CN103060358A - 产n-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法，包括如下步骤：将与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因导入宿主菌得到产N-乙酰神经氨酸的重组菌；所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因为N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因。利用本发明所构建的产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌生产N-乙酰神经氨酸，具有以下优点：所用原料相对低廉，易于工业化大规模生产，因而将在今后N-乙酰神经氨酸的生产中占据了重要的地位。

Description

产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac）是唾液酸家族中最有代表性的成员，由9个碳原子组成的吡喃糖，具有广泛的生物学功能，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，具有广泛的应用前景和较高的市场价值，特别是在流感（包括禽流感H5N1和2009年的H1N1）的预防和治疗方面有良好的效果。

目前，N-乙酰神经氨酸的来源有限，工业化生产研究较少，传统的生产方法导致其价格昂贵，大大限制了相关的研发和应用。N-乙酰神经氨酸可从天然物质（比如燕窝、牛奶或者禽蛋）中提取，但由于含量低，分离纯化工艺复杂，N-乙酰神经氨酸产量低、纯度也极低，因此难以用于大工业化生产。由于N-乙酰神经氨酸及其衍生物结构复杂，化学合成法合成N-乙酰神经氨酸需要繁多的保护和去保护步骤，反应条件苛刻，需要铟等贵重金属作为催化剂，并形成大量的中间产物，分离过程复杂困难，造成N-乙酰神经氨酸价格昂贵。自1957年Barry和Goebel首先在大肠杆菌K-235中发现聚唾液酸后，人们陆续在脑膜炎奈瑟菌、沙门氏菌中发现聚唾液酸，聚唾液酸是N-乙酰神经氨酸的同聚物，经酸水解或者酶水解后，分离纯化可得N-乙酰神经氨酸，微生物发酵产聚唾液酸，容易实现规模化，在唾液酸生产中占据了重要的地位，但存在酸水解对环境不友好、酶解成本较高的问题。N-乙酰神经氨酸可通过酶法合成，N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（Neu5Ac lyase or Neu5Acaldolase,NanA，EC4.1.3.3）作用下生成N-乙酰神经氨酸。但是ManNAc的价格昂贵，难以适用于工业化生产。研究发现，GlcNAc-2-异构酶（GlcNAc 2-epimerase，AGE，EC5.1.3.8）可催化GlcNAc异构化生成ManNAc。通过GlcNAc-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶两步酶法反应实现Neu5Ac的生产。GlcNAc异构化生成ManNAc的酶反应需要ATP作为激活剂，导致酶法合成成本高。近几年来，研究人员将重组表达GlcNAc 2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(或N-乙酰神经氨酸合成酶)的两种大肠杆菌细胞作为生物催化介质，生物转化GlcNAc生产Neu5Ac。这种方法不用分离纯化酶，同时由于细胞膜的保护，酶相对更稳定，辅助因子容易再生。但由于需要分别培养两种表达不同酶的菌，将菌体浓缩后进行混合，这种模式难以工业化，同时底物和产物多次进出细胞，受到细胞壁的屏障，从而影响了催化反应效率和转化率。

从以上几种合成N-乙酰神经氨酸的方法可以看出，现有生产方法产量低，成本高，难以规模化扩大，导致Neu5Ac的生产力水平低下，难以满足未来市场需求。迫切需要利用工业生物技术构建代谢工程菌，实现Neu5Ac的经济高效生产。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法。

本发明所提供的制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法，包括如下步骤：将与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因导入宿主菌得到产N-乙酰神经氨酸的重组菌；所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因为N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因。

所述宿主菌为大肠杆菌或所述大肠杆菌的基因敲除突变体；

所述基因敲除突变体为将大肠杆菌中N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因中的至少一个基因敲除后得到的。

所述N-乙酰神经氨酸转运蛋白的Genbank protein id:AAC76256.2；VERSION GI：87082231；公开日：2011.09.01；

所述N-乙酰甘露糖胺激酶的Genebank protein id:AAC76254.2；VERSION GI：87082230；公开日：2011.09.01；

所述N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶的Genebank protein id:AAC76255.1；VERSIONGI：1789617；公开日：2011.09.01。

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下1）-10）中任一所示：

1）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；

3）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

4）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；

5）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；

6）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由1）衍生的蛋白质；

7）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由2）衍生的蛋白质；

8）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由3）衍生的蛋白质；

9）将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由4）衍生的蛋白质；

10）将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由5）衍生的蛋白质。

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下a）或b）或c）或d）或e）所示：

a）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列8所示的DNA分子或与序列表中序列8所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

b）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列9所示的DNA分子或与序列表中序列9所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

c）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列10所示的DNA分子或与序列表中序列10所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

d）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列11所示的DNA分子或与序列表中序列11所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

e）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列12所示的DNA分子或与序列表中序列12所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子。

所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因是通过重组载体导入宿主菌的；

所述宿主菌为大肠杆菌K12或大肠杆菌K12ΔnanT或大肠杆菌K12ΔnanK或大肠杆菌K12ΔnanTEK；

所述大肠杆菌K12ΔnanTEK为在大肠杆菌K12中敲除了N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺6-磷酸差向异构酶编码基因得到的基因工程菌。

所述N-乙酰神经氨酸转运蛋白的Genbank protein id:AAC76256.2；VERSION GI：87082231；公开日：2011.09.01；

所述N-乙酰甘露糖胺激酶的Genebank protein id:AAC76254.2；VERSION GI：87082230；公开日：2011.09.01；

所述N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶的Genebank protein id:AAC76255.1；VERSIONGI：1789617；公开日：2011.09.01。

由所述方法制备得到的基因工程菌也属于本发明的保护范围。

所述基因工程菌在制备N-乙酰神经氨酸中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备N-乙酰神经氨酸的方法。

本发明所提供的制备N-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：发酵所述基因工程菌，得到表达N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的菌体细胞，用所述菌体细胞催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。

含有N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下1）-10）中任一所示：

1）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；

3）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

4）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；

5）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；

6）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由1）衍生的蛋白质；

7）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由2）衍生的蛋白质；

8）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由3）衍生的蛋白质；

9）将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由4）衍生的蛋白质；

10）将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由5）衍生的蛋白质。

所述重组表达载体为将所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编基因插入pBADhisB载体的多克隆位点得到的重组表达载体；

本发明所提供的产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌，可以减少底物传输障碍，提高催化效率；同时利用代谢工程(Metabolic engineering)原理，进行菌种改造，消除产生副产物的途径及N-乙酰神经氨酸降解途径，则可大大提高N-乙酰神经氨酸的累积。利用该基因工程菌生产N-乙酰神经氨酸，具有以下优点：所用原料相对低廉，易于工业化大规模生产，因而将在今后N-乙酰神经氨酸的生产中占据了重要的地位。

附图说明

图1为N-乙酰神经氨酸代谢途径。

图2为重组载体pEcNA的示意图。

图3为N-乙酰神经氨酸标准品的HPLC图谱。

图4为转化产物的HPLC图谱。

图5为产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌中AGE和nanA蛋白的电泳检测结果。

图6为大肠杆菌K12的基因组部分结构示意图。

图7为大肠杆菌工程菌K12ΔnanTEK的基因组部分结构示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

N-乙酰神经氨酸代谢途径如图1所示。

实施例1、构建产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌

一、构建协同表达N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶重组质粒

1、构建重组质粒pEcNA

以发光蓝细菌Anabaena sp.PCC7120基因组为模板，设计一对引物（P1和P2），扩增得到带有RBS及其间隔序列的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因（GlcNAc 2-异构酶的编码基因，即age基因），片段大小约1200bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与NCBI上编号为BA000019.2的age基因序列相同，age基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，该核苷酸序列所编码的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

将age基因用EcoRI和HindⅢ酶切后，回收age基因片段；将pBADhisB载体（购自invitrogen公司）也用EcoRI和HindⅢ酶切后，回收载体大片段；将回收的age基因片段与载体大片段进行连接，方法如下：将T4 DNA连接酶buffer 2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的pBADhisB DNA片段1μl和目的片段age DNA 7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒pAge。用EcoRI和HindⅢ酶切重组质粒pAge，回收1167bp的age基因片段。

以大肠杆菌（Escherichia coli）K12基因组DNA为模板，设计一对引物（P3和P4），扩增得到EcnanA基因，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与NCBI上编号为CP001637.1的nanA基因序列相同，EcnanA基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示，该核苷酸序列所编码的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。将EcnanA基因用NcoI和EcoRI酶切后，回收EcnanA基因片段；将pBADhisB载体（购自invitrogen公司）也用NcoI和EcoRI酶切后，回收载体大片段；将EcnanA基因与载体大片段进行连接，方法如下：将T4 DNA连接酶buffer 2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的pBADhisB DNA片段1μl和目的片段EcnanA DNA 7μl，加入T4DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时。得到重组质粒pEcnanA。

用NcoI和EcoRI酶切重组质粒pEcnanA，回收约900bp的EcnanA DNA片段；用NcoI和EcoRI酶切重组质粒pAge，回收约5100bp的pAge（N/E）DNA片段。将T4 DNA连接酶buffer 2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的pAge（N/E）DNA片段1μl和EcnanA DNA片断7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时。将连接产物转化DH5α（购自Takara，产品目录号为D9057A），氨卞青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切验证，结果表明age基因和NanA基因串联插入pBADhisB的多克隆位点中，即894bp的EcnanA基因插入pBADhisB载体的NcoI和EcoRI酶切位点间，1167bp的age基因插入pBADhisB载体的EcoRI和HindⅢ酶切位点间，说明重组载体构建正确，将该重组载体命名pEcNA（图2）。

引物序列如下：

P1：5’-CCGGAATTCAAGGAGATATAATGGGGAAAAACTTACAAGC-3’

P2：5’-CCCAAGCTTTTAACTCAAGGCCTCGAAT-3’

P3：5’-CGGAATTCTCACCCGCGCTCTTGCATC-3’

P4：5’-CATGCCATGGCAACGAATTTACG-3’

2、构建重组质粒pPaNA

以乳酸小球菌（Pediococcus acidilactici）基因组为模板，扩增得到PananA基因，经测序分析，结果表明扩增得到的PananA基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示，该核苷酸序列所编码的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

除将EcnanA基因替换为PananA基因外，重组质粒pPaNA的构建方法与上述重组质粒pEcNA的构建方法相同。

3、构建重组质粒pSaNA

以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因组为模板，扩增得到SananA基因，经测序分析，结果表明扩增得到的SananA基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示，该核苷酸序列所编码的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

除将EcnanA基因替换为SananA基因外，重组质粒pSaNA的构建方法与上述重组质粒pEcNA的构建方法相同。

4、构建重组质粒pSdNA

以痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）基因组为模板，扩增得到SdnanA基因。经测序分析，结果表明扩增得到的SdnanA基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示，该核苷酸序列所编码的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示。

除将EcnanA基因替换为SdnanA基因外，重组质粒pSdNA的构建方法与上述重组质粒pEcNA的构建方法相同。

5、构建重组质粒pSmNA

以苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）基因组为模板，扩增得到SmnanA基因，经测序分析，结果表明扩增得到的SmnanA基因的核苷酸序列如序列表中序列12所示，该核苷酸序列所编码的N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示。

除将EcnanA基因替换为SmnanA基因外，重组质粒pSmNA的构建方法与上述重组质粒pEcNA的构建方法相同。

二、构建敲除N-乙酰神经氨酸分解代谢途径关键基因的大肠杆菌K12ΔnanTEK

大肠杆菌K12的基因组部分结构示意图见图6所示，设计引物nanT(P1H1)和nanK(P2H2)，引物5′端有50bp的拟敲除基因的同源臂（引物序列下划线部分），3′端为扩增引物，以质粒pKD13（购自Clontech公司）为模板，扩增两侧含FRT位点的卡那霉素抗性基因。将pKD46质粒（购自Clontech公司）通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌K12（公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.），得到含有质粒pKD46的大肠杆菌K12的感受态细胞。含有质粒pKD46的大肠杆菌K12，在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。将扩增得到的卡那霉素抗性基因线性片段电转入含有质粒pKD46的大肠杆菌K12的感受态细胞，利用卡那霉素平板筛选到阳性转化体。再利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（购自Clontech公司），将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除。利用该重组系统，构建了N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因（sialic acidtransporter,nanT,Genbank protein id:AAC76256.2；VERSION GI：87082231；公开日：2011.09.01）、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因（N-acetylmannosamine kinase，nanK.Genebankprotein id:AAC76254.2；VERSION GI：87082230；公开日：2011.09.01）和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因（N-acetylmannosamine-6-P epimerase,nanE，Genebank protein id:AAC76255.1；VERSION GI：1789617；公开日：2011.09.01）缺失的大肠杆菌工程菌。通过引物对（nanA-P1和yhcH-R）扩增得到一个约1400bp的片段，经测序分析获得的大肠杆菌工程菌的基因组上没有nanT、nanE和nanK，说明nanTEK已成功敲除，其基因组部分结构示意图见图7所示。将获得的大肠杆菌工程菌命名为K12ΔnanTEK，编号TL001，即得到大肠杆菌TL001。

引物序列如下：

           5’-TTTTCATACCAAAGCGTGTGGGCATCGCCCACCGCGGGAG

nanT(P1H1)：

           ACTCACAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’

           5’-AGACGGTAATGACTGTACTTCACCCATCATCATAATTTTTC

nanK(P2H2)：

           TCCCTGGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’

nanA-P1    CCGGAATTCATGGCAACGAATTTACG

yhcH-R     CTTCACACTGACGCGCAGTG

三、构建产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌

1、构建基因工程菌TL004

将重组质粒pEcNA用氯化钙法转化大肠杆菌TL001，在氨卞青霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pEcNA/ΔTEK，再用蛋白电泳验证，结果见图5（图5中，泳道1为阳性克隆子pEcNA/ΔTEK细胞破碎上清），从图中可见，AGE（39KD）和nanA（32KD）两个蛋白都有表达，说明菌株正确，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pEcNA/TL001，菌株编号为TL004。

2、构建基因工程菌TL005

将重组质粒pPaNA用氯化钙法转化大肠杆菌TL001，在氨卞青霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pPaNA/ΔTEK，结果见图5（图5中，泳道4为阳性克隆子pPaNA/ΔTEK细胞破碎上清），从图中可见，AGE（39KD）和nanA（32KD）两个蛋白都有表达，说明菌株正确，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pPaNA/TL001，菌株编号为TL005。

3、构建基因工程菌TL006

将重组质粒pSaNA用氯化钙法转化大肠杆菌TL001，在氨卞青霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pSaNA/ΔTEK，结果见图5（图5中，泳道2为阳性克隆子pSaNA/ΔTEK细胞破碎上清），从图中可见，AGE（39KD）和nanA（32KD）两个蛋白都有表达，说明菌株正确，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pSaNA/TL001，菌株编号为TL006。

4、构建基因工程菌TL007

将重组质粒pSdNA用氯化钙法转化大肠杆菌TL001，在氨卞青霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pSdNA/ΔTEK，结果见图5（图5中，泳道5为阳性克隆子pSdNA/ΔTEK细胞破碎上清），从图中可见，AGE（39KD）和nanA（32KD）两个蛋白都有表达，说明菌株正确，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pSdNA/TL001，菌株编号为TL007。

5、构建基因工程菌TL008

将重组质粒pSmNA用氯化钙法转化大肠杆菌TL001，在氨卞青霉素平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子命名为pSmNA/ΔTEK，结果见图5（图5中，泳道3为阳性克隆子pSmNA/ΔTEK细胞破碎上清），从图中可见，AGE（39KD）和nanA（32KD）两个蛋白都有表达，说明菌株正确，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pSmNA/TL001，菌株编号为TL008。

6、构建基因工程菌TL002

将重组质粒pEcNA用氯化钙法转化大肠杆菌K12ΔnanT（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pEcNA/ΔnanT，菌株编号为TL002。

7、构建基因工程菌TL003

将重组质粒pEcNA用氯化钙法转化大肠杆菌K12ΔnanK（购自国立遗传学研究所（NIG，Japan)，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pEcNA/ΔnanK，菌株编号为TL003。

8、构建基因工程菌pEcNA/K12

将重组质粒pEcNA用氯化钙法转化大肠杆菌K12，得到产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌pEcNA/K12。

实施例2、利用产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的制备产N-乙酰神经氨酸

一、产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的诱导

自诱导培养：将产N-乙酰神经氨酸的代谢工程菌基因工程菌TL004、TL005、TL006、TL007、TL008、TL002、TL003和pEcNA/K12划线到含有质量百分比浓度为1.5％的琼脂和含50μg/mL的氨卞青霉素LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含80μg/mL氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速250rpm；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，37℃振荡培养，转速250rpm，培养时间16h。

自诱导培养基ZYM配方如下：100mLA+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E（以下均为质量百分比浓度）；

A.ZY：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25%甘油，2.5%葡萄糖，10%L-阿拉伯糖；

D.1M MgSO₄；

E.1000×微量元素：50Mm FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

二、生物转化制备N-乙酰神经氨酸

诱导后的细胞，于4℃，8000转/分钟，离心5～15min，用质量百分浓度为0.85%氯化钠水溶液洗涤2次后以相同的离心条件收集菌体。重悬于适当体积的转化底物液（30mM PKB缓冲液；0.2~1.0M N-乙酰葡萄糖胺；0.4~1.4M丙酮酸；0.1～1％Triton X-100（体积百分比浓度）中，30℃，200转/分钟，pH7，转化16h，得到转化液。

将得到的转化液于4℃，12000转/分钟，离心5min，取上清，用0.22μm的滤膜过滤后，用HPLC检测N-乙酰神经氨酸的产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪（配四元泵、DAD检测器和工作站）。色谱条件：Aminex HPX-87H column(300×7.8mm)；流动相：6mMH₂SO₄，流速：0.55ml min^-1，柱温65°C；进样量10μL，检测波长210nm。N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）标准品购自sigma公司。实验设三次重复，结果取平均值。

结果：N-乙酰神经氨酸标准品的HPLC图谱如图3所示，从图中可见，N-乙酰神经氨酸标准品的保留时间为8.5。转化产物的HPLC图谱如图4所示，从图中可见，保留时间为8.5处为N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）的峰；9.9min处为pyruvate的峰；11.7min处为ManNAc的峰；12.4min处为GlcNAc的峰。

N-乙酰神经氨酸的产量如下：基因工程菌TL004为200mM、基因工程菌TL005为32.6mM、基因工程菌TL006为200mM、基因工程菌TL007为194.8mM、基因工程菌为TL008为7.2mM、基因工程菌TL002为123.9mM、基因工程菌TL003为118.9mM和基因工程菌pEcNA/K12为118.3mM。N-乙酰神经氨酸产量最高达到200mM（61.9gl^-1)，生产强度3.9gl^-1h^-1，从N-乙酰葡萄糖胺计算的转化率为50%。

从以上结果可见，转化同一重组质粒pEcNA的基因工程菌TL004、基因工程菌TL002、基因工程菌TL003和基因工程菌pEcNA/K12中，基因工程菌TL004的N-乙酰神经氨酸的产量最高，此结果说明DEnanTEK有效阻断了N-乙酰神经氨酸的分解途径，有利于N-乙酰神经氨酸的生产。

Claims (10)

1.一种制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法，包括如下步骤：将与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因导入宿主菌得到产N-乙酰神经氨酸的重组菌；所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因为N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述宿主菌为大肠杆菌或所述大肠杆菌的基因敲除突变体；

所述基因敲除突变体为将大肠杆菌中N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因中的至少一个基因敲除后得到的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下1）-10）中任一所示：

1）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；

3）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

4）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；

5）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；

6）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由1）衍生的蛋白质；

7）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由2）衍生的蛋白质；

8）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由3）衍生的蛋白质；

9）将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由4）衍生的蛋白质；

10）将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由5）衍生的蛋白质。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下a）或b）或c）或d）或e）所示：

a）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列8所示的DNA分子或与序列表中序列8所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

b）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列9所示的DNA分子或与序列表中序列9所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

c）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列10所示的DNA分子或与序列表中序列10所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

d）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列11所示的DNA分子或与序列表中序列11所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

e）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列12所示的DNA分子或与序列表中序列12所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因是通过权利要求9或10所述的重组载体导入宿主菌的；

所述宿主菌为大肠杆菌K12或大肠杆菌K12ΔnanT或大肠杆菌K12ΔnanK或大肠杆菌K12ΔnanTEK；

所述大肠杆菌K12ΔnanTEK为在大肠杆菌K12中敲除了N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因得到的基因工程菌。

6.由权利要求1-5中任一所述的方法制备得到的基因工程菌。

7.权利要求6所述的基因工程菌在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。

8.一种制备N-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：

发酵权利要求6所述的基因工程菌，得到表达N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的菌体细胞，用所述菌体细胞催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。

9.含有N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因的重组表达载体；

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下1）-10）中任一所示：

1）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；

3）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

4）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；

5）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；

6）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由1）衍生的蛋白质；

7）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由2）衍生的蛋白质；

8）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由3）衍生的蛋白质；

9）将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由4）衍生的蛋白质；

10）将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由5）衍生的蛋白质。

10.根据权利要求9所述的重组表达载体，其特征在于：

所述重组表达载体为将所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因插入pBADhisB载体的多克隆位点得到的重组表达载体。

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