) hibridizada(s) dos polinucleotideos de hibridização. Quando se hibridiza um polinucleot!deo a um polinucleotideo alvo de sequência desconhecida, o comprimento do hibrido é considerado o do polinucleotideo de hibridização. Quando se hibridizam polinucleotideos de sequência conhecida, o comprimento do hibrido pode ser 5 determinado por alinhamento das sequências dos polinucleotideos e identificação da região ou regiões de complementaridades ótimas de sequência. Tampão11: SSPE (lxSSPE é 0,15M de NaCl, lOmM de Nal-bPCq, e l,25mM de EDTA, pH 7,4) pode substituir SSC (lxSSC é 0,15M de NaCl e 15mM de citrato de sódio) nos tampões de hibridização e lavagem; as lavagens são realizadas durante 15 minutos depois de completa a hibridização. TB a TR: A temperatura de hibridização para hibridos antecipados como sendo menores que 50 pares de bases de comprimento deve ser de 5 - 10EC abaixo da temperatura de fusão (Tm) do hibrido, em que Tm é determinada de acordo com as seguintes equações. Para hibridos com menos de 18 pares de bases de comprimento, Tm(EC) = 2 (n2 de bases A + T) + 4 (n2 de bases G + C) . Para hibridos entre 18 e 49 pares de bases de comprimento, Tm(EC) = 81,5 + 16, 6 (logio [Na+] ) + 0,41(%G+C) - (600/N), em que N é o número de bases no hibrido, e [Na+] é a concentração de ions sódio no tampão de hibridização ([Na+] para lxSSC = 0, 165 M) .

Exemplos adicionais de condições de rigor para hibridização de polinucleotideos são apresentados em Sambrook, J. , E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capitulos 9 e 11, e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds. , John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4, aqui 5 incorporados por referência.

A invenção considera o uso de polinucleotideos que sejam completamente complementares a esses polinucleotideos, assim como sequências antissentido. As sequências antissentido, também chamadas de oligonucleotideos 10 antissentido, incluem tanto sequências geradas internamente, quanto administradas externamente, que bloqueiem a expressão de polinucleotideos que codifiquem os polipeptidios da invenção. As sequências antissentido da invenção compreendem, por exemplo, cerca de 15 - 20 pares de bases, 15 sem limitação. As sequências antissentido podem ser projetadas, por exemplo, para inibir a transcrição mediante prevenção da ligação do promotor a uma sequência não traduzida a montante ou prevenção da tradução de um transcrito que codifique um polipeptidio da invenção ao 20 evitar a ligação do ribossomo.

Os polinucleotideos podem ser preparados ou obtidos de qualquer maneira adequada (por exemplo, por sintese quimica, a partir de bibliotecas de DNA, a partir do próprio organismo) e podem ter várias formas (como fita 25 simples, fita dupla, vetores, sondas, primers), conforme seria entendido por aqueles versados na técnica. O termo "polinucleotideo" inclui DNA e RNA, e também seus análogos, como aqueles contendo estruturas principais modificadas. De acordo com implementações adicionais da presente invenção, os polinucleotideos compreendem uma biblioteca de DNA, como uma biblioteca de cDNA. Sistemas de Expressão da Proteína 2086: Apresenta-se um microorganismo recombinante capaz de expressar o polipeptídio 2086 de Neisseria meningitidis sorogrupo B 2086 de acordo com uma modalidade da presente invenção. 0 microorganismo recombinante compreende uma sequência de controle de expressão com sequências promotoras 10 e sequências iniciadoras, e uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídio 2086, a sequência de nucleotideos estando localizada em 3' com relação às sequências promotoras e iniciadoras. Em um aspecto adicional, apresenta-se uma célula hospedeira compreendendo 15 um polinucleotideo 2086 recombinante, conforme aqui descrito e nos WO 03/063766 e WO 04/094596, que são aqui incorporados por referência em sua inteireza. Assim, a presente invenção apresenta um método para a produção de uma proteína 2086 recombinante, conforme descrito nos WO 03/063766 e WO 20 04/094596, por exemplo, sem limitação.

Uma vez que as células hospedeiras que expressam a proteína ou polipeptídio desejado da invenção tenham sido construídas por transformação, transfecção ou infecção de células hospedeiras com plasmídios contendo o 25 polinucleotideo 2086 correspondente, as células hospedeiras são cultivadas sob condições em que os polipeptídios sejam expressos de acordo com os métodos da presente invenção. O polipeptídio pode ser, então, isolado substancialmente livre de componentes contaminantes da célula hospedeira por técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

Parâmetros de Limiar:

Vários parâmetros de limiar podem ser usados para monitorizar e controlar o progresso da cultura em termos de crescimento celular e expressão de proteina recombinante. Esses parâmetros incluem, mas não se limitam a, densidade óptica (OD), oxigênio dissolvido (DO), pH, consumo de nutriente/energia (como fonte de carbono), acúmulo de subprodutos metabólicos (por exemplo, ácido acético), tempo de colheita e temperatura. Qualquer parâmetro adequado ou combinação de parâmetros é considerada para uso na presente invenção, conforme seria compreendido por aqueles versados na técnica, com base nas orientações aqui apresentadas.

Estabelece-se um parâmetro de limiar para determinar o ponto em que o indutor deve ser continuamente adicionado à cultura (isto é, alimentado à cultura com o tempo). O parâmetro de limiar é um parâmetro predeterminado. Um parâmetro de limiar apropriado, como uma densidade óptica predeterminada, é prontamente determinado por alguém versado na técnica com base nas orientações aqui apresentadas, de acordo com várias modalidades da presente invenção. Pode-se usar um parâmetro de limiar ou uma combinação de parâmetros de limiar.

O parâmetro ou combinação de parâmetros pode ser monitorizada em quaisquer intervalos de tempo adequados na cultura. Por exemplo, ODS0Q e concentrações de glicose podem ser monitorizados a intervalos de uma hora, meia hora ou um quarto de hora, sem limitação.

A densidade óptica é usada como o parâmetro de limiar para inicio da alimentação continua de indutor, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Quando a densidade celular da cultura atinge um parâmetro de limiar predeterminado, como uma densidade óptica de cerca de 70 a cerca de 110, o indutor é, então, alimentado à cultura, conforme aqui descrito. Pode-se estabelecer uma faixa mais estreita para o parâmetro de limiar. Por exemplo, a presente invenção considera que se pode iniciar a adição continua do indutor à cultura quando a densidade celular da cultura atinge uma densidade óptica de cerca de 70 a cerca de 105, de cerca de 75 a cerca de 100, de cerca de 75 a cerca de 95, de cerca de 75 a cerca de 85, de cerca de 76 a cerca de 84, de cerca de 78 a cerca de 82 ou de cerca de 80, de acordo com modalidades da presente invenção.

A presente invenção também considera o uso de parâmetros de limiar para sinalizar o início e/ou término da alimentação da fonte de carbono.

Qualquer dispositivo adequado ou combinação de dispositivos é considerada para uso na monitorização do(s) parâmetro (s) de limiar, conforme seria sabido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma sonda ou uma combinação de sondas para medir um parâmetro de limiar pode ser montada no dispositivo de fermentação (o "fermentador") de qualquer maneira adequada, sem limitação.

Taxas de Alimentação Constante:

As taxas de alimentação constante se referem à taxa em que o(s) indutor(es) e/ou fonte(s) de carbono é(são) adicionado(s) à cultura. 0 indutor é adicionado à cultura após um parâmetro de limiar ter sido atingido. A fonte de 5 carbono também pode ser adicionada à cultura após um parâmetro de limiar ser atingido (e, da mesma forma, a adição da fonte de carbono pode ser terminada ao se atingir um parâmetro de limiar). Esses parâmetros de limiar incluem, sem limitação, densidade óptica (OD), oxigênio dissolvido (DO), pH, concentração de nutriente no meio de cultura, concentração total da primeira fonte de carbono adicionada ao meio de cultura ou qualquer combinação desses. Qualquer taxa constante adequada é usada para adicionar continuamente o indutor e/ou fonte de carbono à 15 cultura, conforme seria compreendido por aqueles versados na técnica com base nas orientações aqui apresentadas. De acordo com várias modalidades da presente invenção, uma taxa constante adequada é determinada por DO-stat, conforme descrito nos exemplos abaixo. Por exemplo, uma taxa de 20 alimentação equivalente ao controlador DO-stat pode ser selecionada por adição de glicose suficiente para levar a concentração a 15 e 24 g/L a cada hora, sem limitação. Por exemplo, o indutor e/ou fonte de carbono pode ser adicionado à cultura a uma taxa constante até que uma 25 certa quantidade de indutor e/ou fonte de carbono, como de cerca de 4 g/L a cerca de 40 g/L, como 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 9.5 g/L, 9.75 g/L, 10 g/L, 10.25 g/L, 10.5 g/L, 11 g/L, 12 g/L, 13 g/L, 14 g/L, 15 g/L, 16 g/L, 17 g/L, 18 g/L, 19 g/L, 20 g/L, 21 g/L, 22 g/L, 23 g/L, 24 g/L, 25 g/L, 26 g/L, 27 g/L, 28 g/L, 29 g/L, 30 g/L, 31 g/L, 32 g/L, 33 g/L, 34 g/L, 35 g/L, 36 g/L, 37 g/L, 38 g/L, 39 g/L, 40 g/L, com base no volume total da cultura, tenha sido adicionada à cultura, sem limitação. De acordo com várias modalidades, a quantidade total de indutor e/ou fonte de carbono alimentada à cultura é de cerca de 5 g/L a cerca de 20 g/L, 7 g/L a cerca de 15 g/L, 8 g/L a cerca de 14 g/L, 9 g/L a cerca de 11 g/L, ou cerca de 10 g/L. A quantidade total de indutor a ser adicionada à cultura pode ser compensada pela quantidade total de fonte de carbono adicionada à cultura. Por exemplo, quando a fonte de carbono é glicose, e o indutor é arabinose, a quantidade de indutor adicionada pode ser reduzida pela adição de 15 glicose. Por exemplo, em uma modalidade, um total de 10 g/L de um indutor (isto é, como arabinose) é adicionado a uma cultura, e 11 g/L de uma fonte de carbono, como glicose, são adicionados. O rendimento de proteina obtido dessa maneira se aproxima do rendimento quando se usa uma quantidade total 20 de 20 g/L de arabinose (isto é, 20.000 g ou 20 kg no total em uma cultura de 1.000 L de arabinose) e nenhuma glicose. Assim, essa compensação proporcionada pelos presentes métodos é vantajosa, dado o alto custo da arabinose com relação à glicose. De acordo com várias modalidades da invenção, a taxa constante em que o indutor e/ou fonte de carbono é adicionado à cultura pode ser estabelecida na faixa de cerca de 1,5 g/L a cerca de 24 g/L a cada hora. Por exemplo, quando a fonte de carbono é glicose, a taxa constante para a adição de glicose pode incluir, sem limitação, 1,8 g de glicose/L/h, 3,3 g de glicose/L/h, 6,7 g de glicose/L/h,15 g de glicose/L/h, 16,4 g de glicose/L/h, 18 g de glicose/L/h, 5 24 g de glicose/L/h, e outras. De acordo com várias modalidades, um indutor como arabinose é adicionado a taxas constantes de cerca de 1,5 g/L/h a cerca de 16 g/L/h. De acordo com várias modalidades, uma vez que um parâmetro de limiar tenha sido atingido, a alimentação de 10 fonte de carbono pode ser continuada, parada ou temporariamente interrompida. A alimentação da fonte de carbono pode ser interrompida, caso em que a alimentação será reiniciada à taxa constante uma vez que o limiar para inicio da alimentação tenha sido atingido. Assim, de acordo 15 com uma modalidade, podem-se usar um limiar de inicio e um limiar de parada para regular a alimentação da fonte de carbono à cultura. De acordo com outra modalidade, tanto glicose, quanto arabinose são alimentadas a uma taxa constante com base no parâmetro de limiar, sem parar ou 20 reiniciar a alimentação. A quantidade total apropriada de fonte de carbono a ser adicionada a qualquer cultura especifica pode ser prontamente determinada por aqueles versados na técnica com base nas orientações aqui apresentadas. A quantidade total 25 de fonte de carbono adicionada à cultura pode variar de cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L (com base no volume total em litros da cultura) de acordo com uma modalidade da presente invenção. Por exemplo, de acordo com uma modalidade, 50 g/L de glicose são adicionados durante a fase de crescimento partindo-se de 10 g/L no meio, começando a alimentação de glicose a taxa constante quando o nivel de glicose atinge zero e continuando a alimentação de glicose a taxa constante até que a OD atinja 80, quando, então, cerca de 40 g/L de glicose terão sido alimentados, além dos 10 g/L de glicose iniciais. De acordo com uma modalidade, as quantidades totais de fonte de carbono são fornecidas em forma concentrada para facilitar o escalonamento. Essas 10 quantidades são prontamente convertidas na massa total da fonte de carbono a ser usada em uma circunstância particular. Por exemplo, quando 10 g/L de fonte de carbono devem ser adicionados a uma cultura de 1.000 L, a quantidade total de fonte de carbono a ser adicionada é prontamente determinada como 10 g/L X 1.000 L = 10.000 gramas (ou 10 kg) de fonte de carbono total. A quantidade total de fonte de carbono adicionada pode servir de parâmetro de limiar de acordo com várias modalidades conforme aqui descritas. A quantidade total apropriada de indutor a ser adicionada a qualquer cultura especifica pode ser prontamente determinada por aqueles versados na técnica com base nas orientações aqui apresentadas. A quantidade total de indutor adicionada à cultura pode variar de cerca de 4 g/L a cerca de 40 g/L (com base no volume total em litros da cultura) de acordo com várias modalidades. De acordo com várias modalidades, a quantidade total de fonte de carbono adicionada à cultura é de cerca de 5 g/L a cerca de 20 g/L, 7 g/L a cerca de 15 g/L, 8 g/L a cerca de 14 g/L, 9 g/L a cerca de 11 g/L, ou cerca de 10 g/L com base no volume total da cultura. De acordo com uma modalidade, as quantidades totais de indutor são fornecidas em forma concentrada para facilitar o escalonamento. Essas quantidades são prontamente 5 convertidas na massa total do indutor a ser usado em uma circunstância particular. Por exemplo, quando 10 g/L de indutor devem ser adicionados a uma cultura de 1.000 L, a quantidade total de indutor a ser adiciona é prontamente determinada como 10 g/L X 1.000 L = 10.000 gramas (ou 10 kg) 10 de indutor total.

O meio de cultura fresco tipicamente contém uma quantidade inicial de uma primeira fonte de carbono no momento da inoculação com uma célula hospedeira, criando, assim, uma cultura. Essa concentração inicial pode ser 15 monitorizada, e a concentração da primeira fonte de carbono usada como um parâmetro de limiar.

Qualquer suplemento ou nutriente adequado, além da fonte de carbono, também pode ser alimentado à cultura em quantidades apropriadas. O outro nutriente ou suplemento 20 pode ser monitorizado, e limiares apropriadamente estabelecidos. Suplementos como nitrogênio ou fontes de fosfato inorgânico são considerados para uso na presente invenção. Exemplos não limitativos de compostos que são considerados para uso nos métodos da presente invenção incluem KH2PO4, K2HPO4, citrato de sódio, diidrato, (NH4)2SC>4, MgSO4, (Na)2.SO4, CaCl2, FeSCg, cloranf enicol ou qualquer combinação desses. O uso de uma fonte ou fontes de carbono adicionais também é considerado.

Densidade Óptica e Fase de Crescimento Logarítmico:

A introdução de uma célula hospedeira bacteriana a meios de cultura frescos cria uma cultura que tipicamente atravessa quatro fases de crescimento mais ou menos distintas: (i) fase de retardo, (ii) fase log (logarítmica ou exponencial), (iii) fase estacionária, e (iv) fase de declínio (morte) . A própria fase log pode ser adicionalmente dividida em várias fases, como fase de crescimento logarítmico inicial, fase de crescimento logarítmico média e 10 fase de crescimento logarítmico tardia. A densidade óptica está relacionada à fase de crescimento logarítmico. A fase de crescimento logarítmico e a densidade óptica também podem ser usadas como parâmetros de limiar para sinalizar o início e/ou parada da alimentação constante da fonte de carbono 15 e/ou indutor.

Por exemplo, a indução ou adição contínua do indutor pode começar na fase de crescimento logarítmico inicial, fase de crescimento logarítmico média e fase de crescimento logarítmico tardia. A fase de crescimento 20 logarítmico tardia pode ocorrer a uma OD de cerca de 70 a cerca de 110. Em uma modalidade da invenção, a alimentação a taxa constante do indutor começará na fase de crescimento logarítmico tardia do meio de cultura ou a uma OD de cerca de 70 a cerca de 110, de cerca de 70 a cerca de 105, de 25 cerca de 75 a cerca de 85, ou cerca de 80 de acordo com várias modalidades.

A OD pode ser medida a vários comprimentos de onda que sejam comumente empregados por aqueles versados na técnica. Tipicamente, usa-se a OD6oo como uma medida do crescimento celular e densidade de células na cultura. A menos que indicado de outra forma, "OD", conforme aqui usado, refere-se a OD60o- Oxigênio Dissolvido:

Outro parâmetro que pode servir de gatilho para o inicio e/ou parada do controlador de alimentação é o oxigênio dissolvido (DO) (isto é, fermentação por batelada alimentada DO-stat). 0 DO pode ser controlado ajustando-se a 10 agitação, fluxo de ar, suplemento de oxigênio e pressão no recipiente para controlar os meios de cultura. O limiar de DO pode ser estabelecido na faixa de 5% a 80% de DO, como 20%, 40%, ou 80%. Uma vez que o limiar tenha sido encontrado, o controlador de alimentação para a fonte de 15 carbono ou indutor pode ser ligado até ser atingido um limiar que sinalize a parada da alimentação de controle. O limiar de parada pode ser outro limiar de DO ou outro parâmetro, como a quantidade da fonte de carbono ou indutor. Por exemplo, sempre que o DO se elevar acima de 30% ou 40% 20 em um meio de cultura, o controlador de alimentação pode ser iniciado até o momento em que o DO caia para 20%, ou, alternativamente, até que 0,5 g/L ou 1 g/L da fonte de carbono ou indutor tenha sido recém adicionado de acordo com várias modalidades da presente invenção. pH:

Outro parâmetro que pode servir de gatilho para o inicio e/ou parada do controlador de alimentação é o pH (isto é, fermentação por batelada alimentada pH-stat). O pH pode ser controlado pela adição de base ou ácido aos meios de cultura. 0 limiar de pH pode ser estabelecido na faixa de 6,8 a 7,2, como 7,0. Uma vez que o limiar tenha sido encontrado, o controlador de alimentação para a fonte de 5 carbono ou indutor pode ser ligado até que se atinja um limiar que sinalize a parada da alimentação de controle. O limiar de parada pode ser outro limiar de pH ou outro parâmetro, como a quantidade da fonte de carbono ou indutor. Por exemplo, sempre que o pH se elevar a 6, 97 em um meio de 10 cultura, o controlador de alimentação pode ser iniciado até o momento em que o pH caia para 6, 95, ou, alternativamente, até que 1 g/L da fonte de carbono ou indutor tenha sido recém adicionada de acordo com várias modalidades da presente invenção. Tempo de Colheita:

O tempo de colheita representa a quantidade de tempo que se passa depois da indução inicial ou adição de um indutor. Qualquer tempo de colheita adequado é considerado pela presente invenção. O tempo de colheita pode variar de 20 cerca de 2 horas a cerca de 10 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 8 horas, de cerca de 2,5 horas a cerca de 7 horas, de cerca de 3 horas a cerca de 6 horas, e outras, de acordo com várias modalidades da presente invenção. Usando-se a taxa de alimentação constante, o tempo de colheita e a 25 quantidade total de indutor, aqueles versados na técnica perceberão como cada parâmetro pode ser ajustado para se conseguirem os resultados desejados. Aqueles versados na técnica entenderão quando colher com base na quantidade de arabinose alimentada, porque poderiam prontamente determinar a quantidade alimentada com base na taxa de alimentação e no periodo de tempo. Dessa maneira, concentrações finais do indutor de 5, 10, 20, 30, e 40 g/L alimentadas em 3 horas 5 podem ser conseguidas, por exemplo, sem limitação.

Concentração do Indutor: Um indutor em qualquer concentração adequada é considerado pela presente invenção. As concentrações de indutor utilizáveis para induzir células hospedeiras podem 10 variar de cerca de 0,00001% a cerca de 20% (v/v) , sem limitações.

Temperatura:

A cultura das presentes modalidades pode ser incubada a qualquer temperatura que permita o crescimento 15 das células. Várias temperaturas para incubar a cultura associadas a um crescimento abundante incluem, sem limitação, 22°C, 28°C, 37°C, ou qualquer de suas combinações.

Dispositivo de fermentação:

Qualquer dispositivo de fermentação adequado (isto é, "fermentador") é considerado para uso na presente invenção, conforme sabido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o fermentador pode conter qualquer número de propulsores (como propulsores Rushton), entradas e/ou sondas 25 de medição. De acordo com uma modalidade, o fermentador é configurado para incluir três propulsores Rushton e um borrifador de anel ou tubo para introdução de ar no fermentador. A presente invenção considera o uso de sistemas manual e/ou à base de computador. Assim, o sistema de fermentação pode fazer uma interface com um sistema computadorizado para monitorizar e controlar as fermentações. Dessa maneira, o sistema pode ser completa ou 5 parcialmente automatizado, de acordo com modalidades da presente invenção. Composições da Presente Invenção: Composições compreendendo proteínas recombinantes, como aquelas preparadas de acordo com os métodos da presente 10 invenção são aqui apresentadas, de acordo com modalidades da presente invenção. As composições da presente invenção compreendem proteina recombinante em alta densidade em uma cultura, como as proteínas recombinantes preparadas de acordo com os métodos da presente invenção, sem que se 15 pretenda ficar limitado a esses.

A composição compreende uma cultura com proteína recombinante a uma densidade de pelo menos cerca de 1,5 g/L com base no volume total da cultura. A densidade da proteína recombinante é de pelo menos cerca de 1,7 g/L com 20 base no volume total da cultura de acordo com uma modalidade adicional da presente invenção. A densidade da proteína recombinante é de pelo menos cerca de 2,0 g/L com base no volume total da cultura de acordo com outra modalidade da presente invenção. A densidade da proteína recombinante é de 25 pelo menos cerca de 3,0 g/L com base no volume total da cultura de acordo com outra modalidade da presente invenção.

Apresenta-se uma composição compreendendo proteína 2086 recombinante em uma modalidade da presente invenção. A proteina 2086, conforme aqui mencionada, é uma proteina expressada por um polinucleotideo que corresponde ao gene 2086 em N. meningitidis sorogrupo B, incluindo qualquer fragmento, derivado ou mutação dela. Proteinas 2086 5 exemplificativas não limitativas são descritas nos WO 03/063766 e WO 04/094596.

A composição de proteina 2086 recombinante compreende proteina 2086 recombinante em uma cultura em que a proteina 2086 recombinante esteja a uma densidade de pelo 10 menos cerca de 1,5 g/L com base no volume total da cultura.

A densidade da proteina 2086 recombinante é de pelo menos cerca de 1,7 g/L com base no volume total da cultura de acordo com uma modalidade adicional da presente invenção. A densidade da proteina 2086 recombinante é de pelo menos cerca de 2,0 g/L com base no volume total da cultura de acordo com outra modalidade da presente invenção. A densidade da proteina 2086 recombinante é de pelo menos cerca de 3,0 g/L com base no volume total da cultura de acordo com outra modalidade da presente invenção.

As composições da presente invenção podem compreender qualquer proteina, como uma proteina preparada de acordo com um método da presente invenção. As proteinas recombinantes podem ser proteinas lipidadas ou não lipidadas. Em uma modalidade da invenção, a proteina 25 recombinante é proteina 2086 recombinante lipidada ou não lipidada. A proteina 2086 recombinante pode ser uma proteina 2086 da subfamilia A ou subfamilia B, ou uma combinação delas. As composições da presente invenção podem incluir uma proteina ou mais de uma proteina. As proteinas podem ser proteinas relacionadas ou não relacionadas. Por exemplo, uma composição da presente invenção pode incluir proteina 2086 correspondendo a uma ou mais cepas da subfamilia A e/ou uma ou mais cepas da subfamilia B.

Composições compreendendo material para uso na condução dos métodos da presente invenção também são aqui apresentadas. Essas composições incluem os componentes necessários para a cultura, incluindo células recombinantes e nutrientes, de acordo com modalidades da presente invenção. As várias composições podem ser fornecidas juntas em um kit, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Por exemplo, os componentes para formar a cultura podem ser convenientemente pré-embalados nas quantidades requeridas para facilitar o uso em ambientes laboratoriais ou industriais, sem limitação. Esse kit também pode incluir etiquetas, indicadores e orientações para facilitar o uso de cada componente e a maneira de combinar os componentes de acordo com várias modalidades da presente invenção. Os exemplos a seguir são incluidos para demonstrar várias modalidades da invenção. Aqueles versados na técnica devem perceber que as técnicas apresentadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores que funcionam bem na prática da invenção, e, portanto, podem ser consideradas como constituindo vários modos para sua prática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, em vista da presente exposição, perceber que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades especificas que são apresentadas e ainda obter um resultado igual ou similar, sem sair do espirito e âmbito da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Fermentação por batelada alimentada com taxa de alimentação constante Usou-se E. coli (pPW62) subfamilia B como uma cepa modelo para um processo de fermentação por batelada alimentada. Com base nos resultados, o processo será aplicado à subfamilia A de E. coli (pPW102). Prepararam-se um meio e uma solução de alimentação para a fermentação por batelada alimentada usando-se os componentes relacionados nas tabelas a seguir. Meio e solução de alimentação:

Métodos:

A fermentação por batelada alimentada com taxa de alimentação constante foi usada para se conseguir uma alta densidade celular na fermentação com E. coli. A concentração inicial de glicose era de 10g/L no meio. A concentração de (NH4)2SO4 foi aumentada para 3 g/L no meio de fermentação, mas mantida em 1 g/L no meio de cultura de semeadura. Para se determinar a taxa de alimentação, realizou-se primeiro uma batelada alimentada DO-stat. 0 nível de DO foi controlado em 20% por um controlador em cascata, que aumentava a velocidade de agitação ao máximo e, então, usava suplementação com oxigênio. Quando a glicose foi depletada, o DO subiu acentuadamente (acima de 40%) e o concentrado de glicose foi adicionado a uma concentração final de 1 g/L no fermentador. Após cada adição de glicose, a bomba permanecia desligada durante um tempo estabelecido, antes de se permitir a adição seguinte. A OD de cerca de 160 foi atingida quando se realizou uma fermentação por batelada alimentada DO-stat. A taxa constante foi, então, escolhida como sendo equivalente ao controlador DO-stat adicionando glicose suficiente para levar a concentração a 18 g/L ou 24 g/L a cada hora. Durante a fermentação por batelada alimentada com taxa de alimentação constante, a alimentação de glicose era ligada à taxa constante desejada quando havia uma elevação acentuada a 40% no DO.

As culturas de semeadura foram iniciadas usando-se um frasco de E. coli (pPW62) por litro de meio basal + 15 μg/mL de cloranfenicol em um balão Fernbach de 2.800 mL. Os balões foram incubados a 32°C, 150 rpm durante uma noite (~16 h) . A ODβoo final era normalmente de ~ 3. Usou-se um tamanho de inoculo de 10% para inocular cada fermentador. Cada fermentador usou 3 propulsores Rushton e um borrifador 5 de anel. Ajustes iniciais: temp: 36°C, pH: 7,00 ± 0,05 (controlado com NH4OH a 7,4 N) , fluxo de ar: ~1 vvm, DO: 20%. O DO foi controlado por uma cascata de agitação (min: 150 rpm, max: 1.000 rpm) e adição de O2 mediante uma unidade de mistura de gás. Controlou-se a espuma, caso necessário, 10 por adição manual de PPG-2000. 0,35 mL/L de AF foram adicionados ao meio antes da esterilização. Durante a fermentação, colheram-se amostras a cada hora para monitorizar a glicose, pH, e OD6oo off-line. Os sobrenadantes foram preparados a partir de amostras de 1 mL e armazenados 15 para análise posterior de ácidos orgânicos por HPLC.

Resultados:

Fermentação por batelada alimentada com taxa de alimentação constante:

A Figura 1 mostra os cursos temporais de OD, 20 consumo de glicose e acúmulo de ácido acético com taxas de alimentação constantes. ODs máximas de 158 e 150 foram obtidas com taxas de alimentação constantes de 24 g de glicose/L/h e 18 g de glicose/L/h, respectivamente. Uma elevada glicose de 28 g/L foi acumulada durante a operação, 25 quando se usou uma taxa de alimentação de 24 g/L/h. A glicose se acumula a 12 g/L quando se usa uma taxa de alimentação de 18 g/L/h. Pouco ácido acético (isto é, menos de 1,5 g/L) foi produzido em ambos os casos. A fase de crescimento exponencial termino perto de OD 100. A taxa de crescimento especifica foi de aproximadamente 0,60 (hr x) em ambos os casos. Para reduzir o acúmulo de glicose, foram examinadas baixas taxas de alimentação constantes de 16,4 g/L/h e 15 g/L/h. A Figura 2 mostra os cursos temporais de OD, consumo de glicose e acúmulo de ácido acético com as taxas de alimentação constantes acima mencionadas. As ODs máximas foram de 142 e 147, respectivamente. Como em 10 operações anteriores, a cultura com a taxa de alimentação mais rápida acumulou mais glicose, embora a quantidade de glicose se acumulasse muito menos que nos experimentos anteriores. Cerca de 8 g/L de glicose foram acumulados durante a fermentação a 16,4 g/L/h, e 5,4 g/L de glicose durante a fermentação a 15 g/L/h. Pouco ácido acético (como menos de 1,5 g/L) foi produzido em ambos os casos (veja a Figura 2) . A taxa de crescimento especifica foi de aproximadamente 0,60 (hr'1) em ambos os casos. Assim, a taxa de crescimento especifica não foi afetada pela taxa de alimentação entre 15 g/L/h e 24 g/L/h. Indução a várias ODs de crescimento:

Usou-se uma taxa de alimentação constante de 15 g de glicose/L/h para o estudo de indução com arabinose, porque resultava em alta densidade celular e baixo acúmulo 25 de glicose e ácido acético. Neste experimento, foram comparadas induções na fase de crescimento logarítmico média OD ~55 e na fase de crescimento logarítmico tardia OD ~80. A cultura foi induzida simplesmente substituindo-se a alimentação de glicose pela alimentação de arabinose e alimentando-se a arabinose a uma taxa constante de 13,4 g/L/h. Um total de 40 g/L de arabinose foi adicionado a cada cultura no decorrer de 3 horas. Após a indução, colheram-se 5 amostras a cada hora para o ensaio de rLP2086 por SDS-PAGE, ensaios de ácido orgânico e arabinose por HPLC.

A Figura 3 mostra os cursos temporais de OD e produção de rLP2086 quando induzidos a ODs ~55 e ~80. Tanto a OD máxima, quanto o rendimento de rLP2086 foram maiores 10 quando as células foram induzidas a OD ~80 (OD máxima: 101 versus 84; rendimento máximo: 1,8 g/L versus 1,2 g/L) . Indução com vários níveis de arabinose: A finalidade dos experimentos a seguir foi a de avaliar a quantidade total de arabinose alimentada à cultura 15 e examinar se a redução da quantidade total de arabinose alimentada à cultura ainda resultaria em elevada expressão de rLP2086. O concentrado de arabinose foi alimentado a 4 culturas diferentes, cada uma a diferentes taxas de alimentação no decorrer de 3 horas, resultando em 20 concentrações finais de arabinose de 10, 20, 30, e 40 g/L. Todas as culturas foram induzidas a OD6oo ~ 80. A Figura 4 mostras os cursos temporais de OD e produção de rLP2086. A Tabela 5 resume a OD e rendimentos de rLP2086 para cada uma das quatro condições. Mostra os rendimentos máximos de rLP2086 de: 1,2 g/L para os 10 g/L de arabinose total adicionada; 1,6 g/L para os 20 g/L de arabinose total adicionada; 1,7 g/L para os 30 g/L de arabinose total adicionada; 2,0 g/L para os 40 g/L de arabinose total adicionada. Uma alimentação de arabinose entre 20 g/L e 40 g/L resultou em rendimento de rLP2086 similar, entretanto, 10 g/L de arabinose produziram muito menos rLP2086 (isto é, 1,2 g/L). Esses resultados sugerem que a quantidade total de arabinose adicionada para indução pode ser reduzida de 40 g/L para 20 g/L sem reduzir a produtividade de rLP2086. Assim, a redução no uso de arabinose seria mais eficaz em termos de custo, particularmente considerando-se o alto custo da arabinose (aproximadamente 500 dólares/kg).

Comparação dos métodos de adição de arabinose: O experimento a seguir foi conduzido para examinar se uma estratégia de alimentação continua é superior a uma simples adição por bateladas, quando aplicada à arabinose para indução. Na operação X-BRN05-039, 20g/L de arabinose 15 foram adicionados ao fermentador de uma única vez, em vez de se alimentar no decorrer do tempo, quando a OD era de cerca de 80. A Figura 5 mostra os cursos temporais de OD, consumo de glicose e arabinose, e produção de rLP2086. Um máximo de 1,3 g/L de rLP2086 foi obtido. A adição por bateladas da arabinose, embora operacionalmente mais simples, produziu menos rLP2086 do que a alimentação continua. Assim, uma estratégia de alimentação continua de arabinose é superior à 5 adição por bateladas simples. Para examinar se a arabinose pode ser mais eficientemente usada por redução da taxa de alimentação de arabinose, taxas de alimentação de 3,3 g de arabinose/L/h e 6,7 g de arabinose/L/h foram comparadas. A Figura 6 mostra 10 os cursos temporais de OD e produção de rLP2086. O concentrado de arabinose foi alimentado a uma cultura a uma taxa de alimentação de 6,7 g/L/h no decorrer de 3 horas, e uma segunda cultura foi alimentada a uma taxa de 3,3 g/L/h no decorrer de 6 horas. Para ambas as culturas, a quantidade 15 total de arabinose adicionada foi de 20 g/L. Conforme mostrado na Figura 6, ambas as condições produziram a mesma quantidade de rLP2086 máximo (isto é, 2,2 g/L), mas houve diferenças na cinética de produção. A taxa de alimentação mais alta resultou em uma taxa de produção mais elevada. O 20 rLP2086 máximo foi atingido 3 horas e 6 horas após a indução com taxas de alimentação de 6,7 g/L/h e 3,3 g/L/h, respectivamente. A vantagem de se usar uma taxa de alimentação mais elevada (isto é, 6,7 g/L/h) é que o custo de produção (por exemplo, custo de utilidade) será menor 25 quando se usa uma taxa de alimentação mais elevada do que quando se usa uma taxa de alimentação mais baixa. Efeito do tempo de indução sobre o rendimento de expressão de rLP2086:

Para se determinar o tempo de colheita ótimo, o perfil de alimentação normal (20 g/L de arabinose alimentada durante 3 horas) foi estendido para 40 g/L alimentados durante 6 horas. Nas operações X-BRN05-028 e X-BRN05-029, as 5 células foram induzidas a OD ~55 e OD ~80, respectivamente.

A Figura 7 mostra os cursos temporais de OD e produção de rLP2086. Embora a alimentação de arabinose se estendesse de 3 horas para 6 horas, interessantemente, o titulo de pico ainda foi obtido em torno de 3 horas após a indução. O 10 título de produto era ligeiramente mais elevado na cultura que foi induzida a OD mais elevada. O rendimento máximo de rLP2086 na indução a OD ~55 foi de 2,0 g/L (X-BRN05-028), ao passo que foi de 2,4 g/L na indução a OD ~80 (X-BRN05-029). Esse resultado sugere que as células devem ser colhidas 3 15 horas após a indução.

Comparação de soluções de alimentação com e sem sais:

Para se examinar se sais adicionados são essenciais nas soluções de alimentação de glicose e arabinose, alimentações de glicose e arabinose puras foram 20 comparadas com as alimentações padrões de glicose + sais (isto é, K2HPO4/KH2PO4 + (NH4)2SO4) e arabinose + sais. Para ambas as culturas, 20 g/L de arabinose foram alimentados no decorrer de 3 horas. Os perfis de crescimento e de produção de rLP2086 foram muito similares. 0 rendimento máximo de 25 rLP2086 foi de 1,8 g/L quando os sais foram adicionados às alimentações, e de 2,0 g/L quando as alimentações de glicose e arabinose foram preparadas sem sais. Esses resultados sugerem que não há necessidade de adicionar sais às soluções de alimentação de glicose e arabinose. Fermentação por batelada alimentada com taxa de alimentação constante para a cepa de subfamilia B: Culturas de semeadura foram iniciadas por inoculação de 1 L de meio basal contendo 15 μg/mL de cloranfenicol com 1 mL de semeadura de trabalho descongelada. A cultura foi cultivada em um balão Fernbach de 2,8 L e foi incubada durante cerca de 16 horas a 32°C e 150rpm. A ODgoo final era de ~3, 0. 350 mL de culturas de semeadura foram assepticamente transferidas para 3, 15 L de meio basal contendo 3 g/L de (NH4)2SC>4 sem cloranfenicol. A fermentação foi controlada a pH 7,0 ± 0,05 por NH4OH a 7,4 N, temperatura a 36°C, DO a 20%, e fluxo de ar a Ivvm. O DO foi controlado por uma cascata de agitação (min: 150 rpm, max: 1.000 rpm) e adição de oxigênio. Antiespumante PPG-2000 foi automaticamente adicionado para controlar a espuma. Durante a fermentação, colheram-se amostras a cada hora para monitorizar a glicose e OD off-line. Após a inoculação, o DO caiu de -100% para 20% e, então, foi mantido em 20%. Quando houve uma elevação abrupta no DO de 20% para mais de 40% (normalmente 6 horas de Tempo de Fermentação Decorrido (EFT) ) , a bomba de alimentação de glicose (sem sais) foi ligada a uma taxa de 15 g/L/h. Conforme mostrado na Figura 8, a glicose estava completamente depletada a um EFT de 6 horas, resultando em uma elevação abrupta no DO. As amostras foram colhidas a cada meia hora quando a OD atingiu -40. A alimentação de glicose foi desligada a OD 90, e a alimentação de arabinose foi ligada a uma taxa de 13,4 g/L/h. Após 3 horas de alimentação de arabinose (sem sais) (isto é, um total de 20g/L de adição de arabinose), a alimentação de arabinose foi desligada, e se deixou a 5 fermentação continuar durante mais uma hora. Conforme mostrado na Figura 8, uma OD de 102 foi obtida, e 2,0 g/L fr MnB rLP2086 foram expressos com base em SDS-PAGE (veja a Figura 9). O pico ocorreu 3 horas após a indução (isto é, um EFT de ~12 horas) . SDS-PAGE e Western Blot mostraram que a 10 proteína expressada era, de fato, rLP2086 subfamilia B.

Aplicação do processo de fermentação por batelada alimentada para a cepa MnB rLP2086 subfamilia A:

Para se testar se o processo de fermentação por batelada alimentada usado para rLP2086 subfamilia B era 15 aplicável a rLP2086 subfamilia A, o processo foi conduzido usando-se o procedimento estabelecido para a cepa da subfamilia B. A Figura 10 mostra os cursos temporais de OD, consumo de glicose e arabinose, e produção de rLP2086. Os perfis de crescimento e produção de rLP2086 para a 20 subfamilia A foram similares aos obtidos para a subfamilia B (compare com a Figura 8). SDS-PAGE e Western Blot mostraram que a proteína expressada era, de fato, rLP2086 subfamilia A (veja a Figura 11). A Tabela 6 relaciona as OD máximas e os rendimentos de expressão de rLP2086 para seis operações 25 diferentes com a subfamilia A. A faixa de rendimento de expressão máximo de rLP2086 foi de 1,5 - 2,1 g/L (rendimento máximo médio: 1,8 ± 0,2 g/L), similar aos resultados das fermentações por bateladas alimentadas usadas para produzir rLP2086 subfamília B. Assim, a fermentação por batelada alimentada desenvolvida para a cepa de subfamília B também é adequada para a cepa de subfamília A. Tabela 6: Rendimento de expressão e OD máximos de rLP2086 subfamília A

Alimentação dupla de glicose e arabinose durante a indução com arabinose: Para reduzir a quantidade de arabinose necessária sem reduzir a produção de rLP2086, investigou-se a alimentação dupla de glicose e arabinose durante o período de indução. A estratégia foi alimentar 10 g/L de arabinose durante 3 h (metade da quantidade usual), enquanto se continuava a alimentar glicose durante a fase de indução a 25% (3,75 g/L/h), 50% (7,5 g/L/h), e 100% (15 g/L/h) da taxa de alimentação padrão de glicose. Todas as alimentações, glicose e arabinose, foram preparadas sem aditivos.

As Figuras 12a, 12b, e 12c mostram o curso temporal do crescimento de células da subfamília B, das concentrações de glicose, arabinose, ácido acético, e da produção de rLP2086. Todas as três operações foram induzidas a OD ~80. Conforme mostrado na Figura 12a, a OD da operação com alimentação de glicose a 100% continuou a subir após a 5 indução, atingindo um pico em 117, ao passo que a operação a 50% atingiu um pico em 106 (Figura 12b), e a operação a 25% manteve-se em torno de 100 (Figura 12c) após a indução. A alimentação de glicose a 100% começou a acumular glicose e arabinose 3 horas após a indução. A operação a 50% de 10 glicose só mostrou uma leve quantidade de glicose na última amostra (leitura = 0,21 g/L). Não houve acúmulo de glicose na operação com 25% de glicose. Nenhuma das três operações acumulou qualquer arabinose. As operações com alimentação a 100% (Figura 12a) e 50% (Figura 12b) de glicose produziram 15 ~1,5 e 1,7 g/L de rLP2086, respectivamente, ao passo que a operação a 25% (Figura 12c) produziu mais de 2,1 g/L. A produção das operações a 100% atingiu um pico antes de acabar a arabinose, sugerindo que a expressão de rLP2086 pode ter sido suprimida pelo acúmulo de glicose e ácido 20 acético. A produção das operações a 50% atingiu um pico aproximadamente ao mesmo tempo em que acabou a arabinose, e a produção das operações a 25% atingiu um pico depois que acabou a arabinose, sugerindo que a expressão de 2086 não podia ser suprimida enquanto a concentração de glicose era 25 controlada em um nível mínimo (nenhuma glicose se acumulou nas Figuras 12b e 12c) . Embora apenas 10 g/L de arabinose fossem alimentados a essas culturas, sua produção de rLP2086 era similar à obtida quando se alimentavam 20 g/L.

Alimentações simultâneas de glicose e arabinose podem reduzir o consumo de arabinose em 50% e ainda conseguir o mesmo rendimento de rLP2086, quando a concentração de glicose é controlada em um baixo nivel durante a indução. Assim, o custo de substâncias químicas pode ser significativamente reduzido.

Para se examinar se pode reduzir ainda mais o consumo de arabinose e aumentar o rendimento de rLP2086, foram investigadas várias taxas de alimentação de glicose, 10 quantidades totais de arabinose alimentada e ODs de indução.

A Tabela 7 relaciona diferentes combinações dessas condições. Parece que uma taxa de alimentação de glicose entre 2,25 e 7,5 g/L/h e uma taxa de alimentação de arabinose entre 1,7 e 6,7 g/L/h não afetariam

significativamente o rendimento de rLP2086. ODs de indução entre 80 e 105 resultam em rendimento similar de rLP2086.

Tabela 7: OD e rLP2086 máximos sob diferentes taxas de alimentação de glicose, diferentes quantidades de adição de arabinose, e

Exemplo 3: Fermentação por batelada alimentada escalonada para a escala de 100L A cultura de semeadura foi iniciada pela inoculação de 2 X 1 L de meio basal contendo 15 μg/mL de cloranf enicol com 1 mL (isto é, 1 frasco) de semeadura de trabalho descongelada. A cultura em Fernbach de 2,8 L foi incubada durante cerca de 16 horas a 32°C e 150rpm em um agitador rotativo.

Duas culturas de semeadura de uma noite em Fernbach de 1 L foram assepticamente transferidas para um fermentador de 150 L contendo 70 L de meio basal sem cloranfenicol. A fermentação de 150L em meio foi controlada a pH 7,0 ± 0,05 por NH4OH a 7,4 N, temperatura 36°C, DO 20%, e fluxo de ar a lvvm. 0 DO foi controlado por uma cascata de agitação e adição de oxigênio. Antiespumante PPG-2000 foi automaticamente adicionado para controlar a espuma. Durante a fermentação, o DO caiu de -100% para 20% e foi mantido em 20%. Quando houve uma elevação abrupta no DO de 20% para mais de 40% (normalmente a OD ~20) , sinalizando a depleção de glicose, a bomba de alimentação foi ativada para distribuir concentrado de glicose (isto é, 500 g/L) a uma taxa de 15 g de glicose/L de caldo/h. Durante a fermentação, colheram-se amostras a cada hora para monitorizar a glicose e OD off-line. As amostras foram colhidas a cada meia hora quando a OD atingiu -40. Uma vez que a OD atingisse - 80, a alimentação de glicose era interrompida, e a alimentação de arabinose era iniciada (por exemplo, 500g/L de concentrado de arabinose) a uma taxa de 6,7 g de arabinose/L de caldo/h durante 3 horas.

A Figura 13a mostra os cursos temporais do crescimento celular da subfamilia B, do consumo de glicose, do acúmulo de ácido acético, e da produção de rLP2086 na escala de 100 L. O perfil de fermentação na escala de 100 L foi similar ao observado em pequena escala. Foram obtidos uma OD máxima de 99 e um rendimento máximo de 1,9 g/L de rLP208β. Esses resultados demonstram que a fermentação por batelada alimentada é escalonável.

A Figura 13b mostra os cursos temporais do crescimento celular da subfamilia A, do consumo de glicose, 5 do acúmulo ácido acético, e da produção de rLP2086 na escala de 100 L. 0 perfil de fermentação a uma escala de 100 L foi similar ao observado em pequena escala. Foram obtidos uma OD máxima de 96 e um rendimento máximo de 2,0 g/L de rLP2086. Esses resultados demonstram que a fermentação por batelada 10 alimentada é escalonável e robusta.

A Figura 14a mostra os cursos temporais da densidade celular da subfamilia B, das concentrações de glicose, arabinose, ácido acético, e do rendimento de rLP2086 com alimentação dupla de glicose e arabinose a uma 15 escala de 100 L. Durante a indução, as taxas de alimentação foram controladas em 3,75 e 1,67 g/L/h para alimentação de glicose e arabinose, respectivamente. A dupla arabinose e glicose foi alimentada em 5 horas. Foram obtidos uma OD máxima de 90 e um rendimento máximo de 1,8 g/L de rLP2086. O 20 rendimento máximo de rLP2086 apareceu 4 horas após a indução. A OD máxima média e o rendimento máximo médio de rLP2086 para a subfamilia B foram de 84,8 ± 6,8 e 1,6 ± 0,3 g/L, respectivamente. Esses resultados demonstram que a fermentação por batelada alimentada com alimentação dupla de 25 glicose e arabinose durante a fase de indução é escalonável.

A Figura 14b mostra os cursos temporais do crescimento celular da subfamilia A, do consumo de glicose, do acúmulo de ácido acético, e da produção de rLP2086 na escala de 100 L. A fermentação foi operada nas mesmas condições que no parágrafo [0129], e as células foram induzidas durante 6 horas. Foram obtidos uma OD máxima de 89 e um rendimento máximo de 1,8 g/L de rLP2086. O rendimento máximo de rLP2086 apareceu 4 horas após a indução. A OD máxima média é de 87,9 ± 10,5, e o rendimento máximo médio de rLP2086 é de 1,8 ± 0,2 g/L para a subfamília A. Esses resultados demonstram que a fermentação por batelada alimentada é escalonável e robusta.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a várias modalidades e exemplos, aqueles versados na técnica reconhecerão que se podem fazer várias modificações na invenção sem sair de seu espirito e âmbito.

Claims

1. Método para a produção de uma proteína recombinante caracterizado por compreender: cultivar uma célula bacteriana recombinante para expressar uma proteína recombinante em uma cultura; adicionar continuamente uma fonte de carbono à cultura; adicionar continuamente arabinose à cultura quando a densidade celular da cultura atingir uma OD600 de cerca de 70 a cerca de 110, sendo que a referida arabinose é adicionada à cultutra simultaneamente a adição contínua da fonte de carbono, e isolar a proteína recombinante da cultura a partir da cultura, em que a taxa de alimentação da fonte de carbono durante a indução da arabinose está entre 2,25 e 7,5 g/L/h; e em que a taxa de alimentação da arabinose está entre 1,7 e 6,7 g/L/h.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o parâmetro de limite ser densidade óptica (OD), oxigênio dissolvido (DO), concentração de nutriente em meio de cultura, concentração total de fonte de carbono adicionada ao meio de cultura ou qualquer combinação dos mesmos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o parâmetro de limite ser densidade óptica (OD) da cultura.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a arabinose à cultura quando a densidade celular da cultura atinge uma OD600 de cerca de 70 a cerca de 105.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender adicionar continuamente a arabinose à cultura quando a densidade celular da cultura atinge uma OD600 de cerca de 70 a cerca de 85.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender adicionar continuamente a arabinose à cultura quando a densidade celular da cultura atinge uma OD600 de cerca de 80.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar a arabinose à cultura a uma taxa constante, em que a arabinose é adicionada à cultura através de alimentação DO-stat ou a arabinose é adicionada à cultura através de alimentação pH-stat.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a taxa de alimentação de arabinose ser de cerca de 1,7 g/L/h.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a arabinose à cultura de 2 a 8 horas após iniciação do método.

10. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender adicionar continuamente a arabinose à cultura de 3 a 6 horas após iniciação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a arabinose à cultura cerca de 3 horas após iniciação.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a taxa de alimentação de arabinose ser de cerca de 1,7 g/L/h.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a fonte de carbono à cultura antes da indução.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a taxa de alimentação da fonte de carbono antes da indução estar entre 1,5 e 24 g/L/h.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a taxa de alimentação da fonte de carbono antes da indução ser de cerca de 18 g/L/h.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a fonte de carbono à cultura antes e durante a indução.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a fonte de carbono à cultura enquanto a arabinose é continuamente adicionado à cultura.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionar continuamente a fonte de carbono à cultura até a densidade celular da cultura atingir uma OD600 de cerca de 70 a cerca de 110.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fonte de carbono ser alimentada à cultura a uma taxa de alimentação constante durante a alimentação de arabinose à cultura, por alimentação DO-stat da glicose e da arabinose até que a densidade celular na cultura atinja um OD600 de cerca de 80 ou pela alimentação de pH-stat da glicose e da arabinose até que a densidade celular na cultura atinja um OD600 de cerca de 80.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fonte de carbono ser uma fonte de carbono à base de açúcar.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a fonte de carbono à base de açúcar ser glicose.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender adicionar continuamente a glicose ao meio de cultura enquanto a arabinose é continuamente adicionada ao meio de cultura.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender adicionar continuamente a glicose até a densidade celular da cultura atingir uma OD600 de cerca de 80.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula bacteriana compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene de Neisseria meningitidis sorogrupo B.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína recombinante ser uma proteína meningocócica.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a proteína meningocócica ser uma proteína meningocócica 2086.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a proteína ser lipidada.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a proteína ser não lipidada.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a proteína compreender uma proteína meningocócica 2086 de subfamília A.

30. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a proteína compreender uma proteína meningocócica 2086 de subfamília B.

31. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula bacteriana recombinante ser derivada de E. coli.

32. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula bacteriana recombinante compreender ainda um vetor de expressão que codifica a proteína recombinante, compreendendo o referido vetor um promotor de arabinose.