CN103305450B

CN103305450B - 一种大肠杆菌表达菌株及用其生产n-乙酰-d-神经氨酸的方法

Info

Publication number: CN103305450B
Application number: CN201310222109.5A
Authority: CN
Inventors: 尚广东; 李玲; 严振亚; 石牡丹
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-06-04
Also published as: CN103305450A

Abstract

本发明涉及一种基于基因组的酶催化合成N-乙酰-D-神经氨酸的方法。本方法采用的是将分别置于T7强启动子之下的来源于多形拟杆菌VPI-5482基因组中的异构酶基因BT0453和来源于大肠杆菌的醛缩酶基因nanA整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的malE基因区域而获得重组的基因工程菌。菌株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之下表达异构酶BT0453和醛缩酶NanA，以全细胞为催化剂，N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸钠底物，催化合成N-乙酰-D-神经氨酸，产量可达36.3%。本高效的N-乙酰-D-神经氨酸表达体系有着成为N-乙酰-D-神经氨酸生产菌株的潜力。

Description

一种大肠杆菌表达菌株及用其生产N-乙酰-D-神经氨酸的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种基于基因组的酶催化合成N-乙酰-D-神经氨酸的方法。

背景技术

季节性流感和高致病性禽流感是威胁人类健康的大敌。疫苗和引物是治疗流感的两种方式，由于流感病毒不断变化，针对流感病毒的疫苗常常难以有特定的疗效，而且高致病性禽流感常常是突发的，而开发疫苗至少需要数月的时间，因此抗流感药物是必不可少的治疗手段。

抗流感药物的种类较为缺乏，仅有神经氨酸酶抑制剂奥斯米韦、扎那米韦和帕拉米韦。奥斯米韦的临床效果最为明显，使用的也最广泛。但奥斯米韦也有着一些不足。如奥斯米韦有导致患者精神异常、产生幻觉等多种副作用，甚至造成患者死亡，而扎那米韦没有这些毒副作用。H1N1型和H5N1型病毒株的H274Y突变株（即274位组氨酸突变为酪氨酸）表现为奥斯米韦耐药和对扎那米韦敏感，最近发现的帕拉米韦耐药株对奥斯米韦和对扎那米韦均敏感。这些均表明扎那米韦是不可替代的抗流感药物，目前国际市场上扎那米韦的需求量巨大，价格昂贵。

N-乙酰-D-神经氨酸是合成扎那米韦及其它神经氨酸酶抑制类抗流感药物的关键原料。N-乙酰-D-神经氨酸最初是从聚唾液酸（唾液酸以α-2,8或α-2,9酮苷键连接的线性同聚物）水解，或从鸟巢，奶类和卵黄等提取而获得，这些传统方法的缺陷是产量低，步骤烦琐，工艺不稳定，所得产物的纯度较低，故难以进行大规模生产。目前工业化生产N-乙酰-D-神经氨酸均采用酶催化的方法。酶催化反应途径为首先以价格低廉的N-乙酰-D-葡萄糖胺为原料，通过在大肠杆菌中表达的N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶生成N-乙酰-D-甘露糖胺，后者在大肠杆菌中表达的醛缩酶作用下和丙酮酸缩合而催化合成N-乙酰-D-神经氨酸。

目前采用的酶来源是将异构酶基因和醛缩酶基因克隆在载体上，在大肠杆菌中过量表达，此后分离纯化得到纯酶或采用全细胞进行催化。这种克隆在载体上进行表达的方式较为有效，但存在着一些固有的缺点，如两个基因需要分别克隆在各自的载体上，转化得到两个菌株，再分离诱导酶的表达；需使用抗生素以维持质粒的荀子，但抗生素的使用增加了酶的分离纯化的难度和产品的价格、克隆于质粒上的基因存在菌株不均一以及基因的活性在长时间使用后会降低等等问题。这些都有可能对基因的表达和酶的活性不利。此外，对宿主菌的基因组进行操作以提高转化效率的实验过程也不简便。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，以及应用该菌株基于生产N-乙酰-D-神经氨酸的方法。

本发明所述大肠杆菌表达菌株，是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.7483。

大肠埃希氏菌CGMCC No.7483是由如下方法获得：将分别置于T7强启动子之下的来源于多形拟杆菌VPI-5482基因组中的异构酶基因BT0453和来源于大肠杆菌的醛缩酶基因nanA整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的malE基因区域而获得重组的基因工程菌。

整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组采用的是来源于λ噬菌体的重组酶所介导的同源重组方法。来源于λ噬菌体的重组酶是由Redα，Redβ和Redγ这三个酶所组成，Redα编码5'→3'DNA外切酶，Redα酶切转化的DNA底物获得单链DNA、Redβ编码单链结合蛋白，结合在Redα所生成的单链DNA上，并促进同源重组的发生、Redγ编码Gam蛋白，防止菌体内部的外切酶对外来DNA的降解。重组酶基因置于由LacI基因所严谨调节的pLac启动子之下，pLac在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导之下进行表达。重组酶所介导的同源重组方法称为重组工程，重组工程简便、高效、适用范围广。

本发明还公开了一种用大肠埃希氏菌CGMCC No.7483催化合成N-乙酰-D-神经氨酸的方法，是将该菌株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导之下表达异构酶BT0453和醛缩酶NanA，以全细胞为催化剂，N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸钠底物，催化合成N-乙酰-D-神经氨酸。实验证明产量可达36.3%。

采用大肠埃希氏菌CGMCC No.7483菌株进行催化合成N-乙酰-D-神经氨酸

体系的优点在于：两个基因均位于基因组上，避免了基于质粒系统的一系列问题，操作简便快捷，产量高，后续的基因操作更加容易，无需每次转化克隆有基因的质粒，

人们面临着突发性流感和季节性流感的威胁，每年数以十万计的人们死于流感相关疾病，抗流感药物的需求不断增加，价格十分昂贵，供应量也非常不足，这些都和原材料的供应和价格密切相关。N-乙酰-D-神经氨酸由于其在合成扎那米韦以及其他神经氨酸酶抑制剂类抗流感药物中的重要作用，目前价格很高，且供应有限。因此高效的神经氨酸合成体系将极大有益于神经氨酸的合成、扎那米韦的供应以及缓解抗流感药物的供应和价格的问题。本高效的N-乙酰-D-神经氨酸表达体系可能用于工业化生产N-乙酰-D-神经氨酸。

附图说明

图1是基因工程菌株基因型分析的凝胶电泳结果。

1.DL2000DNA分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb；

2.BL21(DE3)基因组为模板，R1073-R1074PCR扩增的2.4kb产物；

3.LS2402基因组为模板，R1073-R134PCR扩增的2.0kb产物；

4.LS2402基因组为模板，R1061-R1074PCR扩增的1.4kb产物；

5.LS2402基因组为模板，R1073-R1074PCR扩增的4.2kb产物；

6.λ/indIII分子量标准：23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0kb。

图2是基因工程菌株表达异构酶BT0453和醛缩酶NanA的的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果。

1.蛋白质分子量标准：116.0，66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4KD；

2.LS2402表达的总蛋白，BT0453为45.7KD，NanA为32.6KD；

3.LS2402表达的可溶性蛋白，BT0453为45.7KD，NanA为32.6KD。

图3是酶催化产物的高效液相分析结果。

高效液相图谱上保留时间8.596分钟的是N-乙酰-D-神经氨酸衍生物；10.191分钟的是N-乙酰-D-神经氨酸；11.648分钟的是丙酮酸钠；13.656分钟的是N-乙酰-D-葡萄糖胺；14.30分钟的是N-乙酰-D-葡萄糖胺。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1.Escherichia coli MG1655。基因型F-LAM-rph-1，来自美国大肠杆菌保藏中心。

2.Escherichia coli DH10B。基因型F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80ΔlacZΔM15ΔlacX74deoRrecA1araD139Δ(ara,leu)7697galU galK rpsL endA1nupG.。文献：LifeTechnologies,Inc.Focus,1990,12:19。购自美国Invitrogen公司。

3.Escherichia coli BW25141。含Pir基因的大肠杆菌菌株，为含R6K复制子的质粒的宿主菌。文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12):6640-5。来自美国Purdue大学Barry Wanner教授。

4.Escherichia coli BL21(DE3)。基因型B F–dcm ompT hsdS(rB–mB–)galλ(DE3)。购自美国Invitrogen公司。

5.pBluescript II(KS-)。基因克隆载体，购自美国Stratagene公司。

6.pET30a(+)。基因表达载体，购自美国Novagen公司。

7.pKD4。文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12):6640-5。来自美国Purdue大学Barry Wanner教授。

8.pMOD4RT-G。文献：Zhang Y,Lindsey Nash L,Fisher A.A simplified,robust,and streamlinedprocedure for the production of C.elegans transgenes via recombineering.BMCDevelopmental Biology2008,8:119。来自美国University of Pittsburgh的Alfred Fisher教授。9.pBAD322C。文献：Cronan JE.A family of arabinose-inducible Escherichia coli expressionvectors having pBR322copy control.Plasmid.2006,55(2):152-7。来自美国Illinois大学Urbana-Champaign分校John Cronan教授。

10.pTKRed。文献：Kuhlman TE,Cox EC.Site-specific chromosomal integration of largesynthetic constructs.Nucleic Acids Research,2010,38(6),e92。来自美国Princeton大学Thomas Kuhlman教授。

实施例1.异构酶基因BT0453和醛缩酶基因nanA偶联质粒的构建

设计引物R133：5'-GGGGGATCCATATGGATTTTAAGAAACTAGCG-3'，（SEQ ID NO.1），BamHI和NcoI酶切位点以下划线表示；R134：5'-GGGGTCGACCTATAGCGGTTCTAATAC-3'，（SEQ ID NO.2），SaII酶切位点以下划线表示。以多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）VPI-5482基因组DNA(来自美国Washington University,St.Louis的Jeffrey Gordon教授)为模板，R133-R134PCR获得1.2kb的BT0453基因，1.2kb片段以克隆至TA载体pMD18-TSimple，获得重组克隆LS1842。

设计引物R135：5'-GGGACTAGTCATATGGCAACGAATTTACGTGGC-3'，（SEQ IDNO.3），SpeI和NdeI酶切位点以下划线表示；R136：5'-GGACTCGAG

TCACCCGCGCTCTTGCATCAAC-3'，（SEQ ID NO.4），XhoI酶切位点以下划线表示。以大肠杆菌MG1655基因组DNA(来自美国University of Illinois at Urbana-Champaign的JohnCronan教授)为模板，R135-R136PCR获得0.9kb的nanA基因片段，0.9kb以NdeI-XhoI酶切后和pET30a(+)以NdeI-XhoI酶切的5.3kb载体相连接，获得重组克隆pLS1843。

设计引物R137：5'-GAACTCGAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCC-3'，（SEQ ID NO.5），XhoI酶切位点以下划线表示。以pLS1843为模板，R137-R135PCR获得1.2kb的T7-nanA片段，1.2kb以XhoI酶切后克隆至pKS(-)的XhoI位点，获得重组克隆pLS1844。

pLS1842以NdeI-SaII酶切分离的1.2kb片段和pLS1844以XhoI酶切分离的1.2kb片段通过三片段克隆法，克隆至pET30a(+)以NdeI-XhoI酶切的5.3kb载体相连接，由于SaII和XhoI同尾酶，酶切后可以相互连接，但连接后两个位点均消失。选择正确的1.2kb的XhoI片段方向，获得重组克隆pLS1845。

设计引物R1061：5'-GAACTCGAGTCTTGAAATAAGATCACTACCG-3'，（SEQ ID NO.6），XhoI酶切位点以下划线表示；R1062：5'-GAACTCGAGTTAC

GCCCCGCCCTGCCACTC-3'，（SEQ ID NO.7），XhoI酶切位点以下划线表示。以pBAD322C为模版，R1061-R1062PCR扩增得到0.7kb的氯霉素抗性基因，0.7kb以XhoI酶切后与pLS1845以XhoI酶切所得的7.6kb相连接，获得重组克隆pLS1852。

设计引物R1067：5'-GGGGGTACCGCTTGCCAGGAGCGATCTAAC-3'，（SEQ ID NO.8），KpnI酶切位点以下划线表示；R1068：5'-GGGTACGTATGCTGTGA

AATGCCGGATGCGG-3'，（SEQ ID NO.9），SnaBI酶切位点以下划线表示；R1069：5'-GGGTACGTAGAATTGGCGGTAATGTGGAGATG-3'，（SEQ ID NO.10），SnaBI酶切位点以下划线表示；R1070：5'-GGGGTCGACGGGGATAGAGCGCGTAAG

ACTG-3'，（SEQ ID NO.11），SaII酶切位点以下划线表示。以BL21(DE3)基因组DNA为模板，分别以R1067-R1068PCR扩增得到malE基因上游0.5kb，以R1069-R1070PCR扩增得到malE基因下游0.5kb。上游0.5kb和下游0.5kb分别克隆至pMD18-T Simple载体（大连宝生物公司）获得重组质粒pLS1937和pLS1938。pLS1937以KpnI-SnaBI酶切分离的0.5kb和pLS1938以SnaBI-SaII酶切分离的0.5kb通过三片段连接，克隆至pKS(-)的KpnI-SaII位点，获得重组质粒pLS2429。

设计引物R1071：5'-CCATACCCACGCCGAAACAAG-3'，（SEQ ID NO.12）；

R1072：5'-AAGGGGTTATGCTAGTTATTG-3'，（SEQ ID NO.13）。以pLS1852为模板，R1071-R1072PCR扩增得到3.2kb片段，继而钝端克隆至pLS2429的SnaBI位点，获得重组质粒pLS2434。

设计引物R6K1：5'-GGGTCTAGAGCTCTCGAGATATCTATGGACAGCA

AGCGAACCGG-3'，（SEQ ID NO.14），XbaI酶切位点以下划线表示；R6K2：5'-GGGGAATTCGGATCCGGTACCACTAGTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG

-3'，（SEQ ID NO.15），EcoRI酶切位点以下划线表示。以pKD4为模版，R6K1-

R6K2PCR扩增得到1.1kb卡那霉素抗性基因片段，1.1kb以XbaI-EcoRI酶切后，克隆至pKS(-)的相同位点，获得重组克隆pLS1913。pLS1913以XbaI-EcoRI酶切分离的1.1kb片段和2.1kbpMOD4RT-G以酶切分离的XbaI-EcoRI连接，转化大肠杆菌BW25141，以30μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的氨苄青霉素进行筛选，获得重组克隆pR6KMCS。pR6KMCS使用R6K复制子，宿主菌为含有pir基因的大肠杆菌BW25141，含R6K复制子的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中不能复制，这就去除了质粒模板的背景干扰。

pLS2434以KpnI-SaII酶切分离的4.2kb片段和pR6KMCS以KpnI-SaII酶切分离的2.0kb载体相连接，转化BW25141感受态细胞，以50μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素筛选，得到pLS2435。pLS2435即为克隆在R6K质粒骨架上的、两端为malE基因两侧500bp同源臂的、BT0453基因和nanA基因分别置于T7启动子之下的克隆。

实施例2.重组工程法构建异构酶基因BT0453和醛缩酶基因nanA整合至BL21(DE3)基因组上的基因工程菌株

1.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组酶表达的菌株电转化感受态细胞的制备和电转化。

首先将质粒pTKRed转化至大肠杆菌BL21(DE3)，在30°C下，以100μg/ml大观霉素进行筛选。所得菌株的单菌落接种至含100μg/ml大观霉素的LB液体培养中，30°C培养过夜，按1:00的体积比转接至100ml同样培养基，30°C，振荡培养，至OD600约0.2时，加入2mM IPTG进行诱导培养，继续培养至OD600约0.4时,将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟后，4°C，7000rpm离心5分钟，弃去上清。菌体沉淀以冰冷的10%甘油洗涤菌体3次，最后以200μl冰冷的10%甘油悬浮，50μl分装，并用于一次电转化。

pLS2434以KpnI-SaII酶切分离的、溶解于ddH₂O的1μg的4.2kb T7启动子之下的BT0453基因，nanA基因片段和氯霉素抗性基因DNA加至IPTG诱导重组酶表达的50μl电转化感受态细胞，轻弹混匀后，将混合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，以如下条件电击转化：1.8kV，200Ω，电转化仪为美国Bio-Rad公司的Gene Pulser II^R电转化仪。随后，以1mL SOC培养基悬浮，转至15ml聚丙烯离心管，37°C振荡培养培养2h，涂布至含25μg/ml的氯霉素的LB平板，筛选得到重组菌株。

2.整合型基因工程菌株的鉴定

设计引物R1073：5'-GAGCGCCAGTTGCCACTCATC-3'，（SEQ ID NO.16），为整合位点上游58bp的引物；R1074：5'-ACGCGTTGGTTAATCACCTC-3'，（SEQ ID NO.17），为整合位点下游76bp的引物。对随机挑选的氯霉素抗性菌株进行菌落PCR验证其基因型，验证结果见图一。以BL21(DE3)基因组为模板，R1073-R1074PCR扩增的是原株2.4kb；以氯霉素抗性菌株为模板，R1073-R134扩增得到上游整合位点至插入片段之间的2.0kb片段，R1061-R1074扩增得到插入片段至下游位点之间的1.4kb片段，R1073-R1074扩增得到4.2kb的全长片段。

最终异构酶BT0453基因，醛缩酶nanA基因片段和氯霉素抗性基因片段取代大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的malE基因而获得的基因工程。菌株命名为LS2402，LS2402已作为专利菌株保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.7483，保藏日期：2013年4月17日。

实施例3.基因工程菌株的蛋白表达

LS2402单菌落LB培养基培养过夜后，1:50转接10ml扩大培养，当OD600至约～0.8时,加入1mM IPTG于30°C诱导表达6h。以SDS-PAGE检测蛋白表达的结果见附图二。由图可见，BT0453表达的蛋白大小为45.7KD，在SDS-PAGE上的大小略低于45.0KD的分子量标准。这是由于BT0453属于糖蛋白类型，而糖蛋白在SDS-PAGE上的迁移稍快是固有的生物学特性。NanA表达的蛋白大小为32.6KD，与预期相符。

实施例4.基因工程菌株酶催化合成N-乙酰-D-神经氨酸

每100ml诱导培养的LS2402菌液，离心收集后，以0.1M Tris.Cl,pH8.0洗涤后，以同样缓冲液悬浮，加入1.8g N-乙酰-D-甘露糖胺，1.32g丙酮酸钠和10mM MgCl₂，终反应体积为10ml。在37°C条件下反应48小时后，13200rpm离心收集上清，以Agilent公司的1100高效液相仪和Bio-Rad公司的Aminex-87H酸性糖基柱进行高效液相分析，条件为流动相：5mMH₂SO₄，流速：0.5ml/min，柱温箱：60°C，紫外检测波长：210nM。结果见图三。经与N-乙酰-D-神经氨酸标准品相比较，以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物进行计算，基因工程菌株LS2402的摩尔转化率为36.3%，换算为N-乙酰-D-神经氨酸的产量为87.4g/L，这预示着本表达体系有着极大的成为工业生产菌株的潜力。

Claims

1.一种大肠杆菌表达菌株，是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，它的保藏编号是CGMCCNo.7483。

2.一种基于基因组的酶催化合成N-乙酰-D-神经氨酸的方法，其特征在于：权利要求1所述大肠埃希氏菌CGMCC No.7483在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之下表达异构酶BT0453和醛缩酶NanA，以全细胞为催化剂，N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸钠底物，催化合成N-乙酰-D-神经氨酸。