CN101906449B - 芽孢表面展示系统用于n-乙酰神经氨酸生产的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法，该方法利用高拷贝穿梭载体，与芽孢外衣蛋白基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因重组后，构建表面展示表达载体，并转化入枯草芽孢杆菌得到重组菌株，该重组菌株的芽孢可催化N-乙酰神经氨酸的合成。与本领域其它方法相比，本发明可一步完成酶的表达、纯化和固定化，操作过程简捷高效。此外，利用枯草芽孢杆菌芽孢稳定易于分离和抗逆性的特点，简便了后续分离过程，提高了N-乙酰神经氨酸醛缩酶的稳定性并增加了整个催化过程的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种N-乙酰神经氨酸生产的方法，尤其涉及芽孢表面展示系统展示N-乙酰神经氨酸醛缩酶用于N-乙酰神经氨酸生产的方法。
背景技术
芽孢表面展示技术作为微生物表面展示的一种，因所表达的异源蛋白无需经过跨膜过程及芽孢的抗逆性等独特优势而备受研究者的关注。2001年，Pozzi以芽孢外衣蛋白CotB为锚定蛋白建立了第一个芽孢表面展示系统，此后芽孢表面展示技术进入了快速发展阶段，不仅在疫苗生产方面得到了广泛应用，在生物催化领域也开始崭露头角【Isticato et al，2001；Kim et al，2005；Kwon et al，2007】。由于芽孢的特殊形成机制，使得以芽孢作为载体进行表面展示时，可一步实现异源蛋白的表达、纯化和固定化，只需进行菌体的培养即可得到固定化的蛋白，不仅解决了过程繁琐的问题还解决了传质阻力的问题。同时，芽孢形成的过程无需添加任何化学物质进行诱导，保证了过程的安全性。
唾液酸(Sialic acid)是神经氨酸及其衍生物的总称，是一类含有羧基的九碳氨基糖类物质，其直接参与多种生理活动，与其衍生物在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的作用，与人类的健康息息相关，具有广泛的应用前景【Traveling，1998；Schauer，2000】。而N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac)是分布最广的一类唾液酸，其本身及其类似物有重要的药用前景。其中N-乙酰神经氨酸的结构类似物——扎纳米韦(Zanamivir)是1995年被批准用于临床的抗流感病毒药物【Dreitlein et al.，2001】。
目前N-乙酰神经氨酸的生产方法有多种，主要有生物提取、化学合成、发酵法和酶催化法。从禽蛋中的蛋黄膜和脐带中或牛乳乳清和酪蛋白可提取N-乙酰神经氨酸，由于含量较低，成分多样，分离和提纯过程比较复杂，收率较低，因此难以实施工业化【Masskarn 1993】；化学法合成N-乙酰神经氨酸至少经过十几步反应，需要大量的保护和去保护过程，形成了大量的中间产物，给N-乙酰神经氨酸的后续分离过程造成了很大困难，同时由于化学法的专一性较差，形成较多异构体，导致N-乙酰神经氨酸的手性纯度较低；某些大肠杆菌菌株在生长过程中能自身合成N-乙酰神经氨酸的同聚合体——多聚唾液酸，经酸或酶水解后即可得到N-乙酰神经氨酸【Mamoru K.，1993】，但产量较低，达不到工业化需要的水平；酶催化方法具有高效性和专一性，步骤简单，易于操作，产物单一，纯度高，适合精细化合物和药物前体的大规模生产。
酶法催化主要包括游离酶催化和全细胞催化，而其中主要用到的酶为N-乙酰神经氨酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)。以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，N-乙酰神经氨酸醛缩酶(EC 4.1.3.3)的逆反应被应用于酶催化合成N-乙酰神经氨酸。目前，使用游离酶催化合成N-乙酰神经氨酸的最高转化率为94.61％，N-乙酰神经氨酸浓度为49.52g/L【Hu etal，2010】。该转化过程所使用的催化剂为固定化的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，使用固定化酶可重复5次催化N-乙酰神经氨酸的合成。然而制备固定化酶的过程过于繁琐，要经过酶的表达、纯化和固定化三个步骤才可得到最终的生物催化剂，并且在制备过程中游离酶活力还存在不同程度的损失。为解决游离酶的这种缺陷，研究者们开始使用全细胞作为生物催化过程中的催化剂。
首次报道的使用全细胞进行N-乙酰神经氨酸合成，是利用异源表达来源于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803的slr1975基因(该基因表达的酶具有GlcNAc异构酶功能)和来源于Escherichia coli K-1的N-乙酰神经氨酸合成酶基因的重组大肠杆菌细胞为催化剂，利用谷氨酸棒杆菌合成辅因子和底物磷酸烯醇式丙酮酸，在葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺存在的条件下，使用三种完整细胞转化生产N-乙酰神经氨酸，但转化率仅达到5％【Tabata，2002】。
2007年Lee等利用来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K12的N-乙酰神经氨酸醛缩酶和来源于Anabaena sp.CH1的N-乙酰葡萄糖胺异构酶分别利用商品化的pET载体系统在大肠杆菌中分别进行表达，以两种混合细胞为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸为底物，催化合成N-乙酰神经氨酸。由于该催化过程中使用的异构酶与前面报道的酶学性质相比，ATP需求量低，酶活性高，才使得最高转化率达到33.3％，接近之前报道的酶催化效率【Lee et al，2007】。
中国发明专利(ZL2004100242223)报道了利用施氏假单胞菌SDM完整细胞与表达有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET15b-nanA为催化剂，以乳酸钠和化学异构得到的N-乙酰甘露糖胺为底物，合成N-乙酰神经氨酸的生产工艺，但是该方法需要两种细胞的参与。
全细胞催化虽然可避免酶的纯化，但是其仍存在传质阻力的问题。细胞表面的细胞膜作为一层天然的屏障，阻碍了底物的进入和产物的释放，降低了产物的转化率；同时处于休止状态的细胞仍具有催化某些酶促反应的能力，从而造成了催化过程中副产物的产生【Chen，2007；Ishige et al，2005】。
芽孢表面展示作为一种新型的技术可有效解决游离酶和全细胞催化过程中的限制。经检索，目前未见芽孢表面展示N-乙酰神经氨酸醛缩酶用于N-乙酰神经氨酸生产的研究或相关报道。
参考文献：
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Tabata K，Koizumi S，Endo T，and Ozaki A.【2002】Enzyme.Microb.Technol.
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Lee Y C，Chien H C，Hsu W H.【2007】J.Biotechnol.129：453-460.
Chen R R.【2007】Appl.Microbiol.Biotechnol.74：730-738.
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Hu S Y，Chen J，Yang Z Y，Shao L J，Bai H，Luo J L，Jiang W H，Yang Y L.【2010】
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发明内容
针对上述现有催化合成N-乙酰神经氨酸方法中，化学法过多的保护和去保护过程，游离酶不易规模化制备并且在制备过程中会引入有毒物质的缺陷以及全细胞催化转化率较低，难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一个芽孢表面展示系统，即一个含有表面展示载体的芽孢表面展示系统，及其用于N-乙酰神经氨酸生产的方法。
本发明所述芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法，步骤包括高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPGD的构建，高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacilluus subtilis)WB600的构建，以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600制备孢子悬液作为转化反应的芽孢催化剂，利用所述芽孢催化剂生产N-乙酰神经氨酸；其特征在于：
所述高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPGD构建的出发载体是来源于大肠杆菌的质粒pHP13和来源于枯草芽孢杆菌168的质粒pGDV1，其得到的高拷贝穿梭载体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.7所示；该载体在大肠杆菌中使用pUC复制子表现为高拷贝载体，每个细胞中为300拷贝左右，在枯草芽孢杆菌中使用pGDV1复制子也表现为高拷贝载体，每个细胞中为150～200拷贝；含有氯霉素和红霉素两个抗性，全长4619bp。
所述高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600的构建是以构建好的高拷贝穿梭载体pHPGD为出发载体，在多克隆位点按顺序插入芽孢外衣蛋白CotG基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD-cotG-nanA，或在多克隆位点顺序插入芽孢外衣蛋白cotB基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD-cotB-nanA，或在多克隆位点顺序插入芽孢外衣蛋白cotC基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD-cotC-nanA，然后分别电转化来源于枯草芽孢杆菌168的、有六个蛋白酶trpC2ΔnprE ΔaprEΔeprΔbpfΔmprΔnprB缺失的枯草芽孢杆菌感受态的菌株WB600，经筛选获得重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)、重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotB-nanA)、重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotC-nanA)；其中所述芽孢外衣蛋白CotB、CotC、CotG基因选来源于枯草芽孢杆菌168；N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因选来源于猪、鼠或大肠杆菌的N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因；进一步的，所述芽孢外衣蛋白CotG基因优选来源于枯草芽孢杆菌168的CotG基因，N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA优选来源于大肠杆菌K12 ATCC 25404的N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因。
上述芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌的基因型为trpC2ΔnprEΔaprE Δepr ΔbpfΔmprΔnprB，其含有芽孢表面展示载体pHPGD-cotB-nanA或pHPGD-cotC-nanA或pHPGD-cotG-nanA。
上述电转化之前枯草芽孢杆菌感受态的菌株WB600的诱导过程为：枯草芽孢杆菌WB600在37℃培养诱导1～3小时，待OD620nm吸光值为0.3～1.0时，收集菌体制备电转化感受态细胞；将上述构建的芽孢表面展示载体转化进入制备的感受态细胞中即可得到本发明所述的芽孢表面展示重组菌株-芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌。其中含有芽孢表面展示载体的重组菌株诱导孢子产生的过程为：重组菌株WB600培养温度为16～45℃，可在含有红霉素和氯霉素的LB和GYS培养基中生长，培养10～48小时，得到重组枯草芽孢杆菌。
上述制备缺失蛋白酶的电转化感受态细胞时，诱导前菌株培养时间优选1.5～2小时。
上述的LB培养基配方为：每升中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，调节pH值为7.5，121℃湿热灭菌20分钟。GYS培养基的配方为：每升中加入1g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，0.1g柠檬酸三钠，2g酵母粉，3.3g K2HPO4，3.33ml 1M MgSO4，1.44ml 1M CaCl2，59μl 1M MnSO4·H2O，115℃湿热灭菌20分钟。
上述芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600的培养温度优选30～42℃。
上述芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600的培养时间优选为22～26小时。
本发明所述以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600制备孢子悬液作为转化反应的芽孢催化剂的方法为：以体积比1％-2％的量将重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600重悬于pH＝8.0、10mM Tris-HCl溶液中，并按0.1～1.5g/L的量添加溶菌酶，37℃作用0.1～5小时，然后用均含有1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)的1M NaCl、1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤1-2遍，而后菌体重悬于pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂。
上述进一步优选的实施方式是：以体积比1％的量将重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600重悬于pH＝8.0、10mM Tris-HCl溶液中，并按0.5g/L的量添加溶菌酶，37℃作用1～2小时，然后用均含有1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)的1M NaCl、1MKCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤1遍，而后菌体重悬于pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂。
本发明所述利用芽孢催化剂生产N-乙酰神经氨酸的条件是：反应体系中催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活为0.1～1.5U，N-乙酰甘露糖胺浓度为50～500mM，丙酮酸浓度为200～1500mM，磷酸缓冲液浓度40～80mM，反应pH值为7～7.8，反应温度为25～70℃，反应时间为6～40小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为30～70％。
上述进一步优选的实施方式是：反应体系中催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活为0.3～0.7U，N-乙酰甘露糖胺浓度为500mM，丙酮酸浓度为600～1000mM，磷酸缓冲液浓度50～60mM，反应pH值为7.4～7.6，反应温度为50～60℃，反应时间为6～20小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为50～60％。
本发明所述芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)作为催化剂在酶法制备N-乙酰神经氨酸中的应用。
进一步的，本发明所述芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)作为催化剂用于N-乙酰神经氨酸生产的具体方法是：
(1)在无菌条件下将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)接种到含有0.1～1.5g/L氯霉素的LB中，置25～40℃下，振荡培养8～30小时，得到种子细胞。
(2)用(1)中的种子细胞，无菌条件下以体积比0.5％～10％的接种量接种于GYS产孢培养基，于25～40℃培养10～48小时。
(3)将上述培养物以10,000转/分钟离心10分钟，并用PBS缓冲液清洗两遍，得到重组枯草芽孢杆菌芽孢。
(4)将(3)中得到的芽孢菌液按照体积比5％～20％的加量添加10mM Tris-HCl(pH＝8.0，含0.25M EDTA)，按质量比0.1～1.5g/L加量添加溶菌酶，37℃作用0.1～5小时。
(5)将(4)中得到的菌液用均含有1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)的1M NaCl、1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤1遍，而后菌体重悬于pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂；进行N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活力测定并置于4℃保存。
(6)应用(4)所述催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反应条件是：反应体系中催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活为0.1～1.5U，N-乙酰甘露糖胺浓度为50～500mM，丙酮酸浓度为200～1500mM，磷酸缓冲液浓度40～80mM，反应pH值为7～7.8，反应温度为25～70℃，反应时间为6～40小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为30～70％。
(7)将(6)的转化液以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的催化剂，利用高效液相色谱(HPLC)法测定上清液中N-乙酰神经氨酸的含量。
其中，步骤(1)中使用的LB培养基配方为：每升中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，调节pH值为7.5，121℃湿热灭菌20分钟。
其中，步骤(1)中所述的种子细胞培养和制备催化剂细胞的优选温度是35～38℃；红霉素的浓度优选为0.3～0.8g/L，种子细胞培养时间优选是20～26小时。
其中，步骤(2)中所述的制备催化剂细胞中，优选种子细胞接种量为3％～7％，培养温度35～38℃，培养时间优选20～26小时。
其中，步骤(2)中使用的GYS培养基配方为：每升中加入1g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，0.1g柠檬酸三钠，2g酵母粉，3.3g K2HPO4，3.33ml 1M MgSO4，1.44ml 1M CaCl2，59μl 1M MnSO4·H2O，115℃湿热灭菌20分钟。
其中，步骤(4)中所述的10mM Tris-HCl(pH＝8.0，含0.25M EDTA)的添加量优选为12％～14％，溶菌酶的优选添加量为0.3～0.7g/L。
其中，步骤(5)中所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活测量反应体系为：20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)350μl，100μl N-乙酰神经氨酸(5mg/ml)，50μl酶液。酶活测量反应条件为：37℃反应10min，加0.5ml 2，4二硝基苯肼(DNP)，20min后加5mlNaOH(0.4M)显色。于520nm比色。丙酮酸标准曲线：配制10mM的丙酮酸钠溶液25ml，分别稀释为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM六种不同浓度。将测酶活反应体系中的50μl酶液换成50μl不同浓度的丙酮酸钠溶液。反应条件与测酶活条件相同。酶活定义为每分钟分解N-乙酰神经氨酸生成1μmol丙酮酸所需酶量为一个酶活单位。
其中，步骤(7)中涉及的采用HPLC分析的方法及条件为：样品沸水浴10分钟后，12,000转/每分钟，离心20分钟，取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22μm滤膜过滤，滤过液进行HPLC检测。采用BioRad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)色谱柱对样品进行分析方法及条件为：柱温为55℃，以10mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4ml/min，在Agilent 1100高效液相色谱仪上运行，进样量5μl，检测器为示差折光检测器(RID)。
本发明所述的芽孢表面展示系统含有安全无毒、操作方便的自诱导启动子，通过菌体的生长即可同时实现催化所用酶N-乙酰神经氨酸醛缩酶的表达和固定化，从而可方便、快捷、高效的得到固定化的催化剂。使用该芽孢表面展示系统可一步完成酶的表达、纯化和固定化，所展示的酶仍可具有较高的生物活性，并且芽孢易于分离，简便了后续分离过程，因此芽孢表面展示在生物催化领域生产高附加化合物方面起着重要的作用。
应用本发明所述芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)在规模化催化生产N-乙酰神经氨酸过程中具有催化剂制备安全简捷高效，催化过程操作简单，价格便宜，效率较高，易于提取等特点，具体为：
(1)本发明首次使用高拷贝穿梭载体构建了高效芽孢表面展示系统，表面展示效率大大提高。
(2)本发明首次构建了N-乙酰神经氨酸醛缩酶芽孢表面展示系统。使用该表面展示系统可一步实现酶的表达、纯化和固定化，并且无需任何诱导剂，不需外加其它物质，过程更为安全，操作更为方便。并且仅需要一次菌体培养即可得到固定化的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。
(3)本发明中使用芽孢外衣蛋白CotG自有启动子作为重组载体的启动子，其具有严格的时序性，保证了芽孢的形成与蛋白的表达同时进行，提高了蛋白展示效率和有效定位效率。
(4)本发明中所涉及的融合蛋白CotG-NanA之间，有一个由5个氨基酸构成的linker，其降低了异源蛋白在表面展示中的空间位阻，增加了表面展示的折叠效率。
(5)本发明中所使用的宿主菌为具有六个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌WB600。使用该菌株不仅增加了蛋白的表面展示效率，同时还提高了该系统的安全性。由于枯草芽孢杆菌是公认的益生菌，因此其安全性更高，更可靠。
(6)本发明中首次以芽孢作为N-乙酰神经氨酸醛缩酶固定化载体。芽孢具有稳定、易于分离的特点，在后处理过程中易于分离。
具体实施方式
实施例1：高拷贝穿梭载体pHPGD的构建
1、pGDV1复制子的克隆
采用常规的方法提取枯草芽孢杆菌168的质粒pGDV1，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌质粒的小量制备的方法。使用所合成的引物从提取的质粒pGDV1中PCR扩增得到高拷贝复制子基因。
其中，pGDV1购自德国枯草基因保存中心(Bacillus Genetic Stock Center，BGSC)，查询号为1E60；上述枯草芽孢杆菌作为复制子基因的来源菌，根据pGDV1已知序列，设计引物：上游引物pGDV1F：5’-ATCGGTCTCACGCCCGAGACCATGTATAAAAACAATCATG-3’，携带有一个BasI酶切位点；下游引物pGDV1R：5’-CCAAGGTCCCTTACTTCCAAAATCTAAA-3’，携带有一个EcoO109I酶切位点。
2、构建穿梭载体pHPGD
将PCR扩增所得到的pGDV1复制子片段经BasI和EcoO109I酶切回收后，连接至经相同酶切处理后回收的质粒pHP13。将连接液转化大肠杆菌感受态细胞，涂布带有氯霉素抗性的LB平板。得到的转化子进行质粒提取、酶切及序列测定验证，保存正确转化子，得到穿梭载体pHPGD。
其中上述大肠杆菌感受态细胞的制备方法可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中大肠杆菌感受态制备方法。
其中上述质粒pHP13购自德国枯草基因保存中心(Bacillus Genetic Stock Center，BGSC)，查询号为ECE32。
其中上述的LB平板配方为每升中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，15g琼脂粉，40mg氯霉素，调节pH值为7.5，121℃湿热灭菌20分钟。
实施例2：高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)的构建
1、芽孢外衣蛋白CotG基因(cotG)克隆
采用常规的方法制备枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法。使用合成的引物cotGF和cotGR从枯草芽孢杆菌168的基因组DNA中PCR扩增得到cotG基因。
其中，上述枯草芽孢杆菌168购自德国枯草基因保存中心(Bacillus Genetic StockCenter，BGSC)，查询号为1A1。
根据已报道的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的基因组序列和已报道的cotG基因的序列，设计引物。
上游引物cotGF：
5’-GCCTTTGAATTCAGTGTCCCTAGCTCCGAGA-3’，携带一个EcoRI酶切位点；
下游引物cotGR：
5’-CTATTGACTAGTTGAACCCCCACCTCCTTTGTATTTCTTTTTGACTACC-3’，携带一个SpeI酶切位点。其中在下游引物序列中插入了一段编码柔性连接手臂(linker)的基因，该手臂由5个氨基酸Gly-Gly-Gly-Gly-Ser构成，起着连接异源蛋白的作用。
2、N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因(nanA)克隆
采用常规的方法制备菌株大肠杆菌K12ATCC 25404(购自American Type CultureCollection，美国标准菌库)的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法；使用合成的引物nanAF和nanAR从大肠杆菌K12的基因组DNA中PCR扩增得到N-乙酰神经氨酸酶基因nanA。
其中，根据已测序的大肠杆菌K12ATCC 25404的基因组序列及已报道的nanA的序列信息，设计引物：
上游引物nanAF：5’-GAGACTAGTATGGCAACGAATTTACG-3’，携带一个SpeI酶切位点；下游引物nanAR：5’-CTCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT-3’，携带一个PstI酶切位点。
3、融合基因cotG-nanA的构建
(1)将PCR扩增得到的cotG基因，经限制性内切酶EcoRI和SpeI处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pEASY-T3相连，使用T4DNA连接酶16℃连接过夜。
(2)将(1)中的连接液转化大肠杆菌Mach T1的感受态细胞，涂布带有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。
(3)挑取(2)中平板上所生长的转化子单菌落至LB培养基中培养，然后提取质粒，利用EcoRI和SpeI双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性。最后保存正确转化子，得到载体pEASY-cotG。
(4)将PCR扩增得到的nanA基因，经限制性内切酶SpeI和PstI处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pEASY-cotG相连，使用T4DNA连接酶16℃连接过夜。
(5)将(4)中的连接液转化大肠杆菌感受态细胞Mach T1，涂布带有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。
(6)挑取(5)中平板上所生长的转化子单菌落至LB培养基中培养，然后提取质粒，利用SpeI和PstI双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性。最后保存正确转化子，得到含有融合基因cotG-nanA的载体pEASY-cotG-nanA。
其中，上述大肠杆菌Mach T1的感受态制备过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中大肠杆菌感受态CaCl2制备方法。
其中上述的LB平板配方为每升中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，15g琼脂粉，100mg氨苄青霉素，调节pH值为7.5，121℃湿热灭菌20分钟。
4、高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)的构建
(1)将获得的载体pEASY-cotG-nanA经限制性内切酶EcoRI和PstI处理回收后得到融合基因cotG-nanA，然后与经相同限制性内切酶处理的高拷贝穿梭载体pHPGD，使用T4DNA连接酶16℃连接过夜。
(2)将(1)中的连接液转化大肠杆菌感受态细胞Mach T1，涂布带有氯霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。
(3)挑取(2)中平板上所生长的转化子单菌落至LB培养基中培养，然后提取质粒，利用EcoRI和PstI双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性。最后保存正确转化子，得到表面展示载体pHPGD-cotG-nanA。
(4)从平板中挑取培养的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600的单菌落，接入LB培养基中，培养10～14小时。将所得培养物以6.25％接种量，转接至含有0.5M山梨醇的LB培养中，37℃培养至OD600nm为0.85～0.95。然后将上述培养菌液置于冰水混合物中10分钟，4℃下5000×g离心5分钟，收集菌体。用预冷的电转化培养基重悬上述菌体，4℃下5000×g离心5分钟，弃去上清，如此漂洗上述菌体4次。最终将菌体重悬到原始培养物体积的1/100的电转化培养基中，得到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600的感受态细胞。
(5)将1ul表面展示载体pHPGD-cotG-nanA与(4)中所制备的80ul枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600感受态细胞加入冰预冷的电转化杯中，冰上放置1～1.5分钟。然后在电容25uF、电阻200Ω、电压2500V条件下进行电击。电击完毕后取出电转化杯并立即加入1ml恢复培养基，37℃培养2.5～3.5小时。然后涂布带有氯霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。
(6)挑取(5)中平板上的转化子至LB培养基中培养，然后通过菌落PCR验证转化子的正确性。上述菌落PCR以各转化子菌液为模板，以cotGF和nanAR为引物，扩增融合基因cotG-nanA，验证转化子的正确性。最后保存正确转化子，得到高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)。
其中，上述用于制备枯草芽孢杆菌感受态的菌株WB600来源于枯草芽孢杆菌168，含有六个蛋白酶trpC2ΔnprEΔaprEΔeprΔbpfΔmprΔnprB的缺失。
其中上述的LB平板配方为每升蒸馏水中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，15g琼脂粉，40mg氯霉素，调节pH值为7.5，121℃湿热灭菌20分钟。
其中，(4)所述的电转化培养基配方为每升超纯水中加入91g山梨醇，91g甘露醇，100g甘油，115℃湿热灭菌20分钟。
其中，(5)所述的恢复培养基配方为每升蒸馏水中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，69.2g甘露醇，调节pH值为7.5，115℃湿热灭菌20分钟。
实施例3：芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法
(1)平板培养：将上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂并含40μg/ml的氯霉素LB平板上，37℃培养12小时。
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5ml的含40μg/ml氯霉素的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12小时。
(3)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为5％的接种量，接种到1L含有40μg/ml的氯霉素的GYS培养基中，37℃摇床振荡培养24小时。
其中，上述(2)中的LB培养基的配方为：每升蒸馏水中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，调节pH为7.0；115℃灭菌20分钟。
其中，上述(3)中的GYS培养基的配方为：每升蒸馏水中加入1g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，0.1g柠檬酸三钠，2g酵母粉，3.3g K2HPO4，3.33ml 1M MgSO4，1.44ml 1M CaCl2，59μl 1M MnSO4·H2O，115℃湿热灭菌20分钟。
(4)收集菌体：将步骤(3)培养得到的培养物4℃条件下，5,000转/分钟离心10分钟，收集菌体，弃去上清，并用无菌蒸馏水洗涤菌体一遍。
(5)孢子悬液即芽孢催化剂的制备：将步骤(4)中所得的菌体按照体积比1％重悬入10mM Tris-HCl(pH＝8.0，含0.25M EDTA)，并按照质量体积比0.05％添加溶菌酶，37℃下在水浴摇床保温1小时。经溶菌酶处理后的培养物用1M NaCl，1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤一遍，最后重悬入原始培养物体积的1/50的1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂。
检测得N-乙酰神经氨酸醛缩酶的酶活力为0.9U/ml，将所得重组芽孢置于4℃的冰箱中冷藏，待用。
其中，上述所用的1M NaCl，1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中都含有1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
其中，上述溶菌酶购自美国Sigma公司，酶活力为40,000U。
其中，上述N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性测定方法如下：
酶活测量反应体系：20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)350μl，100μl N-乙酰神经氨酸(5mg/ml)，50μl酶液。酶活测量反应条件为37℃反应10分钟，加0.5ml DNP溶液显色20分钟后，加NaOH(0.4M)5ml显色。于520nm比色。
(6)利用上述重组芽孢作为催化剂生产N-乙酰神经氨酸：将步骤(5)中得到的生物催化剂即重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)的N-乙酰神经氨酸醛缩酶总活性调节约至0.1U。在25℃，pH 7.4条件下，丙酮酸浓度为1,000mM，N-乙酰甘露糖胺浓度为500mM，在往复式摇床振荡反应30小时，得到含N-乙酰神经氨酸转化液。
(7)将转化液以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，利用高效液相色谱(HPLC)法测定上清液中N-乙酰神经氨酸的含量为50.22g/L.
上述HPLC检测反应体系方法为：样品处理方法如下。样品沸水浴10分钟后，12,000转/分钟，离心20分钟。取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22μm滤膜过滤，滤过液进行HPLC检测。使用BioRad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)色谱柱对样品进行分析。柱温为55℃，以10mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4ml/分钟，在Agilent1100高效液相色谱仪上运行，进样量5μl，检测器为示差折光检测器(RID)。
实施例4：芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法
(1)平板培养：将上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂并含40μg/ml的氯霉素LB平板上，37℃培养12小时。
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5ml的含40μg/ml氯霉素的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12小时。
(3)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为5％的接种量，接种到1L含有40μg/ml的氯霉素的GYS培养基中，37℃摇床振荡培养24小时。
其中，上述(2)中的LB培养基的配方为：每升蒸馏水中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，调节pH为7.0；115℃灭菌20分钟。
其中，上述(3)中的GYS培养基的配方为：每升蒸馏水中加入1g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，0.1g柠檬酸三钠，2g酵母粉，3.3g K2HPO4，3.33ml 1M MgSO4，1.44ml 1M CaCl2，59μl 1M MnSO4·H2O，115℃湿热灭菌20分钟。
(4)收集菌体：将步骤(3)培养得到的培养物4℃条件下，5,000转/分钟离心10分钟，收集菌体，弃去上清，并用无菌蒸馏水洗涤菌体一遍。
(5)孢子悬液的制备：将步骤(4)中所得的菌体按照体积比1％重悬入10mM Tris-HCl(pH＝8.0，含0.25M EDTA)，并按照质量体积比0.05％添加溶菌酶，37℃下在水浴摇床保温1小时。经溶菌酶处理后的培养物用1M NaCl，1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤一遍，最后重悬入原始培养物体积的1/50的1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢悬液，即芽孢催化剂。
测得N-乙酰神经氨酸醛缩酶的酶活力为0.9U/ml，将所得重组芽孢置于4℃的冰箱中冷藏，待用。
其中，上述所用的1M NaCl，1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中都含有1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
其中，上述溶菌酶购自美国Sigma公司，酶活力为40000U。
其中，上述N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性测定方法为如下。酶活测量反应体系：20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)350μl,100μl N-乙酰神经氨酸(5mg/ml)，50μl酶液。酶活测量反应条件为37℃反应10分钟，加0.5ml DNP溶液显色20分钟后，加NaOH(0.4M)5ml显色。于520nm比色。
(6)利用上述重组芽孢作为催化剂生产N-乙酰神经氨酸：将步骤(5)中得到的生物催化剂即重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)的芽孢醛缩酶总活性调节约至0.7U。在70℃，pH 7.4条件下，丙酮酸浓度为1200mM，N-乙酰甘露糖胺浓度为100mM，在往复式摇床振荡反应18小时，得到含N-乙酰神经氨酸转化液。
(7)将转化液以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，利用高效液相色谱(HPLC)法测定上清液中N-乙酰神经氨酸的含量为23.78g/L.
上述HPLC检测反应体系方法为：样品处理方法如下。样品沸水浴10分钟后，12,000转/分钟，离心20分钟。取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22μm滤膜过滤，滤过液进行HPLC检测。使用BioRad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)色谱柱对样品进行分析。柱温为55℃，以10mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4ml/分钟，在Agilent1100高效液相色谱仪上运行，进样量5μl，检测器为示差折光检测器(RID)。
实施例5：芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法
(1)平板培养：将上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂并含40μg/ml的氯霉素LB平板上，37℃培养12小时。
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5ml的含40μg/ml氯霉素的液体培养基中，37℃摇床振荡培养12小时。
(3)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为5％的接种量，接种到1L含有40μg/ml的氯霉素的GYS培养基中，37℃摇床振荡培养24小时。
其中，上述(2)中的LB培养基的配方为：每升蒸馏水中加入5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，调节pH为7.0；115℃灭菌20分钟。
其中，上述(3)中的GYS培养基的配方为：每升蒸馏水中加入1g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，0.1g柠檬酸三钠，2g酵母粉，3.3g K2HPO4，3.33ml 1M MgSO4，1.44ml 1M CaCl2，59μl 1M MnSO4·H2O，115℃湿热灭菌20分钟。
(4)收集菌体：将步骤(3)培养得到的培养物4℃条件下，5,000转/分钟离心10分钟，收集菌体，弃去上清，并用无菌蒸馏水洗涤菌体一遍。
(5)孢子悬液的制备：将步骤(4)中所得的菌体按照体积比1％重悬入10mM Tris-HCl(pH＝8.0，含0.25M EDTA)，并按照质量体积比0.05％添加溶菌酶，37℃下在水浴摇床保温1小时。经溶菌酶处理后的培养物用1M NaCl，1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤一遍，最后重悬入原始培养物体积的1/50的1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢悬液，即芽孢催化剂。
测得N-乙酰神经氨酸醛缩酶的酶活力为0.9U/ml，将所得重组芽孢置于4℃的冰箱中冷藏，待用。
其中，上述所用的1M NaCl，1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中都含有1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
其中，上述溶菌酶购自美国Sigma公司，酶活力为40000U。
其中，上述N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性测定方法为如下。酶活测量反应体系：20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)350μl,100μl N-乙酰神经氨酸(5mg/ml)，50μl酶液。酶活测量反应条件为37℃反应10分钟，加0.5ml DNP溶液显色20分钟后，加NaOH(0.4M)5ml显色。于520nm比色。
(6)利用上述重组芽孢作为催化剂生产N-乙酰神经氨酸：将步骤(5)中得到的生物催化剂即重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pHPGD-cotG-nanA)的芽孢醛缩酶总活性调节约至0.3U。在50℃，pH 7.4条件下，丙酮酸浓度为600mM，N-乙酰甘露糖胺浓度为500mM，在往复式摇床振荡反应6小时，得到含N-乙酰神经氨酸转化液。
(7)将转化液以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，利用高效液相色谱(HPLC)法测定上清液中N-乙酰神经氨酸的含量为54.70g/L
上述HPLC检测反应体系方法为：样品处理方法如下。样品沸水浴10分钟后，12,000转/分钟，离心20分钟。取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22μm滤膜过滤，滤过液进行HPLC检测。使用BioRad Aminex HPX-87H(300×7.8mm)色谱柱对样品进行分析。柱温为55℃，以10mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4ml/分钟，在Agilent1100高效液相色谱仪上运行，进样量5μl，检测器为示差折光检测器(RID)。
Claims (3)
1.芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法，步骤包括高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPGD的构建，高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600的构建，以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600制备孢子悬液作为转化反应的芽孢催化剂，利用所述芽孢催化剂生产N-乙酰神经氨酸；其特征在于：所述高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPGD构建的出发载体是来源于大肠杆菌的质粒pHP13和来源于枯草芽孢杆菌168的质粒pGDV1，其得到的高拷贝穿梭载体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.7所示；所述高效芽孢表面展示系统枯草芽孢杆菌WB600的构建是以构建好的高拷贝穿梭载体pHPGD为出发载体，在多克隆位点按顺序插入芽孢外衣蛋白CotG基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD-cotG-nanA，或在多克隆位点顺序插入芽孢外衣蛋白cotB基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD-cotB-nanA，或在多克隆位点顺序插入芽孢外衣蛋白cotC基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因，得到芽孢表面展示载体pHPGD-cotC-nanA，然后分别电转来源于枯草芽孢杆菌168的、有六个蛋白酶trpC2 ΔnprE ΔaprE Δepr Δbpf Δmpr ΔnprB缺失的枯草芽孢杆菌感受态的菌株WB600，经筛选获得；所述以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600制备孢子悬液作为转化反应催化剂的方法为：以体积比1％-2％的量将重组枯草芽孢杆菌WB600重悬于pH＝8.0、10mM Tris-HCl溶液中，并按0.1～1.5g/L的量添加溶菌酶，37℃作用1小时，然后用均含有1mM的苯甲基磺酰氟的1M NaCl、1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤1-2遍，而后菌体重悬于pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂；所述利用芽孢催化剂生产N-乙酰神经氨酸的条件是：反应体系中催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活为0.1～1.5U，N-乙酰甘露糖胺浓度为50～500mM，丙酮酸浓度为200～1500mM，磷酸缓冲液浓度40～80mM，反应pH值为7～7.8，反应温度为25～70℃，反应时间为6～40小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为30～70％。
2.如权利要求1所述芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法，其特征在于：所述以芽孢表面展示重组枯草芽孢杆菌WB600制备孢子悬液作为转化反应催化剂的方法为：以体积比1％的量将重组枯草芽孢杆菌WB600重悬于pH＝8.0、10mM Tris-HCl溶液中，并按0.5g/L的量添加溶菌酶，37℃作用1小时，然后用均含有1mM的苯甲基磺酰氟的1M NaCl、1M KCl和pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液各洗涤1遍，而后菌体重悬于pH 7.4、1/15M的PBS缓冲液中，得到表面展示有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组芽孢杆菌芽孢催化剂。
3.如权利要求1所述芽孢表面展示系统用于N-乙酰神经氨酸生产的方法，其特征在于：所述利用芽孢催化剂生产N-乙酰神经氨酸的条件是：反应体系中催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活为0.3～0.7U，N-乙酰甘露糖胺浓度为500mM，丙酮酸浓度为600～1000mM，磷酸缓冲液浓度50～60mM，反应pH值为7.4～7.6，反应温度为50～60℃，反应时间为6～20小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为50～60％。
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