JP2014064583A - 組換えタンパク質を製造するための高細胞密度流加発酵法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タンパク質収量を向上させるために、培養培地における誘導時にインデューサを連続供給し、任意選択的に炭素源を連続的に投入、例えば、一定速度で投入することによる流加発酵法を用い、タンパク質、例えば組換え髄膜炎菌2086タンパク質を産生させる。
【選択図】なし
Description
この出願は、2006年7月27日に出願された、表題「HIGH−CELL
DENSITY FED−BATCH FERMENTATION PROCESS FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN」の米国仮特許出願第60/833,479号(この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
本願は、一般に細菌系におけるタンパク質発現を向上させる新規な流加発酵法、並びに高密度タンパク質組成物、及びこの新規流加発酵法に用いる組成物に関する。
実験室、臨床又は商業用途のためにタンパク質を十分な量産生させるための種々の発酵方法が用いられてきた。流加発酵法は、タンパク質の収量を単純な回分発酵法によって得られるものより増加させるために用いられてきた。流加発酵法は、初期の回分相の後、1種以上の栄養素をフィーディングにより培養物に供給する相が行われる方法である。
本発明は、組換えタンパク質を予想外に高い収量で産生させるための新規な流加発酵法に関する。
本発明の方法は、培養培地における誘導時にインデューサを連続供給することによる流加発酵によって予想外に高いタンパク質収量が得られるという意外な発見に基づくものである。炭素源は、任意選択的に、インデューサの連続供給の前及び/又はその間に連続的に供給する。アラビノースによる誘導の場合、本発明の実施形態として(髄膜炎菌血清群Bの2086遺伝子に相当する配列を有する微生物によって発現される)組換え2086リポタンパク質(rLP2086)が約2乃至3g/L産生された。これは、比較回分発酵法と比較してrLP2086タンパク質のサブファミリーA及びBの両方の場合の流加発酵によるこの2086の収量が約2乃至3倍であることを意味している。さらに、本発明の方法は上記及び他のタンパク質の商業規模の生産にすぐに応用できる。
reference)を包含する。同様に、「medium」などの用語の単数形は複数形「media」という表現を包含し、その逆の場合も同様である。従って、例えば、「a
culture medium」という表現は、単一種の培地ばかりでなく、複数種のそのような培地をも包含し、「culture medium」という表現は、単一種の培地ばかりでなく、複数種の培地をも包含する。
adding)」という用語は、全部を一度にではなくある期間にわたって連続的に物質を添加することを意味する。これらの用語では、単回の開始及び/又は終了、或いは発酵過程においてこの物質を連続的に添加するための複数の開始及び/又は停止点を考慮している。
本発明の方法では、培養物が閾値パラメータを達成した後に培養培地にアラビノースなどのインデューサを連続的に添加する新規な流加発酵プロセスを介して予想外に高い収量でタンパク質が得られる。一般には、この誘導期の前に、組換え細菌細胞を含む培養物にグルコースなどの炭素源を添加する。この炭素源は、インデューサと一緒に供給してもよい。このインデューサは二次炭素源としての機能を果たすこともできる。
本明細書に記載の方法は、組換えタンパク質の産生であって、組換えタンパク質の発現が誘導プロモータの転写制御下にあり、これによってその誘導プロモータの制御下の遺伝子発現を培養培地中に存在するインデューサの濃度により直接調節することができるものとする産生のことを意味する。このインデューサは、培養培地に、任意選択的に一定速度で、連続供給する。このインデューサは、閾値パラメータが達成されればすぐに培養培地に添加する。例えば、組換えタンパク質はaraBプロモータ(例えば、ParaB)の制御下におくことができ、このプロモータは、培養培地に一定速度で添加するアラビノースの濃度によって直接調節することができる。本発明と関連して用いるための好適なインデューサは、当業者には公知である。本発明のインデューサの例を以下に示すが、これらに限定されるものではない。
当業者であれば理解されようが、任意の適切な炭素源、例えば、グリセロール、コハク酸、乳酸又は糖系炭素源、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース及びフラクトースを本発明において使用することが企図されている。例えば、本発明に用いることができる糖系炭素源としては、ホモ多糖及びヘテロ多糖、例えば、ラクトース、アミロペクチン、でんぷん、ヒドロキシエチル・でんぷん、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンもしくは酸性ムコ多糖類、例えば、ヒアルロン酸の多糖サブユニットを包含する、以下の糖単量体を含む分枝又は非分枝多糖類:D−マンノース、D−及びL−ガラクトース、フコース、フラクトース、D−キシロース、L−アラビノース、D−グルクロン酸、シアル酸、D−ガラクツロン酸、D−マンヌロン酸(例えば、ポリマンヌロン酸もしくはアルギン酸)、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン、D−グルコース及びノイラミン酸;ポリソルビトール、ポリマンニトールなどの糖アルコールの重合体;ヘパリン又はヘパラン;或いはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。グルコースは本発明の実施態様において主要な炭素源である。アラビノースは、インデューサとして用いる場合、二次炭素源としての機能を果たすこともできるが、主要炭素源とすることもできる。一実施態様では、炭素源として、D−グルコース、L−アラビノース、スクロース、l−イノシトール、D−マンニトール、β−D−フラクトース、α−L−ラムノース、D−キシロース、セルロース又はこれらの任意の組合せのうちのいずれかが挙げられる。1種又は2種以上の炭素源を本発明に用いることができる。
また、本発明は、プロモータ配列及びイニシエータ配列を有する発現制御配列並びに所望のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むプラスミドなどの発現ベクターを含む組換え細菌細胞であって、このヌクレオチド配列がこれらのプロモータ及びイニシエータ配列に対して3’側に位置している細菌細胞を提供する。本明細書に記載した開示内容から当業者には理解されようが、任意の適切な発現制御配列及び宿主細胞/クローニング媒体が企図されている。
Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press):コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨークに記載されている。概して、組換えDNA技術は、対象とする組換えタンパク質をコードしているDNA配列を合成又は単離によって入手し、これを適切なベクター/宿主細胞発現系中に導入し、この系でこの配列を、好ましくはアラビノース誘導プロモータの制御下に発現させるものである。発現ベクター中へのDNAの挿入について記載されている方法はいずれも、プロモータ及び他の調節制御要素をその選択したベクター内の特定部位に結合させるのに用いることができる。次いで、適切な宿主細胞に、従来技術により、そのようなベクター又はプラスミドを形質転換、感染、形質導入又は形質移入させる。
Biotech Inc);Smith及びJohnson、1988年)、Pmal(ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、ベバリー(Beverly)、マサチューセッツ州)及びPrit5(ファルマシア社(Pharmacia)、ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャージー州)が挙げられる。
of unfused and fused proteins in Escherichia coli”、Gene、69:301−315)及びPet
lid(Studierほか(1990年) “Use of T7 RNA polymerase to direct
expression of cloned genes”、 Methods in Enzymology、185:60−89)が挙げられる。このpTrcベクターからの目的遺伝子の発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモータからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存している。Pet
lidベクターからの目的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルスRNAポリメラーゼJ7 gnlにより媒介されるT7gn10−lac融合プロモータからの転写に依存している。このウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモータの転写制御下のT7gnl遺伝子を収容する常在性プロファージから宿主BL21(DE3)又はHMS174(DE3)株によって供給される。
Natl. Acad. Sci. USA、93:3346−3351)、テトラサイクリン抑制系(Gossenほか、1992年、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA、89:5547−5551)、テトラサイクリン誘導系(Gossenほか、1995年、Science、268:1766−1769、Harveyほか、1998年、Curr.
Opin. Chem Biol、2:512−518も参照)、RU486誘導系(Wangほか、1997年、Nat. Biotech.、15:239− 243及びWangほか、1997年、Gene
Ther.、4:432−441)並びにラパマイシン誘導系(Magariほか、1997年、J. Clin. Invest.、100:2865−2872)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施態様では、上記プロモータはアラビノース誘導プロモータである。
Bacteriol.、177:4121−4130)及びpETlld(Studierほか、1990年、Methods in Enzymology、185:60−89)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このpTrcベクターからの目的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp−lac融合プロモータからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存している。pETlldベクターからの目的遺伝子発現は、同時発現されるウイルスRNAポリメラーゼT7gn1により媒介されるT7gn10−lac融合プロモータからの転写に依存している。このウイルスポリメラーゼは、lacUV5プロモータの転写制御下のT7gn1遺伝子を収容する常在性プロファージから宿主BL21(DE3)又はHMSI74(DE3)株によって供給される。PBAD系は、ara−C遺伝子により調節される誘導アラビノースプロモータに依存している。このプロモータはアラビノースの存在下に誘導される。
NaCl、10mM NaH2PO4及び1.25mM EDTA、pH7.4である)で置換することができ、洗浄は、ハイブリッド形成の完了後15分間行う。
J.、 E.F.Fritsch及びT.Maniatis、1989年、”Molecular Cloning: A
Laboratory Manual”、 コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring
Harbor Laboratory Press):コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク、第9及び11章、並びにCurrent
Protocols in Molecular Biology、1995年、F.M.Ausubelほか編、ジョーン・ワイリー・アンド・サンズ社(John Wiley
& Sons, Inc.)、セクション2.10及び6.3−6.4に記載されており、これらは引用によって本明細書に組み入れられている。
本発明の一実施態様では髄膜炎菌血清群B2086ポリペプチドを発現することができる組換え微生物を提供する。この組換え微生物は、プロモータ配列及びイニシエータ配列を有する発現制御配列、並びに2086ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が上記プロモータ及びイニシエータ配列に対して3’側に位置しているヌクレオチド配列を含む。別の態様として、本明細書、及び引用により本明細書にその全体が組み込まれているWO03/063766及びWO04/094596に記載されているような組換え2086ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。従って、本発明は、例えば、WO03/063766及びWO04/094596(これらに限定されるものではない)に記載されているような組換え2086タンパク質を産生させる方法を提供する。
いくつかのパラメータを用いて、細胞増殖及び組換えタンパク質発現の面で培養の進行を把握し、制御することができる。そのようなパラメータとしては、光学濃度(OD)、溶存酸素(DO)、pH、(炭素源などの)栄養素/エネルギー消費、代謝副産物の蓄積(例えば、酢酸)、収集時間、及び温度が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば理解されようが、任意の適したパラメータ又はパラメータの組合せを、本明細書に示した指針に基づいて本発明に使用することが企図されている。
一定供給速度とは、インデューサ(類)及び/又は炭素源(類)を培養物に添加する速度のことを意味する。インデューサは、ある閾値パラメータが達成された後に培養物に添加する。また、炭素源はある閾値パラメータが達成された後に培養物に添加することができる(同様に、炭素源の添加は、ある閾値パラメータに達すると終了させることができる)。これらの閾値パラメータ類としては、光学濃度(OD)、溶存酸素(DO)、pH、培養培地中の栄養素の濃度、培養培地に添加した最初の炭素源の総濃度、又はこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
新鮮培養培地に細菌宿主細胞を導入することによって通常以下の4つの、程度の差はあれ異なる増殖期を経る培養物が得られる:(i)誘導期、(ii)対数(対数又は指数増殖)期、(iii)定常期及び(iv)衰退(死滅)期。対数期自体はさらに、初期対数増殖期、中期対数増殖期、後期対数増殖期などの種々の期に分けることができる。光学濃度は対数増殖の期に関連づけられる。対数増殖期及び光学濃度は、炭素源及び/又はインデューサの一定供給の開始及び/又は停止を信号として知らせるための閾値パラメータとして用いることもできる。
供給制御装置の始動及び/又は停止の引き金となることができる別のパラメータは溶存酸素(DO)(即ち、DOスタット流加発酵)である。DOは、培養培地を含む槽内の攪拌、空気流、酸素補給及び圧力を調整することによって制御することができる。DOの閾値は、20%、40%又は80%など、5%乃至80%DOの範囲に設定することができる。一旦閾値が満たされると、炭素源又はインデューサの供給制御装置は、この制御装置の停止を知らしめる閾値が満たされるまで、オンにしておくことができる。停止閾値は、別のDO閾値又は炭素源もしくはインデューサの量などの別のパラメータとすることができる。例えば、培養培地中のDOが30%又は40%を超えて上昇した時にはいつでも、供給制御装置は、DOが20%に低下するまでに、或いは本発明の種々の実施態様に従って0.5g/L又は1g/Lの炭素源又はインデューサを新たに添加するまでに始動させることができる。
供給制御装置の始動及び/又は停止の引き金となることができる別のパラメータはpH(即ち、pHスタット(pH−stat)流加発酵)である。pHは培養培地に塩基又は酸を添加することにより制御することができる。pHの閾値は、7.0など、6.8乃至7.2の範囲に設定することができる。一旦閾値が満たされると、炭素源又はインデューサの供給制御装置は、制御供給の停止を信号として知らせる閾値が満たされるまでオンにしておくことができる。停止閾値は、別のpH閾値又は炭素源もしくはインデューサの量などの別のパラメータとすることができる。例えば、培養培地中のpHが6.97に上昇した時にはいつでも、供給制御装置は、pHが6.95に低下するまでに、或いは本発明の種々の実施態様に従って1g/Lの炭素源又はインデューサを新たに添加するまでに、始動させることができる。
収集時間とは、最初の誘導、即ち、インデューサの添加後に経過する時間を意味する。本発明では任意の適した収集時間が企図されている。収集時間は、本発明の種々の実施態様では約2時間乃至約10時間、約2時間乃至約8時間、約2.5時間乃至約7時間、約3時間乃至約6時間などの範囲にあるものとすることができる。当業者であれば、一定供給速度、収集時間及びインデューサの総量を用いて、所望の結果を達成するには各パラメータをどのように調整することができるのか分かるであろう。当業者であれば、供給速度及び時間に基づいて供給量を容易に求めることができるので、アラビノースの供給量からいつ収集すべきか分かると思われる。このようにして、例えば、3時間で供給される5、10、20、30及び40g/Lのインデューサの最終濃度を達成することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明では任意の適した濃度のインデューサが企図されている。宿主細胞を誘導するのに有効なインデューサの濃度は約0.00001%乃至約20%(v/v)の範囲にあるとすることができるが、これに限定されるものではない。
本実施態様の培養物は細胞の増殖を可能にする任意の温度でインキュベートすることができる。十分な増殖をもたらす、培養物をインキュベートする各種温度としては、22℃、28℃、37℃又はこれらの任意の組合せが挙げられるが、これに限定されるものではない。
当業者であれば理解されようが、本発明では、任意の適した発酵装置(即ち、「発酵槽」)を使用することが企図されている。例えば、発酵槽は、任意の数のインペラ(Rushtonインペラなど)、取入れ口及び/又は測定プローブを具備することができる。一実施態様では、発酵槽は、3枚のインペラ及び空気を発酵槽中に導入するための1個のリング又はチューブスパージャを含むように構成される。本発明では、手動及び/又はコンピュータ利用システムを使用することを企図している。従って、この発酵システムは、発酵をモニタリングし、制御するためのコンピュータ化システムと連動することができる。このようにして、このシステムは、本発明の実施態様では、完全又は部分的に自動化することができる。
組換えタンパク質、例えば、本発明の方法に従って調製したものを含む組成物を本発明の実施態様として本明細書に記載している。本発明の組成物は組換えタンパク質を高密度で培養物中に含み、そのようなタンパク質としては本発明の方法に従って調製した組換えタンパク質類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
流加発酵法のためのモデル株として大腸菌(pPW62)サブファミリーBを用いた。得られる結果に基づいてこの方法をサブファミリーA大腸菌(pPW102)に適用する。
定速供給による流加発酵法を用いて大腸菌発酵における高細胞密度を実現した。培地中の最初のグルコース濃度は10g/Lであった。(NH4)2SO4濃度は、発酵培地中では3g/Lに増加させ、種培養培地では1g/Lに維持した。供給速度を決定するために、先ずDOスタット流加を行った。DO濃度は、攪拌速度を最大値に引き上げた後、酸素補充を行うカスケード制御装置によって20%に調整した。グルコースが枯渇すると、DOが急激に上昇した(40%超)ので、グルコース濃縮液を発酵槽中1g/Lの最終濃度となるように添加した。グルコースの各添加後、ポンプをある一定時間オフにしておいた後、次の添加を行わせた。DOスタット流加発酵を行うと、約160の最大ODが得られた。次に、グルコースを十分量添加してその濃度を毎時最大18g/L又は24g/LにするDOスタット制御装置と同等であるように一定速度を選んだ。定速供給による流加発酵中、DOが40%に急上昇したときに、グルコース供給を所望の一定速度で開始した。
NH4OHで調整)、空気流:約1vvm、DO:20%。DOは、ガス混合装置による攪拌(最低:150rpm、最高:1,000rpm)及びO2添加のカスケードにより調整した。必要な場合、PPG−2000を手動で添加することによって泡を制御した。滅菌する前には0.35mL/LのAFを培地に添加した。発酵中、1時間ごとにサンプルを採り、オフラインでグルコース、pH及びOD600をモニタリングした。1mLのサンプルから上清を調製し、後のHPLCによる有機酸の分析のために貯蔵した。
定速供給による流加発酵
図1に、一定供給速度によるOD、グルコース消費及び酢酸の蓄積の経時変化を示した。24gグルコース/L/h及び18gグルコース/L/hの一定供給速度で、それぞれ、158及び150の最大OD値が得られた。24g/L/hの供給速度を用いた場合、ラン(run)時に28g/Lの高濃度のグルコースが蓄積した。18g/L/hの供給速度を用いた場合、グルコースの蓄積は12g/Lとなった。いずれの場合も酢酸は殆ど生じなかった(即ち、1.5g/L未満)。指数増殖期は、OD100近くで終わった。比増殖速度は、いずれの場合も約0.60(hr−1)であった。
アラビノース誘導実験には15gグルコース/L/hの一定供給速度を用いた。何故なら、それによって高細胞密度が得られ、グルコース及び酢酸の蓄積が少ないからである。この実験では、中期対数増殖期OD約55及び後期対数増殖期OD約80での誘導を比較した。培養物の誘導は、単にグルコース供給の代わりにアラビノース供給を用い、アラビノースを13.4g/L/hの一定速度で供給することにより行った。各培養物には合計40g/Lのアラビノースを3時間の間に添加した。誘導後、SDS−PAGEによるrLP2086アッセイ並びにHPLCによる有機酸及びアラビノースのアッセイのためにサンプルを毎時採取した。
以下の実験の目的は、培養物に供給されたアラビノースの量を測定し、この培養物へのアラビノース供給量を減少させてもなおrLP2086の高発現が得られるかどうかを検討することにある。4つの異なる培養物のそれぞれににアラビノース濃縮液を種々の供給速度で3時間の間供給し、最終アラビノース濃度10、20、30及び40g/Lを得た。培養物は全てOD600約80で誘導した。図4にOD及びrLP2086産生の経時変化を示した。表5は、これら4条件のそれぞれにつきOD及びrLP2086収量をまとめたものである。表に示したように、最大rLP2086収量は、アラビノース添加総量10g/Lで1.2g/L、アラビノース添加総量20g/Lで1.6g/L、アラビノース添加総量30g/Lで1.7g/L、アラビノース添加総量40g/Lで2.0g/Lであった。20g/L乃至40g/Lのアラビノース供給ではrLP2086収量は同様であったが、10g/LのアラビノースではrLP2086の産生はずっと少なかった(即ち、1.2g/L)。これらの結果は、誘導のために添加するアラビノースの総量をrLP2086生産性を低下させることなく40g/Lから20g/Lへ減少させることができることを示唆している。すなわち、アラビノースの使用量を減らすことは、特にアラビノースの価格が高い(約500米ドル/kg)ことを考えると、より費用効果が高いことになる。
誘導用アラビノースに適用する場合、連続供給法が単純な回分添加法より優れているかどうかを検討するために、以下の実験を行った。ラン(run)X−BRN05−039では、ODが約80である場合、20g/Lのアラビノースを、時間をかけて供給するのではなく、一度に全部発酵槽に添加した。図5にOD、グルコース及びアラビノース消費、並びにrLP2086産生の経時変化を示した。最大1.3g/LのrLP2086が得られた。アラビノースの回分添加では、操作的により簡単ではあるが、連続供給よりrLP2086の産生が少なかった。すなわち、アラビノースの連続供給法は単純回分添加より優れている。
最適の収集時間を決定するために、通常の供給特性(20g/Lアラビノースの3時間にわたる供給)を40g/Lの6時間にわたる供給に拡張した。ラン(run)X−BRN05−028及びラン(run)X−BRN05−029では、それぞれOD約55及びOD約80で細胞を誘導した。図7にOD及びrLP2086産生の経時変化を示した。アラビノース供給を3時間から6時間に延長したが、興味深いことに、それでも誘導後3時間付近にピーク力価が得られた。この生成物力価は、より高いODで誘導した培養物では若干より高かった。OD約55での誘導時の最大rLP2086収量は2.0g/Lであった(X−BRN05−028)のに対し、OD約80での誘導時ではこれは2.4g/Lであった(X−BRN05−029)。この結果は、誘導後3時間に細胞を収集するべきであることを示唆している。
添加塩がグルコース及びアラビノース供給液において必要不可欠であるかどうかを検討するために、単純なグルコース及びアラビノース供給液を標準的なグルコース+塩(即ち、K2HPO4/KH2PO4+(NH4)2SO4)及びアラビノース+塩供給液と比較した。いずれの培養物についても、アラビノースは20g/Lを3時間にわたって供給した。その結果、増殖及びrLP2086産生の特性は極めて類似していた。rLP2086の最大収量は、供給液に塩を添加した場合には1.8g/Lであり、グルコース及びアラビノース供給液を塩を含有させずに調製した場合には2.0g/Lであった。これらの結果は、グルコース及びアラビノース供給液に塩を添加する必要がないことを示唆している。
種培養は、15μg/mLのクロラムフェニコールを含有する1Lの基礎培地に1mlの解凍実用種を接種することによって開始した。2.8Lのフェルンバッハフラスコ中でこの培養物を増殖させ、32℃、150rpmで約16時間インキュベートした。最終OD600は約3.0であった。3g/Lの(NH4)2SO4を含有し、クロラムフェニコールを含有しない3.15Lの基礎培地中に350mLの種培養物を無菌的に移した。発酵は7.4NのNH4OHによりpH7.0±0.05に、温度は36℃に、空気流は1vvmに調整した。DOは攪拌(最低:150rpm、最高:1,000rpm)及び酸素添加のカスケードにより調節した。消泡剤PPG−2000を自動添加して泡を抑えた。発酵中、1時間ごとにサンプルを採取してグルコース及びODをオフラインでモニタリングした。接種後、DOは約100%から20%へ低下した後、20%に維持された。DOの20%から40%超への急激な上昇があった(通常6時間の経過発酵時間(EFT))場合、グルコース(塩を含まない)供給ポンプを15g/L/hの速度でオンにした。図8に示したように、グルコースは6時間のEFTまでに完全に枯渇し、DOの急激な上昇をもたらした。ODが約40に達したら、サンプルを半時間毎に採取した。グルコース供給はOD90でオフにし、アラビノース供給を13.4g/L/hの速度でオンにした。3時間のアラビノース(塩を含まない)供給(即ち、合計20g/Lのアラビノース添加)後、アラビノース供給をオフにし、発酵をさらに1時間継続させた。図8に示したように、102のODが得られ、SDS−PAGEに基づき、2.0g/LのMnB
rLP2086が発現された(図9参照)。そのピークは、誘導後3時間(即ち、約12時間EFT)に生じた。SDS−PAGE及びウェスタン・ブロットにより、発現タンパク質は確かにサブファミリーBのrLP2086であることが示された。
rLP2086サブファミリーBに対して用いた流加発酵法がrLP2086サブファミリーAに適用できるかどうかを調べるために、この方法を、サブファミリーB株で確立した手順を用いて実施した。図10にOD、グルコース及びアラビノース消費並びにrLP2086産生の経時変化を示した。サブファミリーAの増殖及びrLP2086産生特性はサブファミリーBで得られたものと同様であった(図8と比較されたい)。SDS−PAGE及びウェスタン・ブロットにより、発現タンパク質は確かにサブファミリーAのrLP2086であることが示された(図11参照)。表6に6種のサブファミリーAラン(run)の最大OD及びrLP2086発現収量を示した。最大rLP2086発現収量の範囲は1.5乃至2.1g/L(平均最大収量:1.8±0.2g/L)であり、rLP2086サブファミリーBを産生させるために用いた流加発酵からの結果と同様であった。従って、サブファミリーB株用に開発した流加発酵はサブファミリーA株にも適している。
rLP2086産生を低下させないで必要なアラビノースの量を減少させるために、誘導期におけるグルコース及びアラビノースの二重供給について検討した。この方法は、標準的グルコース供給速度の25%(3.75g/L/h)、50%(7.5g/L/h)及び100%(15g/L/h)で誘導期にグルコースの供給を継続しながら、アラビノース10g/Lを3時間かけて(通常量の半分)供給するものである。これらの供給物グルコース及びアラビノースはいずれも添加物を用いないで調製した。
種培養は、15μg/mLのクロラムフェニコールを含有する2つの1L基礎培地に1ml(即ち、1バイアル)の解凍実用種を接種することによって開始した。2.8Lフェルンバッハ中のこの培養物をロータリーシェーカーを用いて32℃、150rpmで約16時間インキュベートした。
NH4OHによりpH7.0±0.05、温度36℃、DO20%及び空気流1vvmに調整した。DOは攪拌及び酸素添加のカスケードによって調節した。消泡剤PPG−2000を自動添加して泡を抑えた。発酵中、DOは約100%から20%へ低下し、20%で維持された。DOの20%から40%超への急激な上昇があることにより(通常、OD約20で)、グルコースの枯渇を知らせている場合、供給ポンプを作動させてグルコース濃縮液(即ち、500g/L)を15gグルコース/L培養物/hの速度で3時間供給した。発酵中、1時間ごとにサンプルを採取してグルコース及びODをオフラインでモニタリングした。ODが約40に達したら、半時間ごとにサンプル採取を行った。ODが約80に達すればすぐに、グルコース供給を停止させ、アラビノース(例えば、500g/Lのアラビノース濃縮液)供給を6.7gアラビノース/L培養物/hの速度で開始させ、これを3時間行った。
Claims (86)
- 組換えタンパク質を産生させるための方法であって、
組換え細菌細胞を含む培養物に炭素源を連続的に添加し、該培養物が閾値パラメータを達成した後に該培養物にインデューサを連続的に添加することを含む、該組換え細菌細胞を培養して組換えタンパク質を発現させること、及び該培養物から該組換えタンパク質を単離することを含む、方法。 - 前記閾値パラメータが光学濃度(OD)、溶存酸素(DO)、培養培地中の栄養素の濃度、培養培地に添加された炭素源の総濃度、又はこれらの任意の組合せである、請求項1に記載の方法。
- 前記閾値パラメータが前記培養物の光学濃度(OD)である、請求項2に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約70乃至約110のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約70乃至約105のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約75乃至約85のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約80のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記培養物に一定速度で前記インデューサを添加すること、該培養物にDOスタット供給により該インデューサを添加すること、又は該培養物にpHスタット供給により該インデューサを添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養物に約3.35g/L/h乃至約16g/L/hの一定速度で前記インデューサを添加すること、該培養物にDOスタット供給により又はpHスタット供給により該インデューサを添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養物に添加する前記インデューサの総量が約4g/L乃至約40g/Lである、請求項1に記載の方法。
- インデューサ供給時に前記培養物に添加する前記インデューサの総量が約5g/L乃至約20g/Lである、請求項10に記載の方法。
- インデューサ供給時に前記培養物に添加する前記インデューサの総量が約7g/L乃至約15g/Lである、請求項11に記載の方法。
- インデューサ供給時に前記培養物に添加する前記インデューサの総量が約10g/Lである、請求項12に記載の方法。
- 前記方法の開始後約2乃至約8時間の間、前記培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 開始後約3乃至約6時間の間、前記培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記培養物への前記インデューサの添加を開始後約2乃至約8時間に前記組換えタンパク質を単離することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養物への前記インデューサの添加を開始後約3乃至約6時間に前記組換えタンパク質を単離することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記インデューサがアラビノースである、請求項1に記載の方法。
- 誘導前の前記培養物に前記炭素源を連続的に添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 誘導前及び誘導後の前記培養物に前記炭素源を連続的に添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記インデューサが前記培養物に連続的に添加されている間に該培養物に前記炭素源を連続的に添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約70乃至約110のOD600に達するまで該培養物に前記炭素源を連続的に添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記炭素源が糖系炭素源である、請求項1に記載の方法。
- 前記糖系炭素源がグルコースである、請求項23に記載の方法。
- 前記インデューサがアラビノースである、請求項24に記載の方法。
- 前記アラビノースが前記培養培地に連続的に添加されている間に該培養培地に前記グルコースを連続的に添加することを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約80のOD600に達するまで前記グルコースを連続的に添加することを含む、請求項25に記載の方法。
- 組換えタンパク質を産生させるための方法であって、
(a)誘導プロモータの制御下にある組換えタンパク質をコードしている発現ベクターを細菌宿主細胞中に導入して組換え細菌細胞を形成すること、
(b)該組換え細菌細胞を培養培地中に導入して細胞培養物を形成すること、
(c)該細胞培養物に連続供給材料として炭素源を添加すること、
(d)該細胞培養物中の細胞増殖を閾値光学濃度(OD600)の達成についてモニタリングすること、
(e)一旦、該閾値光学濃度(OD600)が達成されると、連続供給材料として該誘導プロモータのインデューサを該細胞培養物に添加すること、及び
(f)該細胞培養物から該組換えタンパク質を単離すること
を含む、方法。 - 前記培養物の細胞密度が約70乃至約110のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約70乃至約105のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約75乃至約85のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記培養物の細胞密度が約80のOD600に達した時に該培養物に前記インデューサを連続的に添加することを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記インデューサが一定速度で前記培養物に添加されるか、又は該インデューサがDOスタット供給によって該培養物に添加されるか、又は該インデューサがpHスタット供給によって該培養物に添加される、請求項28に記載の方法。
- 前記インデューサが約3.35g/L/h乃至約16g/L/hの一定速度で前記培養物に添加されるか、又は該インデューサがDOスタット供給によって該培養物に添加されるか、又は該インデューサがpHスタット供給によって該培養物に添加される、請求項33に記載の方法。
- 前記培養物に添加されるインデューサの総量が約4g/L乃至約40g/Lである、請求項28に記載の方法。
- 前記培養物に添加されるインデューサの総量が約5g/L乃至約20g/Lである、請求項35に記載の方法。
- 前記培養物に添加されるインデューサの総量が約7g/L乃至約15g/Lである、請求項36に記載の方法。
- 前記培養物に添加されるインデューサの総量が約10g/Lである、請求項37に記載の方法。
- インデューサ供給の開始後約2時間乃至約8時間に前記培養物から前記組換えタンパク質を単離することを含む、請求項28に記載の方法。
- インデューサ供給の開始後約3時間乃至約6時間に前記培養物から前記組換えタンパク質を単離することを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記炭素源が、該炭素源及び前記インデューサの両者の定速供給中に、又は該炭素源が該炭素源及び該インデューサの両者のDOスタット供給中に、又は該炭素源及び該インデューサの両者のpHスタット供給中に前記細胞培養物に添加される、請求項28に記載の方法。
- 前記インデューサがアラビノースである、請求項28に記載の方法。
- 前記炭素源が糖系炭素源である、請求項28に記載の方法。
- 前記糖系炭素源がグルコースである、請求項43に記載の方法。
- 前記炭素源がグルコースであり、前記インデューサがアラビノースである、請求項28に記載の方法。
- 前記アラビノースが前記細胞培養物に連続的に添加されている間に該細胞培養物にグルコースを連続的に添加することを含む、請求項45に記載の方法。
- 前記細胞培養物の細胞密度が約80のOD600に達するまで該細胞培養物にグルコースを連続的に添加することを含む、請求項45に記載の方法。
- 組換えタンパク質を産生させるための方法であって、
組換え細菌細胞を培養し、培養物が閾値パラメータを達成した後に該細菌細胞を含む該培養物に連続的にインデューサを添加することによって組換えタンパク質を発現させることを含み、該細菌細胞が髄膜炎菌血清群Bの遺伝子に相当する核酸配列を含む、方法。 - 前記閾値パラメータが光学濃度(OD)、溶存酸素(DO)、pH、培養培地中の栄養素の濃度、培養培地に添加された炭素源の総濃度、又はこれらの任意の組合せである、請求項48に記載の方法。
- 前記閾値パラメータが前記培養物の光学濃度(OD)である、請求項49に記載の方法。
- 前記連続的インデューサ供給が、前記培養物の細胞密度が約70乃至約110のOD600に達した時に開始される、請求項50に記載の方法。
- 前記連続的インデューサ供給が、前記培養物の細胞密度が約70乃至約105のOD600に達した時に開始される、請求項51に記載の方法。
- 前記連続的インデューサ供給が、前記培養物の細胞密度が約75乃至約85のOD600に達した時に開始される、請求項52に記載の方法。
- 前記連続的インデューサ供給が、前記培養物の細胞密度が約80のOD600に達した時に開始される、請求項53に記載の方法。
- 前記インデューサが約3.35g/L/h乃至約16g/L/hの一定速度で前記培養物に添加されるか、又は該インデューサがDOスタット供給によって添加されるか、又は該インデューサがpHスタット供給によって添加される、請求項48に記載の方法。
- 誘導時に前記培養物に添加されるインデューサの総量が約4g/L乃至約40g/Lである、請求項48に記載の方法。
- 誘導時に前記培養物に添加されるインデューサの総量が約5g/L乃至約20g/Lである、請求項56に記載の方法。
- 誘導時に前記培養培地に添加されるインデューサの総量が約7g/L乃至約15g/Lである、請求項57に記載の方法。
- 誘導時に前記培養物に添加されるインデューサの総量が約10g/Lである、請求項58に記載の方法。
- 前記インデューサ供給が前記方法の開始後約2時間乃至約8時間継続する、請求項48に記載の方法。
- 前記インデューサ供給が前記方法の開始後約3時間乃至約6時間継続する、請求項60に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質がインデューサ供給の開始後約2時間乃至約8時間に収集される、請求項48に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質産物がインデューサ供給の開始後約3時間乃至約6時間に単離される、請求項62に記載の方法。
- 前記培養培地への前記炭素源供給が前記培養物へのインデューサ供給中継続する、請求項48に記載の方法。
- 前記インデューサがアラビノースである、請求項48に記載の方法。
- 前記炭素源が糖系炭素源である、請求項48に記載の方法。
- 前記糖系炭素源がグルコースである、請求項66に記載の方法。
- 前記インデューサがアラビノースである、請求項67に記載の方法。
- グルコースが、前記培養物へのアラビノースの定速供給時、又は該グルコース及び前記インデューサの両者のDOスタット時、又は該グルコース及び該インデューサの両者のpHスタット供給によって一定供給速度で該培養物に供給される、請求項68に記載の方法。
- グルコースが、前記培養物へのアラビノースの定速供給時に、又は該培養物中の細胞密度が約80のOD600に達するまで該グルコース及び前記インデューサの両者のDOスタット供給によって、又は該培養物中の細胞密度が約80のOD600に達するまで該グルコース及び該インデューサの両者のpHスタット供給によって一定供給速度で該培養物に供給される、請求項68に記載の方法。
- 組換え髄膜炎菌2086タンパク質がリポタンパク質(rLP2086)を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記タンパク質が脂質付加されていないタンパク質を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記タンパク質が髄膜炎菌2086サブファミリーAタンパク質を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記タンパク質が髄膜炎菌2086サブファミリーBタンパク質を含む、請求項68に記載の方法。
- 組換え髄膜炎菌2086タンパク質(P2086)を産生させる方法であって、
(a)誘導プロモータの制御下にある組換え2086タンパク質をコードしている発現ベクターを細菌宿主細胞中に導入して組換え細菌細胞を形成すること、
(b)該組換え細菌細胞を培養培地に導入して培養物を形成すること、
(c)該培養物に炭素源を添加する工程、
(d)該培養物中の細胞増殖を閾値光学濃度(OD)の達成についてモニタリングすること、
(e)一旦、該培養物の細胞密度が約70乃至110の光学濃度に達したら、該誘導プロモータのインデューサを該培養物に連続的に添加すること、ならびに
(f)該インデューサの連続添加開始後約3時間乃至約6時間後に該培養物から該組換え髄膜炎菌2086タンパク質を単離すること
を含む、方法。 - 細菌培養物であって、該細菌培養物の総容量に基づき、少なくとも約1.5g/Lの密度で組換え髄膜炎菌2086タンパク質を含む、培養物
を含む組成物。 - 前記組換え髄膜炎菌2086タンパク質が脂質付加されているタンパク質である、請求項76の組成物。
- 前記組換え髄膜炎菌2086タンパク質が脂質付加されていないタンパク質である、請求項76の組成物。
- 前記組換え髄膜炎菌2086タンパク質が2086サブファミリーAタンパク質である、請求項76の組成物。
- 前記組換えタンパク質が2086サブファミリーBタンパク質である、請求項76の組成物。
- 前記培養物が別の組換え髄膜炎菌2086タンパク質を含む、請求項80の組成物。
- 前記別の2086組換え髄膜炎菌タンパク質が2086サブファミリーAタンパク質である、請求項81の組成物。
- 前記組換え髄膜炎菌2086タンパク質の密度が、該細菌培養物の総容量に基づき、少なくとも約1.7g/Lである、請求項76の組成物。
- 前記組換え髄膜炎菌2086タンパク質の密度が、該細菌培養物の総容量に基づき、少なくとも約2.0g/Lである、請求項76の組成物。
- 前記組換え髄膜炎菌2086タンパク質の密度が、該細菌培養物の総容量に基づき、少なくとも約3.0g/Lである、請求項76の組成物。
- 請求項1乃至75のいずれかの方法に従って調製された組換え髄膜炎菌2086タンパク質を含む細菌培養物を含む組成物。
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